WESTERN JELİNİN (PAGE) HAZIRLANIŞI
Separation Gel
Stacking Gel
ddW (İki kere distile edilmiş su)
ddW
AC/BIS (Acrylamide/Bisacrylamide)
AC/BIS
GB-1 (Jel Tamponu-1)
GB-2 (Jel Tamponu-2)
SDS (deterjan)
SDS
APS
APS
Katalizör
Katalizör
TEMED
TEMED
Akrilamid: Işık görmemesi gerekir, aluminyum folyo kağıdı ile tüp çevrelenir. Karışım, filtre kağıdı ile süzülür.
SDS (sodyum dodesil sülfat): Tüm proteinlerin eksi (-) yükle yüklenmesini sağlayan anyonik bir deterjandır.
Jel Kalıbının Oluşturulması
Çok iyi şekilde temizlenmiş ve alkol ile iyice ovularak tüm lekelerinden arındırılmış olan iki cam, aralarına iki çubuk (Spacer) yerleştirdikten sonra arka arkaya konarak düzeneğe yerleştirilir. Alttan sızıntı olmaması için aşağı doğru bastırılır. Sızıntı olup olmadığı az miktar “distile su” ile kontrol edilir.
Seperating Jel karışımı hazırlandıktan sonra, pipetle hızlıca ama dikkatli bir şekilde kenarından kalıpların arasına dökülür, bu esnada kabarcık oluşmamasına dikkat edilir. Bu işlem çok hızlı yapılmalıdır çünkü katalizörler eklendikten sonra jel solüsyonu 5-10 dakika içerisinde tamamen donmaktadır. Üst kısmın düzgün bir yüzey oluşturması ve hava almaması için 0,5 cc kadar “Bütanol veya İzopropopranol (alkol)” yavaşça eklenir.
Jel iyice polimerleştikten sonra konan alkol geri boşaltılır ve üzerine Stacking jel hazırlanarak aynı şekilde dökülür. Döker dökmez, son olarak “Tarak (comb)” yerleştirilerek jel polimerleşmeye bırakılır, böylece “Kuyular (well)” oluşturulmuş olunur.
Eğer hazır jel kullanılacaksa; Jelleri ambalajlarından çıkartılır, alt kenarlarındaki beyaz bantı sökülüp tarak çıkarıldıktan sonra, alt kenarları iyice temas edecek şekilde yerleştirilir ve vidalarla yerine sabitlenir.
***Hazır jel kesinlikle eldivensiz açılmamalı ve jele dokunulmamalıdır!!! TOKSiK (Sodyum azid var)!!!
Elektroforez sisteminin kurulması
500 ml yürütme tamponu (Running Buffer) hazırlanır. İç havuz (running chamber), 250 ml yürütme tamponu ile kuyucukları tamamen kapatacak şekilde doldurulur, içerisine 600 µl antioksidan çözeltisi eklenir (yürütme esnasında proteinlerin indirgenmiş halde kalmalarını sağlar). İç havuzdan tamponun sızma yapmaması çok önemlidir. Sızma yapmadığına emin olacak kadar beklendikten sonra, tamponun iç havuzda kaldığına emin olunduktn sonra, geriye kalan 250 ml yürütme tamponu dış havuza filling line çizgisine kadar doldurulur. Kuyucuklar mikropipet ya da pastör pipeti yardımıyla iyice temizleninceye kadar birkaç sefer bas-çek şeklinde yıkanır, çünkü kuyular polimerleşmemiş poliakrilamid jelle dolu olabilir. Bu şekilde kuyular arındırılıp, örneğin düzgün bir şekilde kuyucuğa oturması ve yürütme sırasında jele düzgün bir şekilde girebilmesini sağlar.
Örnekleri yüklemeden önce sisteme PRERUN (ön yürütme) yapılır. Prerun yürütmeye hazırlıktır, sample buffer hazırlanır, herbir kuyucuğa 5 µl sample buffer yüklenerek, sistemin kablo bağlantıları yapılır, 15 dak. 120 V.’ da yürütme yapılır. Boyanın jele düzgün girdiğinden, tüm kuyularda aynı hızda ve eşit olarak yürüdüğünden emin olunur. Böylelikle hem jelin homojenliği ve yürütmeye uygunluğu kontrol edilir hem de sistemden akım geçip geçmediği (akım geçtiğini kabarcıklardan anlıyoruz) kotrol edilmiş olur. Bu kontrolden başarı ile geçen jelin yürütmesi, boya jel tabanına gelince durdurulur. Bu sefer örnekler kuyucuklara yüklenerek yürütme tekrardan başlatılır.
Yükleme için:
Yükleme yapmadan hemen önce kuyucuklar yürütme çemberinin içinde bulunan tampon çözelti ile iyice yıkanmalıdır. Mikropipetle her bir kuyuya, hazırladığımız yükleme örnekleri yavaşça ve sızdırmadan konur. Moleküler standart, ilk kuyucuğa 7-10 µl konulabilir. Diğerlerine 30 µl (kuyucuk hacmine bağlı olarak değişebilir) koymak idealdir.
Elektroforez:
Yürütme (Run): Yükleme yapıldıktan sonra dikey elektroforez sistemi kapak ile kapatılır, elektrotların doğru kutuplarda olduğuna emin olunur. Güç kaynağı çalıştırılır. Önce 80V akımla başlanır. Örneklerin yürümesi seperate jel ve stacking jel arasındaki sınırın altına geçtiği an akım arttırılır (120-130 V). Yaklaşık 1,5 saat boyunca örnekler jelde yürür. Moleküler ağırlığına bağlı olarak araştırılan protein poliakrilamid jel üzerinde istenen
düzeye ulaşılınca güç kaynağı kapatılır, yürütme tamamlanır.
Tamamı eksi yükle yüklenmiş olan proteinler westernde moleküler büyüklüklerine göre yukarıdan aşağıya doğru, yani eksiden artıya doğru hareket ederek ayrılırlar.
Genel bilgi: Proteinler; nötr, eksi (-) veya artı (+) yüklü olarak bulunurlar. Biz SDS ile proteinlerimizin hepsini eksi yükle yükledik. Jel yürümesinin bitimine yaklaşık yarım
saat kala Transfer Buffer (20X) hazırlanır. Tek membran için 60 ml hazırlamak yeterli.
Belirlenen yürütme süresi bittikten sonra jel kalıpları vidalar gevşetilerek yerlerinden çıkarılırlar. Kalıbın üç kenarı hazır jellerde kırılarak açılır, dökme jellerde ise spacerlar çıkartılrak iki cam jele zarar vermeden gevşetilir ve ortaya çıkarılan jelin üst kenarındaki kuyucuklar ve eğer alt kenarında kalıp dışına taşan çıkıntılar varsa, düzgün bir sekilde bistüri ile kesildikten sonra, jel parçalanmamasına özen gösterilerek çıkartılır.
Proteinlerin Jel’den Membrana Transferi
2 tür transfer membranı vardır;
•Nitroselüloz membran
•PVDF (Poli-viniliden florür)
Membrana, protein kontaminasyonunu engelemek için ne çıplak elle ne de eldivenle dokunulmamalıdır, iki filtre kağıtının arasından pens yardımıyla yırtılmamasına özen gösterilerek hafifçe alınıp, protokolün sonuna kadar temiz bir pens haricinde hiç bir şey ile membrana dokunulmamalıdır !
PVDF membran 30sn. Metanol’ de (metanol ve distile su) sallandıktan sonra, Transfer buffer' a konur. Shakerda (60rpm ile)10-20 dakika sallanır. Metanol, kutudan kuru çıkan membranın rehidrasyonunu sağlar.
Transfer Düzeneği
Islak (wet) veya yarı kuru (semi-dry) transfer düzenekleri vardır . Bizim kullandığımız Yarı Kuru düzenektir.
Transfer makinesine birkaç kat kurutma kağıdı konup, iyice ıslanan kadar tranfer buffer dökülür, kabarcık kalmayacak şekilde üzerinden basılarak geçilir. Kuru kalmamasına dikkat edilerek membran, kurutma kağıdı üzerine konur. Jel, membran üzerine gelecek şekilde yerleştirilir. Islaklık ortamın elektrik geçirgenliğini oluşturarak üstten alta (eksiden artıya) doğru, yani jelden membrana doğru protein transferini sağlar.
Üstüne de kurutma kağıdı konup, transfer buffer eklenir. Arada kabarcık kalmaması önemlidir. Transfer makinesi güç kaynağı bağlanır; overnight için tek jel 40mA, çift jel için 80mA: 80 dakika için tek jelde 80mA, çift jelde 160 mA ayarlanır.
Transfer tamamlandığında güç kaynağı kapatılır, makineden kurutma kağıtları arasından membran, jelden ayırılarak alınır.
BLOKAJ
Blokaj, membranla antikorlar arasındaki Nonspesifik bağlanmaları en aza indirmek için uygulanır. Membranla antikorlar arasındaki Nonspesifik etkileşim alanının blokajı, membranı bir dilue protein çözeltisi içinde (BSA-Bovin Serum Albumin veya Yağsız Süttozu-TBST karışımı) oda sıcaklığında 1 saat sallandırarak gerçekleştirilir.
Yağsız Süttozu-TBST solüsyonundaki proteinler membran üzerinde, hedef proteinden yoksun olan tüm bölgeyi kaplar. Böylece kullanacağımız primer antikorların sadece hedef proteinlere bağlanmaları sağlanır. Sonucunda zemin kirliliğinden kaynaklanan yanlış pozitif sonuçlar önlenir.
Membrana Birincil Antikor Ekleme
Membran, birincil antikor çözeltisinde gece boyu +4 oC (buzdolabında sallayıcıda (60rpm ile, zamanın sonsuza ayarlandığından emin olarak), sallandırılır.
Primer antikor çözeltisi yeniden kullanılmak üzere ayrılarak, membran yıkamaya alınır.
Membranın Birincil Antikor Fazlasından kurtarılması:
Poşette bulunan membran üstündeki birincil antikor dökülür. Üstüne 20ml yıkama solüsyonu veya TBST (TBS+ %0.1 Tween-20) eklenerek 3 kez 10 dakika sallayıcıya konup sallanarak yıkama yapılır.
(TBST ayrıca antikorları sulandırmada da kullanılır.)
Membrana İkincil Antikor ekleme
Burada önemli olan, birincil antikor ve ikincil antikorun aynı hayvana karşı antikor barındırmasıdır. Yani birincil antikor hangi hayvanın antijenine karşı yapıldıysa ikincil antikorda da yine o hayvana ait olmalıdır.
Membran plastik poşete yerleştirilir. Kullanılacak ikincil antikorbelli bir oranda sulandırıldıktan sonra membran üzerine dökülür ve poşet kapatılıp sallayıcıda 1 saat sallanarak bekletilir.
Membranı İkincil Antikor’dan kurtarma:
Poşette bulunan membran üstündeki ikincil antikor dökülür. Üstüne 20ml yıkama solüsyonu veya TBST (TBS+ %0.1 Tween-20) eklenerek 3 kez 10 dakika sallayıcıya konup sallanarak yıkama yapılır. Ardından distile suyla 2x2 dakika salanarak yıkanır.
Membran bir plastik şeffaf dosya ikiye ayrılarak, bir yaprağın üzerine konur. Kurumamasına dikkat edilir.
Kitteki Chemiluminescent substrat çözeltisinden 2 ml kadar, membran yüzeyine dokunmamaya dikkat ederek, steril bir pipetle, tüm yüzeye uygulanır ve reaksiyon için 5dak beklenir. Kemiluminesans ajanı, ikincil antikor ile aynı konjüge grubu taşımalıdır ve ikincil antikora bağlanarak ışıma yapar.
Kitte bulunan kurutma kağıdını membrandan üzerine koyarak fazla substrat alınır, membranın kurumamasına dikkat edilir.
Şeffaf dosyanın diğer yaprağını üzerine kapatarak, arada hava kabarcığı kalmadığından emin olunur.
Kodak 4000MM ımage Station'a yerleştirip, ışık kaynağı kapalıyken önc 10 dakika deneme çekimi yapılır. Görüntünün durumu gereği bu süre uzatılır ya da kısaltılır. Yukardaki gibi elde edilen bir görüntünün bant profilleri ise yine aynı cihazın programı ile analiz edilir.
Kaynak: www.norbil.hacettepe.edu.tr/west_ornek.shtml
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar