ELEKTROFOREZ PROTOKOLÜ
Jel elektroforezi nedir?
DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla birlikte tüm laboratuarlarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden birisi jel elektroforezidir. DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerinde hareketine dayanmaktadır. Bu hareketin hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmanlarının ayrılabilmesini sağlamasıdır. UV ışığı altında fluoresan etki gösteren etidyum bromür (EtBr) boyasının kullanımı ile çok düşük konsantrasyonlarda (1–10 ng) olsa bile, DNA’nın jel üzerindeki yerini belirlemek mümkündür.
Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmanları (5–500 baz) ve RNA moleküllerinin ayrımında kullanılır. Bu tip ayrım güçleri yüksek jeller, boyut bakımından birbirine çok yakın DNA fragmanlarının analizleri için uygundur. 1 Mb’ dan(megabaz) daha büyük doğrusal çift iplikli DNA molekülleri, jelin por büyüklüğünün doğrusal DNA’nın hareketine yeterli olmaması nedeniyle agaroz jelde aynı hızda hareket ederler. Bunun için Pulse field jel elektroforezi önerilir. Bu yöntemde DNA molekülleri bir elektriksel akıma uygun olarak hareket ederken kısa bir süre sonra farklı bir akıma uygunluk göstermek durumunda kalırlar. Bu şekilde küçük moleküllerin elektriksel alan değişimlerine daha hızlı ve daha kolay uyum sağlamalarından yararlanılarak ayrım elde edilir.
Agaroz jel elektroforezi nasıl hazırlanır ?
Örnek olarak %1-2’lik bir agaroz jel hazırlamak için; 100ml 0,5X TAE ve 1–2 g agaroz bir erlen içerisine ilave edilerek mikrodalga fırında agaroz tamamen çözülünceye kadar kaynatılır, bu aşamada jelin taşmasına engel olmak için yaklaşık 500 ml’lik bir erlen kullanılması tavsiye edilmektedir. Agaroz tamamen çözündükten sonra biraz soğuması beklenmeli fakat katılaşmamasına dikkat edilmeli ve yaklaşık 5 µl EtBr (10 mg/ml) solüsyonu eklenmelidir. Tarakların doğru olarak yerleştirilip yerleştirilmediği kontrol edildikten sonra jel elektroforez tepsisine üzerinde herhangi bir kabarcık kalmamasına dikkat edilerek dökülmelidir. Agaroz jel bu şekilde 15–30 dk bekletildikten sonra kullanılabilir. EtBr güçlü bir mutajenik ajan olduğu için jel dökme işleminin, havalandırılması uygun odalarda ya da çeker ocaklı kabinler içerisinde yapılması tavsiye edilir.
Agaroz jelin tamamen donmasının ardından kuyunun örnek yükleme kapasitesine uygun olarak 6x jel yükleme solüsyonu ve bunun 6 katı oranında örnek (1’e 6 oranında) karıştırılarak ilgili kuyuya yüklenir, jel yükleme solüsyonu örneğin kuyuya oturmasına ve elektroforez sırasında örneğin takip edilmesine imkân vermektedir. Ayrıca bant büyüklüklerinin karşılaştırılabilmesi amacı ile bant büyüklükleri bilinen bir DNA standardının da jele yüklenmesi tavsiye edilmektedir. Ortalama olarak 100-200V arasında 30 dk yürütülebilmekle birlikte, jelin yürütülme süresi kullanılan elektroforez tankının büyüklüğüne, kullanılan agaroz çeşidine ve analiz edilen bant büyüklüğüne bağlı olarak farklılık göstermektedir. Elektroforez işleminin ardından UV ışık altında görüntüleme sistemi ile bantların değerlendirmesi yapılabilmektedir.
Biyokimya
-
Serum Enzimlerini Tayin Yöntemleri
-
Fosfatazlar (Alkali fosfataz= ALP)
-
Transferazlar
-
Transaminazlar
-
Enzimlerin Görev, İşlev ve Özellikleri - Enzimlerin İsimlendirilmesi
-
Kanda Bilirubin
-
Serum Proteinleri
-
Fosfolipidler
-
Trigliseridler
-
Kolesterol Nedir?
-
Kan Lipitleri Nelerdir?
-
Kan Şekeri Nedir?
-
Araşidonik Asit (ARA) Nedir?
-
Lizozim enzimleri
-
Lizozim: İlk Antibiyotik