Klinik mikrobiyolojide kullanılan kültür yöntemlerini ile İn vitro kültür değerlendirmeleri kaç şekilde yapılmaktadır
Mikobakterilerin ikiye bölünmesi için gerekli süre 16-18 saat kadardır ve izole edilmeleri için besiyerlerinin uzun süre inkübe edilmesi gerekir.Zorunlu aerop olan mikobakterilerin bulunduğu ortamda oksijen miktarının azalması,üreme hızlarının da azalmasına neden olur.Uygun sıvı ve katı besiyerlerinde 7-21 gün gibi uzun bir sürede ürerler ve uygun üreme 35-37 °C’de sağlanır.Kültür süreleri ise 6-8 hafta kadardır.
Mikobakterilerin izole edilmeleri ve çeşitli özelliklerinin incelenmesi amacıyla kullanılan konvansiyonel besiyerleri katı ve sıvı olmak üzere iki tiptir.Katı özellikteki besiyerlerini ise yumurta bazlı ve agar bazlı olmak üzere iki bölümde incelemek mümkündür.Tam yumurta yada yumurta sarısı içeren yumurta temelli besiyerleri arasında bugün en yaygın kullanılanı Löwenstein-Jensen (L-J) besiyeridir.
Ancak Petragnani ve American Trudeau Society gibi besiyerleri de tercih edilebilir.Tipik koloni morfolojisi oluşturmaları ve daha bol üremeleri nedeniyle özellikle primer izolasyonda L-J besiyerinin kullanılması önerilir.Yumurta temelli besiyerlerinin opak görünümlü olmasına karşın,agar temelli besiyerleri şeffaftır.Bu nedenle,ekim yapılan besiyerleri 10-12 gün sonra mikroskop altında incelenirse ,oluşan kolonileri görmek mümkündür.Middlebrook 7H10 ve Middlebrook 7H11 en çok tercih edilen agar temelli besiyerleridir.Bunun yanısıra kontaminasyona neden olan mikroorganizmaların üremesini etkin bir şekilde engellemek amacıyla selektif besiyerleri olan,L-J Gruft,Mycobactosel LJ, Mitchison selektif 7H 11 de kullanılabilir.
Primer izolasyonda besiyerlerinden en az birisinin selektif olması önerilir.
Sıvı besiyerleri içinde yer alan Middlebrook 7H9 ve Dubos tween albumin, mikobakterilerin stok suşlarının subkültürlerinin yapılması,duyarlık deneyleri ve diğer in vitro deneylerde inokulum hazırlanması amacıyla kullanılır.Ayrıca bakteri sayısının az olduğu steril bölgelerden alınan klinik örneklerde,bakteriyi çoğaltmak ve dolayısıyla izolasyon şansını artırmak amacıyla da kullanılabilir.Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri ,çoğu hızlı kültür sisteminde temel besiyeri olarak kullanılmaktadır.
Günümüzde birçok laboratuvarda,konvansiyonel besiyerlerinin yanısıra tüberküloz etkeni bakterilerin izolasyon süresinin çok daha kısa ve izolasyon oranının çok daha yüksek olduğu hızlı kültür sistemleri rutin inceleme amacıyla kullanılmaktadır. Çoğunda sıvı
besiyeri kullanılmakla birlikte,bifazik ve katı besiyerlerinin kullanıldığı sistemler de mevcuttur ve bu sistemlerde gaz basıncındaki değişiklikler,CO2 oluşumu ve oksijen kullanımı fluorometrik veya kolorimetrik olarak ölçülür. Primer izolasyonda sıvı besiyerlerine ilave olarak bir de katı besiyeri kullanılması Centers for Disease Control (CDC) tarafından önerilmiştir ve bu kombinasyonla mikobakterilerin izolasyon şansının arttığı bilinmektedir.
Hızlı kültür sistemleri içinde yer alan yarı otomatize Bactec 460 TB (Becton Dickinson Diagnostic Instruments, Sparks,MD) sistemi, izolasyon, idantifikasyon ve duyarlılık deneylerinin uygulandığı bir sistem olarak uzun yıllardır başarı ile kullanılmaktadır.Sistemde izolasyonun yanısıra, Mycobacterium tuberculosis (M.tb.) kompleksi ile tüberküloz dışı mikobakterilerin (MOTT) ayrımı yapılabilmekte ve M.tb. kompleksi suşlarının primer antitüberküloz ilaçlara duyarlığı denenmektedir.Bactec 12B (Middlebrook 7H12) ve Bactec 13A (Middlebrook 7H13) olmak üzere iki tip besiyeri içeren bu sistem;besiyerlerinde bulunan C14 işaretli palmitik asitin
kullanılması ve metabolizma sonucu oluşan 14 CO2 nin 0-999 sayısal değerleri arasında üreme indeksi(GI) olarak ölçülmesi prensibi ile çalışmaktadır.Ekim işleminden önce besiyerlerine polimiksin B,azlosilin, nalidiksik asit, trimetoprim ve amfoterisin B (PANTA) içeren antibiyotik karışımı ilave edilmelidir.Başarı ile kullanılmakla beraber,sistemde yeralan besiyerlerinin radyoaktif madde içermesi ve cihazdayapılan rutin kontroller sırasında meydana gelen çapraz kontaminasyon sorun oluşturmaktadır.
Günümüzde alternatif izolasyon sistemlerinin geliştirilmesi için çalışmalar devam etmektedir.Myco-ESP(Extra Sensing Power)ΙΙ, (Trek Diagnostics,Inc. ,Westlake ,Ohio), MB/Bact T (Organon Teknika, Durham, NC) , Bactec 9000 MB (BD Biosciences,Sparks,MD) ve Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) 960 (BD Biosciences,Sparks,MD)
mikobakterilerin tanısı için geliştirilmiş tam otomatize sistemlerdir.Sistemler arasında
izolasyon oranı açısından önemli bir fark olmamakla birlikte,konvansiyonel katı
besiyerlerine göre daha yüksek;Bactec 460 TB sistemine göre daha düşük oranda
izolasyon sağladıkları bildirilmektedir.Mikobakterileri üretme süreleri açısından sistemler karşılaştırıldığında ,Bactec 460 TB sisteminin, ESP ΙΙ ve MB/BacT
sistemlerine oranla daha avantajlı olduğu belirlenmiştir.Birçok çalışmada tam
otomatize sistemlerde üretme süresi ortalama ≤ 14 gün olarak saptanmış ve en
yüksek izolasyon oranının Bactec 460 TB ve katı besiyeri kombinasyonu ile
sağlandığı bildirilmiştir.Kontaminasyon oranları açısından tam otomatize sistemler
birbiri ile karşılaştırıldığında önemli bir fark bulunamamıştır ancak bu sistemlerde
oran, Bactec 460 TB ve katı besiyerlerine göre daha yüksektir.
Myco-ESP ΙΙ, selüloz sünger ve Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri içeren bir sistemdir.
Sistemde mikroorganizmaların üremesi sonucu oluşan gaz basıncındaki değişiklikler
ölçülerek değerlendirme yapılır. Bilgisayar destekli bir sistemdir ve besiyerinde oluşan
gaz basıncındaki değişiklik grafiksel olarak bilgisayarda görüntülenir. Besiyerlerine ekim yapılmadan önce, mikobakterilerin üremesini destekleyen oleik asit-albumin-dekstrozkatalaz (OADC) ve kontaminasyonu engellemek amacıyla antibiyotik karışımı ilave
edilir. Sistem tüm klinik örnekler için uygundur.
MB/Bac T, besiyerinin dip kısmında kolorimetrik bir sensor içeren ve oluşan CO2
düzeyini ölçerek üremeyi değerlendiren bir sistemdir. Bilgisayar desteği bulunan sistemde besiyerleri sürekli kontrol altındadır. Steril örnekler ekilmeden önce besiyerlerine reconstitution sıvısı ilave edilirken; steril olmayan örneklerin ekiminden önce antibiyotik karışımı ilave etmek gereklidir. Sistem kan
dışındaki tüm örnekler için uygundur.
Bactec 9000 MB, besiyerlerindeki oksijen kullanımının fluoresans ile belirlendiği bir
sistemdir. Modifiye Middlebrook 7H9 sıvı besiyerlerine ekimden önce PANTA ilave edilir. Sistemde balgam ve diğer solunum yolu örnekleri için Myco/F sputa, kan ve diğer steril
vücut bölgelerinden alınan örnekler için MycoF/lytic besiyeri kullanılır.
Bactec MGIT 960 sisteminde kullanılan tüplerde, Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri ve dip
kısımlarında oksijene duyarlı rutenyum metal kompleksi içeren silikon bulunur. Klinik
örnekler ekilmeden önce besiyerlerine OADC ve PANTA ilave edilir. Kullanılan
besiyerlerinde herhangi bir üreme olmadığında oksijen varlığına bağlı olarak
silokon tabakaya gönderilen UV ışınına karşı fluoresans oluşmazken; mikobakteri
veya diğer mikroorganizmalar ürediğinde oksijenin kullanılması sonucunda UV
ışınına karşı fluoresans oluşmakta ve oluşan fluoresans miktarı üreme indeksi
olarak değerlendirilmektedir. Tam otomatize bir sistem olmakla birlikte, UV
ışığı altında makroskobik olarak da değerlendirme yapılabildiğinden manuel
olarak kullanılmaya da uygundur. Kan dışındaki diğer tüm klinik örnekler için
kullanılabilmektedir.
Fazla sayıda örneği aynı anda kontrol edebilen Bactec MGIT 960 ( 960 örnek),
Bactec 9000 MB (240 örnek) , MB/BacT (240 örnek) ve ESP ΙΙ (128/256/384 örnek
inceleyen üç farklı cihaz) genellikle yüksek kapasite ile çalışan laboratuvarlarda tercih edilmekle birlikte;daha düşük kapasite ile çalışan laboratuvarlar için Septi-Chec AFB (BD Biosciences, Sparks, MD), MGIT (BD Biosciences, Sparks, MD) ve MB Redox
(Biotest Diagnostics Corp., Danville, NJ)gibi manuel sistemler önerilmektedir.
Septi-Check AFB, sıvı (Middlebrook 7H9) ve üç tip katı (L-J, Middlebrook 7H11,
çukulatamsı agar) besiyerinin kullanıldığı bifazik bir kültür sistemidir. Çukulatamsı
agar kontaminasyonu belirlemek amacıyla kullanılır. Kültür işleminden önce besiyerine
glukoz, gliserin, oleik asit, pridoksal HCI, katalaz, albumin, azlosilin, nalidiksik asit, trimetoprim, polimiksin B ve amfoterisin B içeren supleman ilave edilir. Klinik örneklerin ekiminden sonra besiyerleri ilk 24 saat ters olarak bekletilir ve süre sonunda dik konuma getirilir. Kültür süresince besiyerleri ara sıra hafifçe çalkalanarak sıvı besiyerinin katı besiyerlerine teması sağlanmalıdır. Sistem
kan dışındaki tüm klinik örnekler için uygundur.
Cihaz gerektirmeyen MB Redox sisteminde mikobakterilerin izolasyonu amacıyla
antibiyotik karışımı ve renksiz tetrazolium tuzu içeren modifiye Kirchner besiyeri kullanılır.
Tetrazolium tuzu mikobakterilerin redoks sistemi sayesinde, hücre yüzeyinde granüler
formda biriken pembe, kırmızı ve menekşe renginde formazona indirgenir ve üreme
sonucu oluşan mikrokoloniler renkli partiküller şeklinde makroskobik olarak görülebilir.
Drancourt ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, M.tuberculosis’in primer
izolasyonunda %5 koyun kanlı agar kullanılabileceği de bildirilmiştir.
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar