RFLP ANALİZ PROTOKOLÜ
RFLP nedir?
Restriksiyon enzimleri kullanılarak DNA’nın farklı büyüklükteki fragmanlara ayrılması RFLP (Restriksiyon Fragment Length Polymorphism) olarak adlandırılır. Bu yöntem polimorfizm çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır.
Restriksiyon enzimleri, DNA üzerinde yaklaşık 5-10 baz uzunluğunda belirli bir nükleotid dizisini tanıyarak bu noktada kesim yapar ve DNA’yı ikiye ayırır. İlki Hamilton tarafından keşfedilen Hind III başta olmak üzere, 200 den fazla farklı bakteri türünden, her biri bakterinin orijinal isminin kısaltması ile anılan çok sayıda restriksiyon enzimi bulunmuştur. Her DNA molekülü farklı kesim noktalarına sahip bölgeleri içerir. Bu DNA bölgeleri aynı restriksiyon enzimi kullanılarak kesildiğinde bireylerin taşıdığı mutasyonlara bağlı olarak değişik miktar ve uzunlukta parçalar elde edilebilmektedir.
RFLP yöntemi hangi aşamalardan oluşmaktadır?
Yöntem temelde dört adımdan meydana gelmektedir; DNA izolasyonu, PCR, elde edilen PCR ürününün restriksiyon enzimleri kullanılarak kesimi ve elektroforez ile kesilen fragmanların ayrımı, görüntülenmesi.
RFLP analizinin daha kolay uygulanır olabilmesi açısından seçilen enzim büyük önem taşımaktadır. Seçilen enzimin kesilmek istenilen DNA’yı birden fazla noktada kesmesi sonucu oluşan çok sayıda ve birbirine yakın büyüklükte ki fragmanlar analizi zorlaştırmaktadır. RFLP tek nokta mutasyon analizlerinde sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Tek nokta mutasyonları ile meydana gelen veya zarar gören enzim kesim noktaları kullanılarak bu bölgelerde oluşan mutasyonları tespit etmek mümkündür. Mutasyon noktasını çevreleyen primerler ile gerçekleştirilen PCR reaksiyonunun ardından tek nokta mutasyon bölgesinden kesen bir enzim seçilerek analiz edilir.
RFLP bileşenleri nelerdir?
PCR çalışmasının ardından gerçekleştirilecek enzim kesimleme işlemi için gerekli olan dört ana madde vardır: PCR ürünü, elde edilen PCR ürününü belirli noktalardan kesen restriksiyon enzimi, enzime ait 10X solüsyon ve BSA (Bovine serum albumin). BSA bazı enzimler ile birlikte kullanıldığı zaman enzim aktivitesini arttırmaktadır.
Toplam hacmin 20 µl olduğu standart bir enzim kesiminde kullanılan ortalama değerler şu şekildedir;
Bileşen Miktar
10X Buffer 2 µl
Enzim* 2u
PCR ürünü 10 µl
BSA (10mg/ml)** 2,5 µl
Ultra Saf Su 20 µl’ye tamamlanacak kadar Ultra Saf Su
* Kullanılacak enzim miktarı, enzime ve çalışmaya göre farklılık göstermektedir. 2 u olarak verilen enzim miktarı ortalama bir değerdir.
** BSA, enzimle birlikte verilmektedir ve 10 mg/ml olarak 100X konsantrasyona sahiptir, çalışma sırasında kullanılması gereken değer yaklaşık olarak 0,1 mg/ml (1X) dir.
Biyokimya
-
Serum Enzimlerini Tayin Yöntemleri
-
Fosfatazlar (Alkali fosfataz= ALP)
-
Transferazlar
-
Transaminazlar
-
Enzimlerin Görev, İşlev ve Özellikleri - Enzimlerin İsimlendirilmesi
-
Kanda Bilirubin
-
Serum Proteinleri
-
Fosfolipidler
-
Trigliseridler
-
Kolesterol Nedir?
-
Kan Lipitleri Nelerdir?
-
Kan Şekeri Nedir?
-
Araşidonik Asit (ARA) Nedir?
-
Lizozim enzimleri
-
Lizozim: İlk Antibiyotik