WESTERN BLOTTING YÖNTEMİ
Western Blot; dokudaki spesifik bir proteini analiz etmemizi sağlayan moleküler biyoloji tekniğidir. Bu teknik sayesinde dokuda bulunan bir proteinın varlığı, büyüklüğü, konsantrasyonu, konsantrasyon değişimleri, farklı gruplar arasındaki konsantrasyonlarının karşılaştırılması vb. araştırılabilir.
NOT: Antikor kullanarak dokulardaki proteini tayin etmemizi sağlayan bir diğer teknik, immünohistokimyadır.
Blotlama yöntemeleri;
Western Blot: Protein tayini
Southern blot: DNA tayini
Northern blot: RNA tayini için kullanılır.
Western blotlama prosedürü dört ana kısımdan oluşur:
1.Örneklerin Hazırlanması: Öncelikle ister in vitro (hücre kültürü, vb) ister in vivo (deney hayvanı çalışmaları) deneyler yapıldıktan sonra doku içerisindeki hücreler veya kültür hücreleri parçalanarak proteinleri içeren kısım diğer kısımlardan ayrıştırılır. Daha sonra elimizdeki protein karışımlarının protein konsantrasyonu spektrofotometre yöntemiyle belirlenir. Bu basamağın optimum uygulanması Western jelinin her bir kuyucuğuna eşit miktarda protein yükleyebilmemizi sağlar.
2.Yürütme ve Transfer: Öncelikle proteinler denatüre edilip, indirgenerek düzgün yürütülebilecek hale getirilir. Daha sonra örnekler jel üzerindeki kuyucuklara yüklenerek, elektroforez yöntemiyle moleküler ağırlıklarına göre bantlar halinde ayrıştırılırlar (running) ve sonrasında bir membran üzerine aktarılırlar (transfer). Bu basamağın amacı antikorlarla işaretlenebilecek bir yapı elde etmektir (membran veya blot).
3.İlgili Proteinin İşaretlenmesi ve Boyanması: İmmünohistokimyaya çok benzer bir şekilde blokaj, birincil antikor, yıkama, ikincil antikor, yıkama ve boyama kısımlarından oluşur. Görünür dalga boyundaki boyalar yerine kemiluminesan (kimyasal ışıma) işaretlenmesi kullanılır.
4.Görüntüleme ve Analiz: Analog olarak bir filme veya dijital olarak CCD chip üzerine yapılabilir. Bantlar görülebilir ve analiz edilebilir hale getirilir. Önceki basamakların sorunsuz yapılmış olması bu basamağın da sorunsuz yapılabilmesini sağlar.
UYGULAMA
İlgilenilen protenin bulunduğu dokunun karakteristiğine ya da proteinin bulunduğu hücresel bölgeye veya proteinin özelliğine göre pekçok farklı lizis tamponu kullanılabilir. Deney hayvanları ile yapılan in vivo deneyler sonunda beyin örnekleri genellikle RIPA buffer (Radioimmunoprecipitation assay buffer) ile homojenize edilir. Doku örneği tartılarak 10 katı kadar hacimde buffer eklenir. Proteaz inhibitörü RIPA’ya taze olarak eklenir. Çalışılacak proteinin fosforile olup olmamasına göre proteaz inhibitörünün içeriği değiştirilmelidir ve gerekli durumlarda fosfotaz inhibitörü de kullanılmalıdır, ilgili protein için literatüre bakılmalıdır.
Örnek;
•50 µg dokuya 500 µL RIPA eklenir, RIPA eklenmeden hemen önce:
•1/50 oranında (10µL) Proteaz inhibitör kokteyli ve
•1mM PMSF (elimizdeki solüsyondan 1/50 oranında, yani 10 µL) eklenir.
RIPA Buffer içindeki proteaz inhibitörü proteinlerin yıkılmasına neden olabilecek proteazların aktivitesini inhibe eder.
Homojenizasyon için homojenizatörler kullanılır. Örnekler 1.5 ml’ lik mikrofüj tüplerine konur. Homojenizasyon mutlaka buz içinde yapılmalıdır. RIPA ile doku tamamen karışıp, krema haline gelince işlem tamamlanır.
Homojenizasyonu takiben dokunun proteinli kısmını ayrıştırmak amacıyla santrifügasyon yapılır. Bunun için masaüstü tipteki santrifüjü kullanıyoruz.
Santrifüj: 14000 RPM'de, +4oC derecede, 15 dakika santrifüj edilir.
Üstte: Süpernatan (sıvı)
Altta: Pelet (çökelti)
Süpernatanlar ayrı birer mikrofüj tüpüne alındıktan sonra bir kere daha santrifüj edilebilir. Süpernatan mikropipet yardımıyla 0.5’lik mikrofüj tüplerine eşit miktarda aliquotlanır ve -80 oC’ de saklanır.
Spektrofotometre ile Protein Konsantrasyonu Tayini
Spektrofotometre ile protein abzorbansı ölçülür.
Bunun için Bradford yöntemini kullanıyoruz.
50 µl örnek (5 µl Süpernatan, 45 µl Distile su ile 10 kat seyreltilerek, bu oran eğer ölçüm sonucunda elde edilen absorbans değeri standart doğrunun dışında çıkarsa arttırılmalıdır, örneğin 20 kat), güzelce karıştırılarak mikroküvete aktarılır ve üzerine:
30 kat (1500 µl) Bradford protein assay reagent (Sigma®, markaya göre protokol değişebilir) eklenir.
Örnekler ölçülmeden önce ilk olarak, standart protein solüsyonları (0,1-1,4 mg/mL arasında değişen) hazırlanarak bir standart grafik (protein konsantrasyonu-abzorbans grafiği) oluşturulur. Bu doğru protein ölçümü yapılmadan önce her seferinde yeniden oluşturulmalıdır.
Standartların hazırlanması (200 mg/mL stok BSA kullanılır)
1,4 mg/mL
2µL stok BSA + 283,8 µL Dsu
1 mg/mL
100µL 1,4'ten + 40 µL Dsu
0,5 mg/mL
80µL 1'likten + 80µL Dsu
0,25 mg/mL
80µL 0,5'likten + 80µL Dsu
0 mg/mL
50µL Dsu
Standart Grafik Hazırlanması:
Daha sonra örneklerin abzorbans ölçümü yapılır. Karışım içinde çökelti oluşmaması ve partikül kalmaması gerekir, bunun için de önce örneği üzerine de Bradford çözeltisini koymak tavsiye edilir. Bradford eklendikten sonra tüp birkaç kez ters düz edilerek iyice karıştırılmalıdır.
Prensip: Bradford reaktifi içindeki “Coomassie mavisi’’nin, proteine bağlanmasıyla boyanın abzorbansı 465 nm’den 595 nm’ye kayar. Abzorbans değeri protein konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. BSA (bovine serum albumine) standart protein olarak kullanıldığında lineer konsantrasyon aralığı 0.1-1,4 mg/mL’dir.
Her bir beyin için elinizdeki 1550 µl'lik örneklerle 595 nm'de abzorbans değerleri ölçülür. Standart grafiğin eğim değerinden OD(optik dansite-abzorbans) değerini bildiğimiz proteinin C (konsantrasyon) değerini hesaplayabiliriz.
NOT: SP-8001 UV-VIS Spektrofotometre cihazının 9 numaralı menüsü QUANTITATIVE’ den cihaz önce hazırladığımız standart protein örneklerine göre standart grafiği çizer, daha sonrada bu grafiği baz alarak protein örneklerinin konsantrasyonlarını hesaplar. Ama bu özelliği olmayan cihazlar için standart grafiğin hazırlanması yukardaki şekilde yapılmaktadır.
Abzorbans değerleri ile protein yoğunluğunun hesaplaması:
Protein (mg/ml) = (Abzorbans/0.9929-standart grafiğin eğimi) x dilüsyon oranı
Yükleme için kullanacağınız örnekte ne kadar protein olmasını istediğimize karar veririz. Örn : 20-30-40 µg gibi. Az yüklemek düşük miktardaki proteinlerin gözden kaçmasına, fazla yüklemek ise kirli bir background’a ve analizde ciddi zorluklara sebep olabilir. Örnek olarak 20 µg’ı seçmişsek, örneklerdeki protein yoğunluğunu kullanarak (mg/mL), her bir örnekten hangi hacimde alırsak 20 µg protein almış olacağımızı hesaplarız (=20/Protein konsantrasyonu).
Kaç µl hacim ile yükleme yapacağınıza karar verin (20-30µl gibi). Yükleme için kullanacağınız solüsyonun %25'i Sampling buffer (4X) olmalı; hesaplanan miktarda örnek ekledikten sonra üzerini distile suyla tamamlayın.
Örn: Abzorbans değeri 0.8 olan bir örnekte protein konsantrasyonu, 8.06 mg/ml olarak hesaplanır.
Yukardaki formülle :
20 µg protein yüklemeye karar verilmişse, 8.06 mg/ml yoğunluğundaki örnekten 2.48 µl almak gerekir.
30 µl yükleme yapılacaksa:
2.48 µl örnek
Yükleme çözeltisi
+ 7.5 µl (30X0.25) sample buffer
hazırlanır
+ 20.02 µl distile su ile.
Yükleme çözeltilerine merkaptoetanol eklenir (%2.5 v/v, yani 30 µl için 0,75 µl). Merkaptoetanol, proteinlerin disülfit bağlarının indirgenmesini sağlar.
Sample buffer ise proteinleri denatüre hale getirerek merkaptoetanol ve kaynatma işlemleriyle birlikte proteinlerin denatüre olarak, jel üzerinde düzgün bir şekilde yürüyebilmesine olanak tanır.
Ependorflarda hazırlanmış yükleme çözeltilerini önceden 90oC’ye getirilmiş Dryblock’ta 5 dakika kaynatılır.
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar