Faj Gösterim Teknolojisi

Phage display technology, yani faj gösterim teknolojisi, 1985’te George Smith tarafından tanımlanmıştır.

Bakteriyofajları kullanarak onların genomuna entegre edilmiş bir genin ifade edilip virüs kapsülüne yerleşebileceğini göstermiştir. Makalesine ‘’Filamentli füzyon fajı: virion yüzeyinde klonlanmış antijenleri gösteren yeni ekspresyon vektörleri.’’ başlığını vermiştir. Yabancı DNA parçaları, filamentli faj geni III içine, ortada yabancı sekansa sahip bir füzyon proteini oluşturmak için yerleştirilebilir. Füzyon proteini, bulaşıcılığı koruyan ve yabancı amino asitleri immünolojik olarak erişilebilir formda gösteren viryona dahil edilir. Bu "füzyon fajı", yabancı sekansa karşı yönlendirilmiş antikor için afinite ile normal faj üzerinde 1000 kattan fazla zenginleştirilebilir. Füzyon fajı, bir genin ürününe karşı bir antikor mevcut olduğunda bir geni klonlamanın basit bir yolunu sağlayabilir. (1)

Protein üretimine odaklı bu çalışmalarıyla, George P. Smith, Frances Arnold, Gregory Winter 2018 Nobel Kimya Ödülü’ne layık görülmüştür. Smith ve Winter faj gösterimi tekniğini geliştirirken; Arnold, yönlendirilmiş evrim adını verdiği düşüncesini temel alarak enzim geliştirme çalışmaları yapmıştır. Tüm bunlar kanser araştırmalarına yön vermiş, immünoterapide umut vadetmiştir.

Bilindindiği üzere faj, bakteriyi enfekte eden virüstür. Bu çalışmalarda en çok kullanılan bakteri ise bir gram negatif bakteri türü olan Escherichia coli’dir. G.Smith çalışmasında filamentli (ya da flamentöz) faj kullanmıştır. Bu fajların en önemli özelliği Escherichia coli'yi en verimli şekilde enfekte etmesidir. Bu fajların en bilinen örneği M13 fajıdır. M13 fajı, genetik mühendisliği alanında rekombinant DNA çalışmalarında klonlama yapmak amacıyla en çok kullanılan vektörlerden biridir.

Aslında, bu yöntem ligand ve reseptör arasındaki reaksiyona dayanmaktadır. Proteinlerin fajların yüzeyinde gösterilmesi, bağlayıcı aktiviteye sahip proteinleri kodlayan alışılmadık niteliklerin seçimi için güvenilir bir stratejidir. Faj gösterimi, çok değerli konfigürasyonda önemli farklılıklar gösteren farklı miktarlarda peptitleri gösterecek şekilde ayarlanabilir. Ekran seviyesi sekansa ve ayrıca poli (peptit) uzunluğuna dayanır. Küçük peptitler durumunda (8 rezidüden daha küçük), yüzlerce veya binlerce kopya gösterilebilir. Bu teknoloji, herhangi bir proteine yüksek bağlanma afinitesi olan küçük peptidleri (1-20 rezidü) vermek için uygundur.

Rekombinant antikorların üretimine yönelik çalışmalara bakıldığında, örneğin, immünoglobulin moleküllerinin yüksek karmaşıklığı nedeniyle büyük miktarlarda antikor üretimi zordur. Dolayısıyla araştırmacılar antijene özgüllüğü koruyan ve aynı zamanda önemli avantajlar sağlayan diğer küçük boyutlu antikor biçimlerini üretmeyi düşünmüşlerdir. Bu amaçla peptid faj kütüphaneleri oluşturulmuştur. Bu yöntemle tamamen insan antikorları üretilebilmektedir. Faj yüzeyinde ilk sergilenen protein antikor olmuştur.

Faj gösterim tekniğinin işleyişine monoklonal antikor üretimi uygulamasıyla bakalım:

* Gen fragmanının üretimi : Bu faz, istenen antijen ile hayvan immünizasyonunu ve ardından B lenfositlerinin izolasyonunu, mRNA ekstraksiyonunu ve cDNA sentezini içerir. Sentezlenen cDNA, çeşitli antijenleri hedef alan tüm antikorların genetik bilgisini içerir ve yaklaşık 109 ila 1011 lenfosit klonundan oluşur.

* Bu gen fragmanlarının fajmid (M13 ori bölgesi içeren) vektörlerine klonlanması : Farklı antikor klonlarına ilişkin genler, restriksiyon enzimleriyle kesilir, fajmid vektörlerine klonlanır ve sonra fajların yüzeyinde görüntülenir. Bu aşamadaki fragmanların sekans çeşitliliği, sonraki aşamalarda antikorların optimum izolasyonuna yol açar. Şimdiye kadar, antikor fragmanlarının gösterilmesi için faj λ, T4, T7 ve M13 gibi çeşitli fajlar tarif edilmiştir. Bu vektörler, görüntülenen antikorlara, faj yüzeyindeki işlevlerini sürdürmeleri için yardımcı olur. Ancak yukarıda belirtildiği gibi bakteriyel hücreleri tahrip etmeyen M13 gibi fajların kullanılması en verimlidir. Fajmid vektörler, bakteriyel hücrelerden paketlenmesi, çıkması ve ortama girmesi için yardımcı faja ihtiyaç duyar.

* Spesifik fajların seçimi : Klonlamadan sonra, antikor genindeki çeşitlilik nedeniyle, çeşitli antikor klonları fajın yüzeyinde ortaya çıkar. Antijeni tanıyan spesifik klon seçimleri (hedefimiz olan) biopanning ile yapılır. Faj yüzeyindeki antikor fragmanları fonksiyonel olduğu için, spesifik antikor içeren faj, spesifik olmayan fajlardan izole edilebilir (antijen-antikor bağlama özellikleri nedeniyle). Bu aşamada, fajın yüzeyinde, hedef antijene bağlanma yeteneklerine bağlı olarak eksprese edilen antikorlar, biopanning yoluyla zenginleştirilecektir. Biopanning işlemleri şunları içerir: antijenin immobilizasyonu, fajların bağlanması, bağlanmamış fajların yıkanması ve çıkarılması, bağlanmış fajların elüsyonu, bakteriyel hücrelerin tekrar enfekte edilerek elüsyonu yapılmış fajların çoğaltılması, rekombinant fajların saflaştırılması ve faj yüzeyindeki antikorların yeniden ekspresyonu. Biyopanning genellikle hedefe yüksek afiniteye sahip spesifik antikorları izole etmek için 3 ila 5 kez tekrar eder. Katı fazda kaplanmış antijene dayalı faj seçiminin en yaygın olduğu biyopanning için farklı in vitro ve in vivo modeller tarif edilmiştir.

* Screening : Hedefe yüksek afiniteye sahip antikorların izolasyonu bu adımın ana amacıdır. Tarama, immünoassay, immünositokimya, floresan özellikleri nedeniyle hücrelerin aktif izolasyonu ve immünoblotlama gibi farklı yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. İmmün tahlilinde, ilk antijen katı fazda kaplanır, faj gösteren antikor eklenir ve daha sonra fajların yüzey proteinlerini tespit eden ikincil antikor eklenir. İnkübasyon ve yıkamadan sonra, sinyal değeri ve bağlanma uygun dalga boyunda ölçülür.

Bu yöntem, birçok ayrıntıya sahip olmakla birlikte anlaşılacağı üzere yöntemde en özen gösterilmesi gereken nokta faj ve konak hücre seçimidir. Yaptığım derleme konuyla ilgili genel bilgileri içermekle birlikte bu konuyla ilgilenmek isteyenlerin altında yatan mekanizmaları, uygulamalarını, hedeflerini araştırmalarını tavsiye ederim.

Çeviren ve derleyen : Büşra AKYOL

KAYNAKLAR

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4001944

2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2221169117305130

#gösterim #teknolojisi