Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

CRISPR Tabanlı Kanser Hücresinin Soyağacını İzleme, Metastazın Etkenleri Hakkında Bilgi Sağlıyor

---

Binlerce hücrede gerçek zamanlı kanser ilerlemesini izlemek için CRISPR tabanlı yeni bir yöntem, kanser metastazının hızları, yolları ve etkenleri hakkında yeni bilgiler ortaya koydu.

Soy izleme tekniğini kullanarak, Whitehead Enstitüsü üyesi Jonathan Weissman, PhD ve meslektaşları, kanser hücrelerini, evrimsel biyologların türlere baktıkları gibi, karmaşık bir şekilde ayrıntılı bir soy ağacını haritalayarak tedavi etmeyi başardılar. Bu yaklaşım, yazarların, bir akciğer kanseri ksenogreft fare modelinde filogeniler üretmesine ve metastatik insan kanser hücrelerinin birkaç aylık büyüme ve yayılma hareketini takip etmesine izin verdi.

Şubelerin incelenmesiyle hücre soyunu takip ederek tek bir tümör hücresinin ne zaman girdiği yerden ayrıldığını, soyunu vücudun kalanına yaydığını bulmak mümkündür. “Bu yöntemle 'Bu tümör ne sıklıkla metastaz yapıyor? Metastazlar nereden geldi? nereye gidiyorlar? ' Gibi sorular sorabilirsiniz.  Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'nde biyoloji profesörü ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nde bir araştırmacı olan Weissman, "Tümörün geçmişini in vivo takip edebildiğiniz için, tümörün biyolojisinde aksi halde görünmez olan farklılıkları ortaya çıkarırsınız." dedi.

Araştırmacılar, Science dergisinde bildirilen çalışmaları sayesinde, kanser ilerlemesinde daha önce bilinmeyen rollere sahip aday genleri ortaya çıkaran metastatik fenotiplerle ilişkili farklı gen ekspresyon profillerini de belirlediler. Ekip, yeni soy izleme tekniğinin, genetik mutasyonlar, mikro çevre adaptasyonu ve terapötik ajanlara karşı direnç kazanımı dahil olmak üzere hücresel kanser biyolojisinin gözlemlenmesi zor diğer birçok yönünü bilgilendirebileceğini öne sürüyor.

Weissman'ın laboratuvarı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden meslektaşı Jeffrey J. Quinn, PhD ve California Üniversitesi, Berkeley'de bilgisayar bilimcisi olan Nir Yosef ve California Üniversitesinde kanser biyoloğu olan Trever Bivona, MD, PhD ile birlikte California, San Francisco (UCSF), " Tek hücre soyları kanser ksenograftlarında metastaz oranlarını, rotalarını ve itici güçlerini ortaya koyuyor " başlıklı bir makalede yaptıkları çalışmaları bildirdi .

Kanser vücutta bir nokta ile sınırlı olduğunda, genellikle ameliyat veya diğer tedavi yöntemleri kullanılarak tedavi edilebilir. Bununla birlikte, kanserle ilişkili ölüm oranlarının çoğu, metastaz yapma ve vücutta kök salma yeteneğinden kaynaklanmaktadır. Ancak, metastazın oluşum anı çok hızlıdır, Bir tümörde meydana gelen milyonlarca bölünmede kaybolur. Yazarlar, "Metastaz, kanser ilerlemesinde özellikle kritik bir adımdır çünkü kanserle ilişkili ölüm oranlarından başlıca sorumludur" diye yazdı. “Yine de metastatik olaylar doğası gereği nadir, geçici ve stokastik olduğundan, gerçek zamanlı olarak izlenmeleri zor oldu. Weissman'ın da eklediği gibi, "bu olayların gerçek zamanlı olarak izlenmesi genellikle imkansızdır."

Bilim adamları geçmişte, DNA planlarındaki ortak mutasyonları ve diğer varyasyonları karşılaştırarak kanser hücrelerinin soylarını izlediler. Bununla birlikte, bu yöntemler, belirli bir dereceye kadar, hücreler arasındaki ilişkileri doğru bir şekilde göstermek için yeterince doğal olarak meydana gelen mutasyonların veya diğer işaretlerin mevcut olmasına bağlıdır.

Ekip, "Klasik soyağacı izleme stratejileri, tümör soyunu, tümör alt popülasyonları arasında paylaşılan sekans varyasyonlarının modelinden çıkarabilir (örn., Tek nükleotid polimorfizmleri veya kopya sayısı varyasyonları gibi doğal olarak oluşan mutasyonlar)," diye devam etti. Ancak, izlemeye yönelik “geriye dönük” yaklaşımlar gibi doğal ayırt edici mutasyonların sayısı ile sınırlı olmanın yanı sıra, sonuçları karıştırabilecek başka sınırlamalara da işaret ettiler.

Weissman ile birlikte ilk yazar Quinn, o sırada Weissman'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı ve yüksek lisans öğrencisi olan Matthew Jones, CRISPR teknolojisini, özellikle de Weissman Lab üyesi Michelle Chan, PhD tarafından geliştirilen bir yöntem soy izlemeyi kolaylaştırmak için embriyo gelişimini izledi. Ekip, "Cas9 özellikli soy izleme tekniklerinin tek hücreli RNA dizileme okumaları ile daha önce klasik prospektif veya geriye dönük izleme yaklaşımlarıyla mümkün olandan çok daha büyük ölçeklerde ve daha ince çözünürlükte keşfetme potansiyeli sağlıyor" diye yazdı.

Araştırmacılar, bir kanser soyunun takip etmek için yeterince kökene özgü belirteçler içerdiğini ummak yerine, belirteçleri kendileri eklemek için yeni bir yöntem kullandılar. Weissman, "Temel fikir, DNA'nın genomik bir çizimine (scratchpad) sahip bir hücreyi tasarlamaktır, bu da CRISPR kullanılarak ‘yazılabilir’ " dedi. Genomdaki bu "yazı", kalıtsal hale gelecek şekilde yapılır, yani bir hücrenin yavruları, ana hücrelerinin ve grandparent hücrelerinin kendi genomuna kaydedilmiş "yazısının" olacağı anlamına gelir.

Weissman, bu özel " scratchpad" hücrelerini oluşturmak için, eklenmiş genlere sahip insan kanser hücrelerini tasarladı: biri bakteri proteini Cas9 için - CRISPR genom düzenleme yöntemlerinde kullanılan "moleküler makas" - diğerleri mikroskopi için glowing proteinler için ve birkaç sekans CRISPR teknolojisi için hedef görevi görür. Araştırmacılar daha sonra bir insan akciğer tümörünü taklit etmek için binlerce değiştirilmiş insan kanser hücresini farelere yerleştirdiler (ortak çalışan Bivona tarafından geliştirilen bir model). Ve insan akciğer tümörlü farelerin sıklıkla agresif metastaz sergilediği göz önüne alındığında, araştırmacılar modelin kanser ilerlemesini gerçek zamanlı olarak izlemek için ideal olacağını düşündüler.

Hücreler bölünmeye başladığında, Cas9 bu hedef bölgelerde küçük kesikler yapar. Hücre kesikleri onardığında, birkaç rastgele nükleotidi yamalıyor veya siliyordu, bu da indel adı verilen benzersiz bir onarım dizisine yol açar. Bu kesme ve onarım neredeyse her nesilde rastgele gerçeklesir. Yazarlar makalelerinde şöyle açıkladılar: “Kısaca, Cas9 tanımlanmış bir genomik lokusu (bundan sonra 'Hedef Bölge' olarak anılacaktır) keser ve sonraki nesillere miras kalan kararlı bir ekleme / silme (indel) 'alel' ile sonuçlanır; Hücreler bölündükçe, ek bölgelerde daha fazla Cas9 indüklü indel biriktirerek ardışık hücre kuşaklarını daha da ayırt eder. " Bu yöntem, Weissman ve ekibinin daha sonra Yosef ile çalışarak oluşturdukları özel bilgisayar modellerini kullanarak izleyebilecekleri bir hücre bölünmeleri haritası oluşturuyor.

Her renk vücutta farklı bir yeri temsil eder. Çok renkli bir ağaç, bir hücrenin soyundan gelenlerin farklı dokular arasında defalarca atladığı oldukça metastatik bir fenotipi gösterir. Öncelikle tek renk olan bir ağaç, daha az metastatik bir hücreyi temsil eder. [Jeffrey Quinn / Whitehead Enstitüsü]

Ekip, hücreleri bu şekilde izlemek bazı ilginç sonuçlar verdiğini bildirdi. Örneğin, tek tek tümör hücrelerinin, araştırmacıların beklediğinden çok farklı olduğu bulundu. Araştırmacıların kullandığı hücreler, A549 adlı yerleşik bir insan akciğer kanseri hücre hattındandı. Weissman, "Nispeten homojen olacaklarını düşünürsün," dedi. “Ama aslında, aynı farede bile farklı tümörlerin metastaz yapma eğiliminde çarpıcı farklılıklar gördük. Bazılarının çok az sayıda metastatik olayı vardı ve diğerleri gerçekten hızla etrafta dolaşıyordu. "

Ekip, bu heterojenliğin nereden geldiğini bulmak için aynı hücrenin iki klonunu farklı farelere implante etti. Hücreler çoğaldıkça, araştırmacılar yavru hücrelerin oldukça benzer bir oranda metastaz yaptığını buldular. Aynı hücre hattından farklı hücrelerin yavruları için durum böyle değildi - orijinal hücreler görünüşe göre hücre hattı birçok nesil boyunca korunduğu için farklı metastatik potansiyeller geliştirmişti.

Bilim adamları daha sonra, aynı hücre hattındaki kanser hücreleri arasındaki bu değişkenlikten hangi genlerin sorumlu olduğunu merak ettiler. Böylece metastatik olmayan, zayıf metastatik ve yüksek oranda metastatik tümörler arasında farklı ifade edilen genleri aramaya başladılar.

Metastazın mı yoksa sadece bir yan etkisinin mi olduğu net olmasa da, daha önce bazılarının metastazla ilişkili olduğu bilinen birçok gen göze çarpıyordu. Ekip, "Aylarca süren büyüme ve yayılma boyunca izlenen on binlerce kanser hücresi için derinlemesine çözülmüş filogenileri rapor ediyoruz" dedi. "Bu, gen ifadesinde önceden var olan ve kalıtsal farklılıklardan kaynaklanan, metastatik kapasitede keskin bir heterojenliği ortaya çıkardı." Örneğin ekip, bu genlerden biri olan ve Keratin 17 proteinini kodlayan KRT17'nin, yüksek metastatik tümörlere göre düşük metastatik tümörlerde çok daha güçlü bir şekilde ifade edildiğini buldu. Weissman, "Keratin 17'yi düşürdüğümüzde veya aşırı eksprese ettiğimizde, bu genin aslında tümörlerin istilasını kontrol ettiğini gösterdik" dedi.

Metastazla ilişkili genleri bu şekilde tanımlayabilmek, araştırmacıların tümörlerin nasıl geliştiği ve adapte olduğu hakkındaki soruları yanıtlamasına yardımcı olabilir. Weissman, "Bir tümörün davranışına ve evrimine bakmanın tamamen yeni bir yolu" dedi. "Kanser biyolojisindeki birçok farklı soruna uygulanabileceğini düşünüyoruz."

Yazarların yorumladığı gibi, "Burada tanımlanan diğer gen adaylarının metastazda oynadıkları rolleri araştırmak ve ayrıca KRT17'nin in vitro ve in vivo metastatik fenotipi baskıladığı moleküler mekanizmayı aydınlatmak da ilgi çekici olacaktır - beklenmedik bir rol bu çalışma ortaya çıkarıldı. "

Weissman'ın CRISPR yöntemi, araştırmacıların vücutta metastaz yapan hücrelerin nerede ve ne zaman gittiğini daha ayrıntılı bir şekilde izlemelerine de izin vermiş oldu. Örneğin, implante edilmiş bir kanser hücresinin soyu, her seferinde sol akciğerden sağ akciğer ve karaciğer gibi diğer dokulara yayılmak üzere beş ayrı kez metastaz geçirdi. Diğer hücreler farklı bir alana sıçradı ve oradan tekrar metastaz yaptı. Bu hareketler, her rengin vücutta farklı bir konumu temsil ettiği filogenetik ağaçlarda düzgün bir şekilde haritalanabilir. Çok renkli bir ağaç, bir hücrenin soyundan gelenlerin farklı dokular arasında defalarca atladığı oldukça metastatik bir fenotipi gösterir. Öncelikle tek renk olan bir ağaç, daha az metastatik bir hücreyi temsil eder.

Ekip, "Yeni nesil Cas9 tabanlı soy izleyicimizi bir fare metastaz modeline uygulayarak, metastatik biyolojinin yalnızca subklonal soy bilgisi sayesinde görünen anlamlı özelliklerini gözlemledik" dedi. “Bu temel anlayışlar arasında, farklı tümör popülasyonları için geniş metastatik oranlar aralığı, bu heterojen metastatik fenotiplerin önceden varlığı ve istikrarlı kalıtılabilirliği ve kanser hücrelerinin bu modelde yaydığı karmaşık, çok yönlü doku yolları vardı.

Tümör ilerlemesini bu şekilde haritalamak, Weissman ve ekibinin metastaz mekaniği hakkında birkaç ilginç gözlem yapmasına izin verdi. Örneğin, bazı klonlar, başladıkları yerde sol akciğerden vücudun farklı bölgelerine seyahat ederek ders kitabında tohumlandı. Diğerleri daha düzensiz tohumlandı, oradan tekrar metastaz yapmadan önce diğer dokulara geçtiler. İlk yazar Quinn, böyle bir doku, akciğerler arasında yer alan mediastinal lenf dokusu, bir tür merkez gibi görünüyor dedi. "Kanser hücrelerini, daha sonra gidebilecekleri ve kolonileşebilecekleri tüm bu verimli toprağa bağlayan bir ara istasyon görevi görüyor." Ve terapötik olarak düşünürsek, metastaz "merkezlerinin" keşfi son derece yararlı olabilir. Weissman, "Kanser tedavilerini bu yerlere odaklarsanız, daha sonra metastazı yavaşlatabilir veya ilk başta onu önleyebilirsiniz" dedi.

“Çalışmamız, on binlerce hücreyi birkaç aylık in vivo büyüme boyunca benzersiz bir şekilde ayırt etmenin, derinlemesine çözülmüş ve doğru hücre filogenilerini yeniden yapılandırmanın ve daha sonra hücrelerin atalarındaki nadir, geçici olayları tanımlamak için yorumlamanın artık mümkün olduğunu ortaya koyuyor (burada , metastaz) hücresel fenotiplerde başka türlü göze çarpmayan farklılıkları ortaya çıkarıyor ”diye sonuçlandırdı yazarlar.

Weissman gelecekte sadece hücreleri gözlemlemenin ötesine geçmeyi ve davranışlarını tahmin etmeye başlamayı umuyor. Weissman, "Newton mekaniğinde olduğu gibi - hızı, konumu ve bir topa etki eden tüm kuvvetleri biliyorsanız, topun gelecekte herhangi bir zamanda nereye gideceğini anlayabilirsiniz," dedi. Hücrelerle de aynı şeyi yapmayı umuyoruz. Esasen bir tümörün farklılaşmasına neden olan şeyin bir işlevini inşa etmek ve ardından herhangi bir zamanda nerede olduklarını ölçmek ve gelecekte nerede olacaklarını tahmin etmek istiyoruz. "

Ve metastazın ötesine geçen ekip, bu yaklaşımın kanser biyolojisinin diğer yönlerine yeni bir bakış açısı sağlamak için kullanılabileceğini söylüyor, "… malign dönüşüm sırasındaki genetik mutasyonların zamanlaması veya sırası, farklı tümör mikro ortamlarına adaptasyon veya tümör hücrelerinin terapötik maddelere direnç kazandığı kökeni ve mekanizması gibi."

Araştırmacılar, tek tek hücrelerin aile ağaçlarını gerçek zamanlı olarak izleyebilmenin diğer ortamlarda da faydalı olacağı konusunda iyimserler. İlk yazarlardan Matthew Jones, "Biyolojide ölçülebilir bir miktar olarak düşündüğümüz şeye yepyeni bir boyut açacağını düşünüyorum" dedi. "Genel olarak bu alanda gerçekten harika olan şey, görünmeyen ve görünür olanı yeniden tanımlıyor olmamızdır."

Yazarların belirttiği gibi, "... kanserin ötesinde, yaklaşımımız, birçok hücre nesli boyunca benzeri görülmemiş bir çözünürlük ve ölçekte ortaya çıkan biyolojik süreçlerin filogenetik temellerinin incelenmesini güçlendirme potansiyeline sahiptir."

Çeviren ve Derleyen: Çiğdem Afat

Kaynak:

https://www.genengnews.com/news/crispr-based-cancer-cell-lineage-tracing-offers-insights-into-drivers-of-metastasis/amp/

---