İlk plazmid nasıl oluşmuştur
*Plazmidler, çoğu bakteri türünde bulunan,ancak her suşta bulunmayan halkasal veya süper sarmallı DNA molekülleridir.
*Plazmitler, küçük moleküllerdir; bu açıdan bir karşılaştırma yapılırsa, bakteriyel kromozomun %20’si ile %4′ü arasında büyüklüklerde olduğu görülür.
*Plazmidler, bazı üreme koşullarında konakçı hücre için mutlaka taşınması gereken yapılar değildir. Bununla birlikte, pek çok plazmid, özel koşullara uyum sağlamak için önemli olan genler içerir. Bu genler,çoğu kez bakterinin plazmiti taşıdığına dair temel işaret olurlar. Örneğin R plazmid taşıyıp, çeşitli antibiyotiklere dirençli olan bakteriler, aynı plazmiti taşımayan bakterilerin yaşayamadığı antibiyotikli ortamlarda yaşayarak diğerlerinden ayrılırlar .
*Bir çok bakteride plazmid, hücreler arası gen transferinin özel bir tipinden sorumludur. Plazmidlerin bu özellikleri, 1950′lerde ilginç bir çalışma konusu olmalarına sebep olmuştur. Plazmidler, normalde konakçının replikasyon sistemini büyük ölçüde kullanmaları sebebiyle bakteriyel DNA replikasyonunun anlaşılması için iyi modeller olmuşlardır. Ayrıca, mikrobiyal genetikte kısmi diploidlerin yapılmasına yönelik çalışmalarda kullanıldıkları için önemlidirler.
***Başka bir önemleri de, genetik mühendisliğinde klonlama vektörü olarak kullanılmalarıdır.
Plazmit Tipleri
Farklı tiplerdeki plamitlerle ilgili genel bilgi
Plazmitlerin Saptanması
Bir bakteri suşunun plazmit taşıyıp taşımadığının, taşıyorsa bu plazmitin ne gibi özelliklerinin olduğunun bakteri genetiği yöntemleri ile belirlenmesi.
Plazmitlerin Saflaştırılması
Plazmit DNA’nın saflaştırılması: Moleküler biyolojide temel ve vazgeçilmez tekniklerden biri, Alkali lizis yöntemi.
Plazmit Transferi
Bakterilerde gen aktarımı.
Plazmitlerin Replikasyonu
Plazmit DNA nasıl çoğalır, yavru hücrelere nasıl dağılır?
Önemli Plazmitler
Önemli plazmit tipleri hakkında daha ayrıntılı bilgi.
F, R, Col; ek olarak Ti ve Degredasyon Plazmitleri
Kaynakça
PLAZMİD TİPLERİ
Çetitli E.coli suşlarında bir çok plazmit tipine rastlanmıştır. Ancak en çok bilinenleri, F, R ve Col plazmidleridir. Bu plazmidler, bazı özellikleri paylaşsalar da, önemli farklılıklara sahiptirler. Bir bakteride F, R ya da Col plazmidinin bulunup bulunmaması aşağıdaki özelliklerden yararlanılarak anlaşılabilir:
1. F ; Fertilite veya Seks Plazmidleri:
Bu plazmidler, konakçılarına, kromozomal genlerini F plazmidinden yoksun hücrelere aktarma yeteneği kazandırırlar. F plazmidi, bu gibi durumlarda kendisini de alıcı hücreye transfer edebilir.
2. R ; Direnç Plazmidleri:
R plazmidleri, konakçıyı bir veya daha fazla antibiyotiğe karşı dirençli kılar. Bu tip plazmidler, transfer edilerek başka hücrelerin de direnç kazanmasına yol açabilirler.
3. Col; Kolisinojenik Plazmidler:
Col plazmidleri, “kolisin” adını alan bir grup proteinin sentezinden sorumlu genleri içerirler.Kolisinler,yakın suşlardan aynı tip Col plazmitini taşımayan bakterileri öldürme özelliğindedirler. Öldürme mekanizmasi, Col plazmidinin tipine göre değişiklik gösterir.
Bu plazmit tipleri hakkında daha ayrıntılı bilgi, Önemli Plazmitler bağlantısında bulunabilir.
Sonraki Konu: Plazmitlerin Saptanması
PLAZMİDLERİN SAPTANMASI
Plazmidler,hem genetik,hem de fiziksel yöntemler kullanılarak saptanabilirler.İlk olarak F plazmidi keşfedilmiştir. Met-Bio-Thr+Leu+ fenotipineki bir E.coli sutu (A),Met+Bio+Thr-Leu- fenotipindeki diğer bir suşla karıştırılarak minimal agara ekim yapıldığında minimal agarda yaklaşık 10-7 frekansında koloniler teşekkül etmiştir. Bu koloniler, Met+Bio+Thr+Leu+ fenotipinde; dolayısıyle, rekombinant kolonilerdi. Karıştırma işleminden önce A suşu streptomisinle muamele edilince,rekombinant koloniler yine oluşmuş; ancak ,B suşuna streptomisin uygulanınca koloni gözlenmemiştir. Bu deney, rekombinantların B suşundan türediğini olayın tek yönlü bir genetik bilgi akterımı olduğunu göstermiştir. Başka bir deneyde B’ye genetik bilgi aktaramayan bir suş, “C” suşu, A ile karıştırılıp uzun süre bir arada üretilmiş ve daha sonra karışımdan izole edilen C kolonilerinin B’ye gen aktarımı yaptığı gözlenmiştir.Bu deney sonuçlarından anlaşılmıştır ki, A suşu, B’ye gen transferini sağlayan bir fertilite elementine; “F” faktörüne sahiptir, C suşunda da F faktörü bulunmamaktadır; A ve C suşlarının bir arada üretilmeleri halinde F faktörü, A suşundan C suşuna transfer edilmekte, buna bağlı olarak da, genetik markırları B suşuna aktarabilen yeni bir C suşu ortaya çıkmaktadır. Başlangıç çaprazlaması:
F+Met-Bio-Thr+Leu+ X F-Met+Bio+Thr-Leu-
şeklindeydi. Transfer tek yönlü olduğu için F faktörü taşıyan hücreye donör (erkek), taşımayan hücreye ise resipient (dişi) adı verilmiştir.
F’ adını alan F varyantlerı, plazmid üzerinde kromozomal genler de taşırlar.Bu konudaki ayrıntılı çalışmalardan biri, lac operonu ile ilgilidir ve kısmi diploidlerin elde edilmesimde kullanılmıştır. Bu deneyde, F’ lac bakteriler tasarlanmıştır. F’ ın transferi, bir antibiyotik içeren minimal laktoz katı kültür ortamına duyarlı donör ve dirençli resipient hücrelerin ekilmesiyle kolayca anlaşılabilir. çapraz tekli:
F’ lac+ / lac- Strs X lac- Strr
Plazmid üzerinde lac+ markırı taşıyan donör hücrelerle kromozomda lac- markırı taşıyan resipient hücreler karıştırılıp streptomisinli minimal laktoz agara ekilince rekombinant koloniler oluşmuştur (F’ lac+ / lac- Strr rekombinantları). Yalnızca donörün ekildiği kontrolde hücreler streptomisine duyarlı oldukları için; yalnız resipientin ekildiği kontrollerde ise hücreler laktozu kullanamadıkları için koloni oluşmamıştır. Burada, streptomisin markırının donör üremesini engelleyici özelliği önemlidir ve böyle markırlara “counterselection” ya da “counterselective” markırlar denir. Counterselective amaçlı olarak antibiyotik resistansı sıklıkla kullanılsa da diğer fenotipler de iyi sonuç verir. Örneğin, F’ transferi,
F’ lac+ / met- X lac- met+
çaprazları minimal laktoz katı besiyerine ekilerek kontrol edilebilirler. Donörler, ortamda methionin olmadığı için (methionin eksiklği, counterselectiondur); resipientlerse laktozu karbon kaynağı olarak kullanamadıkları için üreyemezler. Yalnızca, F’ transferi yapan rekombinantlar üreyebilir. Bu durumda seçilmiş markır, lac+ ‘tir.
F içeren A ve B suşları arasındaki çaprazlama ve F’ suşlarıyla yapılan deneyler arasında,önemli sayısal farklılıklar gözlenmiştir. Suşlar,ekilmeden önce yarım saat karıştırılırsa A X B deneyinde rekombinantların donör hücreye oranı 10-7; F’ deneyinde ise % 50′dir.Farklılığın sebebi, genetik markırın F’ bakterilerde plazmit üzerinde olmasından kaynaklanır. A X B deneyinde resipientlerin yarısı F faktörünü alsalar da çok az bir kısmı kromozomdaki markırları alabilmiştir.
Plazmid Nasıl Transfer Edilir ?
F’ lac+ / lac- Strs tsxr X F’ lac- Strr tsxs
Eşletmesi gerçeklettirilmit, tsxr taşıyanlara Faj T6′nın absorbe olamadığı gözlenmiştir.Eşleşmeden bir süre sonra, bakteri karışımının bir kısmı streptomisinli laktoz kolorindikatör katı besiyerine ekilmiş ve kolonilerin %90′ından çoğunun lac+ olduğu gözlenmiştir.Bu da, donörlerin büyük kısmının F’ lac+ transferi yaptığını gösterir. F’ lac+ i trensfer eden bakterilerin hala plazmidin bir kopyasını taşıyıp taşımadığını belirlemek için, eşleşme karışımının bir kısmı T6 fajı ile muamele edilmiştir. tsxs bireyler,resipientler gibi viruslar tarafından lizise uğratılmıştır. tsxr donörü olup hayatta kalan hücreler, laktoz indikatör besiyerine ekilince, lac+ koloniler oluşmoştur. Sonuçta, donör hücrenin transferden sonra da plazmidin kopyasını taşıdığı; yani,transferin DNA replikasyonu ile birlikte geçekleştiği görülmüştür.
Basit bir fenotip göstermeyen plazmitlerin varlığı ise, başka bir yöntemle saptanır. Hücre kültüründen DNA izole edilerek agaroz jel elektroforezi ile analiz edilir. Bakteri kromozomu büyük olduğu için jele giremez. Oysa plazmid, jelde yürüyecek kadar küçüktür. Eğer plazmid varsa, molekkül ağırlığına göre belirli sınırlar içinde band verir. Band, jelin EtBr ile boyanması durumunda UV ışığında görülür. Plazmid DNA büyüklüğü, molekül ağırlığı bilinen ve aynı jelde yürütülen DNA fragmentleriyle karşılaştırılarak hesaplanabilir.
Sonraki Konu: Plazmit DNA’nın Saflaştırılması
PLAZMİD DNA’nın SAFLAŞTIRILMASI
Plazmid izolasyonu için, bakteriler,deterjan uygulamasıyla parçalanır. Elde edilen solüsyon (hücre lizatı), santrifüj edilir. Protein ve RNA ile kompleks yapmış olarak bulunan bakteri kromozomal DNA’sı, büyük olduğu için, santrifüj tüpünün altındaki tabakada yer alır. Daha küçük olan plazmid DNA ise,temiz süpernatanda (temiz lizat) kalır.
Plazmitlerin izolasyonu için kullanılan yöntemler, mini prep ve large scale olmak üzere iki şekilde uygulanır. En çok kullanılanlar, alkali lizis ve boiling lizis yöntemleridir.
PLAZMİT DNA İZOLASYONU
(ALKALİ LİZİS YÖNTEMİ)
1.Gecelik kültürden bir miktar alınarak 6000rpm.de 5 dakika santrifüj edilir.
2.Süpernatan atılararak çökeltiye 100 ml.G.T.E.eklenir.(1.çözelti)
1.Çözelti (GTE.):
50 mM
Glukoz
25 mM.
Tris Cl (pH
10 mM.
EDTA (pH
3.Tüpe 200 ml.2. çözelti eklenir.
2. Çözelti:
0.2 N NaOH
%1 SDS
(2. Çözeltinin taze hazırlanması gerekmektedir.Hazırlandıktan sonra buzda bekletilir.)
0.91 ml.
dH2O
0.05 ml.
NaOH (5 M stoktan)
0.04 ml.
SDS (%20lik stoktan)
4.Tüpe 150 ml.3. çözelti eklenerek 5 dakika buzda bekletilir.
3.Çözelti:
5M (molar) Potasyum asetat
Glecial asetik asit
dH2O
5. Tüpler,12000 rpmde 5 dakika santrifüj edilerek supernatan yeni tüpe alınır.400 ml.fenol ve 400 ml.kloroform eklenerek 12000 rpm’de 2 dakika sanntrifüj edilir.
Üst faz yeni bir tüpe alınarak 2 hacim etanol eklenip düşük hızda vortekslenerek 2 dakika oda sıcaklığında bekletilir.
6.12000 rpm’de 5 dakika santrifüj uygulanır,süpernatan atılarak çökeltiye 1 ml. %70′liketanol eklenir.
7.12000 rpm’de 2 dakika santrifüj edilir.
8.Süpernatan atılarak çökelti vakum altında kurutuldu.Kuruduktan sonra distile suda çözülür.
Sonraki Konu: Plazmit DNA’nın Transferi
PLAZMİD DNA’nın TRANSFERİ
Donör ve resipient Hücreler arasındaki rekombinasyona ilişkin ilk bulgulardan biri, rekombinasyon için hücreler arasındaki bir bağlantının gerekliliğidir. Bu durum,F+ ve F- hücre kültürlerinin porlu filtre ile ayrıldığı deneyde gösterilmiştir. Bu durumda, hücre hücreye bağlantı engellenerek rekombinant oluşumunun engellendiği görülmüş ve olay için bakteriyel konjugasyon ya da çiftleşme terimi kullanılmaya başlanmıştır.
Bir dizi deneyle, plazmid transferinin dört adımda gerçekleştiği gösterilmiştir. Bu adımlar:
1.Özel donör-resipient etletmesi (efektif kontakt)
2. DNA transferi için hazırlık (mobilizasyon)
3.DNA transferi
4.Replike olabilen fonksiyonel plazmidin resipient içinde tekillenmesi.
F ya da F’ içeren hücreler,bir resipientle kontakt kurdukları zaman bu dört adım gerçekleşir. Bazı plazmit tipleri, bu işlemlerin tamamını gerçeklştirmek için genetik olarak yeterli değildirler. Plazmidler, bu özelliklerine göre dört gruba ayrılırlar:
· 1. Nontransmissible Plazmitler:Efektif kontakt ve DNA transferi için gerekli olan genleri içermezler.
2. Konjugatif plazmidler: Efektif kontakt itleminin gerçeklettirilmesi için gerekli genleri içerirler.
3. Mobilisable Plazmidler: Plazmid DNA’ sını transfer için hazırlayan genleri taşır.
4. Self Transmissible Plazmidler: Hem konjugatif, hem de mobilize özellik taşırlar (F plazmitler gibi).
Konjugatif fonksiyonlar, çoğu kez, plazmide özel değildir ve bundan dolayı, bir plazmid, ikinci bir plazmidin transferine yardımcı olabilir. Örneğin, bir tek hücre, hem F plazmid, hem de Col E1 plazmid taşıyabilir. F plazmid, hem konjugatif hem de mobilisable’dir. Oysa Col E1, mobilisabledir, fakat konjugatif değildir. Bu nedenle,sadece Col E1 plazmidi taşıyan bir hücre, plazmid transferi yapamaz. Her iki plazmidi içeren bir hücrede, F plazmidi,Col E1′de olmayan konjugatif fonksiyonu sağlayabilir, böylece Col E1 plazmiti, her iki plazmitten de yoksun olan bir hücreye aktarılabilir. Bu şekilde nonkonjugatif bir plazmidin, bir konjugatif plazmit sayesinde kurulan efektif kontakt yoluyla transfer edilmesine “donation” denir. Mobilizasyon fonksiyonları ise, genellikle plazmite özeldir; yani, bir self-transmissable plazmid, nonmobilisable bir plazmiti transfer etme yeteneğine sahip değildir. Bununla birlikte, bazı örneklerde, frekans düşük de olsa transfer gerçekleşebilir. Transferin olması için, iki plazmid arasında rekombinasyon yapılarak transfer edilebilir tek bir DNA molekülünün oluşturulması gerekir.Sonuçta, ortaya nonmobilisable plazmidin tamamını taşıyan bir selftransmissible plazmit çıkar. Bu işleme,”kondüksiyon” adı verilir.
F aracılığı ile transfer edilen kromozom, kondüksiyonla mobilize edilir. F’teki dizilerle kromozom arasında bir genetik rekombinasyon meydana gelir ve f faktörü, kromozom boyunca resipient hücreye geçer.
EFEKTİF KONTAKT ve PİLİ
Efektif kontakt için ilk adım, donör ve resipient hücrelerin çift oluşturmasıdır. Çift oluşumu için, donör üzerinde seks pilus adı verilen kıl benzeri bir protein ilaveye ihtiyaç vardır. F içeren ve R içeren hücrelerde, F piluslar ve R piluslar bulunur.
F pilus, izole edilmit ve pilin adı verilen tek bir hidrofobik proteinden oluştuğu saptanmıştır. F piliye bağlanan bazı fajlar bulunmaktadır (male spesific fajlar). Bu fajlar iki tiptir.Bir kısmı pilusun ucuna, bir kısmı da dibine bağlanır. Uca bağlananlar, eşleşmeye engel olurken; dibe bağlananlar olmaz.Eşleşme sistemlerinin tümü piliye bağımlı değildir. Örneğin, Streptococcus fecalis, bir selftransmissible plazmit taşır. Plazmitsiz resipientler, dişi böceklerdeki feromona benzer şekilde bir eşleşme proteini üretirler. Bu protein,plazmit içeren (donör) hücrelerde yapılmaz. Feromon, donör hücrede adhesin denilen bir proteinin sentezlenmesine sebep olur.Adhesin, donör hücreyi çevreleyerek donör-reipient çiftinin oluşmasını sağlar. Plazmid transferi tamamlandıktan sonra feromon sentezi durur.
MOBİLİZASYON ve TRANSFER
Mobilizasyon, plazmitte kodlanıp muhtemelen rilaksasyon kompleksinde nik oluşturan proteinin özel baz dizisine sahip transfer orijininde (oriT) bir tek zincir (single strand) kırık oluşturmasıyla başlar. nik, dönen halka (rolling circle) replikasyonunu başlatır ve dönen halkanın lineer kolu transfer ediliri. Nik oluşturan protein, 5′ ucuna bağlı kalır ve replikasyon şekli, FX 174 fajının rolling circle mekanizmasına benzer.
Burada önemli bir özellik, DNA sentezinin hem donör, hem de resipient hücrede gerçekletmesidir. Donördeki sentez, donör konjugal DNA sentezi adını alır ve transfer edilen tek zincirin yerini doldurur. Resipient hücredeki sentez ise (resipient konjugal DNA sentezi), alınan tek zinciri çift zincire çevirir.
Genellikle, transfer edilen zincirin donör konjugal sentezle yer değiştirmesi ve resipient hücrede çift zincir DNA’ya çevrilmesi eş zamanlıdır.
F PLAZMİDİNİN tra GENLERİ
Genetik madde transferi, fin genlerinin kontrolündedir. Temel transfer (tra) fonksiyonları, bir operonda kodlanmaktadır. tra genlerinin çoğu,pili sentezinde görevlidir. Örneğin. tra A geni, pilin proteinini kodlar ve tra B,C,D,E,F,G,H,K,L,Q,U,V,W genleri ise, fonksiyonel bir pilusun oluşması için gereklidir. Diğer genler, eşleşme, transferin başlaması, transferin gerçekleşmesi, oriT’de nik oluşturulması, normal replikasyon orijini oriV’den DNA replikasyonu, iki f+ hücrenin eşleşmesinin engellenmesi (surface exclusion) ve plazmit uyuşmazlığında gereklidir.
TRANSFERDE KONAKÇI KISITLAMASI
Bazı durumlarda transfer edilen plazmit,konakçının restriksyon endonükleaz enzimleri tarafından parçalanır. Bu gibi durumları engellemek için, transfer edilen DNA, çift zincire çevrildikten sonra metillenmelidir. Bir zincirden metillenen DNA, restriksiyon endonükleaz enzimlerinden etkilenmez.
Sonraki Konu: Plazmit Replikasyonu
PLAZMİD REPLİKASYONU
Bir plazmid, ancak konakçı hücre içinde replike olabilir. Plazmid, hangi tipte olursa olsun,replikasyonun doğru şekilde gerçekleşmesi için “replikasyon orijini ” adını alan belirli dizilere sahip olması gerekir.
Plazmitler, replike olabilmek için, konakçının replikasyon proteinlerine gereksinim duyarlar. DNA polimeraz III, E.coli kromozomal DNA’sı için ana replikasyon proteinidir. Ancak, bazı plazmitler, onun yerine DNA polimeraz I’i kullanırlar. Örneğin, pol A mutantlarında, Pol-I düzeyinin düşüklüğünden F plazmitinin replikasyonu etkilenmezken Col E1 plazmiti, replike olamaz. Bunun sebebi, F plazmiti replikasyonunda pol-III; Col E1 replikasyonunda ise pol-I’in kullanılmasıdır. Bazı plazmitler, yalnızca konakçı genlerinin ürünlerini kullanırlar. Col E1 DNA saflaştırıldıktan sonra Col E1 yada diğer bir plazmid taşıyan hücrelerden elde edilen ekstrakta eklenirse replike olabilir. Diğer plazmidlerse, plazmitte kodlanan gen ürünlerine ihtiyaç duyarlar. Tüm plazmitlerin replikasyonu, semikonservatiftir. Farklı plazmitlerin replikasyon modelleri arasında önemli farklar vardır.Bazıları tek yönlü (unidirectional); bazıları çift yönlü (bidirectional) replike olurlar. RK 6 plazmidi, önce bir yönde, sonra da aynı orijinden ters yönde replike olur. Çift yönlü replike olan plazmidlerde, replikasyon iki şekilde sonlanır. Birinci tipte, terminasyon, büyümekte olan çatallar çakıştığı zaman olur. Diğerlerinde ise sabit bir terminasyon bölgesi vardır. Replikasyon halkası tamamlandığı zaman, halkalardan biri, yeni sentezlenen DNA’ların ayrılması için kırılır. Replikasyon sonucunda, bir nik açılmış molekül, bir de süper koil molekül meydana gelir.
KOPYA SAYISININ KONTROLÜ
Bir plazmid, hangi tipte olursa olsun, replikasyonun başlangıcını,dolayısıyle hücre içindeki sayısını kontrol eden genlere sahiptir. Plazmidler,hücre içindeki sayılarına göre, stringent yani düşük kopya sayılı (hücrede 1-2 kopya) veya relaxed yani, yüksek kopya sayılı (10- 100 kopya) plazmidler olarak iki gruba ayrılırlar.
Plazmidler, replikasyonun başlangıcını negatif kontrol eden bir repressör kodlarlar. Bu, kopya sayını denetleyen bir mekanizmadır. Repressörün aktivitesi, konsantrasyonuna bağlıdır. Hücre gelişirke hacim artar, repressör konsantrasyonu düşer ve replikasyonu inhibe edemez. Bu nedenle plazmid sayısı, repressör gen sayısı ve buna bağlı olarak da repressör protein konsantrasyonu iki katına çıkar. Konsantrasyon belirli düzeye erişinde, replikasyon engellenir. Benzer olaylar zinciri, yüksek kopya sayılı plazmidlerin hücrede tek bulunması halinde de cereyan eder ve repressör konsantrasyonu replikasyonu inhibe edecek seviyeye çıkana dek plazmid, çoğalmaya devam eder. Plazmidlerin farklı kopya sayılarında bulunmalarını açıklamak üzere ileri sürülen bir modele göre, yüksek kopya sayılı plazmitlerin represyonu için gereken repressör konsantrasyonu, düşük kopya sayılıların repressör konsantrasyonuna göre daha yüksektir.
PLAZMİD AMPLİFİKASYONU
Plazmid içeren bir bakteri kültürüne, kloramfenikol gibi protein sentez inhibitörleri eklenecek olursa, kromozomal DNA replikasyonu inhibe edilir, ancak plazmit DNA, hücredeki sayısı bin, hatta daha fazla oluncaya kadar replike olmaya devam eder. Kromozomal DNA replikasyonun durma sebebi, bu reaksiyonların başlaması için protein sentezine gerek olmasıdır. Eğer plazmit, bakteriyel ya da plazmitte kodlanan dayanıklı proteinleri kullanıyorsa replike olmaya devam edebilir. Bunun yanında, konsantrasyona bağlı etki gösteren regülatör proteinlerin sayıları artamayacağı için plazmit replikasyonu baskılanamayacaktır.
Plazmit amplifikasyonundan,genetik mühendisliğinde yararlanılır; kullanılacak plazmid, saflaştırılmadan önce bu yöntemle sayısı arttırılabilir.
İNKOMATİBLİTE
Birbirine yakın, ilişkili plazmidler, aynı hücre içinde stabil kalamazlar. Böyle plazmidlere “incompetable” denir.Plazmid replikasyonunun başlangıcında işlevi olan repressör modeli de bu durumu açıklar.
İki plazmid taşıyan bir hücre düşünelim. Bu plazmidler, farklı repressörlere sahip olan F ve Col E1 plazmidleri olsun. Repressörler farklı olduğu için,bir plazmidin repressörü, diğerini regüle edemez ve plazmidler birbirinden bağımsız olarak replike olurlar. Bu durumda,F ve Col E1 plazmidleri uyumludur (competable); başka bir deyişle, farklı inkompatiblite gruplarına aittirler.
Çetitli Enterobacteria’lar, bir çok plazmidi aralarında transfer edebilirler.Bu plazmidler, 25 inkompatiblite grubunda sınıflandırılırlar.Plazmidler, oluşturdukları pilus tipine göre de sınıflandırılırlar.
AKRİDİNLERLE REPLİKASYONUN İNHİBE EDİLMESİ
Çeşitli ajanlar, DNA’daki bazların aralarına girerler. Özellikle akridinler, kromozomal DNA’yı etkilemeden plazmid replikasyonuna engel olurlar. Bu inhibisyonla hücrenin plazmidi kaybetmesi sağlanabilir (acridin curing). Üreme ortamındaki akridin konsantrasyonu çok yüksek olursa kromozomal; düşük olursa plazmid DNA’nın replikasyonu durur.
HÜCRE BÖLÜNMESİNDE PLAZMİDLERİN PAYLAŞILMASI
Bir dizi deney,düşük kopya sayılı plazmidlerin bölünme sırasında kardeş hücrelere dağılmasının kontrol altında olduğunu göstermiştir. Şöyle ki, bölünmeye hazır bir hücre, plazmid DNA molekülünün iki kopyasını taşır ve yeni oluşan hücrelere bu kopyalardan biri gider (F plazmitte olduğu gibi). Eğer böyle bir kontrol olmasaydı, yeni hücrelerden bazıları plazmit taşımazdı.
Plazmitsiz hücre sayısının artışını engellemek için, düşük kopya sayılı plazmidlerde bulunan paylaşım fonksiyonu, yüksek kopya sayılı plazmidler için gerekli değildir.
Sonraki Konu: Önemli Plazmitler
ÖNEMLİ BAKTERİYEL PLAZMİTLER ve ÖZELLİKLERİ
F PLAZMİDLER
F plazmidlerin en büyük özellikleri, bakteri kromozomuna entegre olabilmeleridir. Bu integrasyon sonucunda, Hfr hücreler oluşur. İntegrasyon, l fajının bir bakteride lizojenize olmasına benzer; ancak, F’in E.coli kromozomuna integrasyonu, l DNA’nın integrasyonundan farklıdır. F, kromozomal DNA’da bir çok bölgeye bağlanabilir. Kromozom üzerinde yirmiden fazla mamajör ve yaklaşık yüz minür bölge bilinmektedir. F’in her bir bölgeye affinitesi aynı değildir.
F’in kromozomdan ayrılması, nadir de olsa gerçekleşir. Ayrılma frekansı, bazı lokalizasyonlarda, diğerlerine göre yüksektir. Çoğu kez, F’in ayrılması hatasız olmaz. Böyle durumlarda, iki kesimden biri entegre olmuş F’in içinde; ikincisi ise kromozomal DNA’nın F’e bitişik parçasında olur. Bu tip ayrılmalar, F’ plazmidlerin orijinini oluşturur.
F faktörünün DNA replikasyonunda defekti olan mutant bakteri kromozomuna entegre olması, integratif süpresyon adı verilenolayda artışa sebep olur. F faktörü,replike olmak için E.coli’nin çeşitli replikasyon proteinlerini kullansa da, kromozomal DNA replikasyonunun başlamasını sağlayan dnaA geninin ürününe ihtiyacı yoktur.Yani, F faktörü,dnaA (Ts) mutantında serbest bir protein olarak bulunuyorsa, sıcaklık 42oC’ye yükseltildiği zaman (yükseltmenin amacı,mutant DnaA proteinini inaktive etmektir) kromozomal replikasyonun gerçekleşmesi, pek olası değildir; ancak, F plazmid, hala replike olabilir. F faktörü, dnaA (Ts) mutant suşta kromozoma entegre olmuşsa (hücre Hfr ise) Kromozomal replikasyon,yüksek sıcaklıkta da olur. Böyle bir durumda replikasyon, E.coli replikasyon orijininden değil, F faktörünün oriV bölgesinden başlar. Sonuçta,F faktörünün entegre olması, dnaA (Ts) fenotipini DnaA-bağımsız replikasyon orijini sayesinde baskılar.
İntegratif süpresyonun gözlenmesi, F faktörü kromozoma entegre olmuş bir suşu izole etmek için kullanışlı bir yöntemdir. Örneğin, bir F’ Lac+ / Strs sutu, bir lac- DnaA (Ts) Strrsutuyla çiftlettirilebilir ve Lac+ Strr hücreler, 42oC’de streptomisinli minimal laktoz agara ekilerek seçilebilir. Hayatta kalan kolonilerin tümü, entegre olmut F’ lac içeren Hfr koloniler olacaktır.
DİRENÇ (R) PLAZMİDLERİ
R plazmitleri, ilk defa Japonya’da bir dizanteri salgını sırasında S.dysenteriae bakterilerinden izole edilmit, daha sonra, E.coli ve bir çok bakteride bulunmuştur. R plazmitler, konakçılarına bir grup fungal antibiyotiğe karşı direnç kazandırırlar ve genellikle self-transmissible özelliktedirler. Çoğu R plazmiti, bitişik iki DNA segmentinden ibarettir. Bu fragmentlerden biri, resistans transfer faktör (RTF) olup, DNA replikasyonunu, kopya sayısını, gen transferini ve kimi zaman tetrasiklin resistans genin regüle eder. R determinant olarak da adlandırılabilen öbür segment ise, antibiyotik resistansı için gereken diğer genleri taşır. R plazmitleri, genellikle, bir grup kombinasyonla, ampsilin (amp), kloramfenikol (Cam), streptomisin (Str), kanamisin (Kan) ve sulfonamid (sul) resistans genlerini taşır. İki bileşenli R plazmitleri, F’ plazmitlerden farklı olarak integrasyondan sonra gelen bir eksidasyonla oluşmazlar. Bu mekanizmanın yerine, transpozonlarla resistans genleri taşınabilir.
R plazmitler,tıp alanında da büyük öneme sahiptir. Çünkü, bakteriler arasında transfer edilebilme özelliklerinden dolayı, büyük epidemilere sebep olmuşlardır.
KOLİSİNOJENİK PLASMİDLER
Col plasmidleri , kolisin üretme yeteneği sağlayan E.coli plasmidleridir.Kolisin, Col plasmidi taşımayan duyarlı bakterilerin çoğalmasını engelleyen bir proteindir. Col plasmidleri çeşitli bakteri türlerinde bulunan ve baktriosin üreten bakteriosinojenik plasmidler gurubundadır. Bakteriosinler, ki kolisinler bunlara bir örnektir; duyarlı bakterilerde etkileşime girerek birçok temel işlevi inhibe ederler. DNA replikasyonu, transkripsiyon, translasyon veya enerji metabolizması, kolisinlerin kötü yönde etkilediği işlevlerdendir.Kolisinlerin birçok tipi vardır. Her tip bir harfle belirtilir ve duyarlı hücrelerde özel şekillerde inhibisyona neden olurlar.
Kolisin üretiminin saptanması, faj saptanmasına benzer bir yöntemle yapılır. Kolisin üreten hücre, duyarlı hücre kültürü üzerine konulur; kolisin, etraftaki bakterilerin çoğalmasını engeller.Koyu bakteri tabakasında “lacuna” olarak bilinen temiz bir bölge oluşturur. Col plasmidler, konakcılarının , doğada kolisine duyarlı hücrelere göre avantajlı olmalarını sağlar.
Saflaştırılan kolisinlerde yapılan çalışmalar,bu proteinlerin gerçek kolisin ve defektif faj partikülleri olmak üzere iki tipte olduğunu göstermiştir. Bazı kolisinler, basit proteinlerdir. Diğerleri, elektron mikroskobu ile incelendikleri zaman faj kuyruklarına benzedikleri görülmüştür.Böyle plazmidler, eski profaj kalıntılarının gen ürünleri olabilirler; replikasyon ve baş ünitelerinin üretiminden sorumlu genleri kaybetmiş, ancak ve bir represör sistem, lizis enzimi ve kuyruk kodlayan gen bozulmadan kalabilmiştir. Faja benzer şekilde , kolisin hücre duvarı üzerinde özel reseptör bölgelere bağlanır.Ek olarak, bazı kolisinlerin ekspirasyonu normalde represe edilmiş olsa da UV ışığı gibi DNA bozan ajanlarla indüklenebilirler.
Genellikle kolisinler, Col ilişkili bir hücreye karşı inaktiftirler.Bu olaya immünite denir. Çoğu kez, immünite, salınan küçük bir proteinin büyük kolisin proteinine bağlanması ile gerçekleşir. İmmünite proteini, yalnızca Col + hücrelere immünite sağlamaz, bunun yanında Col- hücrelerin öldürülmesinde degörev yaparlar. Örneğin, kolisin kloasin DF 13 proteini , üç bölgeden meydana gelir. Bu bölgeler, bir reseptöre bağlanan bölge, bir RNase ve immünite proteinine bağlanan bir segmentir. Reseptöre bağlana uç, hidrofobiktir ve hücre zarı ile interaksiyona girmesi olasıdır. İmmünite bağlayan segment, güçlü bir negatif yüke sahiptir; böylece pozitif yüklü immünite proteini ile nötralize olur. Kolisin bir reseptöre bağlandıktan sonra, parçalanır. N terminal bölgesi hücre dışında kalır, RNase segmenti hücreye girer, hücre yüzeyindeki immünite proteininden ayrılır. RNase, ribosomdaki RNA yı etkiler ve böylece duyarlı hücreyi öldürür.
Col plasmidler, çok büyük boydadırlar. En çok çalısılan Col plasmidi, Col E1 dir.6646 baz çiftlik tam sekansı bilinmekte ve rekombinant DNA araştırmalarında çok sık kullanılmaktadır. Büyük self transmissible Col plasmidlerin çoğu, küçük Col plazmidler ile F veya F’ plasmidler arası hibritlerdir.
Col E1, mobilize olabilen ancak konjugatif olmayan bir plasmittir. Plasmidde kodlanan bir nükleaz( Col E1 için nükleaz, mob geni tarafından kodlanır) ve bom (basis of mobility) adını alan özel baz dizisi üzerinde aktivite gösterir. Bu dizi kolisin bölgesini içerir. Mob geni transkribe edilir, mob ürünü, bom bölgesinde nik açar (nik gerçek kesim bölgesidir) ve süperkoil Col E1 DNA sı niklenmiş bir halkaya dönüşür.Bu olayları gerçekleştiren hücre F- ise, Col E1 plasmidi, pili yapma yeteneğine sahip olmadığı için konjugasyon çifti olusturamaz, transfer gerçekleşmez.
Ancak hücrede hem Col E1 hem de F plasmidi varsa, F plasmidi, pilus ve transfer aparatının sentezini sağlayacağı için Col E1 transfer edilebilir. Mob- mutantı Col E1 ler, F plasmidi varlığında da transfer edilemezler. F+ mob+ bom- mutantlarında da transfer gerçekleşmez.
Agrabacterium Ti PLAZMİTİ
Bir çok Dictyledonus bitkisinde Agrabacterium tumefaciens bakterisinin sebep olduğu bir crown gall tümör bulunur. Tümörü oluşturan özellik, Ti adı verilen bir plazmite bağlıdır. Bitki enfekte olduğu zaman, bazı bakteriler bitki hücrelerinin içlerine girer,orada büyür ve lizise uğrarlar. Bunun sonucunda DNA’lar, hücre içine salınır. Bu noktadan sonra, tümör oluşumu için bakteriye gerek yoktur. Ti plazmitinin, replikasyonds görevli genler içeren küçük bir fragmenti, bitki hücresinin kromozomuna entegre olur ve hormonların etkisiyle hücre bölünmesini kontrol eden sistemin etkisini azaltır. Böylece hücre, tümör hücresine dönüşür.Bu plazmidler, bitki kültürlerinin geliştirilmesinde önemlidir. Özel genler, rekombinant DNA teknikleriyle bu plazmitlere takılabilir ve bu genler,bazen bitki kromozomuna entegre olabilir. Sonuçta,bitkinin genotip ve fenotipi değiştirilebilir.
KONAKÇI SINIRI GENİŞ PLAZMİDLER
Bazı plazmidler, sadece sınırlı sayıda, ilişkili bakteride bulunabilir. Bu plazmitlere, konakçı sınırı dar plazmitler denir. E.coli Inc P ve Pseudomonas aeruginosa Inc P1 inkompatiblite gruplarındaki self transmissible R plazmidleri ise, çok sayıda bakteri türüne transfer edilebilirler. Bunlar da, konakçı sınırı geniş plazmidler olarak adlandırılırlar. Neden bazı plazmitlerin konakçı sınırı dar, bazısının geniş olduğu bilinmemektedir.
Plazmid:
Büyüklük (Kb):
Kopya Sayısı:
Self-Transmissible
Fenotipik Özellikler:
Col plazmidler
ColE1
6.4
10-15
Colicin E1,enerji gradientini parçalar,konakçyya Colicin E1′e ba?y?yklyk sa?lar.
ColE2
7.6
10-15
Colicin E2,bir Dnase’dyr;konakçyya Colicin E2 ba?y?ykly?y.
ColE3
7.6
10-15
Colicin E3 bir ribozomal Rnase’dyr;konakçyya ColicinE3 ba?y?ykly?y.
F plazmid
94.5
1-2
F-pilus , konjugasyon.
R plazmidler
R100
106.7
1-2
Camr,Strr,Sulr,Tetr
RK2
56.0
5-8
Geni? konakçy siniri
pSC101
9.0
<5
Faj plazmidler
ldv
6.4
50
l genleri cro,cl,O,P
Rekominant plazmidler
pBR322
4.4
20
Orta kopya sayysy,ColE1 tipi replikasyon,Ampr
pUC18
2.7
200-500
Yüksek kopya sayysy,kopya sayysyny yükselten bir mutasyonla ColE1 tipi replikasyon Ampr
pACYC184
4.0
10-12
Camr, Tetr
DİĞER PLAZMİDLER
Kimi plazmitler,zararsız bakterilere girerek onları patojen hale getirirler.E.coli Ent plazmitler, bu gruptadır ve diareye sebep olan enterotoksinlerin sentezini sağlarlar.Hly adında bir plazmid (hemoliz yapan plazmid), domuzdan izole edilen E.coli’lerde bulunmuştur.Hemolizin, kan örneklerindeki eritrositleri yıksa da Hly plazmitinin herhangi bir patojeniteye sebep olduğu görülmemiştir.
Çoğu Pseudomonas türü, yüzlerce çeşit organik bileşiği karbon kaynağı olarak -özellikle, toluen, oktan gibi zehirli olanları- kullanabilmektedir. Bu metabolik yetenek, degredasyon plazmidleri tarafından sağlanır. Her bir plazmid,bu bileşikleri yıkmaya yarayan bir veya daha fazla metabolik yolda görevlidir. Bu tipteki bazı plazmitler,bakteriye sentetik bileşikleri yıkma yeteneği kazandırır.
Başka bir plazmit grubunun üyeleri ise, toksik metal iyonlarına karşı direnç sağlar. bu plazmidler, direnç sağladıkları iyonun var olduğu ortamda bulunurlar. Hg++ iyonlarına karşı direncin biyokimyasal mekanizması iyi çalışılmıştır. Olay, plazmitte bulunan ve Hg++ iyonlarını metalik merküriye çeviren redüktaz enzimi sayesinde gerçekleşir.
KAYNAKLAR:
1.Microbial Genetics; Stanley R.Maloy; John E. Cronom; David Frefeld
2.Biochemistry; Geoffrey Zubay
3.Concepts of Genetics; William S.Klug; Michael R.Cummings
4. Molecular Cloning; J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis
Plasmid zaten bakteri hücresi içerisinde, bakteri kromozomundan bağımsız genellikle dairesel yapıda, replikasyon yapabilen bir DNA parçası. Yani oluşturulmaktan öte bakterinin kendi doğasında olan bir yapı. Bakteri plasmidlerinden tra genlerini taşıyanlar, bakterinin kromozomuna eklenip, tekrar ayrılabilme özelliğine sahip. Bazıları da fertilizasyon plasmidi olarak, replikasyon sonucu bir kopyasını başka bir bakteriye aktarabiliyorlar. Üzerinde antibiyotik üreten genler( ki bakteriler antibiyotiği diğer bakterilere karşı kendilerini koruma aracı olarak kullanırlar) ya da antibiyotik direnç genleri mevcut. Bu haliyle plasmid bakterinin doğal parçası.
Bugün bizim klonlama için kullandığımız yapay plasmidler de, bakterilerdeki doğal plasmidlerden esinlenilerek düşünülmüş. Bakteri plasmidlerinin kendilerini çoğaltabilme özelliği ve antibiyotik direnç genleri klonlama vektörlerinin anahtar kısımlarını oluşturup, bunlar üzerinde çeşitli düzenlemeler ile istenen klonlama plasmidleri elde edilmiş durumda.
Bu konuda plazmidlerin kromozomal DNA'dan koparak oluştuğuna dair bir teori var. bu kopan DNA parçalarının replikasyon orijinleri de mevcut. bazı bakterilerde tekrar kromozom DNA'sına entegre olabilen plazmidler mevcuttur. bunlara epizom denir. umarım sorunuzun cevabı olmuştur.
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar