Periferik Kandan DNA İzolasyonu
FENOL-KLOROFORM KULLANARAK DNA İZOLASYONU
1. Az Miktarda Kan Örneğinden;
• EDTA içeren tüplere alınmış olan kan örneklerinin 500 uL’si 1-5 mL’lik ependorf tüpüne konulur.
• Kan örneklerinin üzerine son hacim 1 mL olacak şekilde TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) tamponu ilave edilir ve daha sonra tüpler 13.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edilir.
• Üstte kalan sıvı kısım atılır ve üzerine yeniden 1 mL olacak şekilde TE tampon ilave edilir ve yeniden santrifüj edilir. Bu yıkama işlemi üç kez tekrarlanır.
• Son yıkama işleminden sonra üst faz uzaklaştırılır ve pellet üzerine 80 µL %10 sodyum dodesil sülfat (SDS), 90 µL 1 M NaCl ve 10 µg/µL proteinaz-K ilave edilir. Son hacim, TE tamponu kullanılarak 500 µL’ye tamamlanır.
• Örnekler 56°C’de 90 dakika inkübe edilir.
• İnkübasyon sonunda tüplerin üzerine tüpün içindeki hacime eşit miktarda fenol-kloroform (250 µL fenol ve 250 µL kloroform) ilave edilir.
• Tüpler 2500 rpm’de 2 dakika santrifüj edilir.
• Üstte kalan DNA içeren tabaka yeni bir tüpe aktarılır ve üzerine DNA’nın çökelmesi için saf etil alkol ilave edilir.
• DNA santrifüj edilerek çöktürüldükten sonra, üzerindeki alkol tamamen uzaklaştırılır ve %70’lik etil alkol ilave edilir.
• Santrifüj edilerek DNA çöktürüldükten sonra alkol uzaklaştırılır ve tamamen kuruması sağlandıktan sonra DNA peletin büyüklüğünegöre 100-500 µL steril distile su içerisinde çözülür.
2. 8-10 mL Kan Örneğinden;
• Her hasta için, 8-10 mL EDTA’lı kan 50mL’lik etiketlenmiş falkon tüpe boşaltılır. 35- 40 mL’ye kadar TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) ilave edilir. 4000 rpm’de 4 dakika santrifüj edilir.
• Falkon tüpte 5 mL kalacak şekilde fazlası çektirilir veya yavaşça dökülür. Üstüne 25 mL TE eklenir ve karıştırılır. 4000 rpm’de 4 dakikasantrifüj edilir.
• Tüpte 5 mL kalacak şekilde fazlası çektirilir ve 15 cc’ye TE ile tamamlanır, karıştırılır. 4000 rpm’de 4 dakika santrifüj edilir.
• Üç yıkamadan sonra, alt taraftaki bulutumsu tabaka ve pelet kalacak şekilde üst kısım atılır. Vortekslenerek peletin çözünmesi sağlanır.
• 1.6 mL %10 SDS 1.8 mL 1M NaCl ilave edilir ve vortekslendiklen sonra üzerine 2.5 mL TE eklenir ve karıştırılır.
• Üzerine 65 mL proteinaz-K (10 mg/mL) ilave edilir.
• En az 2 saat 56°C’de Benmari’de bekletilir her 30 dakikada bir karıştırılır veya hücreler yeterince parçalanıp viskoz sıvı oluşmamışsa bir gece boyu 37°C’de inkübe edilir.
• Üzerine 5 mL tris ile satüre edilmiş fenol eklenir ve karıştırılır. Süt beyazı bir renk oluşur.
• Üzerine 5 mL kloroform eklenir ve karıştırılır. Beş dakika +4°C’de buzdolabına konulur.
• 2500 rpm’de 3 dakika santrifüj edilir.
• Pipet yardımıyla üst fazdan alıp 15 mL’lik falkon tüplere aktarılır. Bu kısım su gibi berrak olmalı, kahverengi (fenol) asla karışmamalıdır.
• Falkona aktarılan DNA’yı içeren fazın üstüne 15 mL’ye kadar %100 soğuk etanol ilave edilir. Alt üst edilerek karıştırılır. DNA sarmalları çıplak gözle bile görülebilir hale gelir.
• 10 dakika -20°C’de bekletildikten sonra 4000 rpm’de 4 dakika santrifüj edilir.
• Üstteki alkol uzaklaştırılır ve dipteki DNA üzerine 5 mL %70’lik soğuk alkol eklenir.
• 4000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.
• Alkol tamamen uzaklaştırılır.
• Tam olarak kuruduktan sonra üzerlerine 0.5-1 cc distile steril su eklenir. DNA çözülene kadar oda ısısında bekletilir.
3. Tuzla Çöktürme Yöntemi
• 8-12 mL eritrosit lizis solüsyonu üzerine 1 mL tam kan ilave edilir ve alt üst edilir.
• 3000-4500 rpm’de 5 dakika çevrilir.
• Süpernatan dökülür ve üzerine 850 μL nüklei lizis eklenir (istenirse 10 μg/mL proteinaz- K konabilir).
• Vortekslenir (20 dakika süresince her 4 dakikada bir vortekslenir) alternatif olarak 10-15 dakika süreyle pipetaj yapılır veya istenirse bir gece 40-60°C’de inkübe edilir.
• 850 μL kloroform eklenir ve vortekslenir.
• 1.5 mL-2.0 mL’lik ependorf tüpe aktarılır.
• 12.000-13.000 rpm’de 3 dakika santrifüj edilir.
• Süpernatan alınır (üst faz) 1 mL %100 etil alkol içine aktarılır.
• Alt üst edilir ve DNA gözle görülür hale getirilir.
• 13.000 rpm’de 3 dakika santrifüj edilir.
• Süpernatan dökülüp %70’lik alkolde yıkanır ve 13.000 rpm de 3 dakika santrifüj edilir.
• Süpernatan dökülür ve tüpler kurutma kağıdına ters çevrilerek kurutulur.
• Üzerine 200-300 μL steril distile su veya 10 mM Tris eklenir.
• Vortekslenir ve oda ısısında veya 37°C’de 1-2 saat inkübe edilir.
• Tekrar vortekslenir.
• Kullanılıncaya kadar -20°C’de muhafaza edilir.
4. Gerekli Solüsyonlar
• Eritrosit lizis solüsyonu (hipotonik solüsyonu)
20 x eritrosit lizis tamponu (3.1 M NH4Cl,0.2 M KHCO3, 20 mM EDTA, pH:7.4)
• Nüklei lizis solüsyonu
Tris EDTA, pH: 8.0 1 mL, NaCl, 5 M 8 mL, EDTA, 0.5 M 0.4 mL, dH2O ile 100 mL’ye tamamlanır.
* Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Allerji ve Astım Ünitesi ANKARA
Dr. E. BİRBEN
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Çocuk Allerji ve Astım Ünitesi, ANKARA.
e-posta: [email protected]
Periferik Kandan DNA İzolasyonu PDF VERİLERİ İNCELEYİN
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar