PCR/ASO-PCR ANALİZ PROTOKOLÜ
PCR/ASO-PCR ANALİZ PROTOKOLÜ
PCR nedir?
PCR, nükleik asitlerin in-vitro olarak (canlı organizma dışında), uygun koşullar altında çoğaltılmasına dayanmaktadır.
Hem araştırmada hem de klinik laboratuar tanısındaki uygulama alanlarıyla büyük öneme sahip olan PCR' ın geliştirilmesindeki çalışmaları nedeniyle, K. Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülünü almaya hak kazanmıştır.
PCR hangi basamaklardan oluşur?
PCR, istenilen sayıda tekrarlanabilen döngülerden oluşur. Bir PCR döngüsü sırasıyla, deoksiribonükleik asidin (DNA) iki zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılması (Denatürasyon-Denaturation); sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanması (Hibridizasyon-Annealing) ve zincirin yeni çift zincirli DNA'lar oluşturacak şekilde uzaması (Polimerizasyon-Extension) aşamalarından meydana gelir (Şekil 1).
Bu aşamaların her biri farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilir, sıcaklık aralıkları genel olarak;
>94°C-98°C Denatürasyon
>37°C-65°C Hibridizasyon (Annealing)
>72°C Polimerizasyon şeklindedir.
PCR tekniği, tek ve çift sarmallı DNA ya da RNA için kullanılabilir. PCR ile bir hedef DNA parçasından milyonlarca çoğaltmak mümkündür. Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı olan, 18-25 baz uzunluğunda bir çift sentetik oligonükleotid primer kullanılarak, bu iki primer ile sınırlandırılan bölgenin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır. PCR'ın önemli bir avantajı da çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamasıdır.
PCR bileşenleri nelerdir?
Bir PCR döngüsü için gerekli olan beş ana madde vardır: DNA örneği, bu genelde genomik DNA dır; çoğaltılacak bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer; deoksinükleotit trifosfatlar (dNTP); yüksek ısıya dayanıklı Taq DNA polimeraz enzimi; uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı ve MgCl2.
Moleküler genetik çalışmaları için birçok farklı kaynak materyalden farklı yöntemler kullanılarak DNA izole edilebilmektedir, PCR’ da kalıp görevi gören DNA’nın temiz ve PCR inhibitörlerinden arındırılmış olması, sonucu etkileyen en önemli adımlardan biridir. DNA ile ilgili daha ayrıntılı bilgi DNA izolasyon başlığı altında verilmektedir.
PCR yöntemi ile çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı özellikte 18-25 baz uzunluğunda, sentetik olarak sentezlenebilen oligonukleotidlere primer denir. Bu diziler çeşitli tasarım programları kullanılarak hedeflenen gen bölgesine özgü olarak sentezlenmektedir. Primer tasarımında genel olarak dikkat edilmesi gereken bazı noktalar bulunmaktadır. Öncelikle primer dizisi hedeflenen DNA’ya özgün olmalıdır, bu nedenle ayrıntılı bir sekans araştırması tavsiye edilmektedir, primerin 3’ ucunda 1-2 adet G/C nükleotidi bulunmalı aynı şekilde primer genelinde G/C oranı %45-55 olmalıdır. Forward ve reverse primerlerin seçiminde birbirlerine yakın Tm değerlerine sahip olmalarına, bu aralığın 55-65º C arasında olmasına özen gösterilmelidir. Ayrıca primerlerin kendi içinde veya birbirleri ile komplementer olmamalarına dikkat edilmelidir. Forward ve reverse primer arasındaki uzunluğun 100-600 baz olması tavsiye edilmektedir.
MWG firması tarafından sentezlenen primer ve problar, kullanıcıya liyofilize olarak teslim edilmektedir. Liyofilize ürünler firma tarafından gönderilen talimatlara uygun olarak distile su ile sulandırılır.
Firma tarafından gönderilen sulandırma kağıdında sentezlenen primere ait dizi, konsantrasyon, molekül ağırlık, Tm ve 100 pmol/uL stok primer hazırlanması için eklenmesi gereken distile su miktarı (volume for 100 pmol/uL) belirtilmektedir. Bu talimatlara uygun olarak hazırlanan 100 pmol/uL’lik stok primerin ayrı olarak saklanması, devamlı kullanım için 10 pmol/uL konsantrasyonda hazırlanmış seyreltik primerlerin kullanımı tavsiye edilmektedir. Bu şekilde stok primerin daha uzun ömürlü olarak saklanması sağlanacak ve kontaminasyon riski minimuma inecektir.
100 pmol/uL stok primerden, 100 uL 10 pmol/uL’lik primer solüsyonu hazırlamak için 90 uL distile su’ya 10 uL stok primer (100 pmol/uL) ilave edilir.
Primer çalışmalarında gerekli olabilecek bazı çevrimler; 1 nmol=1000 pmol, 1 uM=1 pmol/uL şeklinde belirtilebilir.
Farklı firmalardan elde edilen liyofilize primerlerin sulandırılması için ise primerin nmol cinsinden değerinin bilinmesi yeterlidir. Yukarıda belirtilen 1 nmol=1000 pmol eşitliği kullanılarak, sulandırma için eklenmesi gereken distile su miktarı hesaplanabilmektedir. Örnek olarak elinizdeki A primeri 21,5 nmol değerinde ise 1 nmol=1000 pmol eşitliği kullanılarak 21500 pmol değerini elde ederiz. 1 µl’de 100 pmol olmasını istediğimiz stok primerimizi hazırlamak için;
1 µl 100 pmol
X 21500 pmol denkleminden
X= (1 µl x 21500 pmol)/ 100 pmol = 215 µl distile su eklediğimizde 100 pmol/uL stok primer solüsyonu elde edilir.
Taq DNA polimeraz, tamamlayıcı DNA dizisinin sentezi sırasında serbest dNTP’ye (deoksiribonucleotid-trifosfat) ihtiyaç duymaktadır. Set dâhilinde 100 mM’lık stok solüsyonlar halinde bulunan dATP, dGTP, dTTP ve dCTP’ den eşit miktarda alınarak bir mikrosantrifüj tüp içerisinde pipet yardımı ile karıştırıldığında PCR için kullanıma hazır, 25 mM dNTP karışım elde edilmektedir. PCR reaksiyonu sırasında ortamda bulunması gereken ortalama dNTP miktarı 0,2-0,4 mM olarak belirtilmektedir. dNTP’ nin raf ömrünü uzatmak amacı ile kullanılacak miktarların porsiyonlar halinde bölünerek, dondurup çözme işleminin en aza indirilmesi tavsiye edilmektedir.
Taq DNA Polimeraz enzimi, ortamdaki dNTP’leri kullanarak kalıp DNA iplikçiğine tamamlayıcı bir DNA ipliğini meydana getirecek sentez reaksiyonunu katalizler. Enzim, tamamlayıcı DNA sentezini başlatmak için primerlere ihtiyaç duymaktadır. Sentezin yönü 5’ ucundan 3’ ucuna doğru olup, primerin serbest 3’ hidroksil ucuna ortamdaki dNTP’lerin fosfodiester bağları ile bağlanması sonucu yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır.
MgCl2 ortamda bulunan serbest dNTP’ler ile bir araya gelerek Taq DNA polimerazın tanıyabileceği çözünebilir bileşikler oluşturmaktadır. Mg+2’deki artış enzim aktivitesini etkilemekte ve çift zincirli DNA’nın Tm ısısını arttırmaktadır. Reaksiyonda bulunan fazla miktarda Mg+2, spesifik olmayan primer bağlanmalarına ve buna bağlı olarak da spesifik olmayan bantlara neden olabilmektedir. Ortamda bulunması gereken MgCl2 konsantrasyonu en yaygın olarak 1,5 mM kullanılmakla birlikte 1-5 mM arasında olmalıdır.
Toplam hacmin 50 µl olduğu standart bir PCR çalışmasında kullanılan ortalama değerler şu şekildedir;
Bileşen Miktar Son Konsantrasyon Ortalama Aralık
10X Buffer 5 µl 1X 1X
MgCl2 (25 mM) 3 µl 1,5 mM 1-5 mM
dNTP (10 mM) 1 µl 0,2 mM 0,2-0,4 mM
Primer F (10 pmol/µl) 1 µl 10 pmol/µl 0,01-0,1 µM
Primer R (10 pmol/µl) 1 µl 10 pmol/µl 0,01-0,1 µM
Taq DNA Polimeraz (5 u/µl) 0,25 µl 1,25 u 0,5-2,5 u
DNA 5 µl 100 ng 50-200 ng
Ultra Saf Su 50 µl’ye tamamlanacak kadar Ultra Saf Su
PCR yönteminde karşılaşılabilecek muhtemel problemler ve çözümleri nelerdir?
Çok fazla dNTP yada dejenere olmuş dNTP : Reaksiyondaki çok fazla dNTP PCR’ı inhibe eder. Ayrıca dNTP ısınma-soğuma döngülerine karşı hassastır. Bu nedenle sık sık dondurup çözme yerine ilk ambalajı porsiyonlayarak kullanmak dNTP’nin ömrünü uzatacak, reaksiyonunuzu olumsuz etkileme riskini düşürecektir.
Karışmamış MgCl2: MgCl2 solüsyonu kullanmaya başlamadan önce iyice karıştırılmalı, reaksiyonda da kullanırken, pipetaj ile homojen hale gelmesi sağlanmalıdır.
Yanlış MgCl2 konsantrasyonu: MgCl2 iyonları dNTP ile kompleks oluştururlar . Ayrıca polimeraz için de kofaktör rolü görürler. Bu nedenle konsantrasyonları çok önemlidir. İdeal olarak reaksiyon başına 1-5 mM MgCl2 olması gerekir.
PCR inhibitörleri: DNA’nızın temiz olduğundan emin olmalısınız çünkü izolasyon sonrası artık olarak kalabilecek kloroform, fenol, deterjan, EDTA vb. maddeler PCR’ı inhibe eder. Aynı şekilde polimerazın etkinliğini de değiştirebilirler. Bu nedenle DNA’nızı aynı anda pürifiye de edebilecek yöntemlerle izole etmeniz önerilir.
Çok fazla polimeraz enzimi: Fazla polimeraz enzimi PCR ürününüzde smear’a neden olur. Bir çok reaksiyonda 1 ünite Taq kullanılmaktadır ancak yine de reaksiyona uygun Taq miktarının kontrol edilerek kullanılması tavsiye edilir.
Yanlış primer konsantrasyonu: Çok az primer konulursa PCR ürünü elde edilemeyebilir. Çok fazla primer de jel üzerinde primer dimerine neden olabilir. Primer aralığı, her primer için genellikle 0,01-0,1 µM arasında olmalıdır.
Yanlış PCR programı: PCR programı, reaksiyonun en önemli aşamasıdır. Kullandığınız programın çoğaltmak istediğiniz gen bölgesine uyumlu olup olmadığını ve reaksiyonu başlatırken doğru program seçip seçmediğinizi mutlaka kontrol etmeniz tavsiye edilir. Ayrıca program içerisindeki en önemli aşama da hibridizasyon (annealing - primerin dizisine göre DNA bölgesine yapışma) sıcaklığıdır. Bu sıcaklığın, literatürden ve primerlerinizin bilgilerinden kontrol edilmesi önerilir.
Yanlış DNA miktarı: Çok fazla DNA tüm primerlere bağlanarak PCR’ı inhibe eder. Çok az konulursa da ürün tespit edilmeyebilir. Bu nedenle döngü sayısına da bağlı olarak ortalama 50 – 200 ng DNA koymanız yeterli olacaktır.
Yanlış primer tasarımı: Primer tasarımı yapılırken, primer dizisinin kendisi ile ve diğer primerle komplementer olmamasına ve çok uzun (>30 bp) olmamasına dikkat edilmelidir.
ASO-PCR nedir?
PCR, aynı zamanda allel-spesifik oligonükleotid (ASO) yöntemi kullanılarak da bilinen tek nokta mutasyonların (SNP) tespit edilmesinde kullanılmaktadır. Tipik bir ASO çalışması, ortak bir primer içeren iki tamamlayıcı reaksiyondan meydana gelmektedir. Her iki reaksiyon ortak primer dışında allel spesifik primer ve diğer PCR bileşenlerinden oluşmaktadır. İlk reaksiyon normal (wild-type) DNA dizisine spesifik, verilen bölgede mutant diziye zıt primer içermektedir. Benzer şekilde ikinci reaksiyon mutant diziye spesifik, normal (wild-type) DNA’ya uyumsuz primer içermektedir (Şekil 2).
Yöntem, uygun koşullar altında her reaksiyon tüpünde spesifik olarak gerçekleşen normal (wild-type) ve mutant amplifikasyonların değerlendirilmesine dayanmaktadır. Normal bir birey sadece ilk, normal reaksiyonunda amplifikasyon meydana getirirken, homozigot bireyde her iki reaksiyonda da amplifikasyon ürünü beklenmektedir. Homozigot mutant bireyde sadece ikinci reaksiyonda ürün elde edilecektir. PCR reaksiyonuna eklenecek internal kontrol çalışmanın doğruluğunun belirlenmesi açısından önemlidir.
Alıntıdır...
Genel Biyoloji
-
Protista Alemi ve Genel Özellikleri
-
Hücrelerdeki farklı ve benzer yapılar
-
Ses Nedir ? Ses Nasıl Oluşur?
-
Kültürü Yapılan Fitoplankton Türleri Nelerdir?
-
Apoptoz: Programlı Hücre Ölümü Nedir?
-
Ribozom ve Protein Sentezi
-
Mikrotübüller ve İplikçikler
-
Hücre Zarları
-
Lipid Çift-Katmanın Keşfi
-
Biyoreaktör
-
Telomerler ve İnsan Telomerinin Kristalik Yapısı
-
Hücre Biyolojisinin Tarihsel Gelişimi
-
Hücre biyolojisi nedir ?
-
Biyolojik Çeşitlilik Nedir ?
-
Sinir Sistemi Yapısında Bulunan Hücre Tipleri ve Özellikleri Nelerdir?