Bitkilerde DNA İzolasyonu

Biyoteknoloji çalışmalarında DNA izolasyonu oldukça önemli bir basamaktadır.

Bitkilerin genetik ilişkilerinin tespit edildiği moleküler karajterizasyon çalışmalarında, genetik haritaların oluşturulmasında, GDO’ların tespit edilmesi için yapılan çalışmalarda, mutasyon belirleme ve markırlar yardımı ile yapılan erken seleksiyon gibi çalışmalarda bitkisel dokulardan DNA izolasyonu gerçekleştirilmelidir.

Uygulama kapsamında, bitkisel materyallerden DNA izolasyonunu gerçekleştirmek amacıyla yapraklar toplanmıştır. Her örnek porselen havan içerisinde sıvı azot ile öğütülerek 0,1 g olacak şekilde 1,5 ml’lik santrifüj tüplerine alınmıştır (Şekil 1).

Şekil 1. A.Yaprakların Sıvı Azota Daldırılması, B. Yaprakların Sıvı Azotta Öğütülmesi, C. Örneğin Santrifüj Tüplerine Doldurulması, D. Sıvı Azottaki Santrifüj Tüplerinin Saklama İçin Alınması

DNA İzolasyonu İçin Gerekli Solüsyonların Hazırlanması

Uygulamada MiniPrep DNA izolasyon yöntemi kullanılmıştır (Johnstone ve Thompson, 1991). DNA izolasyonu aşamasında kullanılan tampon çözeltinin içeriği Çizelge 1’de sunulmuştur. İzolasyon sırasında ekstraksiyon tampon çözeltiler dışında kloroform:izoamilalkol (24:1 oranında), Tris-EDTA (Tris 1 M pH:8, EDTA: 0.5 M pH:8), RNase A (10 mg/ml) solüsyonu, izopropanol ve etil alkol (%99) kullanılmıştır.

Çizelge 1. DNA izolasyon yönteminde kullanılan tampon çözeltisinin içeriği

Solüsyon	Konsantrasyon
CTAB	%2.00
NaCl (5 M)	1.4 M
EDTA (0,5 M) pH 8,0	0.2 M
TRIS-HCl (1 M) pH 8,0	0.1 M

DNA İzolasyon Aşamaları; (Şekil 2.)

Ø Hazırlanmış olan ekstraksiyon solüsyonundan her tüpe 396µl ve 4µl β-merkaptoetanol eklenmiştir.

Ø Bir pipet aracılığıyla tüpler homojenlik sağlanana kadar karıştırılmış ve daha sonra tüpler 65^oC’de 20 dakika bekletilmiştir ve iki defa karıştırılmıştır.

Ø Her tüpe 400µl kloroform:izoamilalkol eklenerek 15 dakika vorteks yardımıyla karıştırılmıştır.

Ø Tüpler 5 dakika 13.000 rpm/dk santrifüj edilmiştir. Bekleme sırasında her örnek için yeni temiz bir santrifüj tüpü hazırlanıp etiketlenmiştir ve tüplerin içine 400 µl soğuk (-20^oC) izopropanol eklenmiştir.

Ø Santrifüj tamamlandığında tüplerin üst kısmındaki sıvı kısım steril pipet aracılığıyla 400 mikrolitre soğuk (-20^oC) izopropanol içeren santrifüj tüplerine aktarılmıştır. Tüpler dikkatli bir şekilde karıştırılarak 1 saat süreyle –20^oC’de bekletilmiştir.

Ø 5 dakika 13.000 rpm/dk santrifüj edilmiştir.

Ø Süpernatant dikkatli bir şekilde dökülmüştür. Pelletin kuruması için tüpler ters bırakılarak bekletilmiştir

Ø Kuruyan Pellet 100 µl TE (Tris-EDTA) içerisinde çözülmüştür. Her tüpe 4 µl RNase A eklenmiştir ve 15 dakika oda sıcaklığında tüpler bekletilmiştir.

Ø Her tüpe 500 µl soğuk EtOH (%100) (buzluktan çıkmış) eklenmiştir ve tüpler dikkatli bir şekilde karıştırılarak 1 saat süreyle –20^oC’de bekletilmiştir.

Ø 5 dakika 13.000 devirde santrifüj edilmiştir.

Ø Süpernatant dikkatli bir şekilde dökülmüş ve pelletin kuruması için tüpler ters çevrilmiştir

Ø Pellet 100 µl TE (Tris-EDTA) içerisinde çözülmüştür.

Ø Örnekler –20^oC’de saklanmıştır.

Şekil 2. A. Öğütülmüş bitkisel materyalin 65^o C’de bekletilmesi, B-C. Tüplerin üzerine solüsyonların eklenmesi, D. Santrifüj işlemi.

Dr. Özhan Şimşek
Çukurova Üniversitesi

#bitkilerde #izolasyonu