DOKU TAKİBİNİN (İMPREGNASYON ) PRENSİPLERİ
Doku takibinin amacı, dokuyu desteklemek için yeterince sert bir katı ortama gömmek ve kesitlerin alınması için gerekli sertliği vermektir. Bu sertliği verirken de dokunun bıçağa çok az zarar verecek sertlikte olmasını sağlamaktır. Rutin histoloji için tatmin edici gömme materyeli parafindir. Doku parafine gömülmeden önce şu işlemlerden geçirilmelidir.
l-Fiksasyonun tamamlanması
2-Sulu fiksatifi ve doku sıvısını uzaklaştırmak için hafif fakat tatmin edici bir dehidrasyon
3-Hem kendinden önceki dehidrasyon ajanı ile hem de daha sonra uygulanacak gömme ajanı ile tam olarak karışabilen bir madde ile şeffaflandırma
İMPREGNASYON HIZINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER
Doku sıvıya daldırıldığında, doku sıvısı ve çevresindeki sıvı arasında karşılıklı yer değişimleri olmaktadır ve bunu birçok faktör etkilemektedir. Bunlar fiksasyondan gömmeye kadar tüm basamakları etkilemektedir.Bunlar:
1-Ajitasyon: Shandon Elliott ve Technicon ultra modelleri vertikal ajitasyon uygularken Colombia Histokineti dönme hareketi uygulamaktadır. Ajitasyonun hızı önemlidir, çok düşük hız etkisizken, çok yüksek hız ise yumuşak veya gevşek dokularda harabiyete yolaçabilir. Dakikada 25-30 cm' lik bir hız her iki ajitasyon için de uygundur.
2-Isı: Isı penetrasyon hızını artırırken, soğuk azaltır. Isı her nekadar süreci hızlandırırsa da dokuları fazla ısıtmamaya dikkat edilmelidir. Çünkü büzülmeye, gevrekleşmeye ve kesit almada zorluklara yol açabilir. Kullanılan sıvıların birçoğu yanıcıdır ve ısıtma yangın tehlikesini artırabilir.
3-Viskozite: Kullanılan sıvıların viskozitesi, dokulara penetre olma hızını etlkiler, molekül büyüdükce viskozite artar ve penetrasyon hızı azalır.
4-Ultrason: Ultrason kullanımı önerildiği halde birçok nedenle çok geniş kullanım kazanamamıştır.
5-Vakum: Azaltılmış vakumun kullanımı erimiş parafinle dokuların impregnasyonunda çok kullanılmaktadır. Bazı otomatik takip aletlerinde takibin tüm basamaklarında vakum kullanılmaktadır. Dehidrasyon ve şeffaflandırmada vakumun kullanılmasının çok az avantajı vardır. Dokudaki hava kabarcıkları bu yolla uzaklaştırır.
Sert Dokuların Muamelesi: Tendon, tırnak, fibröz doku, keratin kütleleri normal şekilde takip edilebilir. Fakat takipten önce özel işlemden geçirilirse daha iyi sonuçlar alınabilir. Bu dokuları yumuşatmak için % 70 lik alkolle hazırlanmış % 4 lük phenol kullanılabilir. Ayrıca molliflex gibi çeşitli gliserol, alkol ve anilin oil karışımları da kullanılabilir. Mollflex, kesit alırken parafin bloklarda da kullanılabilir.
3-SUDAN KURTARMA ( Dehidrasyon)
Tespitten sonra suyun ve bazı lipid doku sıvılarının uzaklaştırılmaları gerekir. Dehidrasyonda genellikle değişik alkol tipleri kullanılmaktadır. Bunların çoğu hidrofiliktir ve dokulardaki suyu çekerler. Diğerleri ise sulu doku sıvılarının seyreltilmeleri ile dehidrasyonu etkilerler. Dehidrasyon basamağı katılaştırıcı ortam olarak suyla karışabilen madde kullanan gömme teknikleri hariç tüm tekniklerde kullanılır.
Dokular genellikle fazla miktarda su içerirler. Dokulardan suyun çıkarılmasıyla erimiş parafinin doku parçalarına tamamıyle nüfus etmesi sağlanır. Alkol en iyi su çeken maddedir. Genellikle dehidrasyon safhasında doku parçaları tespitten sonra en az 2-3 saat akar suda yıkanırlar. Sonra %30 veya %50 alkolden başlayarak %10 artan alkol serilerinden geçirilirler. En çok kullanılan dehidrant etil alkoldür. % 70’lik derişim ile başlayarak, % 95’ lik alkole kadar artan derişimlerden sonra birkaç absolü alkolden geçirerek dokular sudan kurtarılır. Kademeli geçiş ile dokular büzülme olmadan sudan kurtarılır. Özellikle embriyonik dokular gibi hassas yapılarda % 30’ luk derişimden başlamak uygun olur.
Dehidrasyon Sıvıları
1-Etanol: Şeffaf, renksiz, yanıcı ve hoş kokulu bir sıvıdır. Hidrofiliktir bu yüzden su ile her oranda karışır. Histolojik çalışmalar için çok uygundur.
2-Ticari Endüstriyel Metillenmiş Ruh: Etanole biraz metanol eklenerek hazırlanmış bir dehidranttır.
3-Metil Alkol: Su, etanol ve çoğu organik çözücü ile karışır.
4-Propan-2-ol,ipopropil alkol:Su, etanol ve çoğu organik çözücü ile karışabilir.Rutin histoloji laboratuvarında çok kullanılmaz fakat dokuları etanolde olduğu gibi sertleştirmez.
5-Aseton: Renksiz, şeffaf, yanıcı ve karakteristik keskin kokulu, su, etanol ve çoğu organik çözücü ile karışan bir sivıdır. Yaygın kullanılan diğer dehidrantlardan daha uçucudur ve etanol ve metanolden daha hızlı hareket etmektedir. Fakat uzun süre mualemede dokuları gevrekleştirir. Uçucu, yanıcı yapısından ve sertleştirici etkisinden dolayı rutin dehidrant olarak otomatik takiplerde fazla kullanılmaz. Hız önemli olduğunda ise aseton, çoğu şeffaflandırma ajanını hızla uzaklaştırdığından elle takip yöntemlerinde iyi bir dehidranttır. Aseton, lipidler üzerine etanol ve metanolden daha çözücü bir etkiye sahiptir.
6-Katı Dehidrantlar: Anhidros bakır.sulfat yüksek konsantrasyonlu dehidretleyici alkollerde kullanılabilir. Anhidros olduğunda tuz beyazdır fakat suyun absorbsiyonunda mavileşir; su kontaminasyonu ile sıvı mavi renktedir.
7-Kimyasal Dehidrasyon: Son yıllarda. dokuların sudan kurtarımında 2,2-dimetoksipropanın kimyasal olarak su ile birleşimi kullanılmaktadır. Doku hızla aşağıdaki karışım kullanılarak sudan kurtarılır.
2,2-dimetoksi propan 100 cc
Konsantre HCl 0.05 cc
Bu yöntemde dehidrant tek seferde kullanılır, değişik kaplardan geçirmeye gerek yoktur. Gece boyunca tutmak gibi uzun süre kullanım, dokuda bir miktar büzülmeye yol açmaktadır. Dimetoksipropan çoğu resinle ve erimiş parafinle karışmaz. Fiksasyonu takiben ve dehidrasyondan önce doku suda iyice yıkanmalıdır. Çünkü tampon tuzları dimetoksipropanla precipite olur. Dimetoksipropan bir fiksatifle veya dehidrantla birleştirerek de kullanılabilir.
Dehidrasyon genellikle aşağıdaki gibi uygulanır:
%50 alkolde 1 saat
%60 alkolde 1 saat
%70 alkolde 1 saat
%80 alkolde 1 saat
%95 alkolde 2 saat
%100 alkolde 2 saat ( iki defa değiştirilerek)
4-ŞEFFAFLANDIRMA (Clearing) : Bu terim, dehidratlayıcı ajanı uzaklaştırmak için seçilmiş sıvının uygulanmasından sonra dokuların görünümünü ifade etmektedir. Bu sıvıların çoğu proteinlerinkine benzer bir refraktif indisine sahiptir. Bu nedenle de dokuyu yarı şeffaf hale getirir. De-alkolleyici ajan olarak ksilen kullanırken bu yarı şeffaflık, küçük bir doku parçası aydınlık görüldüğünde bir rehber olarak kullanılır. Şeffaflandırıcı ajanın kullanımı dehidratlayıcı ajanın-örneğin alkol- gömme ortamı ile karışmadığı zaman-örneğin parafinle- gereklidir. Bir şeffaflandırıcı ajandan esasda beklenen şey hem dehidrant .ile hem de gömme ajanı ile karışabilir olma özelliğidir. Bu amacı tam olarak yerine getirecek birçok sıvı vardır. Uygun şeffaflandırıcı ajanın seçiminde şunlara dikkat edilmelidir:
l-Alkolü uzaklaştırma hızı,
2-Erimiş gömme ortamı ile uzaklaştırılmasının kolaylığı,
3-Dokulara karşı nezaketi
4-Yanıcılık,
5-Toksisite
6-Fiyat
Şeffaflandırıcı ajanların çoğu yanıcı sıvılardır onun için dikkati gereklidir. Bir şeffaflanrıcı ajanın kaynama noktası erimiş parafinin uzaklaştırılmasındaki hızının belirleyiciliğini verir. Sıcak parafine aktarmada kaynama noktası düşük sıvılar, yükseklere göre uçuculuklarındaki fark nedeni ile daha hızlı uzaklaştırılmaktadır. Bu özellik vakum altında artırılır. Bu kesin bir faktör değildir. Örneğin çok düşük kaynama noktasına sahip olan kloroform, ksilene göre daha yavaş uzaklaştırır. Viskozite, şeffaflandırıcı ajanın penetrasyon hızını eşit olarak etkileyebilir. Parafine gömme takibinde kullanılan şeffaflandırıcı ajan, kesit almanın kolaylaştırılması üstüne ve kesitlerin sonuçtaki niteliği üzerine etkilidir. Çoğu şeffaflandırıcı ajan, dehidratasyon ajanının tam olarak uzaklaştırılması için gereklı minimum zamanda kullanılırsa tatmin edici sonuçlar verir. Otomatik olarak takip yapılıyorsa zaman çok geniş ve çok dens bloklar için yeterli olmalıdır fakat zamanda küçük doku parçaları , bu uzun uygulamadan da etkilenmemelidir.
Şeffaflandıcı Ajanlar
1-Ksilen
2-Toluen
3-Kloroform
4-Benzen
5-Karbon tetraklorür
6-Propilen oksit
7-Petrol
8-Karbon disülfit
9-Amilasetat
10-Metil benzoate ve metil salisilat
11-Sedir yağı
12-Karanfil yağı
13-İnhibisol (1,1,1,trikloroetan (metil kloroform)
Dehidrasyondan alınan doku parçaları xylol, toluol, benzen ve sedir yağı içine aktarılırlar. Burada parçalar şeffaflanıncaya kadar bırakılırlar. Amaç, dokulardaki alkolün şeffaflandırıcı madde ile yer değiştirmesidir. Böylece alkol ve sudan yoksun hale gelmiş ve şeffaflanmış doku parçaları artık parafinin nüfüz etmesine elverişli hale gelmişlerdir.
5-PARAFİNE GÖMME ( Embedding) :Gömme materyeli olarak parafin, selloidin, selloidin-parafin kullanılabilir. Amacı, dokuları yarı sert ve kolayca kesebilen bir materyal içerisine yerleştirmek ve şeffaflandırıcı ajanı dokudan uzaklaştırmaktır. Böylece kolay taşınan ve parçanın istenilen yönde kesilmesini sağlayan bloklar elde edilir. Histolojik çalışmalarda ençok kullanılan parafine gömme tekniğidir. Çünkü uygun takip hızına sahiptir, seri kesit alınımı için iyi bir kıvamı vardir. Kesit kalınlığında geniş ranjı vardır. Dens kortikal kemiği parafinde kesmek, kalın kesitler istendiğinde büyük beyin parçaları için sellüloz nitrat gömmesi veya dondurma kesit daha uygundur.
Erime derecesi 45-50 C olan parafin yumuşaktır, 55-60 C' lik ise daha sert olur. Parafinin seçimi çalışma ortamının ortalama ısısına, gömülecek materyelin yapısına ve istenilen kesit kalınlığına bağlı olmalıdır. 3-5 mikronluk kesitleri, sıcak bir iklimde 45 derecelik ergime noktası olan parafinle kesmek çok zordur. Parafine gömme safhası sıvı parafinin dokuya nüfuzu ve şeffaflandırıcı madde ile yer değiştirmesi ile başlayıp dokunun kesilmesi için uygun blok yapılması ile sona erer. Şeffaflandırıcı maddeden çıkarılan doku parçaları 55-60 C deki parafin etüvünde üç ayrı kaptaki erimiş parafinden geçirilerek blok yapılırlar. Genellikle doku parçaları parafinde 1 ,5 saat , 2.parafinde 1 .5 saat , 3.parafinde 2-3 saat kalabilir. Fakat her dokuya sıvı parafinin nüfuz etme kabiliyeti değişik olduğundan parafinde kalma süresi doku çeşitlerine göre tecrübe ile ayarlanmaktadır Büyükçe bir cam parçası üzerine ''L'' şekline sahip olan blok demirleri , tahta, hatta kağıtlardan yapılmış kare veya dikdörtgen şeklindeki kalıplara yerleştirilir. "Leuckhart's plakları'' ile hazırlanan kalıba önce bir miktar erimiş parafin, ardından dokuyu istenilen yönde yerleştirip tekrar parafin dökülerek etiketlenip soğumaya bırakılır. Sıvı parafin buz kalıplar içinde doku parçaları ile birlikte dondurulurak (soğuk su ile veya buzdolabında) kalıplardan kolaylıkla ayrılabilen sert parafin blokları elde edilir.
Histoloji
-
Endosülfan ve okratoksin-A’nın birlikte sıçanlarda toksisitesi: histopatolojik değişiklikleri
-
Histoloji Pdf Ders Notları
-
DEKALSİFİYE EDİLMEMİŞ KESİTLERİN HAZIRLANIŞI
-
DEKALSİFİKASYONU TEST ETMEK
-
KELATLAMA AJANLARI
-
ELEKTROLİTİK DEKALSİFİKASYON
-
ASİT DEKALSİFİKASYON SIVILARI
-
Histopatoloji nedir ?
-
KEMİK DOKUSU VE DEKALSİFİKASYON
-
MSS’DE DEJENERE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
MARKSCHE’DEN BOYASI (Spielmayer, Benda)
-
MSS‘DE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
KARIŞIK OLAN TEKNİK
-
BİELSCHOWSKY TEKNİĞİ
-
GÜMÜŞ ÇÖKTÜRME YÖNTEMLERİ