DISK DIFÜZYON TESTI PROSEDÜRÜ
1. Disk difüzyon testi
Rutin laboratuvarlarda antibiyotik duyarlılıgının saptanmasında en sık olarak kullanılan yöntem disk difüzyon testleridir. Ucuz ve uygulaması basit olan bu yöntem Kirby- Bauer tarafından gelistirilmistir ve bu isimlerle de anılmaktadır. Bu test, kagıt disklere emdirilen antibiyotigin, duyarlılıgı arastırılan organizmanın inoküle edildigi besiyerine difüze olması temeline dayanmaktadır. Bu amaçla; belli miktarlarda antibiyotik emdirilmis kagıt diskler, test edilecek olan mikroorganizmanın yogun bir sekilde inoküle edildigi katı besiyerlerine yerlestirilir. Diskler bir süre sonra çözünüp agara dogru difüze olurken, inoküle edilen mikroorganizma da çogalmaya baslar. Belirli bir inkübasyon süresinden sonra ilacın inhibitör konsantrasyonlarının saglandıgı diskin çevresinde üreme görülmez.
Mikroorganizma ilaca ne kadar duyarlı ise, diskin etrafında olusan inhibisyon zonu o kadar genis olacaktır. Inhibisyon zonunun çapı mm seklinde ölçülerek, standart zon tablolarına göre degerlendirmeler yapılır ve mikroorganizmanın kullanılan antimikrobik ajanlara karsı
duyarlılık durumu belirlenir.
Bu yöntemde, incelenecek olan mikroorganizma trypticase soy buyyonda 2 saat süreyle 37°C'de inkübe edilir. Bulanıklık olustuktan sonra McFarland 0.5 (108 mikroorganizma / ml)'e göre ayarlanarak standart bir bulanıklık olusturulur (McFarland standartları, bir sıvı besiyerinde bulunan bakteri sayısını belirlemek amacıyla gelistirilmistir.
McFarland'ın baryum klorür ve sülfirik asit kullanarak gelistirdigi standart bulanıklık tüpleri,
sıvı bir besiyerine ekilen bakterinin miktarına esdeger bulanıklık derecelerini içerir). Bu süspansiyondan steril bir eküvyon yardımıyla alınan örnek Mueller-Hinton agar yüzeyine inoküle edilir. Takiben farklı antibiyotikleri içeren diskler steril bir pens yardımıyla agar yüzeyine yerlestirilir. Bu islem yapılırken, olusacak zonların birbiri üzerine gelmemesi için diskler arasında 22 mm, petri kenarından ise 14 mm uzaklık olmasına dikkat edilmelidir.
Daha sonra besiyerleri 18-24 saat süreyle 35°C'de inkübe edilir ve olusan inhibisyon zonları ölçülür.
AMAÇ:Bu yöntemde, sık rastlanan belirli patojen bakteriler agar disk difüzyon testi prosedürüyle yarı-kantitatif in vitro duyarlılık testi için kullanılır. Bunlara Enterobacteriaceae, Staphylococcus türleri, Pseudomonas türleri, Acinetobacter türleri, Enterococcus türleri, Vibrio cholera ve modifiye prosedürler yoluyla Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae ve diger streptokoklar dahildir.
ÖNEMI: Belirli konsantrasyonlarda antimikrobiyal ajan emdirilen, kurutulmus filtre kagıt diskleri kullanılan agar difüzyon yöntemleri 1940’larda gelistirilmistir. Bu test yönteminde degiskenligi ortadan kaldırmak veya azaltmak için, Bauer ve arkadasları, test ortamı olarak Mueller Hinton Agar’ın seçildigi standartlastırılmıs bir prosedür gelistirdiler. Daha sonra çesitli denetim daireleri ve standart olusturma kurumları, Bauer-Kirby yöntemine dayanarak standartlastırılmıs referans prosedürleri yayınlamıslardır. Bu standartlastırılmıs prosedürlerin ilk ve en çok kabul görenleri, ABD Gıda ve Ilaç Dairesi (FDA) ve Dünya Saglık Örgütünün (WHO) yayınladıgı prosedürler olmustur. Prosedür, Klinik ve Laboratuvar Standartları Kurumu (CLSI, eski adıyla NCCLS) tarafından bir konsensüs
standardı olarak kabul edilmistir ve belirli aralıklarla güncellenmektedir.
PROSEDÜR ILKELERI: Çok çesitli antimikrobiyal ajan içeren diskler, saf klinik izolat kültürlerinin inoküle edildigi Mueller Hinton Agar (veya H. influenzae için Haemophilus Test Ortamı Agarı, N. gonorrhoeae için zenginlestiricili GC Agar veya S. pneumoniae, - hemolitik ve viridans grubu streptokoklar için %5’lik Koyun Kanı içeren Mueller Hinton Agar) plak yüzeylerine yerlestirilir. Inkübasyon sonrasında plaklar incelenir ve diskleri çevreleyen inhibisyon zonları ölçülüp, belirlenen zon boyutlarıyla karsılastırılarak antimikrobiyal terapide kullanılmak için en uygun antimikrobiyal ajan/ajanlar tespit edilir.
REAKTIFLER: Antimikrobiyal ajan içeren diskler, yüksek kalitede absorban kagıda (WHATMAN kagıdı) tam olarak belirlenen antimikrobiyal ajanın standart konsantrasyonda emdirilmesi ile hazırlanan 6-mm’lik disklerdir. Disklerin her iki tarafı da etken madde ve miktarını belirten harflerle ve rakamlarla belirgin sekilde isaretlidir. Disk performansı yalnızca disk etkinligine degil, dogru inokülum ve kontrol kültürlerinin kullanımına, islevsel olarak ön denemesi yapılmıs plakların kullanımına, uygun saklama sıcaklıgına ve diger faktörlere baglıdır. Tüm prosedürler boyunca mikrobiyolojik tehlikelere karsı uygun aseptik teknikleri ve belirlenen önlemler uygulanır. Kullanım sonrası kültürler, kapları ve diger kontamine olmus malzemeler sterilize edilir.
SAKLAMA TALIMATLARI:
1. Diskler -20°C ile +8 °C’de saklanır. Laboratuvar buzdolabı sık sık açılıp kapanıyor ve uygun sıcaklık korunamıyorsa, dolaba yalnız bir hafta yetecek kadar disk konur. Bazı diskler (örnegin karbapenemler) tercihen -20 °C’de dondurularak saklanmalıdır.
2. Diskler yerlestirilmeden önce oda sıcaklıgına gelmeleri beklenir. Disklerin uygulanması tamamlandıktan sonra kartuslar buzdolabına geri konur.
3. Önce en eski diskleri kullanılır.
4. Son kullanma tarihi geçen diskleri atılır. Hafta boyunca disklerin sık sık çıkarıldıgı kartuslar ve gece laboratuvarda bırakılmıs diskler de atılmalı ya da kullanıma devam etmeden önce disklerin kabul edilebilir performans gösterip göstermedigi test edilmelidir.
5. Diskler önerilen kontrol organizmalarıyla hatalı zon boyutları olusturuyorsa prosedürün tamamı kontrol edilmelidir. Hatalı zon boyutu diskten, inokulasyondan, ortamın hazırlanmasından veya derinliginden (yaklasık 4 mm) veya diger faktörlerden kaynaklanıyor olabilir.
ÖRNEKLER: Kültürler, antimikrobiyal terapiye baslanmadan önce hastalardan alınan örneklerden türetilmelidir.
PROSEDÜR
Saglanan Malzemeler: Antimikrobiyal duyarlılık testi diskleri Gerekli Fakat Saglanmamıs Malzemeler: Yardımcı kültür ortamı, reaktifler, kalite kontrol organizmaları ve standartlastırılmıs prosedürle disk difüzyon duyarlılık testini gerçeklestirmek için gerekli laboratuvar ekipmanı. 0,5 mL 0,048 M BaCl2’ü (%1,175 [w/v] BaCl2•2H2O) 99,5 mL 0,18 M (0,36N) H2SO4’e (%1 [v/v]) ekleyerek 0,5’lik McFarland türbidite standardını elde edilir. 1 cm’lik ısık yolu ve uygun küveti olan bir spektrofotometre kullanarak dogrulanır; 625 nm’deki absorbans 0,08 – 0,13 olmalıdır.
Kullanıcı Kontrollerini Içeren Talimatlar:
1. Test ve kontrol kültürleri ile inokülum hazırlanması:
a. Yalnızca saf kültür kullanılır.
b. Üç ila bes benzer koloni seçilir ve inokülasyon ignesi veya öze kullanarak 4 – 5 mL’lik triptik soy broth gibi uygun bir sıvı ortamına (broth) (veya güç üreyen organizmalar için Mueller Hinton Broth) aktarılır.
c. Gerekiyorsa, 0,5 McFarland’lık türbidite standardını (yaklasık olarak, 1 ila 2 x 108 CFU / mL) elde etmek için sıvı ortamdaki kültürler 35 °C’de 2-6 saat süreyle inkübe edilebilir.
Alternatif olarak; gece boyunca inkübe edilen agar plagından alınan kolonileri kullanarak dogrudan bir sıvı besiyer veya tuz süspansiyonu hazırlanır. (H. influenzae ve N. gonorrhoeae için kanlı agar veya çikolata agar gibi seçici olmayan bir ortam kullanılmalıdır). Dogrudan koloni süspansiyon yöntemi, Staphylococcus türleri, S. pneumoniae ve diger streptokoklar, Haemophilus türleri ve N. gonorrhoeae için tercih edilir.
d. 0,5 McFarland’lık türbidite standardına esdeger bir türbidite degeri elde etmek için gerekiyorsa seyreltilir. Seyreltim sıvısı olarak steril sıvı besiyeri veya tuz çözeltisi kullanılabilir. Alternatif olarak; inokülum fotometrik olarak standartlastırılır.Geceden kalma sıvı besiyeri kültürleri inokülum olarak kullanılmamalıdır.
2. Inokülasyon:
a) 15 dakika içinde, steril bir eküvyon uygun bir sekilde ayarlanmıs inoküluma daldırılır ve fazla sıvının akması için eküvyon tüpün iç üst duvarına bastırılarak birkaç kez döndürülür.
b) Mueller Hinton Agar (veya uygun baska bir agar) plagının yüzeyi, tamamı üç kez çizilerek ekim yapılır. Esit bir inokulasyon elde etmek için her çizimden sonra plak 60° döndürülür.
c) Ilaç asılanmıs diskler uygulanmadan önce, varsa yüzey neminin emilmesi için kapak 3
– 5 dakikalıgına aralık bırakılabilir ama bu süre 15 dakikayı asmamalıdır.
3. Uygun diskler seçilir.
4. Diskler dispanser veya penset aracılıgıyla, aseptik önlemlere dikkat edilerek uygulanır.
Diskler, merkezleri arasında en az 24 mm olacak sekilde yerlestirilir. Penisilin ve
sefalosporin disklerinin petri kabı kenarından en az 10 mm uzakta olması ve merkezleri
arasında en az 30 mm mesafe bulunması tercih edilir. H. influenzae, N. gonorrhoeae ve S.
pneumoniae ile 150 mm’lik plak için en fazla dokuz veya 100 mm’lik plak için en fazla dört
disk kullanılır. Disklerin agar üzerinde yüzeyle teması saglamak için steril bir igne veya
forsepsle disklere bastırılabilir.
5. Plaklar 15 dakika içinde, agar yüzeyi yukarı bakacak sekilde 35 ± 2 °C’lik inkübatöre
yerlestirilir (Staphylococcus türleri için test 35 °C’den yüksek sıcaklıklarda
gerçeklestirildiginde metisiline dirençli stafilokoklar [MRS] tespit edilemez. N. gonorrhoeae
ise 36 ± 1°C’de [37 °C’yi asmayın] inkübe edilmelidir). Haemophilus türleri, N.
gonorrhoeae, S. pneumoniae ve diger streptokoklar %5’lik CO2 ile zenginlestirilmis
atmosferde inkübe edilmelidir.
6. 16-18 saat inkübasyondan sonra plakları incelenir (N. gonorrhoeae,
S.pneumoniae ve diger streptokoklar için 20-24 saat).
Metisilin / nafsilin / oksasilin / vankomisine direncin tespiti amacıyla Staphylococcus türleri
için ve vankomisine direncin tespiti amacıyla Enterococcus türleri için tam 24 saatlik
inkübasyon önerilir. Tamamen inhibisyon görülen zonların çapları genel görsel incelemede
belirtilen sekilde ölçülür. Zonlar, en yakın tam milimetre degerine kadar ölçülür. Sadece
izole kolonilerin gelismesi inokülumun yetersiz oldugunu gösterir, bu durumda test
tekrarlanmalıdır. Farklı ilaçlar içeren disklerin etrafındaki zonlar ilaçların etkisinin
karsılastırılması amacıyla kullanılamaz. Sık görülen aerobların testi için tahmini degerleri
gösteren Zon Çapı Yorumlama Tablosuna (CLSI) bakılır.
7. Önerilen kültürlerin kullanıldıgı kontrol testleri, duyarlılık testinin gerçeklestirildigi her
gün veya CLSI standardına göre yeterli performans belgelenebiliyorsa her hafta
yapılmalıdır. E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853, H.
influenzae ATCC 49247, H. influenzae ATCC 49766, N. gonorrhoeae ATCC 49226, S.
pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 35218 (-laktamaz üreten sus), E. faecalis ATCC
29212 (gentamisin 120 μg ve streptomisin 300 μg disklerinin kalite kontrol testi için) ve
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (ESBL’lerin tarama ve teyit testleri için) için tipik zon
boyutları tabloda verilmistir (CLSI) ve tüm prosedür için dogru performans kriterlerini
göstermektedir. E. faecalis ATCC 29212 (veya 33186), yeni Mueller Hinton Agarı lotlarının
düsük timin ve timidin içerigi bakımından degerlendirilmesi için de önerilir. H. influenzae
ATCC 10211, Haemophilus Test Ortamı Agarının çogalmayı tesvik edici özelliklerini
dogrulamak için önerilen baska bir kalite kontrol susudur.
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar