5’ NUKLEAZ-PCR ANALİZ PROTOKOLÜ
5’ NUKLEAZ-PCR ANALİZ PROTOKOLÜ
Floresan boyalar kullanılarak eş-zamanlı olarak DNA’nın çoğaltılması ve saptanması işlemi “Real-Time PCR” olarak adlandırılmaktadır. Sistem her döngüde oluşan PCR ürünleri ile doğru orantılı olarak artan floresan ışıma sinyallerinin tespitine dayanmaktadır. Bu ışıma sinyali, başarılı olarak tamamlanan her PCR döngüsü ile doğru orantılı olarak artmaktadır.
Real-time PCR metodunun özelliği amplifikasyon reaksiyonun gerçekleştirilmesi ve görüntülenmesi için kullanılan cihaz ve kimyasallara bağlıdır. Bu amaçla birçok farklı kimyasal kullanılabilmektedir: Ethidyum bromid, SYBR Green I gibi boyalar ve TaqMan, Molecular Beacon, Scorpion, Fluorescence Resonance Enerji Transfer probları.
5’ Nukleaz PCR nedir?
5’ nukleaz (TaqMan®) yöntemi Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır. TaqMan probu yaklaşık 23–30 baz uzunluğunda bir oligonükleotid dizisidir. Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya bulunmaktadır. 3’ ucunda bulunan quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir. Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit edilmektedir .
Bu yöntemde kullanılan problar farklı floresan değerli boyalarla işaretlenerek multipleks çalışmalara imkân vermektedir. Primerlerin çoğalttığı bölgede ışımanın meydana gelmesi işaretli probun hedef bölgeye hibridizasyonu ile mümkün olmakta, bu şekilde daha spesifik ve doğru sonuçlar elde edilmektedir.
Biyokimya
-
Serum Enzimlerini Tayin Yöntemleri
-
Fosfatazlar (Alkali fosfataz= ALP)
-
Transferazlar
-
Transaminazlar
-
Enzimlerin Görev, İşlev ve Özellikleri - Enzimlerin İsimlendirilmesi
-
Kanda Bilirubin
-
Serum Proteinleri
-
Fosfolipidler
-
Trigliseridler
-
Kolesterol Nedir?
-
Kan Lipitleri Nelerdir?
-
Kan Şekeri Nedir?
-
Araşidonik Asit (ARA) Nedir?
-
Lizozim enzimleri
-
Lizozim: İlk Antibiyotik