TRANSFORMASYON
Transformasyon rekombinant DNA teknikleri kullanılarak hücre dışı uygulamalar ile farklı bir genotipten hücre genotipine doğrudan bir modifikasyon işlemidir. Transformasyon terimi genel olarak ekzogenik DNA’nın hücre içine alınıp hücre genetiği ile bütünleşmesi anlamına gelir (Şekil 1). Transformasyon işlemine başlamdan önce ilgilenilen gen bölgesi plazmid vektör ile ligaz enzimi aracılığıyla birleştirilir. Bu işleme ligasyon adı verilir (Şekil 2). Genellikle nükleik asitler, örneğin plazmidler kendiliğinden bakteri hücrelerinin içine giremezler bunun için uyarıcı bir etki gereklidir. Bu yüzden transforme olacak hücre membranlarının daha önceden düzenlenmesi gereklidir. Kompetan hücre olarak da ifade edilen transforme olacak hücreler kalsiyum klorür ile uyarılır ve hücre membranları ilgilenilen geni içeren plazmid vektörü hücre içine alabilecek şekilde düzenlenir.
Transformasyon İçin Gerekli Malzemeler
1. Buz kabı
2. Su banyosu ya da inkübatör
3. Saat
4. Otoklavlanabilir atık kabı
5. Yaklaşık 100-200 μl kompetan hücre
6. Sıvı besiyeri
7. Rekombinant plazmid DNA
8. 1.5 ml ependorf tüpleri
9. Mikropipet seti ve uygun steril uçlar
Kompetan hücreler hassas olduğu için çalışma dikkatli yapılmalıdır. Çalışma buz üzerinde yapılmalı ve hücreler vortekslenmemelidir. Pipetleme işleminde ise büyük hacimli uçlar ile pipetaj yapılmalıdır.
Kompetan Hücrelerin Transformasyona Hazırlığı
1. Hazırlanan kompetan hücreler genellikle -86 oC’de ya da sıvı azotta saklanır. Düşük sıcaklıkta bekleyen kompetan hücreler buz üzerinde 15 dakika boyunca eritilir
Rekombinant DNA’nın Kompetan Hücrelere Bağlanması
2. 10 μl transforme edilen plazmid (yaklaşık 1-10 ng DNA içermelidir) kompetan hücre ( 100- 200 μl ) üzerine eklenir ve hafifçe karıştırılır.
3. 30 dakika buz üzerinde inkübasyon yapılır (Şekil 4). Bu aşamada transforme olan plazmid DNA’sının hücreye yapışması sağlanır.
Isı Şoku
4. Buz üzerinde inkübasyonu yapılan kompetan hücreler 42OC’de bir ya da iki dakika bekletilir, Bu aşamada tüp karıştırılmamalıdır. Isı şoku olarak ifade edilen hücrelerin yüksek sıcaklıkta bekletilmesi hücre membranlarındaki fosfolipidlerin hareketlerini sağlar.
5. Isı şoku işleminden sonra kompetan hücreleri içeren tüpler hücreleri korumak için hızlıca buz üzerine alınır.
6. Hücreler buz üzerinde beş dakika bekletilir.
Kompetan Hücrelerin Toplanması
7. Hücrelerin buz üzerinde 5 dakika inkübasyonundan sonra herhangi bir antibiyotik içermeyen besiyeri (1 ml) hücrelere eklenir.
8. Hücreler ve besiyeri karıştırılır. Hücreleri ısı şokundan etkilenmeden toplamak için antibiyotik içermeyen besiyeri kullanılır. Hücreler besiyeri ile karıştırıldığında stres durumu ortadan kalkar. Daha sonra hücreler içlerine aldıkları ilgilenilen geni içeren plazmidleri sentezlemeye başlar. Sentezlenen plazmidler bölünen hücrelere aktarılır.
9. Besiyerindeki hücreler 37°C’de inkübe edilir. İlk 15 dakika hücreler karıştırılmaz (Şekil9).
10. Daha sonra 45 dakika 600 rpm’de inkübasyon yapılır.
Hücrelerin antibiyotik içermeyen besiyeri ile bir saat inkübasyonundan sonra, hücreler antibiyotik direncine hazırdır.
Mavi-Beyaz Tarama ile Antibiyotik Seçimi
11. Kimyasal olarak uyarılan kompetan hücrelerin transformasyon oranı genellikle düşüktür. Bu oran genellikle 1/10.000’in üzerinde değildir. Bu yüzden plazmid içeren bakteriyel hücrelerin seçilimine ihtiyaç duyulur.
İlgilenilen geni içeren (transforme olan) plazmid DNA içeren hücrelerin seçimi antibiyotik direncine göre yapılır. Birçok E. coli soyu antibiyotiklere hassastır. Manipülasyon ya da klonlama için kullanılan plazmid DNA’lara antibiyotik direnç geni gen mühendisliği kullanılarak eklenmiştir. Plazmid DNA’lar içerdikleri antibiyotik direnç özelliğinden dolayı antibiyotik içeren besi ortamında antibiyotiğe direnç gösterdikleri için içinde bulundukları kompetan bakteri hücresi hayatta kalacaktır. Fakat plazmidi almayan kompetan hücreler antibiyotik direnci kazanamadıkları için öleceklerdir.
Rekombinant plazmidleri (ilgilenilen gen bölgesi ligasyon olan) ve rekombinant olmayan plazmidlerden (ilgilenilen gen bölgesini içermeyen) belirlemek için plazmid vektörün çoklu klonlama bölgesine (MCS) ‘’β-galactosidase’’ geni eklenmiştir. LacZ geni olarak da bilinen β-galactosidase geni laktozun parçalanmasını katalizler. Eğer ilgilenilen gen plazmidin çoklu klonlama bölgesine bağlanmışsa bu durumda LacZ geninin bütünlüğü bozulacağı için besiyerinde bulunan laktoz parçalanmayacaktır.
12. Transforme hücrelerin seçiminde antibiyotik kullanımının yanında iki kimyasala daha ihtiyaç duyulmaktadır.
IPTG (isopropylthiogalactoside)
X-gal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside).
IPTG β-galactosidase geni için bir uyarıcıdır. Bunun anlamı eğer ortamda IPTG varsa enzim sentezlenir. X-gal ise renksiz, kromojen bir maddedir ve laktoz analoğu olarak kullanılır. Bu madde β-galactosidase geni sentezlendiği zaman oluşan enzim ile parçalanır ve mavi renk oluşur. Transforme olmayan hücreler antibiyotik direnci içermediklerinden dolayı antibiyotikli besiyerinde hayatta kalamazlar. Plazmid çeren fakat ilgilenilen geni içermeyen plazmidi bulunduran hücreler antibiyotik direncine sahiptir. Bu yüzden antibiyotikli besiyerinde hayatta kalırlar. Fakat çoklu klonlama bölgelerindeki LacZ geninin bütünlüğü bozulmadığı için ortamda bulunan X-gal maddesini parçalar ve mavi renk açığa çıkar. Fakat ilgilenilen geni içeren Plazmid DNA’daki LacZ gen bütünlüğü bozulduğu için X-gal maddesini parçalayacak enzim sentezlenmez ve böylelikle hücreler mavi renk oluşturmaz, beyaz renkli kalırlar.
Rekombinant Hücrelerin Seçimi için Gerekli Malzemeler
1. Steril kabin
2. Gaz ocağı
3. Mikropipet
4. Steril uçlar
5. Yayma spatulası
6. % 70 etanol
7. Besiyerinde bulunan transforme olan hücreler
8. Antibiyotik ve mavi-beyaz koloni seçimi için IPTG ve X-gal içeren katı besiyeri
9. Otoklavlanabilir flask ve atık kabı
10. Bakteri peletlerini çökeltmek için kullanılan santrifüj
11. İnkübatör
Hücrelerin Katı Besiyerine Aktarılması
13. Antibiyotik ve mavi-beyaz koloni seçimi için IPTG ve X-gal içeren katı besiyerine hücrelerin aktarılması;
a. Steril spatula %70 etanol ile temizlendikten sonra ateşe tutularak alkolün yanması sağlanır.
b. Daha sonra spatulanın soğuması beklenir.
c. 100 μl hücre süspansiyonu nütrient agar üzerine yavaşça aktarılır.
d. Bakterileri agarın yüzeyine yaymak için soğumuş spatula kullanılır.
e. Hücrelerin aktarıldığı plate katı besiyeri içeren taraftan etiketlenir.
Katı Besiyerindeki Hücrelerin İnkübasyonu
14. Hücreleri içren plate’ler oda sıcaklığında bekletilerek hücre süspansiyonunun tamamını alması sağlanır.
15. Daha sonra plate’ler ters çevrilerek 37 °C’de inkübe edilir. Transforme olan hücreler 12-18 saat sonra gözükür.
Oluşan Hücre Kolonilerinden Mavi-Beyaz Klon Seçimi
16. İnkübasyon sonrası plate içinde hayatta kalan bakteriler besiyerinde bulunan antibiyotiğe direnç gösteren bakterilerdir. Bu bakterilerde antibiyotik direnci olduğu için plazmid içermesi gerekmektedir.
17. Bu içerdikleri plazmidlerin transforme olduğunu anlamak için mavi-beyaz hücre seçimi yapılmalıdır. Plate üzerinde bulunan mavi kolonilerde X-gal parçalandığı için enzim sentezlenmesi gerekmektedir. Enzim sentezlenen plazmidin LacZ gen bütünlüğü bozulmadığı için istenilen geni alması mümkün olmaz. Oluşan beyaz kolonilerde ise X-gal parçalanmadığı için renk değişimi olmamıştır. Bunun nedeni X-gal kimyasalını parçalayacak olan enzimin sentezlenmemesidir.
18. Bu enzimin sentezlenmemesi için LacZ gen bütünlüğünü bozacak ilgilenilen genin plazmide ligasyon olması gereklidir. Böylelikle çoklu klonlama bölgesinde bulunan LacZ geninin bütünlüğü bozulacak ve galaktozidaz enzimi sentezlenmediği için X-gal parçalanmayacak bunun sonucunda da hücre kolonilerinde renk değişimi gözlenmeyecektir.
Genetik
-
İnsanlarda Kaç Kromozom Vardır?
-
Sık görülen mikrodelesyon sendromları nelerdir?
-
Bilim insanları kromozomları nasıl inceler?
-
Arkea'da Kromozomlar ve DNA Replikasyonu
-
DNA Onarım Mekanizmaları Nelerdir?
-
DNA hasarına neden olan etkenler nelerdir?
-
XYY Süper Erkek Sendromu - JACOB’S, Sendromu
-
Bitki doku kültürü çalışmaları ile haploid bitkiler elde edilebilir
-
Gram pozitif bakterilerden genomik DNA izolasyon protokolü
-
E. coli bakterisinden genomik DNA izolasyon protokolü
-
DNA’nın Keşfi
-
İnsan Genom Projesi Nedir ? Amaçları Nelerdir ?
-
Genomik mikrodizilimlerle ikilenme teşhisi yöntemi
-
Gen duplikasyonu ve amplifikasyonu nedir?
-
DNA ile RNA Arasndaki Farklar ve Benzerlikler Nelerdir