Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

RUTİN HİSTOLOJİK TAKİP

---

1-Parça alma
2-Tespit
3-Sudan kurtarma
4-Şeffaflandırma
5-Gömme
6-Kesit alma
7-Boyama
8-Kapatma

1-PARÇA ALMA: Parçalar ölümden, biyopsiden ve cerrahi işlemden hemen sonra veya en kısa zamanda alınmalıdır. Büyük parçalar, dokunun ezilmesini önlemek için çok keskin bistüri veya jiletle daha küçük parçalara ayrılmalıdır. Parçaların kalınlığı 2-4 mm’yi (1 mm3) geçmemelidir.

2-TESPİT: Canlı öldüğünde içerdiği katabolik enzimler nedeniyle otoliz olmaya başlar. Bu olay, ölüm sonrası bozulma (postmortem dejenerasyon) olarak bilinir. Otolizde hücre içi enzim hareketleri değiştiğinden proteinler yıkılarak hücreler sıvı hale geçer. Otoliz, soğukta geçiktirilir, 37 0C‘de hızlanır. 57 0C‘de otoliz tamamen durur. Otolizde beyin, böbrek gibi iyi farklanmış organlar, elastik ve kollajen fibrillere göre daha çok etkilenir. Otoliz olmuş hürelerde çekirdeklerde piknoz, parçalanma (karyoreksis), lizis ve erime (karyoliz) görülür. Sitoplazma şişer ve granüler hale gelebilir. Doku granüler ve homojenöz bir kütle haline gelir ve boyanma reaksiyonlarında azalma olur. Otolizde epitel dökülür ve bazal membrandan ayrılır. Glikojen miktarı azalır ve tespit olmadığından dokuya yayılır.
Bakteriler de dokularda otolize benzer sonuçlar çıkarır. Septisemide hastadaki bakteriler ya da normal flora bakterileri çoğalır. Tespit ile tüm bakteriler ölür.

Tespitin (fiksasyonun) amacı:
1-Hücre ve dokuların canlı hale en yakın biçimde muhafaza etmektir. Ancak bu tam gerçekleştirilemez.
2-Otolizi, bakteriyel bozuma ve çürümeyi önlemek.
3-Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek.
4-Sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek.
5-Dokunun boyalarla ve diğer reaktiflerle boyanmasını kolaylaştırmak.
Fiksasyonda doku proteinleri ve yapı taşları koagüle olur. Böylece takip sırasında kayıpları ve diffüzyonları en aza iner. Ancak koagülasyon, dokularda artifakta yol açaçaktır. Bir fiksatif, takip sırasındaki haraplayıcı etkilere karşı koruyucu olmalıdır. Taze dokular suda yıkanırsa hücreler patlar. Önce tespit uygulanırsa yıkamanın etkisi olmaz.
Fiksasyon, dokuların kırma indislerini değiştirerek optik differansiyasyon sağlar. Bazı hücre bileşenlerinin kırma indisi çevreleyen ortama çok yakın olduğundan klasik mikroskopla incelendiğinde görülemezler. Fiksasyon, boya hareketlerini kolaylaştırır. Çekirdek boyası carmalum, formalin fiksasyonunda az, civa klorür boyasında ise daha iyi boyar. Bazen tespit ajanı özel doku bileşeni ve doku arasında mordant gibi hareket edebilir. Hematoksilen ile miyelin gösteriminde dokunun potasyum dikromatla bu şekilde hareket eder.
Fiksasyonla proteinler, tuzlar, karbohidratlar veya lipitler çökertilir ve doku sertleşir, katılaşır. Doku sertleştiğinden ince kesitlerin alımı kolaylaşır. Fiksatifteki kimyasalların etkisiyle enzimler inaktifleşir veya muhafaza edilir. Fiksatif seçilirken, dokunun boyutu, tipi, tazeliği ve uygulanacak boya bilinmelidir. Bir fiksatif bütün dokular ve boyalar için ideal değildir.

FİKSASYONUN UYGULANMASI: Fiziksel (ısı, kurutma ve dondurma) ve kimyasal yolla yapılabilir. Isı ile fiksasyon, bozulmaya yol açtığından artık kullanılmamaktadır. Kurutma ile fiksasyon, kan ve kemik iliği yaymalarında kullanılır. Dondurma ile fiksasyon, lipitler, enzimler ve ameliyat parçalarının hızlı tespitinde kullanılır. Dondurulan örnekler aynı zamanda sertleştiğinden hemen dondurma mikrotomu ile kesit alınır.
Kimyasal fiksasyon en çok uygulanan yöntemdir. Çeşitli kimyasal maddeler kullanarak fiksatif adı verilen çözeltiler hazırlanır. Alınan örnekler ya fiksatife atılır (daldırma=immersiyon yöntemi) ya da anestezi altında organı besleyen arter yolu ile önce serum fizyolojik verilerek damardaki kan boşaltılır ardından fiksatif verilerek organ daha vücutta iken kısmen tespit edilir. İncelenecek örnekler ardından fiksasyonun tamamlanması için fiksatif çözeltisine daldırılır. Bu yöntemde yapı daha iyi korunduğundan araştırmalarda tercih edilir.

3-SUDAN KURTARMA (Dehidrasyon):Tespitten sonra suyun ve bazı sıvıların uzaklaştırılması gerekir. Dehidrasyonda genellikle alkol ve aseton kullanılır. Dokular genellikle fazla miktarda su içerir. Bu suyun çıkarılmasıyla erimiş parafin doku parçalarının boşluklarına girebilir. Tespitten çıkarılan dokular genellikle yıkanır. Ardından % 30-50’lik etil alkolle başlayarak %60-70-80-96-96-100-100-100’lük etil alkolden birer saat geçirilir. Böylelikle dokular büzülmeden sudan kurtarılır. Embriyonik dokular gibi hassas dokularda dehidrasyonun % 30luk basamakla başlaması önerilir.

4-ŞEFFAFLANDIRMA (Clearing): Bu terim, dehidratlayıcı ajanı uzaklaştırmak için seçilmiş sıvının uygulanmasından sonra dokuların görünümünü ifade etmektedir. Doku bu işlemle yarı şeffaf hale getirilir. Bir şeffaflayıcı ajandan esas beklenen hem dehidrantla hem gömme ajanı ile karışabilir olma özelliğidir. Şeffaflandırıcı ajanı seçerken şunlara dikkat edilmelidir.
1-Alkolü uzaklaştırma hızı
2-Erimiş gömme ortamı ile uzaklaştırılmasının kolaylığı
3-Dokulara karşı nezaketi
4-Yanıcılık
5-Toksisie
6-Fiyat
Yanıcı olduklarından dikkatli kullanılmalıdır. Otomatik takip aletleriyle işlemde geniş ve dens bloklar için süre uzatılmalı ancak küçük parçalar etkilenmemelidir.
Şeffaflandırmada, ksilen, toluen, kloroform, benzen, karbontetrakorür, propilen oksit (özellikle e.m.de), karbondisülfit, amilasetat, sedir yağı, karanfil yağı trikloroetilen kullanılabilir. Genellikle 2-3 değişim bu sıvılardan geçirilerek dokular şeffaflandırılır ve parafinin işlemesine uygun hale getirilir.
5-PARAFİNE GÖMME (Embedding):Gömme ortamı olarak parafin, selloidin, selloidin-parafin kullanılabilir. Amaç, dokuları yarı sert ve kolayca kesilen materyel içine yerleştirmek ve şeffaflandırıcı ajanı dokudan uzaklaştırmaktır. Parafin en çok kullanılan ortamdır. Uygun takip hızı ve seri kesit için uygun kıvamı vardır. İstenilen kalınlıkta kesit alınabilir. Erime derecesi 45-50 0C olan parafin yumuşaktır. 56-60 0C’ lik ise daha serttir. Ortam ısısı, gömülecek mataryelin yapısı ve kesit kalınlığına uygun parafin seçilmelidir. Sıcak iklimde 450C’lik parafinle 3-5 µm lik kesit almak zordur.
55-60 0C’ lik parafin etüvündeki 3 kap erimiş parafinden geçirilen örnekler cam veya fayans üzerinde L-biçimli Leuckhart plakları ile hazırlanan kalıplara yerleştirilir. Kalıba önce erimiş parafin, ardından istenilen yönde doku yerleştirilir ve tekrar kalıp parafinle doldurulur. Bir etiket yerleştirilerek soğumaya bırakılır.
Gömme Hataları:
1-Parafin dokuya işlememişse bloklar iyi kesilemez, yırtılır.
2-Sıvı parafin çok sıcak ise doku büzülür.
3-Hızlı hareket edilmezse hava kabarcıkları, kristaller oluşabilir.

6-KESİT ALMA (Sectioning): Mikrotom ile 5-7 µm lik kesitler alınır. Bıçak keskin olmalı ve uygun açıda kullanılmalıdır. Kesitler, açılmaları için 45-50 0C’lik ben mariye atılır. Ben mariye kesitlerin lama kolay yapışması için jelatin eklenebilir. Ben mari soğuksa kesitler açılmaz, çok sıcaksa ani açılma ile yırtılabilir. Kesitler lama alınarak havada ya da etüvde kurutulur.

7-BOYAMA (Staining): Dokuları ilk kez Leuwenhoek (1719) safran kullanarak boyamaya çalışmış ve başaramamıştır. Boya endüstrisinin gelişmesi ile carmin boyası ile dokular hafifçe renklendirilmiş, Gerlach (1858)’ de tesadüfen cerebellumu boyayabilmiştir. 1863’te hematoksilen kullanılmaya başlanmış, 2 yıl sonra Böhmer mordant olarak alum kullanmış ve başarılı olmuştur. Anilin boya endüstrisinin gelişmesi ile dokular mükemmel olarak renklendirilebilmiştir.
Boyanmamış preparatlarda doku elemanlarının kırma indisleri birbirine yakın olduğundan ayrıntılar izlenemez. Farklı boyalar kullanarak dokular ve hücre bileşenleri birbirinden ayrılabilir. Doku bileşenlerinin ayırt edilmesi için kullanılan histolojik tekniklerde ya doku kontrastında değişiklik veya renkte değişiklik yapılır. Doku kontrastında değişiklikler faz-kontrast ve polarize mikroskobu ile veya metal çöktürme yöntemleri ile gerçekleştirilir. Histolojik boyama yöntemlerinde genellikle boya ile boyanma ile renk oluşturulur. Böylelikle boyanmış dokunun içinden geçen ışığın dalga boyu değiştirilir.
Genellikle dokular asit ve bazik boya ile boyanırlar. Bazik boya ile boyanan doku elemanları bazofilik; asit boya ile boyananlar ise asidofilik olarak adlandırılırlar. Genel olarak bazik boyalar dokuları mavi-mor, asit boyalar ise pembe-kırmızı renklerde boyar.
Boyalar sulu bir çözelti içinde anyon ve katyonlarına ayrılır. Boyaların renk verme özellikleri anyon ve katyonlardaki boya taşıyan organik gruplara bağlıdır. Eğer boya taşıyan grup katyonda ise boya bazik (katyonik); anyonda ise asit (anyonik) bir boyadır.
Dokularda protein, lipoprotein ve glikoproteinler amfoteriktir. Yani pH’ya ve diğer çevre şartlarına bağlı olarak iyonize olabilirler. Bir protein elektrik yüküne ve boyanmanın olduğu pH’ daki yüküne göre boyanır. Proteinin negatif ve pozitif yüklerinin eşit olduğu pH’ ya o proteinin izoelektrik noktası denir. İzoelektrik noktalarında proteinler çok az boyanır. İzoelektrik noktasının üstünde anyonik gruplarının iyonize olması ile bazik boyalarla; altında ise katyonlarının iyonize olması ile asidik boyalarla boyanır. Proteinlerin amino asit içerikleri farklı olduğundan farklı izoelektrik noktaları vardır.

8-KAPATMA (Mounting): Boyanan kesitlere bir damla Kanada balzamı veya entelan damlatılır. Lamel kapatılır, hava kabarcıkları çıkartılır. Bu maddeler hem mikroskopta inceleme için uygun kırma indisi sağlar hem de boyanmış kesitlerin yıllarca korunmasını sağlar.

---