Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Embriyonik Kök Hücrelerin Pluripotens Özelliğinin Transkripsiyonel Düzenleme, Epigenetik ve Mikrorna Açısından İncelenmesi

Embriyonik kök hücreler, pluripotent ve kendini yenileme yeteneğine sahiptirler. Bu özelliklerinden dolayı rejeneratif tıp için umut vadederler.

Pluripotent ve kendini yenileme özelliklerinin altında yatan moleküler mekanizmanın anlanması amacıyla çalışmalar yapılmıştır. Pluripotensiliğin devam ettirilmesinde ve embriyonik kök hücrelerin farklılaşmasında miRNA'ların rolleri, transkripsiyonel ve epigenetik düzenlemeler incelenmiştir.

Embriyonik kök hücreler, implantasyon öncesi embriyonun iç hücre kitlesinden (Inner Cell Mass) sağlanır ve pluripotensi özelliği sayesinde üç temel germ tabakasının tüm dokularına dönüşebilir. Pluripotensi özelliği ayrıca doku formasyonu ve hücre replasman tedavisi için umut vadetmektedir. Klinik uygulamanın asıl amacına ulaşması için, embriyonik kök hücreler spesifik bir soyda farklılaşmaya ihtiyaç duymaktadır ve farklılaşmamış embriyonik kök hücrelerin farklılaşmış olanlarından elenmeleri gerekmektedir. Bu yüzden embriyonik kök hücrelerin pluripotensi özelliğinin altında yatan moleküler mekanizmayı anlamak, farklılaşmış durumlar ile pluripotent arasındaki farklılıkların daha iyi anlanması ve kullanılması için önemlidir.

Embriyonik kök hücrelerin diğer bir özelliği de sürekli olarak kendini yenileyebilmeleridir ki bu da pluripotentliğin özgün transkripsiyonel profilini sürdürmesi için gereklidir. Buna karşın, çeşitli hücrelere farklılaşması için embriyonik kök hücrelerin alternatif transkripsiyonel profilleri değiştirilmelidir. Bu noktada hem transkripsiyonel hem de epigenetik düzenleme, mevcut transkripsiyonel profilin korunmasında ve kontrolünde esas rolü oynamaktadır. Ayrıca, gen düzenlenmesinin yeni düzenleyicilerinden olan mikroRNA'ların pluripotensinin düzenlenmesinde kilit nokta olduğu ortaya çıkmıştır.

Pluripotensi Faktörlerinin Düzenleyici Ağı

Pluripotent hücrelerin, özgün bir dizi faktör eksprese ettiği deneysel yaklaşımlarla varsayılmaktadır. Bu faktörlerin, pluripotent hücrelerin belirteçleri gibi olmasının yanı sıra işlevsel görevleri de vardır ve pluripotensinin korunması için önemlidir. Bu düşünceyi test etmek amacıyla embriyonik kök hücrelerin transkripsiyonel profilleri ve farklılaşmış türevleri karşılaştırılmıştır. Ancak bu çalışmaların sonuçları belirgin şekilde değişmiştir ve aday genlerin çoğunluğu fonksiyonel olarak onaylanmamıştır. Global mikroarray benzerlikleri, pluripotensiye biraz net bir bakış sağlamasına rağmen tek genlere odaklanılmış genetik çalışmalar, kritik pluripotensi faktörlerin tanımlanmasında başarılı olmuştur. İki homeodomain transkripsiyon faktörü olan OCT4 ve NANOG, erken embriyo gelişimi ve embriyonik kök hücrelerde pluripotensinin korunmasında gerekli olduğu belirlenen ilk proteinlerdir. OCT4 ve NANOG faktörlerinin rollerinin daha iyi tanımlanması amacıyla iki grup, insan ve fare embriyonik kök hücrelerinde çalışmalar yapmışlardır. Bir HMG-box transkripsiyon faktörü olan SOX2, insan embriyonik hücrelerinde mikroarray analiziyle birleştirilmiş kromatin immünopresipitasyonuna tabi tutulmuştur ve bu fare embriyonik hücrelerinde farklı genlerin regülasyonu için SOX2 faktörünün, OCT4 ile heterodimerize edilmesi gibidir. OCT4, SOX2 ve NANOG, hedef genlerinin önemli parçasını paylaşırlar. Bu üç faktör, geniş bir regülasyon çemberinde biri diğerinin kontrolünü sağlar. OCT4, SOX2 ve NANOG'un birçok hedefi, farklılaşma ve gelişmede anahtar transkripsiyon faktörlerini kodlar ve Embriyonik kök hücrelerde transkripsiyonel olarak inaktiftir. OCT4, SOX2 ve NANOG ayrıca pluripotensiliğin korunmasında yer alan transkripsiyonel olarak aktif genleri de düzenler. Oct4, Sox2 ve Nanog'a ek olarak, Sall4, Dax1, Essrb, Tbx3, Tcl1, Rif1, Nac1 ve Zfp281 gibi pluripotensi için gerekli birçok faktör tanımlanmıştır. Bu pluripotensi faktörleri, Embriyonik kök hücrelerde karmaşık bir transkripsiyonel düzenleyici ağ oluşturmak için birbirlerini düzenlerler. Örneğin bir 'spalt' ailesinin üyesi olan Sall4, Nanog ve Nanog'la birlikte çalışan Sall4 enhancer bölgeleriyle etkileşir. Ayrıca, Oct4 promotörüne bağlanarak Oct4 ekspresyonunu düzenler. Essrb ve Rif1, Oct4 ve Nanog'un başlıca hedefleridir.

DNA bağlama aktivitelerinin haricinde bu pluripotensi proteinler, yaygın olarak protein-protein etkileşimleri aracılığıyla birbiriyle bağlantılıdırlar. Nanog faktörüyle başlayarak, Nanog ilişkili proteinlerin saflaştırılması ve etiketlenmesiyle fare embriyonik kök hücrelerinde bir protein etkileşim ağı kurulmuştur. Bu etkileşim, ICM'nin hayatta kalması veya farklılaşması ve erken gelişim için gerekli olan proteinler için son derece zenginleştirilmiştir. Etkileşim ağındaki proteinleri kodlayan genlerin çoğu Nanog ve / veya Oct4'ün hedefleridir ve transkripsiyonel ağın protein etkileşim ağı sayesinde bir feedback mekanizmasını mümkün kılabileceğini akla getirmektedir. Bu protein etkileşim ağı, büyük ölçüde transkripsiyonel olarak baskılayıcı çeşitli kofaktör yollarına bağlanır. Bu veriler, temel faktörlerin, pluripotenste yer alan genleri aynı anda aktive ederek ve gelişme için önemli olan genleri baskılayarak pluripotent durumunu koruduğu bir modeli desteklemektedir.

Somatik hücrelerin spesifik genlerle yeniden programlanmasındaki son başarı, bu faktörlerin plupotensideki gerekli rollerini de doğrulamıştır. OCT4, SOX2, c-Myc ve Klf4 faktörlerinin hepsi fare yetişkin ve fibroblast hücrelerini pluripotent duruma yeniden programlayabilir. Bu dört faktörün ayrıca insan deri fibroblastlarını yeniden programlayabildiği kanıtlanmıştır, fakat başka bir grup; OCT4, SOX2, NANOG ve LIN28'in insan somatik hücrelerinden pluripotent hücreler oluşturmak için yeterli olduğunu göstermiştir. Bu faktörlerin pluripotensiliğe indüklemede birlikte nasıl çalıştığı anlaşılması zordur, ama onların transkripsiyonel düzenlemedeki direkt fonksiyonlarına ek olarak kromatin konformasyonunu modüle etmek için kromatin yeniden modelleme faktörleri ve histon modifiye edici enzimlerle etkileşime girmeleri muhtemeldir.

Pluripotent Hücrelerde Kromatinin Epigenetik Regülasyonu

Pluripotensiyle transkripsiyonel faktörlerin belirlenen yakın ilişkisi, diğer protein sınıflarının ya da protein olmayan faktörlerin pluripotensiliğe katkıda bulunup bulunmadığını açıklamada yeterli olmamıştır. Transkripsiyonun substratı olarak kromatin, spesifik genomik bölgelerdeki transkripsiyonel aktiviteyi modüle eden epigenetik düzenlemenin çeşitli biçimlerine (kromatin yeniden biçimlenmesi, histon modifikasyonları, histon türevleri ve DNA metilasyonu gibi) tabi tutulmuştur. Örneğin, histon 3'ün (H3K9 ve H3K27) lizin 9 ve lizinin 27 trimetilasyonu, kromatinin inaktif bölgeleri ile ilişkiliyken, H3K4 trimetilasyonu ve H3 ve H4'ün asetilasyonu aktif transkripsiyon ile ilişkilidir ve DNA metilasyonu genellikle gen ekspresyonunu bastırır. ES ve somatik hücrelerin özdeş genomik DNA içerdiği göz önüne alındığında (birkaç istisna dışında), epigenetik düzenleme onların farklılaşma potansiyelleri üzerindeki en önemli etkilerden biridir ve ayrıca pluripotens için önemlidir.

ES hücrelerinde pluripotensiliği sürdürmek için, up-regülasyonu farklılaşmaya yol açan genler inaktif olmalıdır. Polycomb grup proteinleri (PcG) bu gelişimsel düzenleyicileri susturmada önemli rol oynamaktadır. PcG proteinleri, iki farklı Polycomb Baskılayıcı Kompleksinde (PRC1 ve PRC2)'de işlev görür. Fare ES hücrelerinde PRC1 ve PRC2 için ve insan ES hücrelerinde PRC2 için genom çapında bağlanma alanı analizleri gerçekleştirilmiştir. PcG proteinleri tarafından düzenlenen genler, trimetillenmiş H3K27 ile nükleosomların iş birliği ile işler. Bu genler, ES hücrelerinde transkripsiyonel olarak bastırılır ve farklılaşma indüklendiğinde tercihen aktive edilir. Bu genlerin çoğu, transkripsiyon faktörlerini gelişimdeki önemli rollerle kodlar. İlginç bir şekilde, pluripotens faktörleri (OCT4, SOX2 ve NANOG), PcG proteini ile düzenlenmiş genlerin önemli bir kısmını oluşturur. Bu veriler, PcG proteinlerinin gelişimsel yolları baskılayarak pluripotesi devamlılığını kolaylaştırabileceğini düşündürmektedir.

ES hücrelerinde inaktif gelişim düzenleyicileri, farklılaşma üzerine aktivasyon gerektirir. ES hücreleri, bu genlerin aktivasyon için etkili olduklarından emin olmaya yönelik spesifik mekanizmalara sahiptir. Yakın zamanda keşfedilen “bivalent” histon kodu, hedef genini transkripsiyon için “dengelenmiş” bir halde tutar.Bivalent domain hem baskıcı hem de aktif histon belirleyicilerine sahiptir: daha küçük bir H3K4 trimetilasyon bölgesi barındıran geniş bir H3K27 trimetilasyon bölgesi. ES hücrelerinde, bivalent domainler çoğunlukla, düşük seviyelerde eksprese edilen gelişimsel olarak düzenlenmiş transkripsiyon faktörleri ile ilişkilidir. Farklılaşma üzerinde bivalent domainlerin çoğu, gen ekspresyonunda ilişkili değişikliklerle tutarlı olarak ya H3K4 ya da H3H27 metillenmiş hale gelir. Bu bivalent histon kodu başlıca gelişimsel transkripsiyon faktörlerini düzenlemesine rağmen, bazı dokuya spesifik genler (Ptcra, Il12b ve Alb1 gibi) ES hücrelerinde metillenmemiş CpG dinükleotitleri ve varsayılan “öncü” faktörlerin pencereleri tarafından kontrol edilmektedir. Bu dokuya spesifik genler, ES hücrelerinde susturulur ve promoter ve enhancer bölgelerindeki CpG dinükleotitlerinin çoğu metillenir. Metillenmemiş pencereler, metillenmemiş durumun devamlılığı için transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasının gerekli olduğu sessiz enhancerlarda konumlanmıştır. Ve bu metillenmemiş pencereler farklılaşmış hücrelerde dokuya spesifik genlerin aktivasyonu için gereklidir.

Gelişim ile ilişkili genlerin spesifik düzenlemelerinin ötesinde, ES hücreleri kromatini son derece dinamik ve transkripsiyonel olarak izin veren bir halde korur. Önce, ES hücre çekirdeğinde daha az heterokromatin odağı belirlenir, burada farklılaşmış hücrelerdekinden daha dağınık görünürler. İkinci olarak, , photobleaching ve biyokimyasal analizlerden sonra UV ışıması geri kazanımı farklılaşmış hücrelerle karşılaştırıldığında, ES hücrelerinin, çekirdek ve bağlayıcı histonlarının yanısıra HP1 heterokromatin proteini de dahil olmak üzere gevşek bağlanmış ya da çözünür mimari kromatin proteinlerinin artmış bir fraksiyonuna sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Bir hiperdinamik kromatin yapısı pluripotensinin devamlılığı için fonksiyonel olarak önemlidir, çünkü bağlayıcı histon H1'in dinamik değişiminin kısıtlanması ES hücre farklılaşmasını engeller. Üçüncü olarak, histon modifikasyonlarının durumu ayrıca ES hücrelerindeki kromatinin farklılaşmış hücrelerden transkripsiyonel olarak daha serbest olduğunu gösterir. Global kromatin dinamikleri ile paralel olarak, ES hücre farklılaşması asetillenmiş histon H3 ve H4 gibi global histon işaretleri seviyelerinde azalma ve baskılayıcı histon işaretlerinde, özellikle histon H3 lisin 9 metilasyonunda bir artışla ilişkilidir. Bunun gibi büyük ölçüde dinamik ve transkripsiyonel olarak serbest bir kromatin ortamı, farklılaşma üzerinde seri transkripsiyonel profillerini kolaylaştırabilir ve çeşitli transkripsiyonel profillerinin oluşturulmasına izin verebilir.

Kromatinin Epigenetik Düzenlenmesi Ve Pluriotensi Faktörleri

Hem pluripotens faktörleri hem de epigenetik düzenleyiciler pluripotensinin altında yatan temel mekanizmaları sağlar. İlk olarak, pluripotens faktörleri epigenetik kontrol faktörlerini kodlayan genleri düzenler. OCT4, SOX2 ve NANOG'un, kromatin yeniden modelleme ve histon modifikasyon komplekslerinin bileşenlerini (SMARCAD1, MYS3 ve SET gibi) kodlayan belirli genleri koordine ettiği gösterilmiştir. İkincisi, pluripotens faktörleri ayrıca histon değiştirici enzimler ve kromatin yeniden modelleme kompleksleri ile etkileşime girer. Nanog ve Oct4, histon deasetilaz NuRD (P66b ve HDAC2), policomb grubu (YY1, Rnf2 ve Rybp) ve SWI / SNF kromatin yeniden modelleme (BAF155) kompleksleri ile doğrudan ya da dolaylı olarak etkileşir. Son olarak, pluripotens faktörlerin genleri epigenetik düzenlemeye tabi tutulur. Bunun iyi örnekleri, OCT4'ün downstream'deki hedefleri olan iki histon demetilaz genleri: Jmjd1a ve Jmjd2c'dir. Jmjd1a, promotörlerdeki H3K9Me2'nin demetilasyonu yoluyla pluripotens ilişkili genlerin, Tcl1, Tcfcf21 ve Zfp57'nin pozitif bir düzenleyicisi olarak görev yapar. Jmjd2c, Nanog ifadesini pozitif olarak düzenlemek için Nanog promotöründe H3K9Me3 işaretlerini kaldırır.

Mikrorna'lar İle Pluripotens İlişkisi

Son çalışmalar, kodlayıcı olmayan RNA'nın, büyük bir omurgalı transkriptom fraksiyonu içerdiğini keşfetmiştir. Kodlayıcı olmayan tüm RNA'lar işlevsel olmasa da, çoğu düzenlemede önemli rol oynar. Hem insan hem de fare embriyonik kök hücrelerinde, mikroRNA ekspresyon profilleri embriyonik kök hücrelerin özgün bir miRNA seti ifade ettiğini ve bu miRNA'ların embriyonik kök hücrelerin embriyoid cisimciklerine farklılaştıkça down-regüle edildiğini meydana çıkarmıştır. Bu miRNA'ların bazıları, insan ve fare arasında korunur ve genomda toplanır. Bu veriler miRNA'ların embriyonik kök hücrelerde pluripotensin korunmasında rol oynayabileceğini göstermektedir.

MikroRNA'lar da embriyonik kök hücre farklılaşması için önemli görünmektedir. RNA interferans (RNAi) ve miRNA jenerasyonu için kritik olan bir RNase III ailesi nükleazı olan Dicer'ın yıkılması, embriyonik kök hücre proliferasyonunu tehlikeye sokmakta ve embriyonik kök hücreleri farklılaşmada verimsiz kılmaktadır. Dicer hem RNAi hem de miRNA üretimi için gerekli olduğundan, bu deney embriyonik kök hücrelerdeki kusurdan hangi yolun sorumlu olduğunu belirlemez. MiRNA'ların pluripotenste spesifik rolünü araştırmak için, miRNA'nın işlenmesinde RNase III enzimi Drosha'ya yardımcı olan bir RNA-bağlayıcı protein olan DGCR8, fare embriyonik kök hücrelerde yıkılmıştır. DGCR8'in kaybı, RNAi yolunu etkilememesine rağmen, olgun miRNA'ların tamamen yok olmasıyla sonuçlanır. Farklılaşmaya uyarıldığında, DGCR8 olmayan embriyonik kök hücreler pluripotens işaretlerini tamamen regüle edemez ve bir embriyonik kök hücre koloni morfolojisini koruyamazlar. Yine de, embriyonik kök hücre farklılaşmasında miRNA'ların spesifik rolünü yansıtan bazı ayırt edici işaretleyicileri ifade ederler. Bazı miRNA'lar, embriyonik kök hücre farklılaşmasını destekledikçe, bunların gelişimle ilişkili genler gibi düzenlenmesi, yani embriyonik kök hücrelerinde bulunmaması ve daha sonra farklılaşma üzerinde up-regüle edilerek düzenlenmesi beklenirdi. İlginç bir şekilde miRNA'ların ifadesi, hem transkripsiyonel hem de post-transkripsiyonel düzeyde düzenlenir. Fare embriyonik kök hücrelerde miRNA işleminin post-transkripsiyonel regülasyonu in-vivo olarak erken fare gelişimi sırasında olmasının yanı sıra in-vitro'da da gözlemlenmiştir. Let-7 ailesinin üyeleri dahil olmak üzere birçok miRNA primer transkripti yüksek seviyelerde bulunur, fakat embriyonik kök hücrelerde Drosha tarafından işlenmez. Embriyonik kök hücreler farklılaştıkça, primer miRNA transkriptleri, daha sonra farklılaşmayı kolaylaştıran olgun miRNA'lar oluşturmak için işlenir. İnsan somatik hücrelerini yeniden programlamak için kullanılan dört faktörden biri olan LIN28, embriyonik kök hücrelerde miRNA işleminin bloke edilmesinde rol oynadığı gösterilmiştir.

Pluripotensinin sürdürülmesinde miRNA'nın önemine rağmen, miRNA'ların pluripotensi nasıl düzenlediğini açıklayan ayrıntılı mekanizmalar hala mevcut değildir. MikroRNA'lar pluripotens ilişkili genlerin down-regülasyonu ile farklılaşmayı kolaylaştırabilir, böylece hücrelerin farklılaşmaya doğru pasif olarak sürüklenmesine izin verir. Örneğin, miR-134'ün, embriyonik kök hücrenin hücre diferansiyasyonunun ektodermal yoluna, kısmen de Nanog ve LRH1'in doğrudan translasyonel zayıflatılmasından dolayı desteklediği gösterilmiştir. Embriyonik kök hücrelerin kendini yenileme ve farklılaşmasında miRNA'ların daha fazla araştırılması, pluripotensin hem korunması hem de inhibisyonunda miRNA'ların işlevlerini açıklamak için gereklidir.

Çeviran ve Derleyen : Büşra Akyol

Kaynak : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18632692