Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Clostridium perfringens Aranması

---

Tüm gıda numunelerinde, ısıl işlemini takiben uygun koşullarda soğutulmayan gıdalarada Clostridium perfringens aranması amacını taşır. Et ve et ürünleri riskli gıda arasındadır.Clostridium perfringens; gram pozitif, spor oluşturan, anaerobik, hareketsiz ve çobuk şeklindeki bakterilerdir. Ancak diğer anaeroblara göre oksijene daha toleranslıdır. Enterotoksin A,C ve D tipi Clostridium perfringens türlerinden izole edilir. Clostridium perfringens doğada çok yaygın bulunmakla beraber yüksek sayılara ulaştığında insan sağlığını tehdit eder.

Prensip

Clostridium perfringens anaerob bir bakteri olduğu için ekim yapılan besiyerlerinin anaerob ortamda inkübe edilmesi gereklidir.

Alet ve Ekipmanlar

Otoklav
Sterilizatör ( 160+5 oC lere ayarlanabilen)
İnkübatörler (35+1oC)
Analitik teraziler
Su banyosu(80-100oC)
Stomacher
pH metre
Bunzen beki
Steril bıçak, pens,spatül, vb. malzemeler
Tüp karıştırıcı
Plastik steril petriler (15x90mm )
Otomatik pipet ve steril pipet ucu
Cam tüpler ve tüp sporlar
Erlen , beher, mezür vb. standart laboratuvar cam malzemesi
Koloni sayacı
Platin öze
Anaerobik jar veya aerogen ortam torbası
Anaerobik ortam oluşturma kitleri
Mikrodalga

Kullanılan Besiyerleri

Maximum Recovery Diluent :

Formül :

Pepton : 1,0 g

Sodium clorür : 8,5 g

Distile su : 1 litre

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.

Tryptose Sulfite Cycloserine (Tsc) Agar:

Formül:

Tryptose : 15g

Yeast extract : 5g

Soyone : 5g

Ferric ammonium citrate : 1g

Sodyum metabisulfit : 1g

Agar : 20g

Distile su : 900ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,6+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 10 dakika sterilize edilir.

D-cyclocerineSolusyonu: D-cyclocerine1g, steril distile su 200ml filitreden geçirilerek sterilize edilir.Yada hazır formu kullanılır.

Egg yolk emülsion

Otklavdan çıkan besiyeri 50 oC ‘ye geldiğinde Hazır besiyerinin etiketinde yazdığı ölçülerde D-cyclocerineSolusyonu eklenir ve bir kısmı, ekim sonrası ikinci tabaka oluşturmak için aseptik koşullarda tüplere bölünür.Geri kalan besiyerine Egg yolk ilave edilir ve petrilere aseptik koşullarda bölünür. Streç filme sarılarak +4 oC‘de saklanır.

· Thioglyconat Besiyeri

Formül:

L-cystine : 0.5g

Agar : 0.75g

NaCl : 2.5g

Dextrose : 5g

Yeast extract : 5g

Tryptone : 15g

Sodyum thioglycollate : 0.5g

Rezazurin

(%0.1 sodyum solusyonu) : 1ml

Distile su : 1000ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,1+0,2 olacak şekilde ayarlanır.Tüplere 10ml olarak bölünür. 121+1oC‘de 20 dakika sterilize edilir.

Kullanılan Biyokimyasal Besiyerleri

(istenirse hazır biyokimyasal test kitleri kullanılabilir)

Laktoz Jelatin Besiyeri

Formül:

Tryptose : 15g

Yeast extract : 10g

Lactose : 10g
Phenol red(%1’lik etanoldeki): 5ml

Gelatin : 120g

Distile su : 1000ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,5+0,2 olacak şekilde ayarlanır.Tüplere 10ml olarak bölünür. 121+1oC‘de 10 dakika sterilize edilir.

Hareket Nitrat Besiyeri

Formül:

Beef extract : 3g

Peptone : 5g

KNO3 : 1g

Na2HPO3 : 2.5g

Agar : 3g

Galactose : 5g

Glyserin : 5ml

Distile su :1000ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,3+0,2 olacak şekilde ayarlanır.Tüplere 11ml olarak bölünür. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.

Uygulama

25 g(ml) örnek 225 ml (yada x numune miktarı x9 dilisyon sıvısı) Maximum Recovery Diluent ile gıda mikrobiyolojisi laboratuvar kurallarına uygun olarak homojenize edilir.Bu 1/10’luk dilüsyondan 1ml alınarak önceden hazırlanmış olan TSC(Egg yolk’lu) besiyeri içeren petrilere yayma yöntemine göre yüzeye ekim yapılır. Eğer numunedeki Clostridium perfringens sayısı yüksek bekleniyorsa seri dilisyonlar da yapılabilir.

Ortalama 45oC ye getirilen Egg yolk katılmamış TSC besiyeri ikinci tabaka oluşturmak üzere ekim yapılmış petrilere dökülür.Bu petriler anaerobik jar veya anerogen torbalara anaerobik ortam oluşturma kitleri ile beraber konur. 35oC de 18-24 saat inkübasyona bırakılır.

İnkübasyon sonrası Clostridium perfringens için tipik koloniler lesitinaz aktivitesinden dolayı opak zon oluşur. Sulphide indirgediği için 2-4mm çapında tüm siyah koloniler tipiktir.Petrilerdeki koloni sayısı 25-250 arası olursa sayılabilir. Sonuç kob/g veya kob/ml olarak verilir.

Sülfit indirgeyen Clostridia aranması istendiğinde petrideki siyah koloniler sayılarak hesaplanır.

Doğrulama Testi

Tipik koloniler Thioglycollate besiyerine alınıp 35-37 oC de18-24 saat anaerob ortamda inkübasyondan sonra tekrar TCS agara geçilerek buradaki kolonilerden identifikasyon yapılır.
Biyokimyasal test Sonuç
Hareket -
Nitratı nitrite indirgeme +
Laktoz Asit oluşunu
Gaz +
Jelatıni eritme +

---