GEN KLONLANMASINDA ADIMLAR
Klonlanmasi düsünülen gen ile vektör ayni RE ile kesilir. Vektör DNA ile, DNA parçalari tek-iplikçikli komplementer (uyumlu) sonlari olup; bu parçalar birbirleri ile birlesmeye hazir haldedirler. T4 DNA ligase kullanilarak, arada kovalant fosfo-diester bagi olusmasi suretiyle stabilizasyon saglanir. Sonuçta rekombinant plazmidler transformasyon ile bakteriye sokulur. Vektör DNA tasiyan bakteri, üzerindeki antibiotik direnci ile seçilir. Eger bir RE, vektör hazirlamada kullanilirsa; DNA,5'fosfat gruplarini ortadan kaldirmak için calf intestinal alkaline phosphatase ile muamele edilir. Böylece ligasyon sirasinda, resirkülarizasyona engel olunabilir. Dogru restriksiyon parçasinin klonlandiginin saptanabilmesi için, insert DNA degisik yöntemler kullanilarak (PAGE, low melting agarose, geneclean v.b.) saflastirilir.Vektör ve Insert DNA'nin Ligation'u için Vektör ve Insert DNA oraninin hesaplanmasi gerekmektedir.
Transformation için Kompetent hücrelere gerek vardir. Bunlar konakçi suslardir. Çok degisik tipleri mevcuttur. Önemli olan nokta bunlardaki rezistans genlerin varligidir. En sik kullanilan kompetent hücreler C600, RR 1, JM 110, HB 101, NM 539, LE 392, JM 101, Y 1089, JM 109 , Y 1090'dir. Bunlar gliserol içinde derin dondurucuda (-20/-70°C) saklanirlar. Kompetent hücrelerin hazirlanmasi için degisik metodlar bulunmaktadir.
Plazmid DNA'nin izolasyonunda degisik hazirlama yöntemleri bulunmaktadir. Sezyum kloride yöntemleri veya kolon saflastirma yöntemleri disinda hizli sekilde küçük miktarda plazmid izolasyonu mümkündür. Saflandirilmis DNA, tüm moleküler biyolojik yöntemlerde rahatlikla kullanilabilir.
Bir hastaligin lokusunun bulundugu bölgenin 1 cM yakininda, hastalikla bagintili bir markerin bulunmasi halinde genin klonlanmasi için çok degisik yaklasimlar-yöntemler uygulanabilir. 20-40000 bazlik bir büyük DNA parçasinin kütüphanesi olusturulduktan sonra, "kromozom yürümesi" olarak tanimlanabilecek yöntem uygulanabilir
Ayrica yeni teknikler gelistirilerek, insan genomunun fiziki haritasi çikarilmaktadir. Bu sirada özellikle bilgisayar ortami çok büyük kolayliklar getirmektedir.
Long PCR ile Genome Walking:
Bilinen bir gen bölgesine komsu bilinmeyen bir gen bölgesini aydinlatmak üzere gelistirilmis bir PCR yöntemidir. Bilinen diziden iki primer ile yola çikilarak, tek iplikçilikli DNA elde edilir. Ürünün sonuna poly C eklenir. daha sonra [EcoRI - (dG)n] tasiyan adaptör primer ile PCR tekrarlanir.
Diger Teknikler:
Insan genomunun yaklasik 50000-10000 arasinda gen kapsadigi düsünülmektedir. 16000'in üzerinde genin belirlenmesi tamamlanmistir. Tüm insan genomunun 2005 yilina kadar çözümlenmesi beklenmektedir.
Yeni genlerin belirlenmesi için degisik teknikler kullanilmaktadir:
1) Positional Kloning: Sekil 5.9. da görüldügü gibi bir yol izlenir.
2) Ekson Trapping: Sekil 5.10 da görüldügü gibi.
3) Zoo Blot: homolog kodlayan dizilerin farkli organizmalarda olup olmadiginin kontrol edilmesi yöntemidir.
Genetik
-
İnsanlarda Kaç Kromozom Vardır?
-
Sık görülen mikrodelesyon sendromları nelerdir?
-
Bilim insanları kromozomları nasıl inceler?
-
Arkea'da Kromozomlar ve DNA Replikasyonu
-
DNA Onarım Mekanizmaları Nelerdir?
-
DNA hasarına neden olan etkenler nelerdir?
-
XYY Süper Erkek Sendromu - JACOB’S, Sendromu
-
Bitki doku kültürü çalışmaları ile haploid bitkiler elde edilebilir
-
Gram pozitif bakterilerden genomik DNA izolasyon protokolü
-
E. coli bakterisinden genomik DNA izolasyon protokolü
-
DNA’nın Keşfi
-
İnsan Genom Projesi Nedir ? Amaçları Nelerdir ?
-
Genomik mikrodizilimlerle ikilenme teşhisi yöntemi
-
Gen duplikasyonu ve amplifikasyonu nedir?
-
DNA ile RNA Arasndaki Farklar ve Benzerlikler Nelerdir