Başlıca Plasmidler ve Özellikleri
Bakterilerde, karakterleri çok değişik olan doğal plasmidler bulunmaktadır. Taşıdıkları özel genlere dayalı olarak bunları 6 grup altında incelemek mümkündür.
1) F plasmidi (fertilite faktörü, F faktörü, seks faktörü)
2) Rezistenslik plasmidleri (R plasmidleri, R faktörleri)
3) Virulens plasmidleri
4) Bakteriyosin plasmidleri
5) Metabolik plasmidler
6) Büyük plasmidler
F plasmid (F Faktörü, Seks Faktörü)
F faktörü (fertilite faktörü) en iyi E. coli K 12 suşlarında incelenmiştir. Bir plasmid olan F faktörü, sirküler, sarmal ve çift iplikçikli otonom bir DNA molekülüdür (MA: 63x106 dalton, 95 kbp uzunlukta ve hücre de 1-3 tane kadar). Konak bakterisinin yaklaşık %2'si kadar uzunlukta olan bu plasmid, yapısında replikasyon orijininden (RO)'dan ayrı olarak kendisinin transferini sağlayabilecek ve pilus formasyonunu kodlayan bilgilere sahiptir (Tra operonda 21 gen). Bu plasmid hangi hücreye aktarılırsa, o bakteride hücre membranında pilus sentezi (pilus formasyonu) meydana gelir. Bu pilus (seks pilusu), bu faktörü taşımayan alıcı hücrenin (F- hücre), verici hücre ile (F+ hücre) bağlantı kurmasına ve bir konjugasyon köprüsü oluşturmasına yardımcı olur. F faktörü konjugatif (transmissible) bir plasmiddir.
F faktörü bakterinin sitoplasmasında bulunabileceği gibi, konakçının genomuna da integre olabilir ve Hfr (high frequency recombination) hücre meydana gelir.
F plasmidi ile başlıca 3 tür konjugasyon oluşabilmektedir. Bunlar da,
1) F+ hücre x F- hücre konjugasyonu: F faktörünü sitoplasmasında taşıyan bir F+ hücre ile buna sahip olmayan F- hücre arasında gerçekleşen F faktörü aktarılmasında seks pilusu önemli fonksiyona sahiptir. Ancak, böyle iki hücrenin direkt teması da genetik madde aktarımına yardımcı olabilmektedir. F+ hücre x F¯ hücre birleşmelerinde genin aktarımı tek yönlüdür. Yani vericiden alıcıya doğrudur. İki yönlü olmamaktadır. Ayrıca, F+ hücre ile F- hücre birleşmelerinde de alıcı hücre her zaman F+ hücre şekline dönüşmeyebilir. Konjugasyon sırasında, F faktörünün bir iplikçiğinde oluşan kopma (ori T bölgesi) ve buradan ayrılan 5' ucu, seks pilusunun oluşturduğu köprüden geçerek F- hücreye transfer edilir. Aktarılan tek iplikçiğin karşısında 5' ¬ 3' yönünde ikinci bir iplikçik sentezlenerek alıcı hücrede çift iplikçikli ve sonra da sirküler forma dönüştürülür. Böylece başlangıçta F- olan alıcı hücre F+ hale dönüşmüş olur. Vericide bulunan tek kopya da rolling circle replicationla çift iplikçikli forma getirilir. Böylece verici hücre de yine plasmid kalmış ve bu hücre F+ karakterini korumuş olur.
Alıcı hücreye aktarılan F plasmidi, burada sitoplasmada kalır. Nadiren bakterinin genomuna da integre olabilir ve hücreyi Hfr haline getirebilir veya bazen de hücreden ayrılabilir.
Genetik materyalin, vericiden alıcıya aktarılmasında seks pilusunun çok önemli fonksiyonu olmasına karşın, aktarım bazen, direkt temas sonunda da meydana gelebilmektedir.
2) Hfr hücre x F-hücre konjugasyonu: F faktörünün alıcı hücrenin kromozomu ile birleştiği durumlarda, bakteride seks pilus formasyonu çok daha fazla sıklıkta meydana gelir ve buna bağlı olarak ta gen transferi çok daha yüksek oranda gerçekleşir. Hfr hücrelerde, kromozom üzerinde lokalize olan F faktöründe iplikçikte oluşan kopma sonu ayrılan 5'-ucu konjugasyon köprüsüne girerek buradan alıcı (F- hücre) hücreye transfer edilir. Ancak, bağlı bulunduğu konakçı genomundan da bir segmentin veya nadiren tüm kromozomun da, tek iplikçik halinde, alıcıya aktarılmasını sağlayabilir. Alıcıya geçen tek iplik F faktörü ve/veya kromozom segmenti burada çift iplikçikli ve sirküler forma dönüştürülür. Vericide kalan tek iplikçik F faktörü rolling circle replication ile çift iplikçik haline getirilir. Eğer genomdan bir segment (tek iplikçik) gitmişse, bu da karşı iplikçik kalıp olarak kullanılarak yeni iplikçik sentezlenerek çift iplikçikli hale getirilir.
Alıcı hücreye aktarılan F faktörü veya F faktörü + kromozom segmenti, ya alıcı hücrenin genomuna integre olur ve bu hücreyi de Hfr haline getirir veya F plasmidi, hücre sitoplasmasında da kalabilir.
F+ hücrelerden F- hücrelere aktarılan F plasmidinin alıcı hücrenin kromozomu ile integre olma olasılığı 10-5-10-6 arasındadır. Kromozomla birleşme geriye dönüşlü de olabilir. Yani F faktörü genomdan ayrılabilir. DNA transferi belli bir hız ve belli bir yerden başlayarak devam eder. Bu hız 37°C 'de bir saat içinde yaklaşık 105 nukleotid çifti kadar olduğu belirlenmiştir.
F+ hücrelerden alıcıya F faktörünün transferi oranı genellikle düşüktür. Çünkü, pilus formasyonu, Hfr hücrelere göre daha azdır, Ayrıca direkt kontakla yapılan transferlerde de, sıvı ortamda bakteriler serbest olarak bulunduklarından ve aralarında az da olsa bir mesafe olduğundan direkt temas oldukça sınırlı kalmaktadır. Bazı durumlarda mikroorganizmalar sıvı ortamda kümeler tarzında veya birbirlerine bağlı olarak da üreme gösterebilirler. Ancak, böyle kümeler tek bir mikroorganizmadan oluşması nedeniyle hepsi aynı karakteri yani hepsi F- olabilirler. Katı ortamlarda da üreyen koloniler, aynı şekilde, tek bir mikroorganizmadan kaynaklandığı için aynı sorun burada da bulunmaktadır.
F faktörü, sadece E. coli suşları arasında transfer edilmez. Aynı zamanda, salmonella, shigella, pseudomonas, proteus, vs cinslerine ait türlerde de meydana gelebilir. F+ E. coli suşları diğer Gram negatif mikroorganizmalarla da konjugasyon yapabilir. Ancak; daha az sıklıkta bir gerçekleşme elde edilir. Örn, E. coli ile salmonella arasındaki konjugasyon oranı 10-6-10-8 kadardır. Salmonella ile shigella arasında da buna benzer bir oran bulunmaktadır.
F faktörü bazı indükleyicilerin (akridin boyaları, ethidium bromide, mitomycin C, vs) etkisinde veya spontan olarak bakteriden çıkabilir (eliminasyon, plasmid eksklusiyonu). Böylece, F+ hücreler F- hücre haline gelebilirler.
3) F' hücre x F- hücre konjugasyonu: Bazı indükleyicilerin etkisi altında, Hfr hücrelerinde kromozomda yerleşik bulunan F plasmidi buradan ayrılabilir. Bu ayrılma tam veya kısmi olabildiği gibi bazı durumlarda da kromozomdan da bir segmentin veya genin birlikte çıkmasına neden olabilir. Kısmi ayrılmalarda ise, plasmidin bir bölümü bakteri kromozomu üzerinde kalır.
Bakteri genomundan bir segmentin F plasmidi ile birlikte çıkması (F' plasmidi) durumunda oluşan F' hücre ile F- hücre konjugasyonlarında, bakteri genomu da alıcı hücreye çok nadiren transfer edilebilir ve bu bakteriyi, aktarılan faktör yönünden pozitif hale getirebilir. Ancak, çoğu kez bakteri segmenti transfer edilmez veya aktarılsa bile kromozomla birleşmeyebilir.
Konjugasyonun önemli olan yanlarından biri de, kesintili konjugasyon denemeleri ile bakterinin zamana karşı kromozom lokalizasyonlarının haritasını yapmak mümkündür. Böylece hazırlanan kromozom haritalarında hem genlerin yerleri ve hem de aktarılma süresi içinde zamanları da belirlenmektedir.
F faktörünün bakteri kromozomuna integrasyonunda her ikisinde bulunan İS-elementlerinin rolü olduğu bildirilmektedir. Bakterideki İS-elementi ile F plasmidinde bulunan İS-elementi karşılıklı gelerek çapraz integrasyonla F faktörü kromozoma integre olur.
Rezistenslik Plasmidleri (R Plasmidleri)
Enterobakteriler arasında çeşitli ilaçlara karşı dirençlilik, hem in vitro ve hem in vivo olarak saptanmıştır. İlk defa bu özellik, 1951 yılında Japonya'da seyreden bir dizanteri olgusundan izole edilen S. flexneri suşunun 4 antimikrobial maddeye (kloramfenikol, tetrasiklin, streptomisin ve sulfonamid) karşı dirençli olduğu belirlendikten sonra anlaşılmıştır. Bu etkenin dışında, birçok ilaca karşı çoğul dirençlilik E. coli, salmonella, shigella, Klebsiella, proteus ve bazı enterobakterilerde de rastlanmıştır. Daha sonraları antibiyotik sayısında, dirençlilik yönünden artmalar olmuş ve yukardakilere ilaveten ampisilin, kanamisin, neomisin, vs gibi antibiyotiklere çoğul dirençlilik gösteren suşların sayısında artmalar meydana gelmiştir.
R plasmidleri çift iplikçikli sarmal, sirküler ve yapıda DNA karakterinde genetik elementlerdir. Molekül ağırlıkları >50x106 kadar olup genellikle konjugatif bir özelliktedirler Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler.
R faktörleri iki bölümden oluşurlar. Biri konjugasyonu ve aktarılmayı yöneten transfer faktörü (TF) ve diğeri de çeşitli ilaçlara karşı dirençliliği tayin eden rezistenslik faktörü (RF) veya R determinanttır. E. coli 'de bu iki faktör tek bir ünite halinde bulunmasına karşılık salmonella ve proteuslarda bunlar ayrı sekanslar halindedirler. Bu faktörler birbirlerinden bağımsız olarak aktarılabilirler ve akridin boyalarından da ayrı ayrı etkilenirler. Eğer, RF transfer edilirse alıcı hücre ilaçlara karşı dirençli hale gelir. Ancak, RF'nin, TF olmadan tek başına aktarılması olanaksızdır. Bu nedenle RF'nin aktarılması diğer mekanizmalar tarafından yönetilir.
Patojenik bakteriler, kendilerinde bulunan R faktörlerini nonpatojenik olanlara transfer edebilir. R plasmidleri, aynı zamanda, bazı faktörleri, diğer plasmidlerle birleşerek veya transpozonlardan alabilirler. Bazıları da R faktörlerini amplifiye edebilir veya plasmid sayısı (kopya sayısı) artırılabilir. Böylece bakteriler arasında rezistenslik konsantrasyonu çoğalmış olur.
RF ve TF'yi ayrı üniteler halinde bulunduran suşlarda ya biri veya ikisi birlikte transfer edilebilir.
R faktörleri, etkilerine göre karakterize edilebilirler. Bazıları fertiliteye mani olur ve F pilus oluşumunu baskılar (fi+, fertilite inhibisyon pozitif), bazıları da etkilemez (fi-, fertilite inhibisyon negatif). Ancak, fi+ faktörü, F faktörünün aktivitesini sınırlandırır. Buna karşın, fi-, F faktörünün etkinliğine tesir etmez. Bazen de bir hücrede fi+ ve fi- faktörleri bir arada bulunabilirler. Bu durum, aynı hücrede her iki faktörün replikasyon için aynı bağlanma yerine sahip olmadıklarını göstermektedir.
R faktörü taşıyan hücrelerde, F piluslarına benzeyen piluslar (R pilusu) oluşmaktadır(R-plus formasyonu). Bu pilus da R faktörünü transferde bir konjugasyon köprüsü oluşturur ve genetik materyalin aktarılmasında önemli rol oynar. R faktörü, çeşitli antibiyotiklere karşı dirençliliği tayinde rol alan genlere sahiptir. Şimdiye kadar, 7-8 antibakteriyel maddeye karşı rezistenslik tespit edilmiş olup bunların da tek bir R faktöründe toplanabileceği belirlenmiştir. Bir bakteride, ilaç dirençliliği oluşursa, bu zamanla çok yönlü R faktörüne dönüşebilir ve diğer Gram negatiflere de aktarılabilir. Antibiyotikler alındığında, bunlara duyarlı olan mikroorganizmalarda azalmalar meydana gelirken, dirençliler de ise bunların yerini alma ve çoğalma gözlenir. Bu arada, R faktörünün de hem patojenik ve hem de nonpatojenik Gram negatiflere transferi artar. Böylece, barsakta, R faktörünü taşıyan hücre sayısı çok fazla bir düzeye ulaşır, komensal ve patojenikler arasında yaygın bir hale gelir ve hastalığın nüksüne yol açar.
Bu tarz infeksiyonlara, Gram negatif etkenlerden ileri gelen infeksiyonların sağaltımında kullanılan streptomisin uygulamasından sonra rastlanmaktadır.
R faktörünün bir kısmı, zamanla, spontan olarak veya antibiyotik baskısının kalkması sonu, konakçı bakteriden ayrılabilir. Spontan kaybolmalarda R faktörünün, kromozomla aynı anda bölünerek kardeş hücrelere aktarılması da rol oynar.
P. multocida, S. aureus, Salmonella, Shigella, genellikle, ilaçlara duyarlı, buna karşın Pseudomonaslar ise dirençlidirler.
Mutasyonlar sonu da, antibiyotiklere karşı dirençlilik oluşabilmektedir. Ancak, bu tarz rezistenslik, yukarıda açıklandığının aksine, ekstrakromozomal değil kromozomaldir.
Bakterilerde bulunan restriksiyon endonuklease enzimleri yabancı orijinli genetik materyallerin invazyonuna mani olur. Ancak, bu koruma işlevi her zaman başarılı olmaz ve yabancı DNA segmentleri hücrelere girer ve kromozomla da birleşebilir ve mutasyonlara da yol açabilir.
R faktörü, R+ hücrelerden R- hücrelere genellikle, konjugasyonla transfer olmasına karşın Gram pozitiflerde (stafilokoklarda) genel transdüksiyonla aktarma meydana gelir.
R faktöründeki çoğul dirençlilik, bunda bulunan transpozon (Tn) ve/veya İS-elementlerinden kaynaklanmaktadır.
Çeşitli antimikrobial ilaçlara ve metallere karşı dirençliliği sağlayan ve R plasmidlerince kodlanan özellikler ve bunların mekanizmaları hakkında ayrı bir bölüm halinde, bu kısmın sonunda, bilgi verilmektedir.
Bakteriyosin Plasmidleri
Bakteriyosinler, bazı bakteriler tarafından sentezlenen dar spektrumlu ve letal etkili proteinlerdir. Bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal olmasına karşın, bazıları da plasmid orijinlidirler. Bakteriyosinler, ancak, kendini sentezleyen türden veya konakçısına çok yakın olan mikroorganizmalara etkilidirler. Örn., E. coli tarafından sentezlenen colicin (kolisin, bakteriyosin), bunu sentezleyemeyen E. coli 'ler ile S. sonnei için letaldir. Ancak, diğer bazı enterobakterilere de etkili olabilmektedir. Bu etki çok sınırlıdır. İnsan ve hayvanlardan izole edilen E. coli suşlarının yaklaşık %40 kadarının kolisinojenik olduğu belirtilmektedir. Şimdiye kadar 20'den fazla ve ayrı özellikte kolisin izole edilmiş olup bunlar A'dan V'ye kadar, büyük harflerle bir sıralamaya tabi tutulmuştur. Bunların her biri, E. coli 'lerin bazılarına etkili olmakta ve böylece bir konakçı spektrumu ve spesifitesi meydana gelmektedir. Kolisin sentezleyen suşlar (kolisinojenik suşlar) kendi oluşturdukları kolisinlere dirençlidirler. Ancak, kolisin sentezlenmeyenler etkilenirler.
Bakteriyosinler, Gram negatif mikroorganizmaların yanı sıra bazı Gram pozitiflerce de (stafilokok, streptokok, listeria, basiller vs) sentezlenebildikleri açıklanmıştır.
Bakteriyosin formasyonu için, bakterilerde, özel, bakteriyosinogenlerin bulunması gereklidir. Bunlar, bakteriyosin sentezini spesifiye eden özel genler olup bir kısmı ekstrakromozomal bir karakter taşırlar. Bir çok bakteride böyle genler bulunmasına karşın, genellikle, baskı altında tutulurlar ve bakteriyosin oluşturmazlar. Bu nedenle de hücre filtratlarında bakteriyosinlere çok az rastlanır ve bazen de hiç bulunmayabilirler. Ayrıca, bazı bakteriyosinojenik suşlar da, aynen bakteriyofajlarda olduğu gibi (lizojenik suşlar), bakteriyosin sentezi için indüklenmeleri gerekmektedir. Bakteriyosin sentezleyen hücrelerde, özel bir pilus formasyonuna rastlanmamaktadır. Bunları kodlayan genler, ancak F veya R faktörlerinin oluşturdukları pilusların konjugasyon köprülerinden yararlanarak diğer bakteriye aktarılabilirler. Fakat, Col E1 pilus formasyonunu tayin edebilir ve kendinin transferini sağlayabilir. Bunun yanı sıra, çok az oranda da bakteri kromozomundan bir segmenti de mobilize edebilir ve aktarıldığı hücreye taşıyabilir. Ancak, kromozoma integre olmazlar.
Bazı kolisinler (Col E1), bazı E. coli suşlarında bulunan özel bir plasmid (Col plasmidi) tarafından spesifiye edilirler. E. coli 'lerin genomunda doğal olarak kolisin sentezleyen bir gene rastlanamamıştır. Ancak, kendilerine kolisin geni transfer edilirse böyle E. coli 'ler kolisin genini eksprese edebilirler.
Col plasmidi kendi konakçı bakterisini, aynı kolisine karşı dirençli hale getirmesine karşın, diğer kolisinlere duyarlı olabilirler. Örn., Col1 A plasmidi E. coli 'yi colicin A 'ya karşı dirençli yapmasına karşın, colicin B ve diğer kolisin türlerine duyarlıdır.
Kolisinler, etkilerine göre, E. coli 'ler, Fredericq tarafından 20 farklı tipe ayrılmış ve bunlara A'dan V'ye kadar bir isim verilmiştir (Freedericq klasifikasyonu). Bu sistematikte, E. coli 'lerin dirençlilikleri esas alınmıştır. Ancak, bu sistematik pratiğe pek uymamaktadır. Şöyle ki, bir E. coli suşu, birden fazla türden kolisin sentezlediği gibi, birden fazla türden kolisini kodlayabilmektedir.
Bakteriyosinler düşük molekül ağırlığında ve protein karakterinde substanslar olup her birinin amino asit sıraları ile bazılarının bunları kodlayan genlerin bazılarının baz sıraları saptanmıştır. Yapıları oldukça basit, karbonhidrat ve lipid molekülleri yönünden de bazıları yoksundurlar. Bu nedenle bakteriyosinlerin plasmidler tarafından spesifiye edilip-edilmediklerini saptamak oldukça kolay olmaktadır.
Gram pozitiflerce sentezlenen bazı bakteriyosinler, ayrı cinsten mikroorganizmalara da az da olsa etkili oldukları açıklanmıştır. Ancak, bu özellikteki bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal orijinlidirler. Şöyle ki, P. aeruginosa 'nın aeruginocini (pyocin) kromozomal genler tarafından spesifiye edilirler.
Bakteriyosinler proteazlar tarafından inaktive edilirler. Bazılarının morfolojileri de, elektron mikroskopla yapılan muayenelerde, faj kuyruklarına benzediği açıklanmıştır.
Kolisinlerin ve diğer bakteriyosinlerin molekül ağrılıkları 12000-90000 arasında değişmektedir. Kolisinlerin bazıları iki asimetrik protein molekülü olarak sentezlenir. Bunlardan büyük olanı, duyarlı bakteriyi öldürür ve küçük alt ünite ise kolisin immunite proteini aktivitesi gösterir. Bu alt ünite, kolisinin, in vitro, etkisini inhibe etmesine karşın, büyük alt ünitenin bakteriyi öldürmesine mani olacak etkinlikte değildir. İmmunite proteini kolisine sıkıca bağlanır.
Gram pozitif mikroorganizmaların plasmid orijinli bakteriyosinlerinin (streptococcin, staphylococcin, lactocin, vs) molekül ağırlıkları 10000-25000 arasındadır ve yapılarında lipid ve karbonhidratlar bulunmaktadır. Bu duruma göre lipoprotein veya glikoprotein özelliği taşımaktadırlar.
Kolisinler bazı antibiyotiklerden (Streptomycin, chloramphenicol) daha büyük molekül ağarlığına sahiptirler. Böyle büyük moleküllerin bakterilerin hücre duvarından içeri girmeleri oldukça zordur. Ancak, bakteriyosinler bir çok tarzda hedef bakteriyi etkileyerek lize ederler. Kolisinlerin hücre membranına bağlı enzimleri aktive ederek veya bazıları da hücre membranından içeri girerek, DNA ve RNA'ların fonksiyonlarını bozarlar. Kolisinler, daha ziyade, RNase ve DNase gibi etkinlik gösterirler. Bazıları da hücre membranının permeabilitesini artırır ve böylece kolisinlerin geçişini kolaylaştırır. Buna bağlı olarak diğer moleküllerin içeri ve dışarı akışı hızlanır ve hücrenin ortamdaki metabolik dengesi bozulur. Kolisinler, aynı zamanda, bakteri hücre membranında bulunan kolisin reseptörlerine tutunarak etkili olabilmektedirler. Colicin-B, E, K ve -M reseptörleri, ferri enterocholin, Vit B12, nukleosid ve ferrichrome (sıra ile) moleküllerinin hücreye girişinde rol oynarlar. Kolisin reseptörleri kolisinin aktivitesi için önemlidir. Eğer hücre duvarı ve buna bağlı reseptörler giderilirse, orijinal hücre kolisine rezistans olsa bile, elde edilen sferoplastlar duyarlılık gösterirler.
Ekseri kolisinler (Colicin A, -E1, Ia, Ib, -K) hücre duvarını kanallar oluşturarak, iyonların kolayca girip-çıkışına permeable hale getirir. Kolisinle muamele edilmiş hücrelerden genellikle potasyum (K+) iyonları fazla miktarda dışarı çıkar. Colicin E1 ve -K, hücrelerdeki ATP'ye bağlı reaksiyonları inhibe ederler (protein ve nukleik asit sentezleri de dahil). Katyonların hücreden çıkışı, bunların kofaktör olarak rollerine de mani olduğundan enzimlerin aktivitesini de inhibe eder.
Colicin E2 ile muamele edilen hücrelerin DNA'ları parçalanır. Ayrıca, Colicin E2 ile temas eden hücrelerde (bakterilerde) 16SrRNA'nın 3-terminusundan 50 nukleotidin çıkmasına neden olur ve bu RNA etkisiz hale gelir. Cloacid DF13'de (E. cloacae DF13 tarafından sentez edilir) benzer tarzda etkiye sahiptir. Bu kolisinlerin pürifiye formları in vitro olarak nuklease aktivitesi gösterirler. Col El, -A, Ia, ve Ib, hücre membranında depolarizasyon meydana getirerek bakteriyi öldürürler. Col E2 ve -E3'ün de DNase aktivitesi bulunmaktadır. Col -M ve Pesticin (Y. pestis tarafından sentezlenir), hücre duvarında ayrışmalar oluşturarak mikroorganizmaları lize eder. Pesticin, hücre duvarındaki NAGA ve NAMA molekülleri arasındaki beta-1,4 bağlarını koparır.
Kolisinleri spesifiye eden plasmidler başlıca iki gruba ayrılmaktadırlar. Grup I Col plasmidleri nonkonjugatif bir karakter taşımakta ve MA. 5x106 kadardır (Col El-K30, ve Clo DF13, vs). Grup II Col plasmidleri ise konjugatif olup MA: 50-80 x 106 civarındadır. Bazıları birden fazla kolisin sentezi için genetik informasyonlara sahiptir. Bunlar aynı zamanda ilaçlara dirençlilik genleri de taşımaktadırlar (Col V, ve Col B, F pilusu oluştururlar).
E. coli kültürlerinde, yaklaşık %0.1 bakteri Col+ bir özellik taşımaktadır. Kolisin sentezi ancak bir kaç saat sürer. Bazı kolisinlerin de kendi bakterisine etkiledikleri açıklanmıştır.
Bakterilerde, konjugasyon için pilus formasyonunu kodlamayan nonkonjugatif karakterdeki kolisin plasmidleri, eğer konakçı bakteri Col I gibi I pilus oluşturan bir plasmidle super infekte olduklarında, konjugatif plasmid kendi DNA'sı yanı sıra, diğer plasmidlerin de transferini ve hatta, kendi konakçısının DNA'sını da aktarabilir.
F piluslarını adsorbe eden fajlarla, I piluslarına bağlanan fajlar (Ifl) farklıdırlar. I pilusları, Col+ bakteri ile Col I- E. coli 'ler arasındaki konjugasyonlarda Col I faktörü alıcıya aktarabilir.
Kolisinojenik plasmidler, bakteri içinde bağımsız olarak replike olabilir ve konakçısı için de zararlı bir etkiye sahip değildir. Yani sentezlediği kolisinden konakçısı genellikle etkilenmez. UV-ışınları ve mitomycin C ile bazı kolisinojenik faktörler (plasmidler), indüklenebilirler.
Başlangıçta (orijinalinde) Col plasmidi taşımayan ve nonkolisinojenik olan bir bakteri, bu faktörü sonradan alarak Col+ hale gelebilir.
E. coli 'lerin kolisinojenik olup-olmadıklarını belirlemek için pratikte kullanılan bazı teknikler bulunmaktadır. Bunlardan birisi de "makrokoloni" yöntemidir. Bu teknik kısaca şöyledir:
Taze E. coli buyyon kültürü, agar besi yerinin ortasına, 1 cm çapında yer kaplayacak tarzda ekilir. Uygun bir ısıda (37°C) 48 saat inkube edildikten sonra, kültürün kapağına 1 ml kloroform konarak petri kutusu tersine çevrilir ve böylece 30 dakika kadar bekletilir. Petri kutusunun kapağı açılarak kloroformun uçması beklenir (15. dakika). Bundan sonra, bütün kolisinlere duyarlı olan E. coli K suşunun 24 saatlik buyyon kültüründen 1/100 sulandırılarak bundan petri kutusunu ortasındaki kültüre kadar gelmemek kaydıyla ekim yapılır ve 37°C 'de 24 saat inkube edilir. Ekilen suşun ürememesi kolisinin varlığını ortaya koyar. Ekilen suşun, daha ziyade ortadaki büyük koloniye yakın bölgelerinde inhibisyon oluşur.
Aşağıda bazı önemli bakteriyosinler ve bunları sentezleyen mikroorganizmalar gösterilmiştir. Ancak bunların hepsi plasmid orijinli olmayıp bazıları kromozomaldır.
A) Gram negatif mikroorganizmalar
Aerosin (A. aerogenes), Alveisin (B. alvei), Kloasin (E. cloacae), Kolisin (E. coli) Pestisin (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis) Piyoin (P. aeruginosa)
B) Gram pozitif mikroorganizmalar
Stafilokoksin (Staphylococcus), Streptokoksin (Streptococcus), Subtilisin (B. subtilis), Seresin (B. cereus), Monosin (L. monocytogenes), Megasin (B. megaterium)
Kolisin grupları ve bazı kolisinler
Grup A(I): E, E1, E2, E3, K, L, N, S4, X
Grup B (II): B, D, G, H, I, M,S, V,Q
Virulens Plasmidleri
Patojenik mikroorganizmalar, kendilerinde bulunan bazı virulens faktörleri (bunlardan biri veya birkaçı ile birlikte) ile konakçıyı hastalandırırlar ve hatta ölümlerine neden olabilirler. Ancak, bu etkinlikleri, virulent bakterinin konakçıya yeterince ve uygun yoldan girmesi ve konakçının genetik ve/veya immunolojik yönden (spesifik antikor taşımaması) duyarlı olması ile yakından ilişkilidir. Bakteri, ne kadar virulent olursa olsun, eğer konakçı buna direnç gösteriyorsa, mikroorganizma üreyemez, infeksiyon veya hastalık oluşturamaz.
Bakterilerin sahip oldukları virulens faktörlerinin bir kısmı da kromozomlarında kodlanmasına karşın bazıları da plasmid orijinlidir. Plasmidlerce kodlanan başlıca virulens faktörleri hakkında aşağıda kısa özlü bilgiler verilmektedir.
C. tetani (nörotoksin), B. anthracis (pOX1 letal toksin ve pOX2 kapsül formasyonu), B. thuringiensis (kristal toksin, insekt larvaları için toksik) A. tumefaciens (Ti plasmidi, dikotiledon bitkilerde tümör formasyonu), L. lactis (nisin), S. aureus (eksfoliatif toksin), Y. pestis, Y. psedotuberculosis, Y. enterocolitica (membran proteinlerini kodlayan plasmidler). S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae (dizanteri oluşturan toksinlerin kodlarını taşıyan plasmidler), insanlardan izole edilen E. coli 'lerde LT ve ST-toksinlerin sentezlerini spesifiye eden plasmidler (CFA-1, -2, E8775), buzağı ve kuzularda hastalık oluşturan E. coli 'lere ait K99 antijenleri ile domuz ishallerinden ayrılan E. coli 'ler de bulunan K88 ve 987 antijenleri plasmidler tarafından kodlanmaktadırlar.
Bazı virulens faktörleri de kromozomal orijinli oldukları gibi bir kısmı da fajlarla spesifiye edilirler. Örn, C. diphtheriae 'ye ait beta fajının kodladığı difteri toksini veya C. botulinum C 'de bulunan fajda aynı tarzda toksin sentezini spesifiye eder.
Metabolik Plasmidler
Metabolik aktivite bir çok bakteride kromozomlarda bulunan özel genler tarafından yönetilirler. Ancak, bazı bakterilerde de metabolizma ile ilgili reaksiyonlar hem kromozomal ve/veya hem de plasmid orijinli olabilmektedir.
1) Degradatif plasmidler: P. putida ve diğer pseudomonaslarda bir çok kimyasal maddeyi ayrıştırabilecek plasmid kaynaklı enzimlere sahiptirler. Böyle enzimlerin sayısı 10'dan fazlayı bulmaktadır. Örn., SAL, NAH, ASL ve TOL plasmidleri, sıra ile salycylate, naphtalene, alkyl benzen sulphonate ve tolueni ayrıştırarak catechola çevrilir ve sonra da plasmidlerce kodlanan enzimler tarafından acetaldehyde ve piruvatlara dönüştürülür.
Degradatif plasmidler konjugatif bir özellikte olup molekül ağırlıkları oldukça yüksektir (50-200 x 106). Bu plasmidler, genellikle, kompatible bir karaktere sahiptirler ve büyük plasmidler arasındadırlar.
TOL, SAL, OCT ve NIC plasmidleri de iki veya daha fazla farklı küçük plasmide ayrılabilirler ve bunlar bağımsız replikasyon orijinine sahip olduklarından da, transfer edildiklerinde hücre içinde serbest replike olabilirler. Ancak, bunlar, nonkonjugatif bir özellik gösterirler.
TOL ve NAH gibi plasmidler de geniş bir konakçı spektrumuna sahiptirler ve E. coli 'lere ve pseudomonaslara transfer edilebilirler.
2) Diğer metabolik plasmidler: Salmonellalar, genellikle, Lac-'dirler. Bazen Lac+ fenotipe dönüşebilirler (S. typhi). Bunları, Lac+ plasmidler gerçekleştirirler. Lac+ plasmidlere, salmonellalar dışında, serratia, S. lactis ve proteuslarda da tesadüf edilmiştir. Plasmidler, aynı zamanda, salmonellalarda, sukroz fermentasyonuna da neden olabilirler.
E. coli 'lerde K88 antijenlerini kodlayan plasmidler, aynı zamanda, rafinozun fermentasyonuna da sebep olurlar. Bazı raf + plasmidler de H2S üretimini de bakterilere kazandırabilirler.
Plasmid SCP1 (Streptomyces coelicolor), methylenomycin sentezini kodlayabilmektedir. Kasugamycin ve chloramphenicol da plasmidler tarafından spesifiye edilirler.
Rizobiumlarda bulunan plasmidler de legumine bitki köklerine nitrojen fikzasyonunda etkin fonksiyonlara sahiptirler.
Büyük Plasmidler
Patojenik ve nonpatojenik bakterilerde molekül ağırlıkları 1-600 magadalton (Md) arasında değişebilen plasmidlerin varlığı belirlenmiş, bunların bir kısmının da moleküler yapıları ve kodladıkları spesifik proteinlerin karakterleri saptanmıştır. Genel bir kural olmamakla beraber, molekül ağırlığı 50 Md'den fazla olanlar "büyük plasmidler" olarak dikkate alınmaktadırlar.
Taşıdıkları çok değişik ve spesifik markerler yanı sıra, rekombinant DNA teknolojisinde de, özellikle, gen aktarmalarında önemli fonksiyonları olan plasmidlere, daha ziyade kirli ve organik materyallerden zengin sularda yaşayan bakterilerde rastlanılmaktadır.
Bakterilerin tek ve aynı zamanda küçük kromozoma sahip olmaları bunların genetik potansiyellerini ve diğer bazı fonksiyonlarını, ökaryotiklere oranla, daha kısıtlamaktadır. Ancak, bakteri genomlarında meydana gelen çeşitli mutasyonlar ve buna ilaveten, bakterilerde bulunan ve çok değişik karakterler taşıyan büyük plasmidler, fajlar, transposon ve İs elementleri, bakterilere yeni sekanslar, genler ve bunlara bağlı olarak yeni özellikler kazandırmaktadırlar. Fakat, bu genlerin bazıları, fazla sayıda meydana gelen replikasyonlar sırasında veya indüktörlerin etkisi altında, bakterilerden ayrılmakta ve mikroorganizmalar orijinal parental fenotipik karakterlerine tekrar dönmektedirler.
Bakteri kromozomunun %3-5'i uzunluğuna kadar ulaşabilen büyük plasmidler, hücre içinde, genellikle, küçük plasmidlere oranla daha az sayıdadırlar (1-5 adet). Kointegrasyon sonunda sayıları daha da azalmaktadır. Plasmidler, hücre içinde ya bağımsız replikonlar halinde bulunurlar veya birbirleriyle birleşerek (kointegrasyon) büyük plasmidleri meydana getirirler. Ancak, bunun anlamı, her zaman böyle olur manasını taşımaz. Bazen de, tersi olabilmektedir. Yani, büyük plasmidler, daha küçük replikonlara ayrılmaktadırlar. Kointegrasyon sonucu oluşan multimerik plasmidler etkinlik bakımından diğerlerine oranla daha fazla avantajlıdırlar. Hatta, bazılarında da, birden fazla replikasyon orijini bulunmaktadır. Ancak, replikasyonda sadece bunlardan biri fonksiyonel olmaktadır.
Bakteri sitoplasmasında bağımsız bir replikon olarak bulunan plasmidler, genomla da birleşebilirler ve bunun bir devamı haline gelebilirler.
Bazı durumlarda da plasmidlerle kromozom arasında biyokimyasal yönden bir işbirliği de gelişmektedir. Şöyle ki, bir kimyasal maddenin metabolize olmasında önce kromozom (veya plasmid) etkinlik göstermekte ve oluşan ürünler de plasmid (veya kromozom) tarafından son ürünlere kadar ayrıştırılmaktadır. Örn, P. putida da bulanan CAM (campher) plasmidi (200 Md), campherin ayrışmasının bir bölümünü, bakteri kromozomu da geri kalan kısmını tamamlar. P. oleovorans 'da bulunan OCT (octane) plasmidi (200 Md), alkanları kullanma kapasitesini spesifiye eder. Ancak, tam olarak, alkanları yağ asitlerine kadar ayrıştıramaz. İlk basamakta, alkane oksidasyonu plasmid tarafından yönetilir. İkinci aşamada ise, alkol dehidrasyonu, bağımsız olarak hem plasmid ve hem de kromozom tarafından spesifiye edilir. Agrobacterium tumefaciens, ornitini iki ayrı basamakta ayrıştırır. Bunlardan biri pTiC58 plasmidinde kodlanmıştır ve diğeri ise kromozomal orijinlidir. Kromozom-plasmid işbirliğine (interaksiyon) TOL (toluene) plasmidinde de rastlanılmıştır.
Bazı durumlarda da işbirliği ters veya olumsuz bir yönde gelişebilmektedir. Şöyle ki, Rhizobium leguminosarum (sym plasmidi, pRIJI) ve R. trifoli 'de (pRtr5a) bulunan plasmidler, bakterilerin bakteriosin sentezlerini inhibe ederler.
Aynı fonksiyona sahip plasmidlerin molekül ağırlıkları, değişik bakterilerde, farklı ölçülerde olabilmektedir. Örn, E. coli 'de laktoz fermantasyonu 58.5 Md'luk plasmid tarafından yönetilmesine karşın, K. pneumoniae 'de 163 Md'luk plasmid aynı fonksiyonu yapar. R. leguminosarum 'da bulunan 100 Md'luk plasmid, hidrogenase aktivitesini spesifiye etmesine karşın A. eutrophus 'da 300 Md'luk plasmid aynı aktiviteyi iki enzimle yapar.
Bezende, aynı aktivite, aynı tür içindeki suşlar arasında değişik molekül ağırlığındaki plasmidler tarafından, spesifiye edilebilmektedir. Örn, B. thuringiensis suşlarında insektisidal delta tonsinini kodlayan plasmidlerin molekül ağırlıkları 44;50 ve 75 Md arasında bulunmaktadır. Halobacterium suşları arasında da gaz vakuollerini kodlayan plasmidlerin molekül ağırlıkları 44 ve 100 Md' arasıdır.
Kromozomla birleşen plasmidler bazı nedenlerle genomdan ayrılabilir ve ayrılırken de kromozomdan bir segment alabilirler. Böyle plasmidler de sitoplasmada sirküler forma dönüştürülerek bağımsız olarak kalabilecekleri gibi konakçıdan da çıkabilirler.
Bazı plasmidler de bir bakteride tek bir ünite halinde bulunduğu halde, diğer bir bakteri de iki plasmid halinde olabilmektedir. Örn, E. coli 'deki RI ve NR1 plasmidleri, P. mirabilis'e transfer edilirse küçük replikonlara ayrılmaktadır. P. rettgeri 'den izole edilen R plasmidi 'R 394, 115 Md) iki plasmide ayrılabilmektedir (11 ve 102 Md). Bunlardan her biri ayrı bir rezistanslık genini kodlarlar.
E. coli 'de bulunan R plasmidi tek bir ünite halinde ancak iki kısımdan oluşmakta (RF ve TF). Proteus veya salmonellalar da iki replikona ayrılabilmektedir.
P. mirabilis 'teki rezistenslik plasmidi (NRI) kloramfenikollu ortamda üretilirse, NR1'in büyüklüğünde ve r-determinant sayısında artmalar meydana gelmektedir. Benzer olguya, tetrasiklin plasmidine sahip olan S. faecalis 'te de rastlanılmıştır.
Bakteri içinde iken inkompatible olan iki plasmid, birleştiklerinde (kointegrasyon) bir arada uzun sürü bulunabilmektedirler. Örn, UV-ışınları ve uygun seleksiyon yöntemleri CAM ve OCT plasmidlerini kointegre hale getirebilmektedir.
Kointegrasyon aynı zamanda, nontransmissible (nonkonjugatif) olan plasmidlerin mobilizasyonuna yardımcı olduğu gibi, bazılarının da kromozomla birleşmesine veya genomdan ayrılmasına da yol açabilmektedir.
İn vitro hazırlanan plasmidler, (suni plasmidler) bakterilere aktarıldıktan sonra hücre içinde bazı yapısal değişikliklere maruz kalmaktadırlar.
Mikrobiyoloji
-
Antibiyotiklerin Etki Mekanizmaları Nelerdir?
-
Azot oksit
-
Petri Kutusunda Agarlı Besiyeri Hazırlanması
-
Tüpde Agarlı Besiyerlerinin Hazırlanması
-
Besiyeri Hazırlarken Dikkat Edilecek Hususlar Nelerdir ?
-
Dehidre Besiyerleri Nedir?
-
Besiyerinin Sahip Olması Gereken Özellikler
-
Besiyeri hazırlanmasında kullanılan maddeler nelerdir ?
-
Besiyerlerin Sınıflandırılması Nasıl Yapılır ?
-
Besiyerinin Tanımı ve Kullanım Amaçları Nelerdir ?
-
Pseudomonas Cinsine ait Türler
-
Veba - Yersinia Pestis
-
Tularemi - Francisella tularensis
-
Şarbon - Bacillus anthracis Enfeksiyonu
-
Bruselloz - Brucella spp