Auramin - Rhodamin ile Boyama Yöntemi
Direkt mikroskopi teknikleri konusunun giriflinde verilen genel bilgiler ve yayma preparatın hazırlanması aflamaları hem karbol fuksin boyama hem florokrom boyama yöntemlerinde aynıdır. Rutinde tanı amaçlı en sık karbol fuksinli (Erlich Ziehl Neelsen- EZN , Kinyon) boyama kullanılmakla birlikte, daha duyarlı ve hazırlanan preparatın daha hızlı taranmasını sağlayan florokrom boyalar da kullanılabilir. Bu boyama yöntemlerinde, daha küçük bir büyütme ile daha genifl bir alan taranabilir ve preparatın taranması için gereken zaman azalır.Bu nedenle özellikle zaman problemi olan ve fazla sayıda hasta örneğinin ifllemlendii laboratuvarlarda, florokrom boyama yöntemleri hem tanı için hem de antitüberküloz tedavi alan hastaların izleminde tercih edilebilir.Florokrom boyamada ana ilke fenollü fuksin yerine floresan boyaların kullanılmasıdır. Floresan boyalar, mikobakterilerin lipitten zengin hücre duvarına bağlanarak, görünür hale gelmesini sağlar. Ancak boyaların hazırlanması, amaçlanan hedef (doku, mikroorganizma, antijen antikor kompleksi vs.) ve boyama ifllemi sırasında ısı-süre değiflikliklerinin uygulanması gibi, bazı kriterlere göre, farklı floresan boyama yöntemleri uygulanabilir. Bu yöntemler arasında Auramin-Fenol boyama yöntemi, Glikerson ve Kanner’in floresanlı boyama yöntemi, Auramine-Rhodamine boyama yöntemi, Truant’ın modifiye Auramine-Rhodamine boyama yöntemi sayılabilir. Kullanılan auramin’in karsinojen olduğu unutulmamalı, özellikle direkt temas-hava yolu izolasyon önlemleri alınmalıdır.
AURAMİN-RHODAMİNE BOYAMA İFİLEM BASAMAKLARI
A. Örneklerin Hazirlanması : Karbol Fuksin boyama yönteminde anlatıldı.
B- Kimyasal Maddelerin Hazırlanması
1-Auromine - Rhodamine Floresan Boyanın Hazırlanması
Auromin O----- 1,5gr
Rhodamin B----- 0,75gr
Gliserol----- 75ml
Sıvı fenol----- 10ml
(ısıtılmış fenol 10ml + dH2O 50ml)
Safsu--------- 50ml
2.Asit Alkol Hazırlanması
Etil alkol (% 70’lik) ---------- 99.5 ml
Konsantre HCl------------------ 0.5 ml
3.Karflıt Boya Çözeltisi Hazırlanması
Potasyum permanganat (KMnO4) --------- 0.5 gr
Distile su--------------------------------------- 100 ml
C- Kalite Kontrol Her boyama için mutlak pozitif ve negatif kontroller hazırlanmalıdır.
Her boyama için mutlak pozitif ve negatif kontroller hazırlanmalıdır.
Pozitif kontrol hazırlanması: Middleebrook 7H9 sıvı besiyeri içinde mikobakteri (mümkünse standart M tuberculosis H37Rv) süspansiyonu hazırlanır.Bu süspansiyondan lam üzerine bir damla konularak ya ısıtıcı blokta ya da havada
kurutulup, tespit edilir.
Negatif kontrol hazırlanması: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ile sıvı besiyerinde hazırlanan süspansiyondan bir damla lam üzerine konularak ya ısıtıcı blokta ya da havada kurutulup, tespit edilir.
Pozitif kontrol hazırlanması: Middleebrook 7H9 sıvı besiyeri içinde mikobakteri(mümkünse standart M tuberculosis H37Rv) süspansiyonu hazırlanır.Bu süspansiyondan lam üzerine bir damla konularak ya ısıtıcı blokta ya da havada kurutulup, tespit edilir.
Negatif kontrol hazırlanması: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ile sıvı besiyerinde hazırlanan süspansiyondan bir damla lam üzerine konularak ya ısıtıcı blokta ya da havada kurutulup, tespit edilir.
D- ifllemin Uygulanması• Oda ısısında saklanan boyalar kullanılmadan önce mutlaka iyice çalkalanmalıdır.
• Hazırlanan lamlar alevde fiske edilir.
• Hazırlanan lamların üzerine AR boyası dökülür ve 15-20 dakika oda ısısında beklenir. Boya lamın üzerini tamamen kaplamalı ve eksilmemelidir
. Distile su ile yıkanır. Klorsuz su kullanılmalıdır, çünkü klor floresanı azaltır
• Yıkama sonrası % 0,5 asit alkol dökülerek 2–3 dakika beklenir. Yeterli dekolarizasyon iflleminde çıplak gözle boya görülmez
• Yıkama ifllemi tekrarlanır
• Zemin boyası olarak hazırlanmı fl KMnO4 ile 2 dakika boyanır. Süre uzatılırsa floresan azalabilir
• Yıkanır ve havada kurutulur
• Pozitif bir yaymada mikobakteriler, karanlık bir zeminde sarı-turuncu parlak, ince, kıvrık içi tanecikli floresan veren bakteriler olarak görülür
• Her örneğin boyanması sırasında, mutlaka pozitif ve negatif kontrolkullanılmalıdır.• Boyanan preparatlar en kısa sürede 25x ya da 40x büyütme ile floresan mikroskobunda incelenmelidir. Basil morfolojisi x1,000 ya da x450 büyütme ile kontrol edilmelidir.
• Gerekirse pozitif değerlendirilen preparatlar, EZN ya da Kinyon boya ile boyanabilir.
E. SONUÇLARIN BİLDİRİMİ:
Negatif: Floresan görülmeyen tüm yaymalar “ Aside dirençli basil görülmedi ‘’ fleklinde raporlanır.
Pozitif: Karanlık bir zeminde sarı-turuncu parlak, ince, kıvrık içi tanecikli floresan veren bakteriler olarak görülür “Aside dirençli basil görüldü’’ fleklinde rapor edilir. Boyanma yöntemi belirtilir ve yaymada gözlenen aside dirençli basilin miktarı hakkında bilgi verilir. Basilin miktarı hakkındaki değerlendirmede karbol fuksin boyama yönteminde kullanılan tablo rehber olarak kullanır.Auramine – Rhodamine Floresan Boyama iflleminin resimlerle izlemi
KAYNAKLAR
1 Weitzman I. Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing. Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook ASM Press, Washington DC, 2004; 7.2.1- 7.3.1.
2. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. ikinci basım Barıfl yayınları. izmir 1995: 83-84.
3. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Fifth edition Lippincott, Philadelphia.1997: 903 – 905.
4. Uzun M. Tüberküloz tanısında Ehrlich-Ziehl-Neelsen, Fluorokrom boyama yöntemleri ile BACTEC ve Löwenstein-jensen Kültür yöntemlerinin sonuçlarının değerlendirilmesi Doktora tezi. İstanbul Tıp Fakültesi. 1994.
5. Baron JB, Peterson LR,Finegold SM. Bailey Scott’s Diagnostic Microbiology 9th edition. Mosby-Year Book, St Louis, Missouri. 1995:605-608.
6. Nolte FS, Metchock B. Mycobacterium. In: Murray PR, Baron EJ,Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH eds. Manuel of Clinical Microbiology 6th ed. Washington. ASM Press. 1995: 400-38.
7. http://www2.provlab.ab.ca/bugs/mycob/afb_stain/znstain.htm
Dr. Vildan AVKAN OĞUZ
DEÜ Tıp Fakültesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji AD.
Mikrobiyoloji Laboratuvarı
-
Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) Boyama Yöntemi Nedir?
-
Mantarların Boyanması
-
Laktofenol Pamuk Mavisi Boya Solüsyonun Hazırlanışı
-
Flagella Boya Solüsyonun Hazırlanışı
-
Bakterilerde Kirpik Boyama İçin Preparat Hazırlanması
-
Spor Boyama Solüsyonlarının Hazırlanması
-
Schaffer Fulton Yöntemi ile Spor Boyama
-
Ehrlich – Ziehl – Neelson Boyamada Kullanılan Solüsyonlarının Hazırlanışı
-
EHRLICH - ZIEHL-NEELSEN BOYAMA YÖNTEMI
-
Besiyeri Hazırlamada Kullanılan Araç Gereçler Nelerdir?
-
Karbonhidrat Fermantasyon besiyeri formül ve hazırlanış bilgileri
-
TSİ (Üç şekerli Demirli Agar) besiyeri formül ve hazırlanış bilgileri
-
Çikolata Agar Besiyeri formül ve hazırlanış bilgileri
-
Kanlı Agar Besiyeri formül ve hazırlanış bilgileri
-
Löwenstein- Jensen Besiyeri formül ve hazırlanış bilgileri