Tek gen bozukluklarının tespiti
Mutasyonlar iki tip olabilir: nükleotid substitüsyonları ve nükleotidlerin daha geniş parçalarını içeren mutasyonlar, yani insersiyonlar ve delesyonların sebep olduğu nokta mutasyonları. Bunların örnekleri tablo 4.1’de gösterilmiştir. Delesyonların bazılarının bitişik genlere uzandığı ve kesinlikle bunların sebep olduğu hastalıkların tek gen bozukluğu olmadığı göz önünde bulundurulmalıdır.
Bir gendeki tek nükleotid değişikliklerinin tümü fenotipik bir etkiye (genetik hastalık) yol açmaz. Bunun sebebi değişikliğin proteinin primer amino asit dizilimini değiştirmemesi veya eğer değiştiriyorsa da sonuç değişikliğin proteinin fonksiyonel özelliklerine etki etmemesidir. Fakat, mutasyona uğrayan gen genetik olarak farklılık gösterir ve değişiklik tek nükleotid polimorfizmi (SNP, “snip” olarak okunur) olarak bilinmektedir. SNPler aynı zamanda genomun kodlamayan bölgelerinde de meydana gelir, daha sonra görüleceği gibi, genetik hastalıkların tanısında ve poligenik bozuklukların araştırılmasında oldukça yararlıdırlar.
Nokta mtasyonu
Protein fonksiyonunu etkileyen proteinde amino asit sübstitüsyonuna yol açan missense mutasyon
Kısalmış proteinin oluşumuna yol açan prematüre stop kodonunun oluşumunun sebep olduğu nonsense mutasyon
Anormal splicinge yol açan RNA processing mutasyonu
Gen ekspiresyonunu ör., transkripsiyon faktör binding’i etkileyen regülatör mutasyon
İnseriyon veya delesyon
Çerçeve kaymasına neden olmadan az sayıda bazların (32 veya 3’ün katları bazların) eklenmesi veya delesyonu
Çerçeve kaymasına neden olan azsayıda bazların eklenmesi veya delesyonu
Line veya Alu elementi gibi yaygın tekrar dizisinin insersiyonu
Trinükleotid tekrar dizisinin yayılması
Β-globin geninin altıncı kodonunda A’nın T’ye değişimi bir glutamat rezidusunu valine dönüştürür ve orak hücreanemisine neden olur
β-globin geninin 39. kodonundaki mutasyon bir glutamin kodonunu bir stop kodonuna dönüştürmesi β-talesemiye yol açar.
γ-globin geninin promotorunun upstreaminde G’nin A’ya değişimi fetal hemoglobinin kalıtsal kalıcılığına neden olur.
Kistik fibrozis genindeki üç baz delesyonu fenilaalanin rezidusunu uzaklaştırır, Kafkaslardaki kistik fibrozis vakalarının çoğundan sorumludur.
Heksozaminidaz A geninde dört baz insersiyonu Askenazi Yahudilerinde Tay- Sachs hastalığına yol açar
Huntingtin genindeki CAG tekrarının 35’den fazla kopyası yetişkinlerde Huntington hastalığına yol açar
Tek gen bozukluklarını tespit etmek için pek çok farklı yöntem vardır ve hepsi allel-spesifik oligonükleotidlerin hibridizasyonuna daha fazla veya daha az miktarda bağımlıdır. İlkin moleküler metotlar, bir restriksiyon endonükleazla kesilmiş insan DNA’sının elektroforetik ayrıştırılmasını takip eden Southern blotlamayı kullanarak test problarının hibridizasyonunu içermekteydi. Bu tekniğin bir örneği kalıtsal anfizemden sorumlu α1-antitripsin genindeki bir nokta mutasyonun tespitidir. İki farklı
19-merlik oligonükleotidler kullanılmıştır, biri normal allele komplementerken diğeri mutanat allele komplementerdir. Bunlar normal ve etkilenmiş bireyleri ve heterozigotları (taşıyıcılar) ayırt etmek için yeterli ayrım sağlar (Fig 4.1).
Burada tanımlanan gibi, katı matrisleri içeren yöntemlerin avantajı, yorumlanması kolay olan ‘resimli’ bir sonuç vermesidir. Dezavantajı, her ikisi de zaman alıcı ve külfetli olan Southern blot ve elektroforezi içermesidir. Neyse ki, tamamıyla çözelti içerisinde çalışan birkaç mutasyon tespit yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin en popüler olanı TaqMan assay’dir (Fig. 4.2). Bu metotta, her biri bir
veya diğer allel için spesifik olan iki probun varlığında polimorfizmi kapsayan 100- bp’lik bir bölge PCR ile amplifiye edilir. Problar 5’ uçlarında raportör bir floresana sahiptir ancak solusyon içinde serbest haldeyken ışıma yapmazlar çünkü 3’ ucunda bir söndürücü (quencher) içerirler. PCR sırasında Taq DNA polimeraz özellikle hedefi ile baz eşleşmesi yapan ve floresansı serbest bırakan bir prob ile karşılaşır ve böylelikle net floresansı arttırır. Her biri farklı floresan ile işaretli iki probun varlığı, herhangi bir post-PCR işlemine gerek kalmadan tek bir tüp içinde birinin her iki alleli
tespit etmesine olanak verir.
TaqMan assay’e bir alternatif, moleküler beaconların kullanımıdır. Bunlar hedef-spesifik dizileri kapsayan iki komplementer sekansa sahip, zıt uçlarında bir raportör floresan ve susturucu boya olan oligonükleotid problardır (Fig. 4.3). Hedef DNA’nın amplifikasyonundan sonra, moleküler beaconlar eklenir. Eğer hedef DNA’ya hibridizasyon gerçekleşirse, iki boya ayrılır ve raportör floresan bir sinyal yayar. Eğer hibridizasyon gerçekleşmezse susturucu, raportör boyanın floresansını engeller.
Moleküler beaconlar çok çeşitli floroforların kullanımı ile pek çok farklı renkte yapılabilir ve bu çok sayıda mutasyonun simültane şekilde analiz edilmesine olanak tanır.
Yukarıdaki yöntemler genetik hastalığın bir veya birkaç mutasyon sebebi ile oluştuğu bilindiği durumlarda oldukça kullanışlıdır. Bir gende çok sayıda farklı mutasyon biliniyorsa, ör., β-globin geni, diğer yöntemlerin kullanılması gereklidir. İlgili gende çok sayıda farklı delesyonun olabileceği biliniyorsa western blot kullanılabilir.
Bu yöntemde, bir hücre ekstraktından izole edilmiş proteinler poliakrilamit jel elektroforezinde boyutlarına göre ayrıştırılır ve sonra bir membrana transfer edilir.
Membran analiz edilecek proteini özgül şekilde tanıyan antikorlarla inkübe edilir. Antikor ve antijen arasındaki özgül etkileşim bir histokimyasal veya floresan etiket taşıyan ilk antikora karşı ikinci bir antikorun eklenmesi ile tespit edilir. Bu yöntemin müsküler distrofili hastaların analizinde kullanımı Fig. 4.4’de gösterilmiştir.
Trinükleotid yayılımı gibi değişken sayıda sıralı tekrarların tespiti Southern blot kullanılarak yapılabilir. Bu durumda, ilgilenen bölgeyi taşıyan restriksiyon fragmentlerinin boyundaki değişiklikler aranır (Fig. 4.5).
Bir gendeki tek nükleotid değişikliklerinin tümü fenotipik bir etkiye (genetik hastalık) yol açmaz. Bunun sebebi değişikliğin proteinin primer amino asit dizilimini değiştirmemesi veya eğer değiştiriyorsa da sonuç değişikliğin proteinin fonksiyonel özelliklerine etki etmemesidir. Fakat, mutasyona uğrayan gen genetik olarak farklılık gösterir ve değişiklik tek nükleotid polimorfizmi (SNP, “snip” olarak okunur) olarak bilinmektedir. SNPler aynı zamanda genomun kodlamayan bölgelerinde de meydana gelir, daha sonra görüleceği gibi, genetik hastalıkların tanısında ve poligenik bozuklukların araştırılmasında oldukça yararlıdırlar.
Nokta mtasyonu
Protein fonksiyonunu etkileyen proteinde amino asit sübstitüsyonuna yol açan missense mutasyon
Kısalmış proteinin oluşumuna yol açan prematüre stop kodonunun oluşumunun sebep olduğu nonsense mutasyon
Anormal splicinge yol açan RNA processing mutasyonu
Gen ekspiresyonunu ör., transkripsiyon faktör binding’i etkileyen regülatör mutasyon
İnseriyon veya delesyon
Çerçeve kaymasına neden olmadan az sayıda bazların (32 veya 3’ün katları bazların) eklenmesi veya delesyonu
Çerçeve kaymasına neden olan azsayıda bazların eklenmesi veya delesyonu
Line veya Alu elementi gibi yaygın tekrar dizisinin insersiyonu
Trinükleotid tekrar dizisinin yayılması
Β-globin geninin altıncı kodonunda A’nın T’ye değişimi bir glutamat rezidusunu valine dönüştürür ve orak hücreanemisine neden olur
β-globin geninin 39. kodonundaki mutasyon bir glutamin kodonunu bir stop kodonuna dönüştürmesi β-talesemiye yol açar.
γ-globin geninin promotorunun upstreaminde G’nin A’ya değişimi fetal hemoglobinin kalıtsal kalıcılığına neden olur.
Kistik fibrozis genindeki üç baz delesyonu fenilaalanin rezidusunu uzaklaştırır, Kafkaslardaki kistik fibrozis vakalarının çoğundan sorumludur.
Heksozaminidaz A geninde dört baz insersiyonu Askenazi Yahudilerinde Tay- Sachs hastalığına yol açar
Huntingtin genindeki CAG tekrarının 35’den fazla kopyası yetişkinlerde Huntington hastalığına yol açar
Tek gen bozukluklarını tespit etmek için pek çok farklı yöntem vardır ve hepsi allel-spesifik oligonükleotidlerin hibridizasyonuna daha fazla veya daha az miktarda bağımlıdır. İlkin moleküler metotlar, bir restriksiyon endonükleazla kesilmiş insan DNA’sının elektroforetik ayrıştırılmasını takip eden Southern blotlamayı kullanarak test problarının hibridizasyonunu içermekteydi. Bu tekniğin bir örneği kalıtsal anfizemden sorumlu α1-antitripsin genindeki bir nokta mutasyonun tespitidir. İki farklı
19-merlik oligonükleotidler kullanılmıştır, biri normal allele komplementerken diğeri mutanat allele komplementerdir. Bunlar normal ve etkilenmiş bireyleri ve heterozigotları (taşıyıcılar) ayırt etmek için yeterli ayrım sağlar (Fig 4.1).
Burada tanımlanan gibi, katı matrisleri içeren yöntemlerin avantajı, yorumlanması kolay olan ‘resimli’ bir sonuç vermesidir. Dezavantajı, her ikisi de zaman alıcı ve külfetli olan Southern blot ve elektroforezi içermesidir. Neyse ki, tamamıyla çözelti içerisinde çalışan birkaç mutasyon tespit yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin en popüler olanı TaqMan assay’dir (Fig. 4.2). Bu metotta, her biri bir
veya diğer allel için spesifik olan iki probun varlığında polimorfizmi kapsayan 100- bp’lik bir bölge PCR ile amplifiye edilir. Problar 5’ uçlarında raportör bir floresana sahiptir ancak solusyon içinde serbest haldeyken ışıma yapmazlar çünkü 3’ ucunda bir söndürücü (quencher) içerirler. PCR sırasında Taq DNA polimeraz özellikle hedefi ile baz eşleşmesi yapan ve floresansı serbest bırakan bir prob ile karşılaşır ve böylelikle net floresansı arttırır. Her biri farklı floresan ile işaretli iki probun varlığı, herhangi bir post-PCR işlemine gerek kalmadan tek bir tüp içinde birinin her iki alleli
tespit etmesine olanak verir.
TaqMan assay’e bir alternatif, moleküler beaconların kullanımıdır. Bunlar hedef-spesifik dizileri kapsayan iki komplementer sekansa sahip, zıt uçlarında bir raportör floresan ve susturucu boya olan oligonükleotid problardır (Fig. 4.3). Hedef DNA’nın amplifikasyonundan sonra, moleküler beaconlar eklenir. Eğer hedef DNA’ya hibridizasyon gerçekleşirse, iki boya ayrılır ve raportör floresan bir sinyal yayar. Eğer hibridizasyon gerçekleşmezse susturucu, raportör boyanın floresansını engeller.
Moleküler beaconlar çok çeşitli floroforların kullanımı ile pek çok farklı renkte yapılabilir ve bu çok sayıda mutasyonun simültane şekilde analiz edilmesine olanak tanır.
Yukarıdaki yöntemler genetik hastalığın bir veya birkaç mutasyon sebebi ile oluştuğu bilindiği durumlarda oldukça kullanışlıdır. Bir gende çok sayıda farklı mutasyon biliniyorsa, ör., β-globin geni, diğer yöntemlerin kullanılması gereklidir. İlgili gende çok sayıda farklı delesyonun olabileceği biliniyorsa western blot kullanılabilir.
Bu yöntemde, bir hücre ekstraktından izole edilmiş proteinler poliakrilamit jel elektroforezinde boyutlarına göre ayrıştırılır ve sonra bir membrana transfer edilir.
Membran analiz edilecek proteini özgül şekilde tanıyan antikorlarla inkübe edilir. Antikor ve antijen arasındaki özgül etkileşim bir histokimyasal veya floresan etiket taşıyan ilk antikora karşı ikinci bir antikorun eklenmesi ile tespit edilir. Bu yöntemin müsküler distrofili hastaların analizinde kullanımı Fig. 4.4’de gösterilmiştir.
Trinükleotid yayılımı gibi değişken sayıda sıralı tekrarların tespiti Southern blot kullanılarak yapılabilir. Bu durumda, ilgilenen bölgeyi taşıyan restriksiyon fragmentlerinin boyundaki değişiklikler aranır (Fig. 4.5).
Genetik
-
İnsanlarda Kaç Kromozom Vardır?
-
Sık görülen mikrodelesyon sendromları nelerdir?
-
Bilim insanları kromozomları nasıl inceler?
-
Arkea'da Kromozomlar ve DNA Replikasyonu
-
DNA Onarım Mekanizmaları Nelerdir?
-
DNA hasarına neden olan etkenler nelerdir?
-
XYY Süper Erkek Sendromu - JACOB’S, Sendromu
-
Bitki doku kültürü çalışmaları ile haploid bitkiler elde edilebilir
-
Gram pozitif bakterilerden genomik DNA izolasyon protokolü
-
E. coli bakterisinden genomik DNA izolasyon protokolü
-
DNA’nın Keşfi
-
İnsan Genom Projesi Nedir ? Amaçları Nelerdir ?
-
Genomik mikrodizilimlerle ikilenme teşhisi yöntemi
-
Gen duplikasyonu ve amplifikasyonu nedir?
-
DNA ile RNA Arasndaki Farklar ve Benzerlikler Nelerdir