Gen Tedavisi Ve Gen Tedavisi Yöntemleri

Kromozomal hastalıkların altında genellikle genetik faktörler yatar sadece kromozomal değil nadir hastalıklar ve daha nice hastalıkların altında yatan unsur genetik faktörlerdir.

Gen terapi aslında bir alternatif terapötik yöntemidir. Yani spesifik tedavisi olmayan hastalıkların genetik kusurlarının giderilmesi için, hasar görmüş gen veya gen takımlarının yerine sağlıklı gen veya genlerin aktarılması, bu işlemin doğrudan ya da dolaylı bir yoldan transfer işlemleri gen terapi kapsamında gerçekleşir.

Bilindiği üzere kusurlu genlerin engellenmesi ya da susturulması (RNAi-miRNA işlenmesi) gibi alternatif potansiyel yöntemler gen terapisine ışık tutmuştur. Translasyonel tıbbın yegâne hedefi gen tedavisi ve gen tedavisi yöntemleridir. Bilim insanları hastalığa neden olan geni keşfedip laboratuvar koşullarında tedavi edici genleri rekombinant yollar ile in vitro teknikler kullanarak geliştirmeleri, son zamanlardaki potansiyel ve yüksek teknolojili materyaller ile gen terapi mevzusu gündeme gelmiştir.

Hem in vitroda hem de ex vivo yaklaşımlarda gen terapide bir başarı sağlayabilmek için tedavi edici genin transferinde aracı bir sisteme sahip olmaktır. DNA moleküler yapı olarak büyük ve elektrik yüklü bir moleküldür o yüzdendir ki gen tedavi yöntemlerinde insan hücreleri DNA'yı kolaylıkla kabul etmez ve almaz. Bilim insanları genetik mühendisliği tekniklerini kullanarak virüsleri bir vektör olarak kullanıp tedavi edici DNA ya da RNA moleküllerini insan hücresine aktarımını gerçekleştirmişlerdir. Viral vektöründe hücreyi enfekte ederek hasara uğratmayıp ilgili tedavi edici geni hücreye entegrasyonunu sağlamışlardır.

Görsel 1: In vivo ve ex vivo gen terapi yöntemlerinin şematize edilmiş halleri. İn vivo yöntemlerinde tedavi edici gen direkt damar yolundan enjekte edilir fakat ex vivoda hastadan hücreler izole edilir, kültür ile çoğaltılır, viral vektörlerle karıştırılır ve hastaya damar yolu ile verilir.

Gen Tedavisi İçin Viral Vektörler

Retroviral Vektörler

Bilim insanları vektör olarak retrovirüsleri kullanmayı daha çok tercih etmişlerdir. Retrovirüsler RNA genomu taşırlar. Retroviral vektörler, virüs genomundan replikasyon ve hastalığa neden olan genler çıkarılır yerine tedavi edici genler yerleştirilir. Retroviraller RNA bazlı virüsler olduğu bilinmektedir, RNA molekülleri vektöre aktarılır viral vektör hastanın hücresine verilerek enfekte eder. Viral vektör hücre içerisine girdikten sonra replikasyon genleri çıkarıldığı için çoğalamaz ancak RNA molekülü ters transkripsiyon mekânizması sonucu DNA'ya kopyalanır ve kopyalanan DNA molekülü hücre çekirdeğine girerek kromozomun genomuna yerleşir. Genoma yerleşen DNA molekülünün ifade edilmesi beklenir.

Retroviral vektörlerin avantajı uzun süreli genetik ekspresyon sağlamalarıdır ancak dezavantajı da vardır o da insersiyon mutasyonları nedeni ile ağır toksisiteye sebep olmalarıdır.

Görsel 2: Retroviral vektör ile gen tedavisi. Bu yöntem bilim insanlarınca çok kez kullanılan bir terapötik yöntemdir fakat dezavantajlarından birisi hücresel kontaminasyon ya da toksisite oluşturmalarıdır.

Adenovirüs Vektörleri

Retrovirüsler haricinde başka bir viral vektör Adenovirüs vektörleridir. Bu vektörler birçok öncü gen terapisinde kullanılmıştır ayrıca bu vektörlerin önemli bir avantajı ise boyutsal ve yapısal olarak büyük genleri/molekülleri taşıyabilme potansiyeline sahiptirler. Fakat bu duruma aykırı olan bir olay ise Adenovirüs vektörlerin enjeksiyonundan sonra vücutta immün sistem adenovirüs vektörlerine karşı antikor geliştiriyor olmasıdır ve viral vektöre saldırıyor olmasıdır. Ardından hem virüsü hem de tedavi edici geni etkisizleştiriyorlardır ve hastalarda ciddi yan etkilere sahip reaksiyonları tetikliyorlardır.

Görsel 3: Adenovirüs vektörleri ile gen terapi yöntemleri. Adenovirüs vektörlerinin başarısı, gen terapi araştırmaları için bir sorun haline gelen tedavi edici genin moleküler olarak büyük olması idi. Adenovirüs vektörlerin avantajı budur, 5-10 kb arasındaki tedavi edici genlerin transferini gerçekleştirebilmek için taşıyabilme potansiyeline sahiptirler. Fakat bu vektörlere immün sistemin antikor geliştirmesi ve bu antikorların vektörlere saldırması tedavi edici genin etkisizleşmesine neden olur bu durum ise gen tedavi yöntemler için bir dezavantaj durumdur.

Adeno İlişkili Virüs

Günümüzde gen tedavisi yöntemlerinde sıkça kullanılan bir virüs çeşididir. Bu virüs patojenik değildir o yüzden bağışıklık hücreleri bu virüse bir yanıt oluşturmazlar. AAV virüsünün modifiye formları vardır ve bu yüzden spesifik genleri kromozomlar üzerindeki özgül lokuslara transferi için kullanılır.

AAV'lerin büyük çoğunluğu genleri epizom adı verilen küçük halkasal DNA ile konağın hücre çekirdeğine transferini gerçekleştirir ve aktarılan tedavi edici genin (DNA) ifadesi virüs genomuna ait promotor bölgelerinden sağlanır. AAV formlarının şöyle bir dezavantajı vardır. aktarımını yaptıkları terapötik genin hücre çekirdeğine tam yerleşmesi olmadığından genin replikasyonu tam olarak gerçekleşmez.

Görsel 4: Adeno ilişkili virüs yöntemi ile gen terapi. Patojenik bir etkiye sahip olmadığı için bilim insanlarınca sık kullanılır. Fakat hücre çekirdeğinde yer alan kromozomlara tam olarak yerleşemediği için genin replikasyonu gerçekleşmez.

Viral Olmayan Aktarım Yöntemleri

Bilim insanları viral vektörler kullanmaksızın hem in vivo hem de ex vivo aktarım yöntemlerine çalışmaktadırlar. Viral olmayan yöntemler kapsamında genlerin hücre membranından geçişi için kimyasal destekli aktarım, nanopartiküller ile hücre içerisine dağılımı ve klonlanmış DNA dizilerini lipozom adı verilen yapay lipit vezikülleri ile hücre füzyonu gerçekleşir.

Gen hapları olarak isimlendirilen aktarım çeşidi araştırma fazındadır. Bu yöntemde gen hapı bağırsak hücrelerine ulaşır içerisindeki tedavi edici gen olan DNA bağırsak hücreleri tarafından emilip tedavi edici genin ifade olunmasıyla kan dolaşımına salınır.

İlk Başarılı Gen Tedavisi Çalışması

1990 yılında FDA, SCID (ağır kombine bağışıklık yetmezliği) hastalığına sahip bir bireye gen tedavisini onaylamıştır. SCID'te fonksiyonel bir bağışıklık sistemi bulunmaz ve bu nedenle önemli olmayan enfeksiyonlara yakalandığı zaman bu hastalar yaşamlarını kaybederler. Bu hastalık, T hücrelerinin ürettiği bir protein olan ve o proteini şifreleyen gendeki mutasyon sonucu ortaya çıkar. Bu protein ya da protein bazlı enzim Adenozin deaminazdır. (ADA)

SCID hastası bireyden T hücreleri izole edilmiş, kültürde çoğaltılmış, retrovirüs vektörü ile karıştırılmış ve SCID hastası bireye tam 1 milyar işlevli T hücresi enjekte edilmiştir. T hücresi üretebilmesi için bireyin, bu deney tekrar yapılmıştır bu süreç boyunca SCID hastası bireye düzenli olarak saflaştırılmış ADA proteini verilmiştir.

Görsel 5: SCID hastalığında uygulanan gen tedavisi yöntemi. Klonlanmış insan ADA geni, daha sonra beyaz kan hücrelerinden izole edilen T hücrelerini enfekte etmek için viral vektörlere aktarılır hastaya enjekte edilir.

Başarısız Gen Tedavileri

1990'dan 1999'a kadar 4.000'den fazla gen tedavisi yapılmıştır ve bunların birçoğu başarısızlıkla sonuçlanmıştır. 1999 senesinde ABD'de OTC (ornitin transkarbamilaz) bir karaciğer hastalığına sahip bir birey Jesse Gelsinger, tedavinin güvenilirliği aşamasında hayatını kaybetti böylelikle gen tedavisi hızla düşüşe uğradı.

OTC hastalığının nedeni OTC genindeki meydana gelen bir çeşit mutasyondur. OTC geninin kopyalarını taşıyan viral vektör Jesse Gelsinger'ın hepatik arterinden enjeksiyonu yapılmıştır. İmmün sistemi ağır yangısal cevap tetitklemişti ve vektör ise adenovirüs vektörü idi. Bilim insanların beklentisi aslında şuydu; viral vektör karaciğer hedeflenecekti, karaciğer hücrelerine girecekti, OTC proteinin üretimi tetiklenecekti ve hasta şifa bulacaktı ama sanılan şey olmadı.

Bilim insanları geçmişte 18 kişiyi tedavi edici genlerle tedavi etmişlerdir 17 erişkin hastadan alınan sonuçlar ümit vericiydi fakat 18. hasta Jesse Gelsinger idi. Jesse Gelsinger vücuduna enjekte edilen adenovirüse karşı ağır yangısal tepki verdi, yüksek ateş görüldü, akciğerleri sıvı ile doldu ve 4 gün sonra akut solunum sıkıntısından yaşamını yitirdi. Bunun nedenini daha önceden bağışıklık sisteminin adenovirüse benzer virüslere maruz kalmasına dayandırdılar.

Fransız bilim insanları 2000 yılında büyük bir övgü ile bahsettikleri gen tedavisi aslında göründüğü gibi değildi. Ölümcül X-bağlantılı SCID hastalığına sahip çocuklarda normal geni taşıyan retroviral vektörle tedavisinden sonra işlevsel bağışıklık kazanmışlardır. Fakat araştırmalarda yaklaşık 20 çocuktan 5'inde lösemi ortaya çıktı ve gen tedavisine olan güven azalmıştır. Tedaviler arasında 1 çocuk hayatını kaybetmiştir diğer 4'ü tedaviye cevap vermiştir. Lösemiye yakalanan 5 çocuktan 2'sinde retroviral vektörün kanseri tetikleyen bir gen olan LMO2 geninin ya üstüne ya da yakınına yerleşmiş olduğu tespit edildi. LMO2 geni beyaz kan hücrelerinin kontrolsüz proliferasyonuna ve gelişimine neden olur.

Gen Tedavisi Vektörleriyle İlişkili Sorunlar

Gen tedavisine olan ön yargılar, olumsuz eleştiriler, bilim insanlarını ve araştırma gruplarını gen tedavi yöntemlerine aceleci davrandırmak, çıkar ilişkisi, üşengeçlik veya baştan savma klinik yöntemler gibi olumsuzluklar ile gen terapiyi suçladılar. Jesse Gelsinger ve X- bağlantılı SCID gibi büyük bir talihsizlik ile sonuçlanan gen terapi olaylarını bilim insanları bunun nedenini viral vektörlere bağlamışlardır ve haksız da sayılmazlar zira viral vektörlerin gen tedavisi yöntemlerinde çok ciddi kusurlar sergilediği bilim insanlarınca tespit edilmiştir.

1. Tedavi edici genin konak hücrenin genomuna entegresi ve retroviral virüslerin genomlarının da yerleşmesi ile konak hücreler kendi DNA'larını eşlerken başka bir dokuda veya hücrede DNA replikasyonu gözlenmemiş olarak tespit edilmiştir yani asıl amaç tedavi edici genin bütün hücrelerde ekspresi beklenirken sadece enjekte edildiği dokuda veya hücrede ifadesi gözlemlenmiştir.

2. Adenovirüs gibi diğer viral vektörlerin enjeksiyonu sonucu Jesse Gelsinger olayında ki gibi immün sistemlerin bu viral vektörlere cevap vermesidir.

3. Viral vektörlerin enjeksiyonu yine X-bağlantılı SCID hastalığında ortaya çıktığı gibi önemli bir genin işlevini anormal bir şekilde ifadesine ya da mutasyonuna yol açar.

4. AAV vektörleri 5 kb'dan fazla ve retrovirüsler 10 kb'dan fazla tedavi edici gen taşıyamazlar. Birçok insan geni 5-10 kb arasından daha büyüktür.

5. Aktifliği giderilmiş bir viral vektör ile konak hücrede hâli hazırda bulunan ya da bulunabilir, bir viral genomu ile rekombinasyonu sonucu konak hücrede farklı bir enfeksiyona sebep olma ihtimali vardır.

Yakın Zamanlı Olumlu Denemeler: Retinal Körlüğün Tedavisi

Her yıl 1/50.000 ile 1/100.000 doğan bireylerin arasında bir retinal körlük rahatsızlığı olan leber konjenital amarozis (LCA) tespit edilmektedir ve gen tedavi yöntemleri uygulanarak bir başarı elde edilmiştir. Başlarda bu hastalığa uygulanan gen terapötik köpeklerde uygulanmıştır. Köpeklere uygulandıktan sonra terapötik olumlu cevap vermiştir ardından aynı prosedürler insan gen tedavisi için uygulanmıştır.

LCA'ya neden olan faktörler arasında ışığa duyarlı olan hücreler fotoreseptörler (çubuklar ve koniler) 18 veya daha fazla genin değişikliğe uğraması ile meydana gelen mutasyonlar olarak belirlenmiştir. Bu hastalıkta uygulanan gen tedavisi özellikle bir gene hedeflenmiştir RPE65 geni. Bu genin protein ürünü fotoreseptörleri oluşturan çubuk ve koni hücrelerinin ışığı algılamasını ve elektrik sinyallerini beyne iletmesini sağlayan bir A vitamini formu olan ve retinolü metabolize etmektedir.

Tedavilere yaklaşım olarak RPE65 genini hedef olarak belirleyip tek seanslık gen terapileri uygulanmıştır. Birkaç aydan sonra hastalarda hala körlük olmasına rağmen birçok erişkin hasta ışığı algılayabilmiş ve görme eşliğindeki satırları okuyabilmişlerdir. AAV ile RPE65 geninin kopyaları birleştirilmiş hastalara enjekte edilmiştir.

Tedavi edici gen retinanın görme hücrelerinin hemen altındaki hücre katmanı olan retinal pigment epitel hücrelerine yaklaşık olarak %15-20'sine entegre edilmiştir. Retinal körlük gen tedavilerine çocuklar, erişkin ve yaşlı bireylere göre daha hızlı ve başarılı sonuçlar vermiştir çünkü çocuklardaki fotoreseptör hücreler yaşlı bireylerden daha fazla olduğu ve bu hastalıktan dolayı kaybettikleri fotoreseptör hücre sayıları yaşlı bireylerde daha fazladır, yaşa bağlı dejeneratif göz hastalıkları da belirdiği için nedenler arasından gösterilmektedir.

Görsel 6: Retinal körlüğün gen tedavisi yöntemleri uygulanarak şematize edilmiş hâli. Her yıl 1/50.000 ile 1/100.000 doğan bireylerin arasında bir retinal körlük rahatsızlığı olan leber konjenital amarozis (LCA) tespit edilmektedir ve gen tedavi yöntemleri uygulanarak bir başarı elde edilmiştir. Başlarda bu hastalığa uygulanan gen terapötik köpeklerde uygulanmıştır. Köpeklere uygulandıktan sonra terapötik olumlu cevap vermiştir ardından aynı prosedürler insan gen tedavisi için uygulanmıştır.

Güncel Gen Terapileri: Viral Vektör Olarak HIV

Bilim insanları beta-globin geninin yol açtığı, hemoglobin üretimini azaltan bir kan bozukluğu hastalığı beta-talasemi genç erkek hastaya, gen tedavisi uygulanmıştır. Normal beta-globin geninin kopyasını defektif yani inaktive edilmiş HIV viral vektöre aktarımı yapılmış olup hastaya enjekte edilmiştir. Enjeksiyondan sonra HMGA2 (büyüme faktörü bir gen) adı verilen bir genin aktivasyonu ortaya çıkmıştır ama Fransız bilim insanlarının denediği X-bağlantılı SCID hastalığında ortaya çıkan olumsuzluk gibi bir durum ortaya çıkmamıştır.

2013 yılında bilim insanları metakromatik lökodistrofi ve Wiskott-Aldrich sendromu (WAS) hastası olan çocuklar ile bir gen terapisi çalışmalarını duyurmuşlardır. Çalışmalarda hematopoetik kök hücreler ile HIV virüsünden türetilmiş lentivirüs vektörlerini kullanmışlardır. Toplamda 16 hastaya (10'u MLD'li hasta, 6'sı WAS'li hasta) gen tedavisi uygulanmıştır.

MLD hastalığı lizozomlarda enzimlerin depolanmasını etkileyen, arilsülfataz A (ARSA) genindeki mutasyon ile meydana gelen, sülfatit adı verilen yağların birikimi sonucu beliren ve özünde nörodejeneratif bir bozukluk olan hastalıktır. Sülfatit birikimi nöronlar açısından toksik etki yaratıp, beyni çevreleyen nöronların miyelin kılıflarına saldırması ile demiyelinizasyona sebebiyet vererek bilişsel işlevlerin ve motor becerilerin sekteye uğraması ile sonuçlanır. Bilinen spesifik bir tedavisi yoktur. MLD'li çocuklar doğarken sağlıklı görünürler fakat ileriki dönemlerde semptom gösterirler. Gen tedavisi kapsamında MLD'li çocuklardan hematopoetik kök hücrelerini saflaştırıp işlevselli ARSA genini HIV'den türetilmiş lentivirüs ile muamele edip ex vivo yaklaşımlar doğrultusunda hastanın HSC'lerine infüzyonu yapılır. İnfüzyondan sonra ise MLD'li üç çocuk 18-24 ay arasında tedaviye olumlu yanıt verip, hastalığın ilerleyişi durmuştur.

Görsel 7: Nörodejeneratif hastalıkların genel olarak gen tedavisi yöntemini özetleyen bir görsel. Genel olarak hematopoetik kök hücreler kullanılarak tedavi edici genin bir viral vektöre karışımı ile damar yolundan enjeksiyon yapılır.

WAS hastalığında kan pulcukları işlevsiz hale geldiği için enfeksiyonlara, kanamalara, oto-immün hastalıklara ve kansere daha yatkın hale gelmektedirler. WAS hastalarına gen tedavisi yöntemleri uygulandığında tedavi öncesi egzamada gerileme, trombositlerin sayısında bir artış ve enfeksiyonlarda azalma olduğu görülmüştür.

Gen Tedavileri: Hedefe Yönelik Yaklaşım Araştırmaları

Buradaki yaklaşımlarda mutasyona uğramış genin çıkarılması, değiştirilmesi veya düzeltilmesi ve kusurlu genin ifadesinin susturulması ele alınacaktır.

Gen Hedefleme: DNA-Tashih Nükleazları

Bu yaklaşımda bir restriksiyon enzimi ile yani nükleaz (moleküler makas) ile bir diziye özgü DNA bağlanma domeynini birleştirip hassas bir şekilde kesilip parçalanması yöntemidir.

Bilim insanları 1996 yılında, ZFN'ler (çinko parmak nükleazları) oluşturmak için DNA bağlama domeynini, çinko parmak motifi ve bir nükleaz olan FokI'in DNA kesim bölgesi ile birleştirdiler. Çinko parmak motifleri transkripsiyonda yer alan ve çinko atomlarını bağlayan ve spesifik DNA dizileri ile etkileşime giren iki sistein iki histidin kalıntılarından oluşan kümedir. Çinko parmak motifi ile polipeptitlerin DNA kesim bölgeleri ile birleştirilmesi

ZFN'lerin bu bölgeleri işlemesi ile diziye özgü hedefleme yolu ile genomda modifikasyon söz konusu mekânizma gerçekleşir.

Görsel 8: Gen susturma tekniklerinden birisi olan çinko parmak nükleaz sistemi. ZFN'ler (çinko parmak nükleazları) oluşturmak için DNA bağlama domeynini, çinko parmak motifi ve bir nükleaz olan FokI'in DNA kesim bölgesi ile birleştirdiler.

DNA-hedef nükleazların bir diğeri ise TALEN'lerdir. (transkripsiyon aktivatör-benzeri efektör nükleazlar) TALEN'leri oluşturmak için bitkilerde patojenik olan bakterilerden alınan ve transkripsiyon faktörü olan bir DNA bağlama motifi ise nükleazlara eklenir. TALEN'ler DNA'yı dimerler arasından keser. ZFN ve TALEN'ler genomdan kusurlu bir genin kaldırılması, susturulması, sessizleştirilmesi ya da modifiye edilmesini sağlayan ümit vaad eden yaklaşımlardır. Belirli integrazlar ile birleşerek ZFN ve TALEN'ler kusurlu genleri kesip-çıkararak yerine homolog normal geni rekombinasyon yollar ile yerleştirerek gen tashihi gerçekleştirilmiş olur.

Görsel 9: Transkripsiyon aktivatör-benzeri efektör nükleaz yöntemi. DNA-hedef nükleazların bir diğeri ise TALEN'lerdir. (transkripsiyon aktivatör-benzeri efektör nükleazlar) TALEN'leri oluşturmak için bitkilerde patojenik olan bakterilerden alınan ve transkripsiyon faktörü olan bir DNA bağlama motifi ise nükleazlara eklenir. TALEN'ler DNA'yı dimerler arasından keser.

Gen Tedavisi Yöntemleri: Fiziksel ve Kimyasal Metotlar

Gen tedavi yöntemleri fiziksel ve kimyasal yöntemler olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Fiziksel metotlarda temel amaç DNA molekülünü ya da tedavi edici geni direkt olarak hücre içine enjeksiyonu yapmaktır. Fiziksel yöntemlere örnek olarak mikroenjeksiyon, partikül bombardımanı-gen tabancası metodu, elektroporasyon, sonaporasyon, laser ışıması ve magnetofeksiyon gibi yöntemler örnek olarak verilebilir. Kimyasal metotlara örnek olarak ise lipozom aracılı gen transferi örnek olarak gösterilir ve bu da kendi içinde 3'e ayrılır; anyonik lipozomlar, katyonik lipozomlar ve arkeozomlar.

Mikroenjeksiyon

Gerek sitoplazmayı gerekse hücre çekirdeğini hedef alsın, DNA molekülünü ya da tedavi edici genin hücre içerisine en direkt şekilde sokmanın yoludur. Tek bir hücreye uygulanan mikroenjeksiyon prosedüründe mikrokapiler pipet, mikropipetin hareketini kolaylaştırmak ve onu kontrol etmek için ise mikromanipülatör ve mikroenjektör kullanılmaktadır. Hidrostatik bir basınç ile genetik materyal DNA molekülünü içeren sıvı mikropipete doğru çekilir ve püskürtülür. Enjeksiyonlar daha sonra mikroskop ile gözlemlenir.

Görsel 10: Mikroenjeksiyon. Mikrooperasyon yönteminde, mikrokapiler pipet, mikropipetin hareketini kolaylaştırmak ve onu kontrol etmek için ise mikromanipülatör ve mikroenjektör kullanılmaktadır. Hidrostatik bir basınç ile genetik materyal DNA molekülünü içeren sıvı mikropipete doğru çekilir ve püskürtülür.

Partikül Bombardımanı- Gen Tabancası Yöntemi

Partikül bombardımanı bir diğer ismi ile gen tabancası yönteminde hızlandırılmış bir partikül ile çıplak DNA molekülü ya da tedavi edici genin hücrelere aktarımı yöntemini anlatmaktadır. Yöntem ilk olarak 1987'de bir bitki hücresinde transgen ifadesinin zorluğunun üstesinden gelebilmek için kullanılmıştır. 1990'larda ise memeli hücrelerinde ve diğer canlı dokularda kullanılmıştır.

Görsel 11: Gen aracılı partikül bombardımanı metodu ya da bir diğer ismi ile gen tabancası yöntemi. Bu yöntemde hızlandırılmış bir partikül ile çıplak DNA molekülü ya da tedavi edici genin hücrelere aktarımı yöntemini anlatmaktadır.

Elektroporasyon

Gen aktarım yollarından birisi ise yani en sık kullanılan tekniklerden birisi ise elektrik akımlı aktarımlardır. Elektroporasyon yönteminde ise hücre membranına elektrik vererek geçici olarak bölgesel destibilizasyon oluşturmaktır. Hücre membranında destibilizasyon oluşturduktan sonra daha geçirgen bir hale gelerek molekülleri hücre içerisine alır. Hücre membranındaki geçirgenliğin geçici artışının altında yatan sebep ise elektrik alan tarafından indüklenen porlar sayesinde olduğu düşünülmektedir.

Görsel 12: Elektroporasyon ile gen tedavisi yöntemi. Elektroporasyon yönteminde ise hücre membranına elektrik vererek geçici olarak bölgesel destibilizasyon oluşturmaktır. Hücre membranında destibilizasyon oluşturduktan sonra daha geçirgen bir hale gelerek molekülleri hücre içerisine alır.

Sonaporasyon

Sonaporasyon yönteminde ultrason ile hücre membranın geçirgenliğini arttırması metodudur.

Sonaporasyon yöntemi geniş aralıkta dalga formuna ve sıklığına sahiptir fakat en yoğun aralık sinusoidal problar ile uygulanan sonaporasyon yöntemidir. Bu yöntem gen tedavisi yöntemi olarak kullanılan bir metottur. Daha düşük sıklıktaki dalgalar örneğin 20 kHz'de hücre lizisi ve parçalanması için uygulamalar yapılırken daha fazla sıklıktaki dalgalarda böbrek taşı kırmak için uygulanmaktadır.

Görsel 13: Sonaporasyon yönteminde ultrason dalgalar ile hücre lizisi ve parçalanması meydana getirerek hücre membranın geçirgenliğini arttırması metodudur.

Magnetofeksiyon

Magnetofeksiyon metotunda gen vektörlerinin hücreye girişini arttıran bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Tedavi edici genin yani DNA molekülünün manyetik nanopartikülleri ile bir araya getirerek birleştirilmesi ve hatta tranfeksiyon reaktifi ile de birleştirilmesi fikri ile ortaya çıkmıştır. Bunun için kullanılan nanopartiküller polimer kaplıdır, biyolojik olarak bozunur ve demir oksit nanopartikülleri kullanılır. Bu nanopartiküllerin gen vektörlerine bağlanması tuz ile indüklenerek kolloidal çöktürmesi ile oluşur. Manyetik nanopartiküller,çevresel etmenli veya herhangi bir dış kaynaktan manyetik alan oluşturularak hedef hücrelere yoğunlaşma sağlanır.

Görsel 14: Magnetofeksiyon yöntemi bir gen tedavisi yöntemi olarak kullanılır. Tedavi edici genin yani DNA molekülünün manyetik nanopartikülleri ile bir araya getirerek birleştirilmesi ve hatta tranfeksiyon reaktifi ile de birleştirilmesi fikri ile ortaya çıkmıştır. Bunun için kullanılan nanopartiküller polimer kaplıdır, biyolojik olarak bozunur ve demir oksit nanopartikülleri kullanılır.

Lipozom Aracılı Gen Aktarımı

Fiziksel olarak aktarılan yöntemlerin önemli bir avantajı genetik materyalin direkt olarak hücrelere enjeksiyonu yapabiliniyor olmasıdır. Ancak bu durum viral olmayan lipofeksiyon-polifeksiyon gibi transfer teknolojilerinden ayırt etmektedir. Sentetik bir vektör ile gen aktarımı hücre bağlanması, endositoz ve endositik veziküllerin entegresi, endozom yapıların lizozoma doğru olgunlaşması, veziküllerin ait oldukları kompartmanlardan ayrılması, nükleus çeperine doğru bir moleküler göç, lipit-aracılı gen aktarımında lipit ile DNA'nın ayrılması ve son olarak DNA molekülünün hücre içerisine girişi ile gerçekleşir.

Lipozomun bileşimi, enkapsülasyon oranı, lipit vezikülün büyüklüğü ve yüzey yükü lipozom transfeksiyon yönteminde bu faktörlerin önemi büyüktür. Bu faktörler arasından hücre içerisine gen aktarımı yolları ile entegre edilen DNA molekülünün sitozolden çekirdeğe olan hızı nükleer lokalizasyon sinyalleri ile arttırılmaktadır.

Katyonik Lipozomlar

Katyonik lipit ajanları kullanılarak gerçekleştirilen lipofeksiyon işlemi (kültüre edilmiş hücrelerden katyonik lipitli ortamda DNA transferi) monokatyonik lipit ajanının polikatyonik bir ajan ile yer değiştirmesi ile bu teknik geliştirilmiştir. Bu yöntem, iyonik etkileşimler ve kültüre edilmiş hücrelerde DNA'yı fonksiyonel olarak koruyabilen kompleks bileşenlerden lipozomlara dayanır yani lipozomlar aracılığı ile gerçekleştirilen bir gen aktarım yöntemidir.

Anyonik Lipozomlar

Bazı çalışmalarda anyonik lipozomlar katyonik lipozomlara alternatif olarak gösterilmiştir.

Anyonik lipozomlar önceki çalışmalarda gösterilmiştir ki DNA molekülünün reseptör aracılı olmayan transportundan hücre yüzeylerine stimulasyon için model olarak sunulmuştur. Şimdi ki çalışmalarda anyonik lipozomlar DNA molekülünün enkapsülasyonu olarak kullanılmasıdır. Enkapsülasyon işleminden önce pozitif yüklü polilizin DNA'ya eklenerek onun negatif yüklü moleküler yapısı küçük kompleksler oluşturması modelidir.

Arkeozomlar

Arkeler ekstremum koşullara adaptasyon sağlamışlar organizmalardır. Bu ekstremum koşullardan dolayı da üç boyutlu yapılarını daima korurlar ve kaybetmezler. Arkeal lipit formülasyonlarında oldukça yüksek kararlılıkta oksidatif stres, yüksek sıcaklık, alkali pH, fosfolipaz aktivitesi, safra tuzları ve serum ortamında bulunduğu gösterilmiştir. Arkeal lipit sayesinde arkeozomlar her sıcaklıkta oluşturulabilmektedirler. Arkeozomların biyouyumluluğu ve yüksek kararlılığı gen aktarım yollarında fayda sağladığı görülmüştür. Bundan dolayı DNA aktarımı için umut vaad etmektedir.

Gen Tedavisi: Gelecekte Yaşanılacak Zorluklar ve Etik Meseleler

Geçmişte yaşanan gen tedavisi veya tedavileri trajik olaylardan dolayı insanların bu konudan bu terapötik girişiminden arınıp arınmayacağı ve genetik hastalıkların tedavisi olup olmayacağı soruları halâ cevap beklemektedir. Herhangi bir yeni tedavinin klinik denemeleripotansiyel olarak tehlike arz eder, gen aktarımı metadolojilerine, hayvan deneylerinde hassas reaksiyon verilmesi beklenemez. Bununla beraber hayat kurtaran antibiyotik ve organ nakillerinin tarihinde benzer trajedik sıkıntılar yaşanmıştır. Ancak yavaş yavaş bilimsel gelişmeler ile bir gün ağır ve tedavisi (şu anlık) bulunmayan genetik hastalıkların, bu gen tedavisi gelişmeleri ile ve yüksek teknolojilerle beraber bu sorunlar çözüme kavuşacaktır.

Gen Tedavisi: Etik Meseleler

Gen tedavileri ve/veya gen tedavi yöntemleri çeşitli kaygılara yol açmaktadır ve gen tedavileri etik kurullarının yoğun bir şekilde münakaşa ettikleri bir mesele haline gelmiştir. Gen tedavi yöntemleri olarak bilim insanları etik kurulunun bu domine edici baskıları ve spekülatif nedenlerden dolayı somatik gen tedavisi yöntemi kullanmaktadır. Bu yöntemde sadece tedavi olan birey etkilenmektedir ve tedaviye hastanın veya hasta yakınlarının bilgilendirilmiş onayı ile başlanır.

Eşey hücre gen tedavisi sadece bireyleri değil gelecek nesilleri de etkilemektedir. Bundan dolayı etik kurulları bu konuda taviz vermeyerek çözümlenmemiş mesele arasındadır. Gen tedavisi oldukça maliyetli bir tedavi yöntemidir. Gen tedavisi ile kimlerin tedavi olacağı konusu ise etik kurulunu veya kurullarını ateşlendiren bir diğer meseledir. Jesse Gelsinger olayı henüz bilinmezliğini koruyan bir etik konusudur yani Jesse'nin gen tedavisine gönüllü olarak katılıp katılmadığı, hastalığı için gen tedavisi gerekli miydi değil miydi tartışmalar arasında yer alan etik problemleri olarak gösterilir.

Çeviren ve Derleyen: Alper DEMİREZEN

KAYNAKÇALAR

a. Uchida M, Shimatsu Y, Onoe K, Matsuyama N, Niki R, Ikeda JE, et al. Production of transgenic miniature pigs by pronuclear microinjection Transgenic Res, 2001; 10 (6): 577-82. Doi: 10.1023/A:1013059917280.

b. Hofmann A, Zakhartchenko V, Weppert M, Sebald H, Wenigerkind H, Brem G, et al. Generation of transgenic cattle by lentiviral gene transfer into oocytes. Biol Reprod, 2004; 71 (2): 405-9. Doi: 10.1095/biolreprod.104.028472.

c. Ibraheem D, Elaissari A, Fessi H. Gene therapy and DNA delivery systems. Int J Pharm, 2014; 459: 70-83. Doi: 10.1016/j.ijpharm.2013.11.041.

d. Gehl J. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand, 2003; 177 (4): 437- Doi: 10.1046/j.1365-201X.2003.01093.x.

e. Lin MT, Pulkkinen L, Uitto J, Yoon K. The gene gun: Current applications in cutaneous gene therapy. Int J Dermatol, 2000; 39 (3): 161-70. Doi: 10.1046/j.1365-4362.2000.00925.x.

f. Attar, A., 2017. Gen terapisi yöntemleri: fiziksel ve kimyasal metotlar. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, Cilt/Vol 74, Sayı 1.

g. Klug, W.S., Cummings, M.R., Spencer, C.A., Palladino, M.A. 2018. “Genetik Kavramlar”, Çeviri Editörleri: Sümer, S., Açık, L., Tuncer, M., Palme Yayıncılık, Ankara.

h. Cooper, G.,M., Hausman, R., E., 2016. ‘’Hücre Moleküler Yaklaşım’’, Çeviri Editörleri: Atabey, N., Kalay, E., Sakızlı, M., İzmir Tıp Kitabevi, İzmir.

i. Molecular Biology of the Cell; Alberts, B. 2009

j. Nelson, D., L., Cox, M., M., 2013. ‘’LEHNINGER BİYOKİMYANIN İLKELERİ’’. Çeviri Editörü: Elçin, M., Y., Palme Yayıncılık, Ankara.

k. Karataş, M., 2014. ‘’MOLEKÜLER BİYOLOJİ’’, Nobel Yayıncılık 2. Basım, Ankara.

GÖRSEL KAYNAKÇALAR

● https://www.mdpi.com/2072-6694/11/9/1265/htm

●https://www.researchgate.net/publication/303822936_The_Use_of_Viral_Vectors_in_Gene_Transfer_Therapy/figures?lo=1&utm_source=google&utm_medium=organic

● https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352304217300272

● https://www.nature.com/articles/s41576-019-0205-4?proof=t

● http://weeklywrite744.weebly.com/blog/ashanti-desilva-biography-for-california-coll ege-students

● http://www.mun.ca/biology/scarr/Somatic_Therapy_for_SCID.htm

● https://en.wikipedia.org/wiki/Jesse_Gelsinger

● https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0939641114003774

● https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/hum.2017.160

● https://www.nature.com/articles/nmeth.1805

● https://www.researchgate.net/publication/301252635_Gene_editing_for_corneal_dis ease_management/figures?lo=1&utm_source=google&utm_medium=organic

● https://www.bulenttiras.com/6-soruda-mikroenjeksiyon-icsi-nedir

● http://sitn.hms.harvard.edu/flash/2015/how-to-make-a-gmo/

● https://www.researchgate.net/publication/326150925_Advanced_physical_technique s_for_gene_delivery_based_on_membrane_perforation/figures?lo=1&utm_source=g oogle&utm_medium=organic

● https://www.fusfoundation.org/mechanisms-of-action/sonoporation

● http://www.chemicell.com/products/Magnetofection/Magnetofection_separation.htm

#tedavisi #tedavisi #yöntemleri