Tükürük amilaz aktivitesi tayini ( Enzimler )
Alfa ve beta amilazlar, her ikiside nişastanın ve glikojenin alfa-1,4 glikozit bağlarınaetki ile onları maltoz ve dekstrinlere parçalarlar. Alfa amilazın sistematik adı1,4-glukan-4-glukanohidrolaz olup molekül ağırlığı 45.000'dir. Alfa amilaz tükürük, insan pankreası ve Pseudomonas ve Aspergillus mikroorganizmalarından kristalleştirilmektedir. Amilaz enzimleri genel olarak üç grupta toplanır:
a. Alfa Amilaz (Endoamilaz):
Çok yavaşolarak hidroliz olayına katılırlar. Hasta olarak adlandırılan bir seri üç veya daha fazla alfa-1,4 bağlı glikoz birimlerinitaşıyan ürünler açığa çıkarırlar. Buna, özellikle klorür ve bazıiyonlar da aktivatör olarak etki eder. Alfa amilaz glikojenin dokularda yıkılmasında rol oynamaz, zira glikojen 1,4 glikozit bağının yıkılışı dokularda fosforilize olur. Glikojendeki 1,6 bağlarınıda yine amilaz değil, ancak amilo 1,6 glikozidaz yıkar.
b. Beta Amilaz (Egzoamilaz): Bunlar nişastanın amiloz kısmınımaltoza kadarhızlı bir şekilde hidroliz ederler. Polisakkaritte alfa-1,4 glikon bağlarını hidroliz ederek zincirlerin redükte olmayan uçlarında maltoz birimlerini ayırırlar. Bitkisel bir enzimdir ve özellikle bira, malt ekstrelerinde bulunur.
c. Gama Amilazlar:
Kısa bir süre önce bağırsak ve karaciğerde ortaya çıkan,nişastayı maltoz birimlerine değil glikoz birimlerine kadar parçalamaktadır. Enzim 1,4 ve 1,6 bağlarınıhidrolizleyip nişasta ve glikojeni tamamen parçalayabilir. Tüm bu amilaz enzimlerinin etkisiyle oluşan ürünler, çözülebilen nişasta ve maltozdur. Nişasta beta amilaz ile parçalandığısırada, serbest asetal hidroksili beta durumunda bulunan beta maltozları oluşturduğu halde, alfa amilazla parçalanmasında alfa maltozlar açığa çıkar.
İşte amilazların alfa ve beta adı bu neticeden gelmektedir. Tükürük %99.5 su içerir. Ayrıca tükrük amilazı yani pityalin ve birkaç protein (musin bir glikoproteindir), inorganik iyonlar (kalsiyum, potasyum, sodyum ve klorür)ve fosfatlarıtaşır. Bunlardan başka aminoasitler, üre, ürik asit ve kolesterol gibi biyoorganik bileşiklerde tükürükte bulunurlar. Bunların hepsi amilaz enziminin yapısına girmektedir.
Araç ve Gereçler:
İnsan tükürüğü ve dana salyası, %1 w/v nişasta çözeltisi, %1 w/v (tuz) NaCl, sulu iyot çözeltisi, fosfat tamponu, su banyosu (38 derecede), pipetler (1 mililitrelik ve 5 mililitrelik), dereceli silindir (100mililitrelik), beher (50 mililitrelik),test tüpü (18x150 mm ve 30 adet), pastör pipeti.
Uygulama:
Toplanan insan tükürüğünün bir mililitresi 100 mililitrelik dereceli silindire pipetlenir. 100 mililitre işaretine kadar sulandırılır ve iyice karıştırılır. Bir test tüpüne 5 mililitre %1'lik nişasta çözeltisi konulur. Üzerine 2 mililitre %1 NaCl ve 2 mililitre fosfat tamponu ilave edilir.İyice karıştırıldıktan sonra 38°C sıcaklıktaki su banyosuna yerleştirilir.
Birer mililitre açık sarıiyot çözeltisi taşıyan 10 adet test tüpü hazırlanır. Sulandırılmış tükrüğün 1 mililitresi nişastalıdeney karışımına konulur ve zaman kaydedilir.
Birer dakika arayla inkübasyon karışımından pastör pipeti ile iki damla alarak iyot çözeltisi bulunan tüplerden birine konulur. İyot çözeltisinde renk değişimi olduğu zaman (akromik nokta) geçen süre kaydedilir ve deneye son verilir (eğer geçen süre5 dakikadan az veya 20 dakikadan çok ise, tükürüğün değişik sulandırımı kullanılarak 10 dakika civarında bir uç nokta bulunmalıdır). Deney insan tükürüğü yerine dana salyası kullanılarak tekrar yapılabilir.
Amilaz Aktivitesinin Hesaplanması
Bir amilaz üniti; yöntemde tarif edilen deney koşullarında, 10 dakikada %1'lik nişastanın 5 ml'sini hidroliz eden amilaz miktarıolarak tarif edilir.
Amilaz Ünitesi = 100 (sulandırım faktörü) x 10/T (dakika)
T = Nişastanın ortamdan kayboluşu için geçen zaman.
Eğer nişasta değişikşekilde sulandırılırsa, sulandırma faktörü de ona göre değişir.Çalışmada değişik sulandırma kullanılmadığıiçin, böyle bir değişiklik yapılmasına gerek kalmamıştır. Tüplerde renk değişiminin olduğu, berraklığın ortadan kalktığı nokta " akromik nokta " adınıalır. Bu nokta nişastanın tümünün amilazla şekere dönüştüğü safhadır. Çalışmada, amilaz enzim aktivitesinin ölçülmesinde insan tükrüğü ile dana salyasında aktiviteler ölçülerek, karşılaştırılması yapılır. Enzim aktivitesinin değerlendirilmesi fotoğraflarla belirlenerek, akromik nokta saptanır (Şekil 3.1, 2, 3, 4).İnsan tükürüğü için: (Akromik nokta = 3. tüpte, 3. dakika)
Amilaz Ünitesi
= 100 x 10/T
= 100 x 10/3
= 333,3 ünit
Dana salyası için: (Akromik nokta = 2. tüpte, 2. dakika)
Amilaz Ünitesi
= 100 x 10/T
= 100 x 10/2
= 500 üni
Amilaz, nişasta ve glikojene etkili bir enzimdir. Pankreatik sekresyonun nişasta parçalayıcı etkisi, pankreatik alfa amilaza bağlıdır. Nişasta ve glikojeni maltoz, maltotroz alfa-1,4 bağları ile bağlı3 adet alfa-glikoz kalıntısı ve dallı1,6 oligosakkaritlerve bir miktar glikoza parçalayıcıetkisi tükürük amilazınınkine benzemektedir. Yapılan çalışmada analiz materyali olarak, insan tükürüğü ile dana salyası kullanılmıştır. Kullanılan dana salyasında mukus oranının fazla olmasıve saf dana salyasının elde edilmesinin zor olması nedeniyle, amilaz enzim aktivitesi kesin olarak saptanamayıp yaklaşık bir değer elde edilmiştir. İnsan tükürüğündeki amilaz düzeyi, dana salyasına göre daha fazladır ve daha çabuk parçalanmanın gerçekleşmesi gerekir. En azından reaksiyonun gerçekleşmesiiçin aralarında 30 dakika gibi bir zaman sürecinin geçmesi beklenir. Halbuki bulunan değer sadece bir dakikalık farktır. Bu yüzden sadece renk değişimine göre değerlendirme yapabiliriz. Amilaz miktarı hakkında kesin bir karşılaştırma yapamayız.
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar