Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Crassostrea Hongkongensis'ten Tri-Nükleotid Mikrosatellit Markerlerinin Geliştirilmesi

---

Crassostrea cinsinin istiridyeleri, Güney Çin Denizi'nin kıyı bölgesinde ticari ve ekolojik açıdan önemli bir deniz yumuşakçasıdır.

Crassostrea hongkongensis, yaklaşık bin yıllık ekim geçmişi ve Güney Çin Denizi kıyı sularında yıllık 1,3 milyon tonun üzerinde üretimi ile yüksek piyasa değeri nedeniyle en önemli endemik istiridye türlerinden biridir.   Bununla birlikte, mevsimsel ölümler ve yabani tohumların miktar ve kalitesindeki düşüş, son yıllarda bu endüstri için sorunlar yaratmıştır. Bu nedenle, C. hongkongensis'in yetiştirme stoku için geliştirilmiş stok yönetimi ve genetik iyileştirme, endüstride gerekli hale gelmiştir. DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA diziliş farklılığını çeşitli ortaya koyan markörlerdir. Bu markörler kullanılarak birbirine morfolojik olarak çok yakın olan kültür çeşitleri ayrılabilir ve tanımlanabilir, türlerin taksonomik tanımlaması yapılıp, filogenetik akrabalıkları bulunabilir. Soyağacı analizleri, bağlantı haritalamaları ve seleksiyon programlarında kullanılabilir. Basit Sekans Tekrarları, mikrosatellitler (STR: short tandem repeat), bütün ökaryotların genomlarında bulunur. Birkaç adet veya yüzlerce kez tekrarlanabilen bu diziler 1-4 nükleotidlik sekanslardır. Mikrosatellitler istiridye stoğu ve genetik analizde çok faydalı olduğundan, mikrosatellit markerlerin geliştirilmesi oldukça istenmektedir. Bu tür için geliştirilmiş olan mikrosatellit belirteçlerin çoğu iki baz çifti motiften (di-nükleotidler) oluşur. Di-nükleotidlerin laboratuvar analizi karmaşıktır ve genellikle genotipleme hatalarına neden olan PCR eserlerini (stutter bands) sunarak sonuçları tehlikeye atabilir. Üç nükleotid (tri-nükleotid) veya daha fazla motif içeren bir motifden oluşan mikrosatellit belirteçleri ise daha kararlıdır ve daha az PCR eseri üretir.

Bu çalışmanın temel amacı, Crassostrea hongkongensis'teki genetik değişkenliği güvenilir bir şekilde tahmin etmek için kullanılabilecek tri-nükleotid mikrosatellit belirteçlerini izole etmek ve karakterize etmekti. Ayrıca bu SSR lokus’ların birbirine yakın iki tür olan Crassostrea gigas ve Crassostrea ariakensis’teç çarpraz amplifikasyonu araştırılmıştır. Test edilen 65 primer çiftinden 18'i beklenen PCR ürünlerini üretmede başarısız olmuş, 10'u çoklu bantlar veya karmaşık desenler üretmiştir, 7'si tüm numuneler üzerinde monomorfik bantlar vermiş ve 30'u çalışmada incelenen örnek için polimorfizm gösteren net ve spesifik ürünleri tutarlı bir şekilde güçlendirmiştir. Lokus başına ortalama 7.63 allel olmak üzere alel sayısı 2 ila 12 arasında değişmektedir. Lokus Ch422 ve Ch423 en yüksek allel sayısına sahiptir. Gözlemlenen heterozigotluk, ortalama 0.579 olmak üzere 0.031 ile 0.844 arasında değişirken, bu lokuslar için beklenen heterozigotluk değerleri 0.062 ile 0.881 arasında değişirken, ortalama heterozigotluk 0.665 olmuştur.

Bonferroni düzeltmesinden sonra, Hardy-Weinberg dengesi (HWE) için yapılan kesin testler, 30 belirteçten 24'ünün denge ile uyumlu olduğunu ve geri kalanının, açık bir şekilde heterozigot eksikliğine bağlı olarak yabanıl popülasyonda HWE'den önemli ölçüde sapma gösterdiğini ortaya koymuştur. Buna ek olarak Bonferroni düzeltmesi sonrasında beş çift lokus (Ch405-Ch410, Ch405- Ch 414, Ch410- Ch 414, Ch417-Ch426, Ch427-Ch429) önemli bağlantı dengesizliğini göstermiştir. BLAST analizi, 30 lokusun 23'ünün fonksiyonel genlerle önemli bir korelasyona sahip olduğunu göstermiştir. Bu 23 lokus arasında, Ch427 dışındaki tüm lokuslar C. gigas'taki ilgili genlerle önemli ölçüde ilişkilidir. Ek olarak, daha önce C. hongkongensis için yayınlanan 20 di-nükleotid mikrosatellit işaretleyicisini kontrol etmek için BLASTN fonksiyonu kullanılmış ve sadece 8 lokusun fonksiyonel genlerle ilişkili olduğu bulunmuştur.  Bu nedenle, bu çalışmada geliştirilen tri-nükleotid mikrosatellit belirteçleri, genomdan rastgele geliştirilen di-nükleotid mikrosatellit belirteçlerine göre fonksiyonel genlerle önemli ölçüde daha yüksek korelasyona sahiptir. Bu sonuçlar, bazı su hayvanlarının EST veritabanında geliştirilen tekrarlanan mikrosatellit türlerinin dağılım oranı ile tutarlıdır. Tri-nükleotid tekrar motifleri tanımlanan en yaygın tekrar birimi tipidir.

Meretrix meretrix (tuzlu su istiridye cinsi) ve Tegillarca granosa'da (ark istiridye türü) benzer eğilimler tanımlanmıştır. Çoğu EST sekansı, proteinlere dönüşen ve bu nedenle frameshift mutasyonlarına karşı güçlü seçim baskısı altında olan eksonik bölgelerden oluşur. Kodonlar, üç nükleotidin fonksiyonel birimleri olduğundan, üç nükleotidde bir kaymaya neden olan indel (insertion or deletion) mutasyonlar, belirli bir genin mevcut okuma çerçevesini bozmaz. Tri-nükleotid tekrarlarının, EST'lerde bulunan en bol SSR sınıfı olması beklenmektedir. Bu nedenle, C. hongkongensis'in genomundan rastgele geliştirilen tri-nükleotid mikrosatellit belirteçlerinin fonksiyonel genlerle di-nükleotid markörlerden daha yüksek bir korelasyona sahip olması beklenir ve tri-nükleotidler kullanılarak oluşturulan genetik bağlantı haritalarının, fonksiyonel genlerle yakından bağlantılı polimorfik lokus bulma olasılığı daha yüksektir ve bu nedenle gen haritalamasında, moleküler markör destekli seçim vb. çalışmalarda faydalıdırlar. 

Ek olarak, C. hongkongensis'ten elde edilen tüm tri-nükleotid mikrosatellit belirteçlerinin aktarılabilirliği yakından ilişkili iki türde, C. ariakensis ve C. gigas, sırasıyla Guangxi ve Shangdong eyaletlerindeki yabanıl popülasyonlardan toplanan her türden 22 birey ile birlikte değerlendirilmiştir. 30 markörden 21 ve 15'i, sırasıyla C. ariakensis ve C. gigas'ta başarıyla çapraz amplifiye edilmiştir. Çapraz-tür amplifikasyonun sonuçları, C. hongkongensis ve C. ariakensis'te daha önce tanımlanan C. gigas EST-SSR'sinden önemli ölçüde daha yüksek olmakla beraber; bu çalışmada belirteçlerin yaklaşık yarısı başarıyla çapraz amplifiye edilmiştir.  Bu çalışmadaki yüksek amplifikasyon başarısı, bu lokusların komşu bölgelerinin bu türler arasında iyi korunduğunu ve bu türler arasındaki genetik çeşitliliğin karşılaştırmalı analizleri için kullanılabileceğini göstermektedir. Kalan primerlerin amplifikasyonundaki başarısızlık, büyük olasılıkla, belirli bir lokustaki bir mikrosatellitin silinmesinden veya primer bağlanma bölgelerindeki mutasyonlardan (in-dels) kaynaklanmaktadır. Ayrıca, bu çapraz amplifiye edilmiş lokusların çoğunda, (C.hongkongensis'ten daha yüksek polimorfizme sahip olan C. gigas'taki dört lokus dışında) daha düşük bir polimorfizm seviyesi gözlenmiştir. Bu çıktı, yakından ilişkili türler arasında makul sağlamlığı ve aktarılabilirliği gösterir ve bu çalışmada tanımlanan tri-nükleotid mikrosatellit belirteçlerinin gelecekte karşılaştırmalı bağlantı haritalaması için kullanılabileceğini öne sürer. 

Son olarak, C. hongkongensis, C. ariakensis ve C. gigas'ı etkili bir şekilde ayırt edebilecek iki mikrosatellit lokus bulunmuştur. Mikrosatellit lokus Ch411, C. gigas'ı (177−194bp), C. hongkongensis (208−244bp) ve C. ariakensis'ten (210−238bp) etkili bir şekilde ayırt edebilir. Ch425 mikrosatellit lokusu ise C. hongkongensis'i (405−453bp), C. ariakensis (352−395bp) ve C. gigas'tan (341−396bp) etkili bir şekilde ayırt edebilir. Bu iki mikrosatellit lokus kombinasyonu, bu üç istiridye türünün arı ve hibrit yavrularını etkili bir şekilde tanımlayabilir ve bu nedenle istiridye yetiştiriciliği uygulamasında büyük pratik değere sahiptir.

Özetle bu çalışmada zenginleştirilmiş genomik kütüphaneleri kullanarak C. hongkongensis'ten ilk olarak tri-nükleotid mikrosatellit belirteçleri geliştirilmiş ve yakından ilişkili iki türde çapraz tür amplifikasyonunu doğrulanmıştır. Bu tri-nükleotid mikrosatellit markörleri iyi uygulanabilirliğe sahiptir ve fonksiyonel genlerle di-nükleotid markörlerden daha yüksek bir korelasyona sahiptir. Tanımlanan tri-nükleotid mikrosatellit markörleri, daha önce tanımlanan di-nükleotid markörlere göre gen haritalamada, moleküler belirteç destekli seçimde ve karşılaştırmalı bağlantı haritalamasında gelecekte kullanım için daha büyük potansiyele sahiptir. Ek olarak, bu üç istiridye türünün arı ve hibrit yavrularını etkili bir şekilde tanımlayabilen iki mikrosatellit lokus bulunmuştur.

Çeviren ve Derleyen: Saliha Hızlıok

Kaynaklar: 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352513421000089

Türkeç, A. 2021. Genetik Mühendisliği Ders Notları, Bursa. Sayfa 63-65

Ersoy, F. 2021. Moleküler Markörler Ders Notları, Bursa. Sayfa 44-45

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1050464814000990,

https://group10nervoussystemxhs.weebly.com/crassostrea-ariakensis.html

https://en.wikipedia.org/wiki/Pacific_oyster

 

---