Kromatin Immünopresipitasyon (ChIP) Test Prosedürü
ChIP analizleri, genom ve proteom arasındaki bağlantıları, histon modifikasyonu (epigenetik olarak) veya transkripsiyon faktörleri ile DNA bağlanma etkileşimleri aracılığıyla transkripsiyon regülasyonunu takip ederek tanımlamaktadır.
ChIP yönteminde kuantatif PCR (qPCR) yapılarak kuantatif etkileşimlerin ve sistemde meydana gelen spesifik protein - DNA etkileşimlerin anlık görüntülerinin alınması kullanılır. ChIP deneyleri çapraz bağlama (crosslinking), hücre lizisi, nükleik asit kırılması/kesilmesi,jel elektroforezi, antikora bağlı IP gibi moleküler biyoloji ve proteomik metodlarının kullanımını gerektirir.
ChIP yöntemi temel olarak 6 basamakta gerçekleşir:
1. Çapraz Bağlama: ChIP yöntemi DNA-protein kompleksinin kovalent stabilizasyonu ile başlar. Çoğu DNA-protein etkileşimleri geçicidir ve içerdiği çoklu protein kompleksleri biyolojik fonksiyonları organize eder. İn vivo çapraz bağlama kovalent olarak DNA-protein kompleksini stabile eder.
İn vivo çapraz bağlama genellikle formaldehitle elde edilir fakat EGS veya DGS gibi diğer bağlayıcılar da kullanılabilir. Formaldehit çapraz bağlaması direk olarak etkileşim halinde olan iki molekül için idealdir. EGS ve DGS daha kompleks protein yapısında kullanılır.
Araştırmacılar sık sık protein-DNA etkileşimlerini yakalamak için çapraz bağlayıcıların bir kombinasyonunu kullanırlar.
Bu çapraz bağlayıcılar, protein-DNA komplekslerini etkili bir şekilde bağlamak için sağlam hücrelere doğrudan nüfuz eder, böylece geçici etkileşim komplekslerinin bile analiz için yakalanıp stabilize olmasına izin verir.
2. Hücre Lizisi: Lizis aşamasında, çapraz bağlanmış protein-DNA komplekslerini, hücrelerden veya dokudan ekstrakte edilir ve bunlar çözelti haline getirir. Bu aşamada hücresel komponentler deterjan içerikli solüsyonla hücre membranını degradasyonu sonucu salınır. Protein-DNA etkileşimleri başlıca nüklear kısımda meydana gelir, bu nedenle sitozolik proteinlerin uzaklaştırılması bu komplekslerin elde edilmesinde etkilidir. Deterjan ya da tuz uygulamaları DNA-protein kompleksine zarar vermez, çünkü ilk aşamada elde edilen kovalent çapraz bağlama, ChIP uygulaması boyunca kompleksi sabit tutar.
Lizis işleminin mekanik olarak yapılması nüklear kısma da zarar vereceğinden bu uygulama önerilmez.
3. Kromatin Hazırlaması (Kırma/Kesme): Ekstraksiyon aşamasında nüklear materyal ve DNA-protein kompleksi elde edilir. Protein bağlanma sekanslarının analizi için ekstrakte edilmiş genomik DNA küçük fragmentlere ayrılmalıdır. DNA fragmentasyonu genellikle hem
sonikatör aracılığıyla mekanik hem de MNaz ile parçalama aracılığıyla enzimatik elde edilebilir.
İdeal fragmentler 200-1000 bp arasında değişiklik gösterir. DNA’nın kesilmesi/kırılması işlemi kontrolün sağlanması açısından zor bir aşamadır.
4. İmmünopresipitasyon: Spesifik modifiye edilmiş bir histonun izole edilmesi için ilgili TF ya da kofaktörler ChIP onaylı antikorlar hedefin diğer nükleer bileşenlerden immünopresipitasyonu ve izolasyonu için kullanılır. Bu adım, ilgi konusu olan protein-DNA kompleksi için seçici olarak zenginleşir ve diğer tüm hücresel materyaller ortamdan uzaklaştırılır.
Uygun antikorun seçiminde başarılı ChIP analizi kritik parametredir. Memeliler örnekleri için çok sayıda onaylanmış ChIP kitleri bulunmaktadır. Hedeflenen proteine uygun nitelikte antikorların bulunmadığı durumlarda HA, myc veya GST gibi füzyon proteinleri biyolojik örnekte eksprese edilebilir ve daha sonra afinite etiketlerine karşı antikorlar, hedefin immünopresipitatif olarak kullanılabilir.
Antikor-protein-DNA kompleksi sabitlenmiş (immobilize) protein A, protein G, protein A/G gibi antikor bağlayıcı reçineler kullanılarak afinite ile arıtılır.
Daha izole bir ortam oluşturmak için antikor bağlama boncuklarının, somon sperm DNA’sı ve cinse ait protein kaynağı gibi nükleik asit ve protein engelleyici bufferın kombinasyonu ile bloke edilmesi gereklidir. Her ChIP örneğinde fazla miktarda kullanılan tanecikler kompleks dışı maddeleri de etkileyerek spesifik olmayan bağlanmalar oluşturur.
5. Çapraz Bağlama Ters Dönüşü ve DNA Saflaştırılması: İlgili proteine bağlı DNA'nın zenginleştirilmesi, ChIP amacıdır. DNA seviyeleri agaroz jel elektroforezi veya daha yaygın olarak qPCR ile belirlenebilir. Bir ChIP testinin spesifik DNA ürünleri amplifiye edilip ölçülmeden önce protein ve DNA arasındaki çapraz bağlantılar tersine çevrilmelidir. Bu tipik olarak geniş ısı inkübasyonları veya protein bileşeninin proteinaz K ile sindirimi yoluyla yapılır.
6. DNA’nın Nicel (Kuantatif) Değerlendirilmesi: qPCR ile hedef protein-DNA düzeylerinin ölçülmesi sağlanır.
Çeviren ve Derleyen: Merve Gül Turan
Kaynak: https://www.thermofisher.com/tr/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/chromatin-ip-chip-assays.html (Erişim Tarihi:12.10.2018)
Genetik Haberleri
-
Allopatrik türleşme nedir ? Nasıl Gelişir ?
-
Maryland’teki “Kölelerin” Yaşayan 42.000 Akrabası Bulundu
-
Araştırmacılar kediler, yunuslar, kuşlar ve düzinelerce başka hayvanın genom haritasını çıkarıyor
-
Kolombiya'da nadir görülen bir kuş türünde "gynandromorphy" gözlemlendi
-
Kurumaya dayanıklı bitkiler için genom veritabanı yayınlandı
-
En son DNA barkodlama teknolojisiyle İsrail'in tatlı su balık türleri listesinin yeniden gözden geçirilmesi
-
İnsanların Daha Önce Bilinmeyen Bir Dokunma Duyusu Keşfedildi
-
Bilim İnsanları Tüm İnsan Genomunun Dizilimini Çıkardı. Ancak Henüz Bitmedi
-
İlk Defa Tazmanya Kaplanından RNA Elde Edildi
-
Neandertal DNA’nız, Sizi Acıya Karşı Daha Hassas Yapıyor Olabilir
-
Epigenetik ve Epigenetik Mekanizmalar
-
İlk taslaktan 20 yıl sonra insan Y kromozomu tamamen dizilendi.
-
Kim Bu Kimerizm? Tek Bedende İki Kişi
-
Gen terapi, genetik materyalin yeniden düzenlenmesi
-
mRNA Aşıları: Genetik İnovasyonunun Yeni Yüzü ve Sağlıkta Devrimi