HÜCRE KÜLTÜRÜ BESİYERİ VE SOLUSYONLAR
Hücre kültürü besiyerleri laboratuar ortamında hücrelerin normal metabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyi sağlayan besleyici solusyonlardır. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler. Laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun pH sıcaklık ve nemin sağlanması çok önemlidir. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli ozmolarite ve pH’ı da sağlarlar.
Besiyeri ihtiyacı hücrelerin tipine, adaptasyon kabiliyetine ve hücre kaynağı organizmanın türüne göre farklılık gösterir. Hücreler farklı besiyerlerinde farklı davranabilirler. Bu yüzden çalışmanın amacına göre hücrenin besiyeri ihtiyaçlarının belirlenmesi gerekir.
Hücrelerin canlılıklarının devamı ve çoğalmaları için aminoasitler, karbonhidratlar, lipidler, vitaminler, iyonlar ve proteinlerin ortamda bulunması şarttır. Standart bir besiyerinde yukarıdaki bileşenlerin sağlanması için iki temel solusyon uygulanır:
1) Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)
Hücre kültürlerinde olması gereken temel aminoasit kombinasyonu ilk defa Eagle tarafından 1955’de tanımlanmıştır. Kendi ismini taşıyan Minimum Eagle’s Medium (MEM) isimli besiyeri bazı modifikasyonlarla bugüne kadar gelmiştir. Dulbecco tarafından modifiye edilen MEM solusyonu bugün somatik hücre kültürlerinde en sık kullanılan besiyeri bileşenidir.
DMEM hücrelerin beslenebilmeleri için gerekli glukoza, canlılıklarını sürdürebilmeleri için uygun ozmolarite ve pH’a, fonksiyonlarını görebilmeleri için gerekli aminoasitlere ve vitaminlere sahiptir. Ancak tek başına hücre gelişimi için yeterli değildir.
2) Fetal Bovine Serum
Serum hücrelerin tutunabilmeleri ve çoğalmaları için kullanılan ve içeriği tam olarak tanımlanmamış zengin bir protein çözeltisidir. Bu protein çözeltisinin içinde hormonlar, enzimler, hücrenin büyümesi ve çoğalmasını sağlayan büyüme faktörleri, yüzeylere tutunabilmesini sağlayan hücrelerarası matris proteinleri bulunur. Hücre çeşidine ve uygulamalara göre besiyerindeki serum oranı değişebilir. Standart bir somatik hücre kültüründe serum oranı %10 ‘dur.
Serum üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Sığır embriyolarının kanlarının toplanmasıyla hazırlanan serumların üretiminde bir standart yoktur. Farklı hayvanlardan elde edilen serumlar birbirlerinden farklılık gösterirler. Bu da deneylerin sonuçlarını etkilemektedir. Bu dezavantajlarından dolayı bazı laboratuarlar serumsuz besiyerlerini kullanmaktadırlar. Serum kullanılmayan bir besiyerinin çeşitli büyüme ve tutunma faktörleriyle desteklenmesi gerekir, bu da çalışmaya göre serumdan daha pahalı olabilir.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS)
Hücre içi ve dışındaki ozmotik basıncı dengede tutan bir tuz solusyonudur. İçeriğindeki inorganik tuzlar ve su, hücre metabolizmasını destekler. pHı tamponlayarak hücreler için uygun bir ortam sağlar.
Tripsin
Tripsin hücre pasajlamalarında kullanılan temel enzimdir. Tripsin, bir serin proteaz tipi enzimdir, lizin ve arjinin aminoasitlerinden peptidleri yıkar. Laboratuarımızda %0,25 EDTA’lı tripsin solusyonu kullanılmaktadır.
Tripsin kullanımında dikkat edilmesi gereken bazı noktalar şunlardır:
1) -20 ºC’de saklanır, daha yüksek sıcaklıklarda bekleyen tripsinin aktivitesi düşer, bu yüzde oligotlanarak saklanması en uygunudur.
2) Serum tripsin inhibitörlerini içerir, hücrelere tripsin uygulanmadan önce mutlaka bir kere Ca ve Mg içermeyen PBS ile yıkanmalı ve yüzeylerindeki serum uzaklaştırılmalıdır.
3) Tripsin hücrelerin yüzeyini örtecek kadar uygulanır. Laboratuarımızda 100 mm’lik petriler için 2 ml; 60 mm için 1ml; 35 mm için 0,5 ml tripsin uygulanır.
4) Tripsin sıcaklık arttıkça daha etkili çalışır. Tripsin uygulanan hücreler inkübatöre konduklarında daha çabuk yüzeylerden ayrılırlar, oda sıcaklığındaysa daha yavaş ayrılırlar.
5) Hücreler yüzeyden ayrılır ayrılmaz tripsinin inhibe edilmesi önemlidir. Tripsin hücreleri yüzeyden ayırdıktan sonra hücre membranlarına zarar vermeye başlar.
6) Hücrelerin yüzeylerden ayrılma hızı değişebilir. Besiyerindeki serum oranı, hücre tipi, petrideki hücre yoğunluğu, tripsinin aktivitesi ve son pasaj üzerinden geçen zamana göre hücreler farklı zamanlarda kalkarlar.
7) Farklı şişelerdeki tripsinler birbirlerine her zaman eş değer olmayabilir.
8) Tripsini inhibe etmek için tripsin hacminin en az iki katı kadar %10 FCS’li besiyeri uygulanmalıdır. Daha sonra hücreler pipetlenerek birbirlerinden ayrılırlar.
HÜCRE KÜLTÜRÜ
Hücre kültürü, hücrelerin kontrollü şartlar altında yetiştirilmesi sürecidir. Pratikte hücre kültürü terimi, çok hücreli ökaryotlardan özellikle hayvan hücrelerinden kaynaklanan hücrelerin kültürlenmesi için kullanılmaktadır. Hücre kültürleriyle yapılan çalışmalar günümüzde popüler araştırma konularında önemli bir kısmı oluşturmaktadır. Örneğin, kanser gibi çeşitli patolojik durumlarda belli bir maddenin etkilerini ya da bir hücre veya dokuda üretilen belli bir maddenin işlevlerini belirlemek amacıyla hücre kültürleri yapılabilmektedir. Hücre kültüründe belirli bir hücre hattından çoğaltılan hücrelerde çeşitli çalışmalar yapılarak canlı ortamında (in vivo) yapılamayan denemeler yapılabilir ve burdan yola çıkılarak sonuçlara ulaşılabilir.
Hücre kültürü çalışmalarının gelişimi ve yöntemleri, organ ve doku kültürü çalışmalarıyla yakından ilişkilidir ve onlarla benzer nitelikler taşımaktadır. Doku ve hücre kültürü çalışmaları yüz yılı aşkın bir süredir yapılmaktadır.
Hayvansal hücre kültürü teknikleri 1900'lerin ortalarında laboratuvarda rutin olarak uygulanmaya başlanmış[1] fakat asıl doku kaynaklarından ayrılan sürdürülebilir yaşayan hücre hatları kavramı 19. yüzyılda ortaya konmuştur.[2]
19. yüzyılda İngiliz fizyolog Sydney Ringer sodyum, potasyum, kalsiyum ve magnezyumlu klorürler içeren tuz çözeltilerinin, vücut dışında yaşayan bir hayvan kalbinin atışını sürdürebilmesi için uygun olduğunu deneysel olarak göstermiştir.
1885'de Wilhelm Roux bir tavuk embriyosu nöral plağının bir kısmını ayırmış ve ılık bir tuzlu su çözeltisinde dokuyu birkaç gün yaşatarak doku kültürünün temellerini de atmıştır.[3]
Ross Granville Harrison, 1907 ve 1910 yıllarında yaptığı deneyleri doku kültürünün metodolojisini de belirleyerek yayımlamıştır.[4]
1913’te Carrel aseptik (steril) koşullar altında düzenli olarak beslenmeleriyle hücrelerin kültür ortamında uzun süre hayatta kalıp çoğalabildiklerini göstermiştir. Earle ve arkadaşları ise, 1948’de L hücre hattından saflaştırdıkları hücrelerin kültüre alındıklarında koloniler oluşturduklarını göstemişlerdir. Hücre kültürü teknikleri 1940 ve 50'lerde viroloji araştırmalarıda desteklemek amacıyla önemli ölçüde geliştirilmiştir.
1952’de de Gey ve arkadaşları günümüzde oldukça bilinen HeLa hücre hattını, bir insan servikal karsinomasından türeyen hücrelerin sürekli serisi şeklinde gözlemlemişlerdir.
1986’da Martin ve Evans ile arkadaşları, fareden pluripotent embryonik kök hücrelerini saflaştırarak kültürünü yapmışlardır. 1998’de Thomson ve Gearhart ile yardımcıları ise, insan embryonik kök hücrelerini izole etmeyi başarmışlardır.
Hücre kültüründe virüslerin gelişmesi saflaştırılmış virüs aşılarının hazırlanıp üretilmesine olanak sağlamıştır. Örneğin, Polio aşısı hücre kültürü teknikleri kullanılarak yapılan ilk ürünlerden biridir. Bu aşı, maymun böbreği hücre kültüründe virüsü yetiştirmek için bir yöntem bulan ve bundan dolayı Nobel Ödülü alan John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller ve Frederick Chapman Robbins'in araştırmalarıyla mümkün kılınmıştır.
Mikrobiyoloji
-
Antibiyotiklerin Etki Mekanizmaları Nelerdir?
-
Azot oksit
-
Petri Kutusunda Agarlı Besiyeri Hazırlanması
-
Tüpde Agarlı Besiyerlerinin Hazırlanması
-
Besiyeri Hazırlarken Dikkat Edilecek Hususlar Nelerdir ?
-
Dehidre Besiyerleri Nedir?
-
Besiyerinin Sahip Olması Gereken Özellikler
-
Besiyeri hazırlanmasında kullanılan maddeler nelerdir ?
-
Besiyerlerin Sınıflandırılması Nasıl Yapılır ?
-
Besiyerinin Tanımı ve Kullanım Amaçları Nelerdir ?
-
Pseudomonas Cinsine ait Türler
-
Veba - Yersinia Pestis
-
Tularemi - Francisella tularensis
-
Şarbon - Bacillus anthracis Enfeksiyonu
-
Bruselloz - Brucella spp