Biyolojiye gercekci yaklasimin tek adresi.

Arama Sonuçları..

Toplam 19 kayıt bulundu.

GENETİK KOPYALAMA

İşçilerin tulumları beyazdı; ellerinde soğuk, kadavra rengi kauçuk eldivenler vardı. Işık donuktu, ölüydü: Bir hayalet sanki!.. Yalnız mikroskopların sarı borularından zengin ve canlı bir öz akıyor, bir baştan bir başa uzanan çalışma masalarının üzerinde tatlı çizgiler yaratarak, parlatılmış tüpler boyunca tereyağ gibi yayılıyordu. "Bu da" dedi Müdür kapıyı açarak, "döllenme odası işte..." Doğal olarak, ilkin döllenmenin cerrahlığa dayanan başlangıcından söz etti, derken "Toplum uğruna seve seve katlanılan bir ameliyattır bu" dedi, "altı maaşlık ikramiyesi de caba... Bir yumurta bir oğulcuk, bir ergin; bu normal... Oysa, Bokanovskilenmiş bir yumurta tomurcuk açar, ürer bölünür. Eş ikizler yalnız insanların doğurduğu o eski zamanlardaki gibi yumurtanın bazen rastlantıyla bölünmesinden oluşan ikiz, üçüz parçaları değil, düzinelerle yirmişer, yirmişer." Müdür "yirmişer" diyerek sanki büyük bir bağışta bulunuyormuş gibi kollarını iki yana açtı; "yirmisi birden!.." Ama öğrencilerden biri bunun yararının ne olduğunu sormak gibi bir sersemlikte bulundu. "İlahi yavrucuğum!" Müdür olduğu yerde ona dönüvermişti. "Görmüyor musun? Görmüyor musun, kuzum?" Bir elini kaldırdı; heybetli bir duruşa geçmişti. "Bokanovski süreci toplumsal dengenin en başta gelen araçlarından biridir! Milyonlarca eş ikiz; toptan üretim ilkesinin sonunda biyolojiye uygulanmış olması..." YUKARIDAKİ PARÇA, Aldous Huxley’in 1930’larda yazdığı, geçtiğimiz ay bilim gündemini birdenbire fetheden "koyun kopyalama" deneyine değinen haberlerde sıkça gönderme yapılan, Brave New World (Cesur Yeni Dünya) romanının girişinden kısaltılarak alınmış bir bölüm. Huxley, olumsuz bir ütopya (distopya) niteliği taşıyan romanında, Alfa, Beta, Gama, Delta ve Epsilon adlarıyla, kendi içinde genetik özdeşlerden oluşan beş farklı sınıfa bölünmüş bir toplum tablosu çiziyor. Özdeş vatandaşların üretildiği bu hayali "Bokanovski Süreci", çağdaş anlamıyla klonlama (veya genetik kopyalama) olmasa da, sürecin yolaçtığı etik (ahlaki) ve toplumbilimsel kaygılar, sekiz ay önce İskoçya’da gerçekleştirilen ve geçtiğimiz ay kamuoyuna duyurulan gelişmelerin doğurduklarına denk düşüyor. Şimdi herkesin tartıştığı, son gelişmelerin insanlık için daha insanca bir dönemin mi yoksa, hızla gerçeğe dönüşen korkunç bir distopyanın mı kapısını araladığı. Şubat ayının 22’sinden itibaren, İskoçya’nın Edinburg kentinde, biyoteknoloji alanında tuhaf bir gelişme kaydedildiği, "Dünyanın sonu", "Frankenstein" gibi ifadeleri de içeren dedikodularla birlikte etrafta konu olmaya başladı. Bilim çevreleri de basın da şaşkındı, çünkü, seçkin yazarların ve bazı bilim adamlarının birkaç gündür zaten haberdar oldukları ve konuyu "patlatmayı" bekledikleri bu gelişme, bir biçimde basına sızmış, dilden dile dolaşmaya başlamıştı bile. Normalde pek de ciddiye alınmayacak böyle bir "dedikodunun" bu denli yayılabilmesi, işin içine çeşitli dallarda makalelere yer veren saygın bilimsel dergi Nature’ın adının karışmasıyla olmuştu. Gerçekten de Nature, dedikodu niteliğini fersah fersah aşan bir bilimsel gelişmeyle ilgili bir makaleyi 27 Şubat’ta yayınlayacağını bilim yazarlarına duyurmuş ve bu tarihe kadar "ambargolu" olan bir basın bülteni dağıtmıştı. Batı ülkelerinde yazarlar normal olarak bu ambargolara uyar, hazırladıkları yazıları, ambargonun bittiği tarihte, aynı anda yayına verirler. Ancak, aralarında ünlü The Observer’ın da bulunduğu bazı dergi ve gazeteler ambargoyu çoktan delmiş, konuyu kamuoyuna duyurmuştu bile. Haberin, kaynağı olan Nature ve ambargoya saygı gösteren çoğu nitelikli dergi ve gazetede yer almaması da, dedikodu trafiğini artırmış, ortaya atılan spekülasyonlarla beklenenden fazla ilgi toplanabilmişti. Hatta, Mart ayının başlarında, koyun klonlama haberinin yarattığı ilgi ortamını değerlendirmek isteyen bazı haberciler, aynı yöntemle Oregon Primat Araştırmaları Merkezi’nde maymunların klonlandığını öne sürdüler. Oysa, Oregon’da gerçekleştirilen, embriyo hücrelerinin oldukça sıradan bir yöntemle çoğaltılmasıyla yapılmış bir deneydi. Klonlama, yetişkin bir canlıdan alınan herhangi bir somatik (bedene ait) hücrenin kullanılmasıyla canlının genetik ikizinin yaratılmasını açıklamakta. Kavramsal temelleri çoktandır hazır olan bu işlemin uygulamada gerçekleştirilemeyeceği düşünülüyordu. Edinburg’daki Roslin Enstitüsünden Dr. Wilmut ve ekibi bunu başarmış gibi görünüyor. "Ben bu filmi daha önce seyretmiştim!" diyenleri rahatlatmak için hemen belirtelim ki, aynı ekip 1995 yılında embriyo hücrelerini kullanarak yine ikiz koyunlar üretmiş ve bunu duyuran makaleyi yine Nature dergisinde yayımlatmıştı. Bu deney de basına yansımış, ancak, son gelişmeler kadar yankı uyandırmamıştı. Ne de olsa bu yöntem, döllenmiş yumurtanın kazayla bölünüp tek yumurta ikizlerine yol açtığı bildik süreçlerden farksızdı. Sıklıkla unutulduğu için tekrarlamakta yarar var ki, Wilmut’un son başarısının önemi, işe somatik bir hücrenin çekirdeğiyle başlamasında yatıyor. Bu başarının ortaklarını anarken PPL Tıbbi Araştırmalar şirketini de atlamamak gerek. Borsalarda tırmanışa geçen hisseleriyle gelişmenin meyvelerini şimdiden yemeye başlayan PPL, projenin hem amaçlarını belirleyerek hem de maddi olanakları yaratarak kuzu Dolly’nin varlığının temel sebebi olmuş. Dr. Wilmut’un gerçekleştirdiği başarı şöyle özetlenebilir: Yetişkin bir koyundan alınan somatik bir hücrenin çekirdeğini dahice bir yöntemle, başka bir koyuna ait, çekirdeği alınmış bir yumurtaya yerleştirmek ve bilinen "tüp bebek" yöntemiyle yeni bir koyuna yaşam vermek. Adını, ünlü şarkıcı Dolly Parton’dan alan kuzu Dolly, isim annesinin değilse de, DNA annesinin genetik ikizi. Dolly, sevimli görünüşüyle kamuoyunun sempatisini kazanmış ve tüm bu süreç ilginç bir bilimsel oyun olarak sunulmuşsa da gerçekte deney oldukça iyi belirlenmiş bilimsel ve maddi hedefleri olan, soğukkanlı bir süreç. Zaten Dolly’nin araştırmacılar arasındaki adı da en az varlığı kadar "soğukkanlıca" seçilmiş: 6LL3... PPL’in idari sorumlusu Dr. Ron James, şirket sırlarını kaybetme kaygısıyla maddi hedeflerini pek açığa vurmamakla birlikte, hemofili hastaları için koyunlara insan kanı pıhtılaşma faktörü ürettirmeyi de içeren pek çok önemli ticari hedefin ipuçlarını veriyor. PPL ve Roslin Enstitüsü’nün çalışmaları, geçmişi çok eskilere dayanan ve önemli gelişmelerin kaydedildiği bir alan olan transjenik (gen aktarılmasıyla ilgili) araştırmaların bir üst aşamaya, nükleer transfer (çekirdek aktarılması) evresine doğru ilerletilmesinden başka birşey değil. Yıllardır başarıyla sürdürülen transjenik çalışmalarda tek boynuzlu keçi, üç bacaklı tavuk gibi görünüşte çarpıcı, yararı kısıtlı çalışmaların yanı sıra, insan proteinlerinin hayvanlara ürettirilmesi gibi, modern tıp için çığır açıcı sayılabilecek başarılar kaydedildi. Son gelişmelere imzasını atan ekip, daha önce insan bünyesince üretilen molekülleri gen transferi yöntemiyle bir koyuna ürettirmeyi başarmıştı. Söz konusu deneyde gerek duyulan moleküllerin koyunun tüm hücrelerinde değil, sadece süt bezlerinde sentezlenmesinin sağlanması, koyunun "ilaç fabrikası" olarak değerlendirilmesini beraberinde getiriyordu. Dolly başarısının en önemli potansiyel yararı da bununla ilgili zaten. Gen transferi yöntemiyle, istediğiniz maddeyi sentezleyebilen bir canlıya sahip olduğunuzda, madde verimini artırmak üzere aynı süreci zaman ve para harcayarak yinelemeye çabalamak yerine elinizdeki canlının genetik ikizlerini yaratabilirseniz, ticari değer arz edebilecek miktarda ilaç hammaddesi üretimine geçebilirsiniz. Elinizde birkaç on tane genetik özdeş canlı biriktikten sonra, bu küçük sürüyü doğal yollardan üremeye bırakacak olursanız, hem "yatırımınız" kendi kendine büyüyecek, hem de genetik çeşitlilik yeniden oluşmaya başlayacağından, tek bir virüs tipinin tüm "fabrikayı" yok etmesinin önünü alacaksınız demektir. Biraz Ayrıntı İskoç ekibin gerçekleştirdiği klonlama deneyinin, dünyanın pek çok bölgesine dağılmış sayısız standart biyoteknoloji laboratuvarında "kolayca" gerçekleştirilebileceği söyleniyor. Yine de uygulanan yöntem, günlük gazetelerdeki basit şemalarda anlatıldığı kadar kolay ve hemen tekrarlanabilir türden değil. İskoç ekibin başarısı ve önceki sayısız benzeri çalışmanın başarısızlığı, Wilmut’un, verici koyundan alınan hücre çekirdeğiyle, kullanılan embriyonik hücrenin "frekanslarını" çok hassas biçimde çakıştırabilmesine dayanıyor. Bu yöntemle araştırmacılar, yetişkin çekirdeğin genetik saatini sıfırlamayı, tüm gelişim sürecini başa almayı becerebilmişler. Yöntemin ayrıntılarına girmeden önce bazı temel kavramlara açıklık getirmekte yarar var. Çoğu memeli canlı gibi insan bedeni de milyarlarca hücreden oluşuyor. Bu hücrelerin milyonlarcası her saniye bölünmeyi sürdürerek beden gelişimini devam ettiriyor ve yıpranmış hücreleri yeniliyor. Bu hücrelerin önemli kısmı bedenimizin belli başlı bölümlerini oluşturan "somatik hücreler." Tek istisna, üreme hücreleri. Eşeyli üreme, gametlerin (sperm ve yumurta) ortaya çıktığı "mayoz bölünme"yle başlıyor. Cinsel birleşme sonucunda, spermin yumurtayı döllemesiyle de yeni bir canlının ilk hücresi "zigot" oluşuyor. Bu noktadan sonra gelişmeye dönük hücre bölünmeleri, "mayoz" değil, "mitoz" yoluyla ilerliyor. Koyun ve insan hücrelerinin de dahil olduğu ökaryotik yani, çekirdeği olan hücreler, farklı gelişim evreleri içeren bir yaşam döngüsü geçiriyorlar. Bu döngüyü, hücrenin görece durağan olduğu "interfaz" ve belirgin biçimde bölünmenin gerçekleştiği mitoz evrelerine ayırmak mümkün. Hücre, yaşam döngüsünün yüzde doksan kadarını interfaz evresinde geçiriyor. Aslında, bu duraklama evresi göründüğü kadar sakin değil; hücre, tüm bileşenlerini DNA’yı sona bırakacak biçimde çoğaltarak, bölünmeye hazırlanıyor. Alt evreleri son derece iç içe girmiş olan interfaz evresini işlevsellik açısından G1, S ve G2 alt evrelerine ayırmak yerleşmiş bir gelenek. Yani, hücrenin yaşam döngüsü bu üç evre ve M (mitoz)’dan oluşuyor. G1 evresi, DNA dışındaki bileşenlerin çoğaldığı bir dinlenme dönemi. S, DNA’nın bölünmesiyle sonuçlanan bir geçiş evresi. G2 ise, iç gelişmenin tamamlanıp, hücrenin mitoz yoluyla bölünmeye hazırlandığı süreci içeriyor. Hücrelerin hangi evreyi ne kadar sürede tamamlayacakları bir biçimde programlanmış durumda. Belli bir organizmanın tüm hücreleri bu evreleri aynı sürede tamamlıyorlar. Yine de, ani çevresel koşul değişiklikleri hücreleri G1 evresinde kıstırabiliyor; sözgelimi, besleyici maddelerin miktarı birdenbire minimum düzeye düştüğünde. G1 evresinin belli bir aşamasında, öncesinde bu duraklamaya izin verilen sabit bir kritik noktası var. Bu kritik nokta aşılırsa, çevresel koşullar ne yönde olursa olsun, DNA replikasyonunun önü alınamıyor. İleride göreceğimiz gibi, bu noktanın denetim altında tutulabilmesi, Wilmut ve ekibinin başarılı bir klonlama gerçekleştirebilmelerinin altın anahtarı olmuştur. Bu noktada bir parantez açarak G1, S, G2 ve M evrelerinin denetim altına alınmasının, hücrenin yaşam döngüsünü olduğu kadar, hücrenin özelleşmesini, sözgelimi beyinden veya kas hücrelerinden hangisine dönüşeceğini de kontrol altına alabilmeyi, bir başka deyişle, hücrenin genetik saatini sıfırlamayı sağladığını ekleyelim. Wilmut ve ekibi Dolly’i klonlayıncaya kadar bu sürecin tersinmez olduğu, söz gelimi, bir defa kas hücresi olmaya karar vermiş bir hücrenin yeniden programlanamayacağı zannediliyordu. Peki Wilmut bunu nasıl başardı? Soruyu tersinden cevaplayacak olursak, diğerlerinin bunu başaramamalarının nedeninin, kullandıkları somatik hücrelerin çekirdeklerini S veya G2 evrelerindeki konakçı hücrelere yerleştirmeleri olduğunu söyleyebiliriz. Eski kuramsal bilgilere göre bu yöntemin işe yaraması gerekiyordu, çünkü çekirdeğin mitoza yaklaşmış olması avantaj olarak görülüyordu. Ancak bu denemelerde, işler bir türlü yolunda gitmedi. Kaynaştırmadan sonra, hücre fazladan bir parça daha mitoz geçiriyor ve yararsız, kopuk kromozom parçaları meydana geliyordu. Bu "korsan" genler, gelişimin normal seyrini sürdürmesi için ciddi bir engel oluşturuyordu. Dersini çok iyi çalışmış olan Wilmut, bu olumsuz deneyleri değerlendirerek hücreyi G1 evresinin kritik noktadan önceki duraksama döneminde, "G0 evresinde" kıstırmaya karar verdi. Verici koyundan alınan meme dokusu hücrelerini kültür ortamında gelişmeye bırakan Wilmut, hücrelerin geçirdiği evreleri sıkı gözetim altında tutarak bir hücreyi G0 evresinde kıstırıp bu haliyle durağanlığa bırakmayı başarmıştı. Bunun için, hücrenin besin ortamını neredeyse öldürme sınırına kadar geriletmiş, tüm süreci dondurarak bir anlamda genetik saati de sıfırlayabilmişti. Üstelik bu evre, kaynaştırılacağı yumurta hücresinin mayoz gelişim sırasında girdiği, bu işlem için en uygun olan metafaz-II evresiyle de mükemmel bir uyum içindeydi. İşlemin diğer kısımları yemek tariflerinde olduğu kadar sıradan ve kolay uygulanabilir nitelikte. G0 evresindeki çekirdek metafaz-II evresindeki yumurtayla kaynaştırılıp, normal besin koşulları ve hafif bir elektrik şoku etkisiyle olağan çoğalma sürecine yeniden sokulduğunda, her şey tüp bebek olarak bilinen, in vitro fertilizasyon sürecindeki işleyişe uygun hale geliyor. Zigot, anne koyunun rahmine yerleştiriliyor ve gerekli hormonlarla normal hamilelik süreci başlatılıyor. Wilmut ve ekibinin gerçekleştirdikleri hakkında bilinenler, yukarıda kaba hatlarıyla anlatılanlarla sınırlı. Sürecin duyurulmayan kritik bir evresi varsa, bu ticari bir sır olarak kalacağa benziyor. Ancak, herkesin olup bitenler hakkında aynı bilgilere sahip olması, deneyin başarısı konusunda kimsenin şüphe duymamasını gerektirmiyor. 277 denemeden sadece birinin başarılı olması başta olmak üzere, çoğu uzmanın takıldığı pek çok soru işareti var. Herşeyin ötesinde, herhangi bir olgunun bilimsel gelişme olarak kabul edilmesi için, sürecin yinelenebilirliğinin gösterilmesi gerekiyor. Bir embriyolog, Jonathan Slack, çok daha temel şüpheleri öne sürüyor: "Araştırmacılar, yumurta hücresindeki DNA’ları tümüyle temizleyememiş olabilirler. Dolayısıyla Dolly, sıradan bir koyun olabilir." Slack, alınan meme hücresinin henüz tamamen özelleşmemiş olabileceğini, böyle vakalara meme hücrelerinde, bedenin diğer kısımlarına göre daha sık rastlanılabildiğini de ekliyor. Zaten Wilmut da, bedenin diğer kısımlarından alınan hücrelerin aynı sonucu verebileceğinden bizzat şüpheli. Örneğin, büyük olasılıkla kas veya beyin hücrelerinin asla bu amaçla kullanılamayacaklarını belirtiyor. Üstüne üstlük, koyun bu deneylerde kullanılabilecek canlılar arasında biraz "ayrıcalıklı" bir örnek. Koyun embriyolarında hücresel özelleşme süreci zigot ancak 8-16 hücreye bölündükten sonra başlıyor. Geleneksel laboratuvar canlısı farelerde ise aynı süreç ilk bölünmeden itibaren gözlenebiliyor. İnsanlarda ise ikinci bölünmeden itibaren... Bu durum, aynı deneyin fare ve insanlarda asla başarılı olamaması olasılığını beraberinde getiriyor. Dile getirilen açık noktalardan biri de, hücrelerde DNA barındıran tek organelin çekirdek olmayışı. Kendi DNA’sına sahip organellerden mitokondrinin özellikle önem taşıdığı savlanıyor. Memeli hayvanlarda mitokondriyal DNA, embriyo gelişimi sırasında sadece anneden alınıyor. Her yumurta hücresi, farklı tipte DNA’lara sahip yüzlerce mitokondriyle donatılmış. Bu mitokondriler zigotun bölünmesinin ileri evrelerinde, embriyo hücrelerine dengeli bir biçimde dağılıyor; ancak, canlının daha ileri gelişim evrelerinde, bu denge belli tipteki DNA’lara doğru kayabiliyor. Parkinson, Alzheimer gibi hastalıkların temelinde bu mitokondriyal DNA kayması sürecinin etkileri var. Bu yüzden kimileri, sağlıklı bir kuzu olarak doğan Dolly’nin, zigot gelişimine müdahele edilmiş olması yüzünden sağlıksız bir koyun olarak yaşlanabileceğini öne sürüyorlar. Şimdilik Dolly’nin tek sağlıksız yönü, basına teşhir edilirken sabit tutulması amacıyla fazla beslenmesi yüzünden ortaya çıkan tombulluğu. Klonlamalı mı? Klonlamanın özellikle de insan klonlama konusunun etik boyutu kamuoyunca, günlük yaşamda kültürün, temel bilimsel birikimin, tarih, siyaset ve toplumbilimin en yaygın ve temel kavramlarıyla tartışılabilir nitelik kazanmıştır. Nükleer enerji kullanımı, hormon destekli tarım, ozon tabakasına zarar veren gazların üretimi gibi, farklı toplum kesimlerince kolayca anlaşılabilir ve tartışılabilir kabul edilen klonlama, şimdiden kamuoyunun gündeminde yerini aldı. Kamuoyunun, bilimsel ve teknolojik gelişmelerin uygulanıp uygulanmaması konusunda birtakım ahlaki gerekçelerle ne şekilde ve ne ölçüde yaptırım uygulayabileceği tartışmalı olsa da, şu anda kamuoyunun isteksizliği klonlama çalışmalarının daha ileri aşamalara taşınmasına en güçlü engel olarak gösteriliyor. Oysa, "tüp bebek" diye bilinen in vitro fertilizasyonun, başlangıçtaki şiddetli tepkilerden sonra kolayca kabullenilmesi, işin içine "çocuk sahibi olma isteği ve hakkı" karıştığı durumlarda (aynı argüman klonlama konusunda da sıkça kullanılıyor) toplumun ne kadar kolay ikna olabileceğinin bir göstergesi. Bilimkurgu romanları ve filmlerinde kaba hatlarıyla çokça tartışılmış olan klonlama konusunda halihazırda belli belirsiz bir kamuoyu "oluşturulmuş" durumda. Şu anda sürmekte olan tartışmaların bilinen yanlışlara yeniden düşmemesi için birkaç temel olguya açıklık getirmek gerekiyor. Olası yanılgıların en sık rastlananı, klonlanmış bir canlının, (tartışmalara sıkça insan da dahil ediliyor) genin alındığı canlının fizyolojik özellikleri bir yana, kişilik özellikleri bakımından özdeşi olacağı kanısı. Kazanılmış özelliklerin kalıtsal yolla taşınabileceği yanılgısı, Philosophie Zooloique (Zoolojinin Felsefesi) adlı ünlü yapıtı 1809 yılında yayınlanmış olan, Fransız zoolog Jean Baptiste Lamarck’a dayanıyor. Lamarck’ın görüşlerinin takipçileri, insanların gözlemlenebilir kişilik özelliklerinin önemli ölçüde kalıtsal nitelik taşıdığını savlayarak, çevresel koşulların gelişim üzerindeki etkilerini neredeyse tamamen yadsıyorlardı. Oysa, genetik, evrim, psikoloji gibi alanların ortaya koyduğu çağdaş ölçütler, kazanılmış karakterlerin kalıtsal nitelik gösteremeyeceğini ortaya koyarak, kişilik oluşumunda çevresel etmenlerin güçlü bir paya sahip olduğunu kanıtlamıştır. Bu bağlamda, basında da yankı bulan "koyunlar zaten birbirlerine benzerler" esprisinin aslında ciddi bilimsel doğrulara işaret ettiğinin altını çizmek gerekiyor. Klonlanmış bir koyunun, genetik annesinin genetik ikizi olduğu ölçülerek gösterilebilir bir gerçektir. Oysa, gözlemlenebilir kişilik özellikleri oldukça kısıtlı olan koyunların birbirlerine benzemeleri kaçınılmazdır. Çok daha karmaşık bir organizma olan insanoğlu, sayısız gözlemlenebilir kişilik özelliği sayesinde, genetik ikizinden kolayca ayırt edilebilir. Tüm bunların ötesinde, klonlanmış bir insanın sadece kişilik bakımından değil, fizyolojik ve bedensel özellikleri bakımından da, genetik ikizinden farklı olacağını peşinen kabullenmek gerekiyor. Bir bebeğin biçimsel özelliklerinin ana rahminde geçirdiği gelişim süreci içerisinde tümüyle DNA’sı tarafından belirlendiği görüşü yaygın bir yanılgı. DNA molekülü, insan geometrisine dair tüm bilgileri en sadeleşmiş biçimiyle bile bütünüyle kapsayamayacak kadar küçük. Çoğu biçimsel özellik, akışkan dinamiği, organik kimya gibi alanlardaki temel evrensel yasaların kontrolünde meydana geliyor. Bu süreçte de, her zaman için rastlantı ve farklılaşmalara yeterince yer var. Bir genetik ikiz, kuramsal açıdan, eşine en fazla eş yumurta ikizlerinin birbirlerine benzedikleri kadar benzeyebilir. Uygulamada ise, benzerlik derecesi çok daha düşük olacaktır; aynı rahimde aynı anda gelişmediği, aynı fiziksel ve kültürel ortamda doğup büyüyemediği için... İşin bu boyutunu da göz önünde bulunduran Aldoux Huxley, romanında, Bokanovski Süreci’yle çoğaltılmış bebekleri, yetiştirme çiftliklerinde psikolojik koşullandırmaya tutma gereği duymuştu. Benzer biçimde, 1976’da yazdığı The Boys from Brazil romanında Adolf Hitler’den klonlanan genç Hitler’lerin öyküsünü kurgulayan Ira Levin, klonları, Adolf Hitler’in kişiliğinin geliştiği tüm olaylar zincirinin benzerine tabi tutma gereğini hissetmişti. Tüm bu "hal çarelerine" rağmen, kopya insanın genetik annesinden çoğu yönden farklı olması kaçınılmaz görünüyor. Diğer tüm koşullar denk olsa bile, kopya birey, aynı zamanda ikizi olan bir anneye sahip olmasından psikolojik bakımdan etkilenecektir. Sağduyumuz bize Hitler’i genlerinin değil, Weimar Cumhuriyeti sonrası sosyo-ekonomik koşulların ve genç Adolf’un kıstırıldığı maddi ve manevi bunalımların yarattığını öğretiyor. Tüm bunların ışığında, klonlama konusundaki popüler tartışmaları, tıkanıp kaldıkları, "beklenmedik bir ikize sahip olma" fobisinden kurtarılıp, daha gerçekçi zeminlere çekilmesi gerekiyor. Gen havuzunun (belli bir topluluktaki genetik çeşitlilik) daralması, hayvancılığın geleneksel yapısından koparılıp biyoteknoloji şirketlerinin güdümüne girmesi, yol açılabilecek genetik bozuklukların kontrolden çıkması, bu alanda çalışan bazı şirketlerin (söz gelimi PPL’in) tüm tekel karşıtı yasal önlemleri delerek ciddi ekonomik dengesizliklere yol açması gibi akla gelebilecek sayısız somut etik sorununun tartışılması gerekiyor. Yoksa, akademik organlardan dini cemaatlere kadar sayısız grup gelişmeleri "kitaba uydurma" çabasıyla, kısır tartışmalara girebilir. Örneğin, Budist bir araştırmacı, Dolly’nin eski yaşamında ne gibi bir kabahat işleyip de bu yaşama klonlanmış olarak gelmeyi hak ettiği üzerine kafa yoruyormuş. Aslında biyoteknolojik tekelcilik tehdidine, Cesur Yeni Dünya’da Aldous Huxley de işaret etmişti: "İç ve Dış Salgı Tröstü alanından hormon ve sütleriyle Fernham Royal’daki büyük fabrikaya hammadde sağlayan şu binlerce davarın böğürtüsü duyuluyordu..." İnsanoğlunun temel kaygıları, şimdilik bazı temel koşullarda klonlamayla çelişiyor gibi görülüyor: Bir çiftçi düşünün ki, kendisi için tüm evreni ifade eden kasabasında herkese hayranlıktan parmaklarını ısırtan bir danaya sahip olsun. Bu danayı klonlayıp tüm sürüsünü özdeş yapmayı ister miydi? Büyük olasılıkla biraz düşündükten sonra bundan vazgeçerdi. Danasının biricik oluşu ve genetik çeşitliliği sayesinde bu danaya yaşam veren sürüsünün daha da güzel bir dana doğurması olasılığı çok daha değerli. Ömrü boyunca aynı dananın ikizlerine sahip olmayı kabullenmiş bir çiftçinin komşusu her an elinde daha güzel bir danayı ipinden tutarak getirebilir. Özgür Kurtuluş Kaynaklar: Biospace Huxley A., Cesur Yeni Dünya, Çev: Gürol E., Güneş Yayınları, 1989 Nash M. J., "The Age of Cloning", Time, 10 Mart 1997 Roslin Enstitüsü Basın Bültenleri Star C., Taggart R., Biology: The Unitiy and Diversity of Life, 1989 Underwood A., "Little Lamb Who Made Thee", Newsweek, 10 Mart 1997 Wilmut I., Schnieke A. E., McWhir J., Kind A. J., Campbell K. H. S., "Viable Offspring Derived From Fetal and Adult Mammalian Cells", Nature, 27 Şubat 1997

http://www.biyologlar.com/genetik-kopyalama

Bir Zamanlar Türlerin Kökeni "Türleşme" Sanılıyordu

Darwinizm'e olan ısrarlı bağlılığı ile tanınan New Scientist dergisinin 14 Haziran 2003 tarihli sayısında "Yeni Türler Nasıl Oluşur?" (How Are New Species Formed?) başlıklı bilimsel bir makale vardı. Yazarı George Turner şu önemli "itiraf"ta bulunuyordu: Çok değil yakın zaman önce, türlerin nasıl oluştuğunu bildiğimizi sanıyorduk. İşlemin hemen her zaman popülasyonların tamamen izole olmalarıyla başladığına inanıyorduk. Genellikle popülasyonun ciddi bir "genetik darboğaz"dan geçmesinden sonra meydana geliyordu; (örneğin) hamile bir dişinin uzak bir adaya sürüklenmesinden ve onun yavrularının birbirleri ile çiftleşmesinden sonra olabileceği gibi. Bu "kurucu etki"nin güzelliği, laboratuvarda test edilebilir olmasıydı. Gerçekte, açıkçası tutmadı. Biyologların tüm çabalarına rağmen, hiç kimse, kurucu bir popülasyondan yeni bir tür yaratmanın yanına bile yaklaşamadı. Dahası, bildiğimiz kadarıyla, insanların az sayılarda organizmayı yabancı ortamlara salmaları sonucunda hiçbir yeni tür oluşmadı.103 Aslında bu yeni bir itiraf değildir. Darwin'den bu yana geçen bir buçuk yüzyıl içinde, onun ileri sürdüğü gibi bir "türleşme" hiçbir zaman gözlenmemiş, "türlerin kökeni"ne tatmin edici bir açıklama getirilememiştir. Bunu açıklamak için Darwin'in nasıl bir "türleşme" öngördüğünü anlatmakta yarar vardır. Darwin'in teorisinin dayandığı "gözlem"lerin türü, hayvan popülasyonlarındaki bazı değişimlerdi. Bunların bazıları hayvan yetiştiricilerinin çalışmalarıydı. Cins köpekler, inekler veya güvercinler yetiştiren bu kişiler, popülasyon içinde belirli bir özelliği baskın olan (örneğin iyi koşan köpekleri, iyi süt veren inekleri veya "zeki" güvercinleri) seçip birbirleriyle çiftleştirerek, birkaç nesil içinde bu seçtikleri özelliklere yüksek oranlarda sahip olan popülasyonlar oluşturuyorlardı. Normal ineklerden, çok daha fazla süt veren inekler türetiyorlardı. Bu "sınırlı değişim", Darwin'e doğada daimi bir değişim olduğunu ve bunun uzun zamana yayıldığında sınırsız bir değişim (yani evrim) meydana getireceğini düşündürttü. Darwin'in aynı konudaki ikinci gözlemi ise, Galapagos Adaları'nda gördüğü farklı ispinoz türleriydi. Bu ispinozların, ana karadakilerden farklı gaga yapılarına sahip olduklarını belirlemişti. Yani aynı popülasyonun içinde uzun gagalı, kısa gagalı, kıvrık gagalı, düz gagalı ispinozlar türemişlerdi ve bunlar da kendi içlerinde çiftleştikleri için ayrı türler haline gelmişlerdi. Darwin tüm bu "değişim" olgularını biraraya getirdiğinde, doğada "sınırsız değişim" yaşandığını, yepyeni türlerin, sınıfların, takımların ortaya çıkması için sadece "uzun zaman" gerektiğini düşündü. Ancak Darwin yanılmaktaydı. Belirli bir özelliği baskın olan canlıları seçip birbirleriyle çiftleştirerek sadece kendi türlerinin daha iyisi, daha güçlüsü canlılar yetiştirilmiş olur. Yoksa bu yöntemle bir başka canlıyı oluşturmak mümkün değildir. Örneğin bu şekilde bir kediden bir at, bir ceylandan zürafa oluşturulamaz ya da bir armuttan bir erik oluşturulamaz. Karpuz her zaman karpuzdur, şeftaliler muza ya da karanfiller güllere dönüşemez. Kısacası herhangi bir türden hiçbir şartta bir başka tür meydana gelmez. Darwin'in bu konuda nasıl yanıldığını ilerleyen sayfalarda detaylıca açıklayacağız. Ama bundan önce konuyu bir örnekle açıklamak yararlı olabilir. Birisinin size şöyle bir "argüman" sunduğunu düşünün: "Ben çok iyi bir okçuyumdur. Yayımdan fırlayan ok, saatte 300 kilometre hızla ilerler. Bu sayededir ki, İstanbul'daki evimden fırlattığım oklar, 1 saat 25 dakika sonra Ankara'nın merkezine varıyor." Bu argümanı çürük ve saçma kılan nokta, okun fırlama hızının sürekli sabit olarak devam edeceğinin varsayılmasıdır. Bir ok saatte 300 kilometre hızla atılabilir, ama birkaç saniye sonra havanın sürtünmesinin ve yerçekiminin etkisiyle bu sürat hızla azalır ve ok yere düşer. İlk anda bir "ilerleme" vardır, ama bunun "sınırsız ilerleme" sağlayıp, oku Ankara'ya kadar götürecegini düşünmek büyük bir yanılgıdır. Darwin de benzer bir yanılgıya düşmüştür. "Biyolojik Değişimin Doğal Sınırları" Darwin doğada gözlemlediği değişimin sınırsız olduğunu varsaymıştı. Eğer inekler, köpekler veya güvercinler sadece birkaç nesilde bile değişim gösterebiliyorlarsa, yeterince uzun zaman verildiğinde herşeye dönüşebilirler, diye düşünmüştü. Ancak aradan geçen 140 yıl içindeki binlerce farklı deney, deneyim ve gözlem, bu varsayımın tamamen yanlış olduğunu ortaya çıkardı. Loren Eisley Bitkiler ve hayvanlar üzerinde 20. yüzyıl boyunca yapılan tüm yetiştirme çalışmaları, türlerin doğal "çeşitlenme" süreciyle asla aşamayacakları sınırlar olduğunu göstermiştir. Bu alandaki en ünlü isimlerden biri olan Luther Burbank, türler içindeki değişimi sınırlayan görünmez bir kanunun olduğu görüşündedir: Tecrübelerimden biliyorum ki, bir buçuk ile altı santimetre arasında bir erik yetiştirebilirim. Ama itiraf edeyim ki, bir bezelye kadar küçük veya bir greyfurt kadar büyük erik elde etme çabası başarıyla sonuçlanmayacaktır… Kısacası, muhtemel sanılan gelişmelerin sınırları vardır ve bu sınırlar bir kanuna tabidir… Bu, ilk hale yani ortalama (vasat) boyuta dönme kanunudur… Geniş çaplı deneyler daha önceden gözlemle tahmin ettiğimiz sonuçları onaylayan bilimsel deliller ortaya koymuştur. Yani bitkiler ve hayvanlar sonraki nesillerde vasat boyutlarına veya yapılarına geri dönmeye eğilimlidirler… Kısacası, tüm canlıları belirli bir sınırda bulunmaya zorlayan bir çekim kuvveti vardır.104 Günümüzde halen bazı yapay genetik düzenlemelerle hayvanların ya da tarım ürünlerinin biyolojik yapılarında bazı değişiklikler yapılabilmektedir. Daha güçlü kaslı, atlar ya da daha büyük lahanalar elde edilebilmektedir. Ama Darwin'in bunlardan yola çıkarak yaptığı çıkarımların yanlış olduğu artık açıkça ortadadır. Dünyanın önde gelen antropologlarından Loren Eisley bunu şöyle açıklar: Atların veya lahanaların kalitelerini yükseltmek için yapılan üretim şekli, sonsuz bir biyolojik değişime, yani evrime giden bir yol değildir. Bu tür yapay üretimlerin evrime kanıt olarak kullanılması gerçekten tuhaf bir durumdur.105 Florida Üniversitesi'nde hayvan bilimci olan Edward S. Deevy de, doğadaki değişimin bir sınırı olduğunu şöyle belirtir: "Buğday yine buğdaydır, greyfurt değildir; domuzlara kanat takamayız, tavuklara silindir şeklinde yumurta yumurtlatamayız."106 Ernst Mayr Meyve sinekleri üzerinde yapılan deneylerde de yine "genetik sınır" duvarına çarpılmıştır. Bu deneylerin hepsinde meyve sineği belli oranlarda değişime uğramış, ama belli sınırların ötesinde bir değişim gözlemlenememiştir. Neo-Darwinizm'in bilinen isimlerinden biri olan Ernst Mayr, meyve sineği ile yapılan iki deneyle ilgili olarak şunları aktarır: Birinci deneyde sineğin kıllarının azaltılması, ikinci deneyde ise artırılması hedeflenmişti. Ortalama 36 olan kıl sayısını 30 kuşak sonra 25'e kadar düşürmek mümkün oldu. Ama daha sonra kısırlık meydana geldi ve o seriden elde edilen sinekler nesil üretemez oldular. İkinci deneyde ise kıl sayısı 36'dan 56'ya çıkarıldı; bu defa da yine ilk deneyde olduğu gibi kısırlık baş gösterdi.107 Mayr yapılan bu deneylerden sonra şu sonucu çıkarmıştır: Belli ki seleksiyonla gerçekleştirilen zorlayıcı ıslahlar, genetik çeşitliliğin kökünü kurutmaktadır… Tek taraflı seleksiyon, genel uyumda (çevreye uyumda) bir düşüşe neden olmaktadır. Bu da, neredeyse her üretim deneyinin baş belasıdır.108 Bu konuyu ele alan en önemli kaynaklardan biri, biyoloji profesörü Lane P. Lester'ın ve moleküler biyolog Raymond G. Bohlin'in birlikte kaleme aldıkları Natural Limits to Biological Change (Biyolojik Değişimin Doğal Sınırları) adlı kitaptır. Lester ve Bohlin, kitabın girişinde şöyle yazmaktadırlar: Yaşayan organizmaların popülasyonlarının, belirli bir zaman dilimi içinde anatomi, fizyoloji, genetik yapı vs. açısından değişim gösterdikleri, tartışılmayan bir gerçektir. Geriye kalan zor mesele, şu sorunun cevabıdır: Ne kadar değişim mümkündür ve bu değişimler hangi mekanizma ile oluşur? Bitki ve hayvan yetiştiricileri, canlıların değiştirilebilirliği konusunda etkileyici örnekleri biraraya getirebilirler. Ama bir yetiştirici işe köpekle başladığında sonuçta yine köpek elde etmektedir, farklı ve garip görünümlü bir köpek bile olsa bu, sonuçta köpektir. Meyve sineği meyve sineği olarak kalmakta, güller gül olarak kalmaktadır.109 Yazarlar kitaplarında bu konuyu bilimsel gözlem ve deneylere bakarak araştırırlar. Vardıkları iki temel sonuç vardır: 1) Canlıların genlerine bir dış müdahale olmadıkça, yeni genetik bilgi edinmeleri mümkün değildir. Bu nedenle, genlere bir müdahale olmadıkça, doğada asla yeni biyolojik bilgi ortaya çıkmaz. Yani yeni canlı kategorileri, yeni organlar, yeni yapılar doğmaz. Doğal yollarla sadece belirli bir tür içinde "genetik varyasyon" oluşur. Bunlar da kısa boylu, uzun boylu, az tüylü, çok tüylü köpek cinsleri ortaya çıkması gibi "sınırlı değişim"lerdir. İsterse milyarlarca yıl geçsin, bu değişimlerin yeni canlı türleri ve daha üst kategoriler (sınıflar, aileler, takımlar, filumlar) oluşturması imkansızdır. 2) Doğada canlıların genlerine dış müdahale, sadece mutasyonlar yoluyla olur. Ama mutasyonlar da, hiçbir zaman, "yapıcı" etki sağlamazlar. Yeni genetik bilgi oluşturmazlar; etkileri sadece genetik bilgiyi tahrip etmektir. Dolayısıyla; Darwin'in sandığı gibi, doğal seleksiyon yoluyla "türlerin kökeni"nin açıklanması imkansızdır. Köpekleri ne kadar "seleksiyona" tabi tutarsak tutalım hep köpek olarak kaldıklarına göre, onların geçmişte aslında balık veya bakteri olduklarını iddia etmenin hiçbir mantığı yoktur. Peki "genlere dış müdahale" seçeneği, yani mutasyonlar dikkate alınırsa? Darwinist teori 1930'lardan bu yana bu seçeneğe bel bağlamaktadır ve bu nedenle de teorinin adı neo-Darwinizm olarak değişmiştir. Ne var ki mutasyonlar da teoriyi kurtaramamaktadır. Bu önemli konuyu, ayrıca incelemek yerinde olacaktır. Galapagos'taki Değişim Nereye Kadar? Darwin'in Galapagos adalarında gördüğü farklı ispinozlar da bir varyasyon örneğidir ve diğerlerinde olduğu gibi kesinlikle evrime bir delil oluşturmazlar. Son yıllarda yapılan gözlemler, ispinozlarda Darwin'in teorisinin öngördüğü gibi sınırsız bir değişim yaşanmadığını ortaya koymuştur. Dahası, Darwin'in 14 ayrı tür olarak belirlediği farklı ispinoz tiplerinin çoğu, aslında birbirleri ile çiftleşebilen, yani aynı türün üyeleri olan varyasyonlardır. Bilimsel gözlemler, hemen her evrimci kaynakta anlatılan "ispinoz gagaları" örneğinin, gerçekte bir "varyasyon" örneği olduğunu, yani evrim teorisine delil oluşturmadığını göstermektedir. Galapagos Adaları'na "Darwinistik evrimin kanıtlarını bulmak" için giden ve adalardaki ispinoz türlerini uzun yıllar boyunca gözlemleyen Peter ve Rosemary Grant'in ünlü çalışmaları, adada bir "evrim" yaşanmadığını belgelemekten başka bir sonuç vermemiştir.110 Mutasyonlar Ne İşe Yarar? Genetik bilgi son derece komplekstir. Hem genlerde saklanan bilginin kendisi komplekstir, hem de bu bilgiyi kodlayan, okuyan ve buna göre üretim yapan moleküler makineler... Bu sisteme isabet edecek olan rastlantısal bir etki, yani bir kaza, hiçbir şekilde genetik bilgi artışı sağlamaz. şeklinde anlatalım. Dört kanatlı mutant meyve sineklerinin ekstra kanatları, uçuş kaslarından yoksundur; bu nedenle gelişim değil sakatlık örneğidirler. Mutasyon, bilgisayar yazılımı ile uğraşan bir programcının klavyesinin üzerine rastgele bir kitap düşmesi ve bu kitabın bazı tuşlara çarparak yazılımın içine rastgele harfler ve rakamlar eklemesi gibi bir şeydir. Böyle bir kaza nasıl bilgisayar yazılımını geliştirmez, aksine bozarsa, mutasyonlar da insanın genetik kodunu bozarlar. Lester ve Bohlin'in Natural Limits to Biological Change (Biyolojik Değişimin Doğal Sınırları) adlı kitaplarında belirttikleri gibi; "mutasyonlar DNA replikasyonunun hassas mekanizmasında meydana gelen hatalardır" ve dolayısıyla "mutasyonlar, aynen genetik varyasyon ve rekombinasyon gibi kendi başlarına büyük evrimsel değişim meydana getiremezler."111 Mantıksal olarak beklenebilecek olan bu sonuç, 20. yüzyıl boyunca yapılan tüm deney ve gözlemler tarafından da doğrulanmıştır. Hiçbir canlıda genetik bilgisini geliştirerek köklü bir değişim meydana getiren bir mutasyon gözlemlenmemiştir. Bu nedenle Fransız Bilimler Akademisi Eski Başkanı Pierre-Paul Grassé, evrim teorisini kabul etmesine rağmen, mutasyonların "yalnızca kalıtsal değişkenler olduğunu, merkez noktaya bağlı olarak sağa sola hareket eden bir sarkaç pozisyonunda olduklarını, ama hiçbir zaman evrimsel etkisi olan bir sonuç olmadıklarını… sadece daha önceden var olanı bir çeşit değişime uğrattıklarını"112 söyler. Dr. Grassé evrim konusundaki problemin "bazı çağdaş biyologların mutasyonu görür görmez evrimden bahsetmeye başlamalarından kaynaklandığını" söyler. Ona göre bu kanı "gerçeklerle uyuşmaz; çünkü ne kadar çok sayıda olurlarsa olsunlar, mutasyonlar herhangi bir evrim meydana getirmezler."113 Canlıların yapılarına, özelliklerine ait her türlü bilginin şifreli olarak saklı bulunduğu genler, mutasyonlar sonucunda bozulmaya uğrarlar; dolayısıyla canlıların varoluşlarında herhangi bir katkılarının olması söz konusu değildir. Mutasyonun tahrip edici, bozucu etkileri yandaki resimde açıkça görülmektedir. Türlerin mutasyonlarla yeni genetik bilgi kazanamayacakları konusunda verilebilecek en güzel örnek meyve sinekleri ile ilgilidir. Meyve sinekleri üzerinde yapılan mutasyonlar, doğadaki canlılara değişimin değil, bir dengenin hakim olduğunu göstermiştir. Meyve sineği gebelik süresi çok kısa (12 gün) olduğu için uzun yıllardır mutasyon deneylerinin gözde deneği olmuştur. Bu deneylerde sineğin mutasyon oranını 15.000 kez artırmak için röntgen ışınları kullanılmıştır. Bilim adamları meyve sineğinin doğal şartlar altında milyonlarca yılda maruz kalacağı mutasyon sayısını kısa bir süre içinde gerçekleştirerek gözlemleyebilmişlerdir. Bu kadar hızlı mutasyonlardan sonra elde edilen hiçbir yeni tür yoktur. Bilim adamları yine meyve sineğinden başka bir şey elde edememişlerdir. Meyve sineklerindeki sözde "faydalı mutasyon"lara örnek verilen klasik vaka, dört kanatlı mutantlardır. Meyve sinekleri normalde iki kanatlıdır, ancak bazı mutantların dört kanada sahip olduğu gözlemlenmiştir. Darwinist literatür bu örneği "gelişim" olarak sunar. Oysa Jonathan Wells'in Evrimin İkonları adlı kitabında detaylı olarak açıkladığı gibi, bu çok yanlış bir yorumdur. Söz konusu ekstra kanatlar uçuş kaslarından yoksundur ve dolayısıyla mutant sineklere avantaj değil dezavantaj getirmektedirler. Nitekim bu mutantların hiçbiri laboratuvar dışında yaşamamıştır.114 Tüm bunlara rağmen evrimciler nadir de olsa "faydalı mutasyonlar" yaşandığını ve bunların doğal seleksiyon tarafından seçildiğini ve böylece yeni biyolojik yapıların ortaya çıktığını ileri sürerler. Oysa burada çok önemli bir yanılgı vardır. Bir mutasyon kesinlikle "genetik bilgi artışı" meydana getirmez ve dolayısıyla evrim sağlamaz. Lester ve Bohlin bu konuyu şöyle açıklarlar: (Mutasyonlar)... zaten var olanı modifiye ederler, çoğunlukla anlamsız ve yok edici bir şekilde. Bu, faydalı mutasyonların hiçbir zaman var olmadığı anlamına gelmez; pek muhtemel olmasa da, yine de oluşabilirler. Faydalı bir mutasyon, basitçe, bu mutasyona sahip olanların, kendi soylarını daha sonraki nesillere mutasyona sahip olmayanlardan daha çok aktarmalarını sağlayandır... Ama bu mutasyonların bir organizmayı bir diğerine dönüştürmekle hiçbir ilgisi yoktur... Bu açıdan Darwin Maderia'da yaşayan kanatsız böceklere dikkat çekmiştir. Rüzgarlı bir adada yaşayan böcekler için, kanatlar kesin bir dezavantaj olabilir. Uçuşun kaybolmasına neden olan mutasyonlar ise kesinlikle yararlı olacaktır. Aynı durum görme yeteneği olmayan mağara balıkları için geçerlidir. Gözler yaralanmaya çok açıktır ve tamamen karanlık bir ortamda yaşayan canlılar, gözlerini yok ederek yaralanma ihtimallerini sıfıra indiren bir mutasyondan fayda göreceklerdir. Bu mutasyonlar etkili ve yararlı bir değişim oluştursalar da, önemli olan bir nokta vardır ki, bunlar her zaman bir kayıp meydana getirmektedirler, kazanç değil. Hiçbir zaman, daha önceden gözlere veya kanatlara sahip olmayan türlerde bunların üretildiğini gözlemlemiyoruz.115 Dolayısıyla yazarların vardıkları sonuç şudur: "Toplamda, mutasyonlar daimi bir genetik bozulma ve dejenerasyon nedeni olarak işlev görürler." Etkileri hep "genetik bilgi kaybı" olan mutasyonların, doğadaki milyonlarca farklı canlı türünün olağanüstü derecede kompleks genetik kodlarını ürettiklerine inanmak ise, klavyelerin üzerlerine düşen kitapların, milyonlarca ansiklopedi yazdığına inanmak gibidir. Yani saçmadır, akıl dışıdır. Paris Üniversitesi Tıp Fakültesinde bölüm başkanlığı yapan ve bilime katkıları nedeniyle Bronz Yıldız Madalya ve Croix de Guerre Şeref Nişanı'na layık görülen Dr. Merle d'Aubigne, bu konuda şu önemli yorumu yapar: Kişisel olarak ben, yaşam koşullarındaki değişikliklere bağlı olarak gerçekleşen mutasyonun beynin, ciğerlerin, kalbin, böbreklerin hatta eklem ve kasların karmaşık ve rasyonel düzenini açıklayabileceği fikrini tatmin edici bulmuyorum. Akıl sahibi ya da düzenleyici bir güç olduğu fikrinden nasıl kaçınılabilir ki? 116 Kısacası mutasyonlar da Darwin'in meselesine, yani "türlerin kökeni"ne bir açıklama getirmemektedir. Avusturyalı evrimci biyolog Gerhard Müller bu çözümsüz durumu, "yeni morfolojik karakterlerin kökeni, çağdaş sentetik (neo-Darwinist) teori tarafından hala açıklanabilmiş değildir" şeklinde ifade etmektedir. Neo-Darwinizm'in öne sürülen iki mekanizmasının, yani doğal seleksiyon ve mutasyonun canlıların kökenini açıklaması mümkün değildir. Çünkü doğal seleksiyon genetik bilgi üretmez; sadece var olan bilgiyi seçer. Mutasyonlar da genetik bilgi üretmez; bu bilgiyi en iyi ihtimalle etkilemez, çoğu zaman tahrip ederler. Genetik bilginin -ve dolayısıyla yaşamın- kökeninin bu bilinçsiz doğa mekanizmaları olmadığı açıktır. Bu köken, Dr. Merle d'Aubigne'nin de ifade ettiği gibi, "akıl sahibi ya da düzenleyici bir güç"tür. Bu güç sonsuz akıl, ilim ve kudret sahibi Yüce Allah'tır. Allah Kuran'da şöyle buyurmaktadır: Yaratmayı başlatan, sonra onu iade edecek olan O'dur; bu O'na göre pek kolaydır. Göklerde ve yerde en Yüce misal O'nundur. O, güçlü ve üstün olandır, hüküm ve hikmet sahibidir. (Rum Suresi, 27) Darwinizm, bu gerçeği inkar etmeye çalışmış, ama başaramamış köhne bir teori olarak tarihe geçecektir. "İşte Öylesine Hikayeler"in Sonu Darwin, "türlerin kökeni"ni ele almaya çalışmasına rağmen, açıklayamadı. Türlerin kökeni Darwinizm açısından çözümsüzdür. Buraya kadar evrim teorisinin türlerin kökenini açıklama çabasının tamamen çıkmazda olduğunu inceledik. Bu çıkmaz son yıllarda evrimciler tarafından da açıklıkla itiraf edilmektedir. Evrimci biyologlar, Gilbert, Opitz ve Raff, Developmental Biology dergisinde yayınlanan 1996 tarihli bir makalelerinde, "türlerin kökeni, yani Darwin'in problemi, çözümsüz kalmaya devam etmektedir" diyerek durumu özetlerler.117 Ama kamuoyu bu durumdan pek haberdar edilmez. Darwinist sistem, sokaktaki insanın "türlerin kökeninin Darwinizm açısından çözümsüz kaldığını" bilmesini tercih etmez. Bunun yerine, medya ve ders kitapları gibi kanallar aracılığıyla, insanlara evrim masalları anlatılır. Bilim dünyasında "işte öylesine hikayeler" (just-so stories) denen bu masallar, evrim teorisine inanan pek çok insanın da başta gelen motivasyon kaynağıdır. Bu "işte öylesine hikayeler"in çok ünlülerinden birini özetle anlatalım. Hemen her evrimci kaynakta ufak tefek farklılıklarla rastlayabileceğiniz bu hikaye, insanın nasıl olup da "ayağa kalktığı" ile ilgilidir: İnsanların ataları olan insanımsı maymunlar, Afrika'nın ormanlarında, ağaçlarda yaşıyorlardı. İskeletleri eğikti, elleri ve ayakları ağaçları tutmaya uygundu. Sonra bir zaman Afrika'da ormanlık alanlar azaldı ve insanımsılar savanlara doğru göç ettiler. Savanlarda yüksek otların arasında etrafı görebilmek için dik durmak, yani ayağa kalkmak gerekiyordu. Böylece atalarımız ayağa kalktılar, dik yürümeye başladılar. Elleri ise boşta kaldı. Bunun sonucunda ellerini kullanmaya başladılar. Ellerini alet yapımında kullandıkça, zekaları da gelişti. Böylece insan oldular. Bu gibi hikayelere evrimci gazetelerde ve dergilerde sıkça rastlayabilirsiniz. Evrim teorisine inanan ve konu hakkında bilgisiz ya da yüzeysel bilgiye sahip muhabirler, bu hikayeleri okuyucularına sözde bilimsel birer gerçek gibi anlatmayı adeta kendilerine görev edinmişledir. Oysa giderek daha fazla bilim adamı bu hikayelerin hiçbir bilimsel değer taşımadığını kabul ve ilan etmektedir. Londra'daki İngiliz Doğa Tarihi Müzesi'nde uzun yıllar üst düzey paleontolog olarak çalışan Dr. Collin Patterson, şöyle yazmıştır: Bir formun bir diğerine nasıl dönüştüğüne dair hikayeler yazmak ve bu dönüşümün aşamalarının doğal seleksiyon tarafından nasıl seçildiğine dair nedenler bulmak kolaydır. Ama bu hikayeler bilimin bir parçası değildir, çünkü onları test etmenin hiçbir yöntemi yoktur.118 Evrimci paleontolog T. S. Kemp ise, 1999 basımı Fossils and Evolution (Fosiller ve Evrim) adlı kitabında "işte öylesine hikayeler"in bilimsel değersizliğini "kuşların evrimi" konusunda yazılmış olanlarını ele alarak şöyle açıklar: Kuşların kökeni hakkında bir senaryo, Geç Jurasik döneminde, küçük, hafif iki ayaklı dinozorlar üzerinde, gittikçe daha arboreal (ağaçlarda yaşamaya yönelik) bir adaptasyonu kayıran bir seleksiyon olduğu şeklindedir. Ağaçlarda yaşamak, onların yırtıcılardan kaçma yeteneklerini artırmış ve yeni besin kaynakları bulmalarını sağlamıştır. İlave seleksiyon baskıları sırasıyla sıçramayı, süzülmeyi ve sonuçta daldan dala ve ağaçtan ağaca güçlü şekilde uçmayı zorlamıştır. Bu ara formlar, onların yaşadıkları ekolojik koşullar ve maruz kaldıkları selektif güçler hakkındaki varsayımların hiçbiri ampirik (bulgusal) olarak test edilemez. Sonuç şudur ki bu evrimsel senaryo, eleştirel olarak ifade edersek, bir "işte öylesine hikaye"dir.119 Patterson'ın veya Kemp'in ifade ettiği husus, yani söz konusu "işte öylesine hikayeler"in test edilemeyecekleri ve dolayısıyla bilimsel bir değer taşımadıkları, meselenin bir yönüdür. İkinci ve belki de daha da önemli yönü ise, bu hikayelerin aynı zamanda gerçekleşmesi imkansız saçmalıklar oluşudur. Yani bu hikayeler bilimsel olmayışlarının ötesinde, zaten mümkün de değildirler. Bunu açıklamak için, yine insanın evrimi konusunda az önce aktardığımız "ayağa kalkan insanımsılar" hikayesini ele alalım. Bundan 150 yıl önce Jean Baptiste Lamarck, döneminin geri kalmış bilim düzeyiyle böyle bir hikaye öne sürmüştür. Oysa modern genetik göstermiştir ki, yaşam sırasında kazanılan özellik sonraki nesle aktarılmaz. Bunun üstteki hikayeyle ilgisi şudur: Hikayede, insanın sözde atalarının, yaşam sırasında kazandıkları özelliklerle evrimleştikleri varsayımı egemendir. İnsanların "otlar arasında etrafı görebilmek için ayağa kalktıkları ve elleri boşta olduğu için bunları kullandıkları ve böylece zekalarının geliştiği iddia edilmektedir. Bu, tamamen bilim ve akıldışı bir iddiadır. Böyle bir olay hiç yaşanmamıştır. Ayrıca bir canlının dik durmaya çalışarak veya el aletleri kullanarak birtakım özellikler elde etmesi mümkün değildir. Elde ettiğini kabul etsek bile (ki bu bilimsel olarak imkansızdır), bu özellikleri sonraki nesle aktarması mümkün değildir. Dolayısıyla bir maymun kendini zorlayarak iskeletini "dikleştirse" bile, bu özellik sonraki nesle geçmez ve dolayısıyla bir "evrim" gerçekleşmez. Peki nasıl olmaktadır da bir yüzyılı aşkın bir süredir çürümüş olan Lamarckist mantıklar hala topluma empoze edilmeye çalışılmaktadır? Lamarck'ın yanlış tezi bilimsel olarak çürütülmüştür ancak buna rağmen hala kitlelerin zihnine işlenmeye çalışılmaktadır. Evrimciler, bu "işte öylesine hikayeler"in, yaşanan asıl biyolojik evrim sürecinin bir özeti olduğunu söylerler. Onlara göre "ihtiyaçlar evrim doğurmaz"; ama "ihtiyaçlar doğal seleksiyonu belirli bir yönde yönlendirir, bu da o yönde sonuç veren mutasyonları seçtirir." Yani, "insanımsılar ayağa kalktı" dediklerinde, aslında "insanımsıların ayağa kalkması avantajlı olacaktı, işte tam bu dönemde onlara isabet eden bir mutasyon iskeletlerini dikleştirdi, dikleşenler de doğal seçilimle seçildi" demiş olurlar. Bir başka deyişle, "işte öylesine hikayeler"de, hikayenin mutasyonla ilgili kısmının bilimsel açıklaması tamamen göz ardı edilmektedir. Çünkü bu kısım ele alınıp incelendiğinde, ortaya bilimsellikten uzak batıl bir inanç çıkacaktır. Evrimcilerin mutasyonla ilgili "işte öylesine hikayeleri"nde bir canlı neye ihtiyaç duyuyorsa, hangi durum onu daha "avantajlı" hale getiriyorsa, o ihtiyacını karşılayacak, o durumu sağlayacak bir mutasyonun mutlaka meydana geleceği varsayılmaktadır. Üstelik bugüne kadar genetik bilgiyi geliştiren tek bir mutasyon bile gözlemlenmemişken... Bu senaryoya inanmak, canlılara, her ihtiyaç duydukları şeyi sağlayan sihirli bir değneğe inanmak gibi bir şeydir. Batıl inançtır. Bu çok önemli gerçeği teşhis edenlerden biri, evrim teorisine prensipte inanmasına rağmen Darwinizm'e şiddetle karşı çıkan, Fransız Bilimler Akademisi'nin eski başkanı olan ünlü Fransız zoolog Pierre Grassé'dir. Grassé mutasyonlar hakkındaki garip Darwinist inancı şöyle tarif etmektedir: Mutasyonların havyanların ve bitkilerin ihtiyaçlarının karşılanmasını sağladığına inanmak, gerçekten çok zordur. Ama Darwinizm bundan fazlasını da ister: Tek bir bitki, tek bir hayvan, binlerce ve binlerce tam olması gerektiği şekilde faydalı tesadüflere maruz kalmalıdır. Yani mucizeler sıradan bir kural haline gelmeli, inanılmaz derecede düşük olasılıklara sahip olaylar kolaylıkla gerçekleşmelidir. Hayal kurmayı yasaklayan bir kanun yoktur, ama bilim bu işin içine dahil edilmemelidir.120 Kısacası Darwinizm hayal kurmaktır. Bilimle ilgisi yoktur. Tüm dünyaya bilimsel gerçekler gibi anlatılan "işte öylesine hikayeler"in ise, en ufak bir bilimsel dayanağı bulunmamaktadır. Tüm bu hikayelerin ortak özelliği, canlıların belirli bir ihtiyacının tanımlanması ve sonra da bu ihtiyacın mutasyonlar tarafından karşılanmış olduğunun varsayılmasıdır. Söz konusu ihtiyaç evrimciler tarafından "evrimsel baskı" olarak nitelenir. (Örneğin savanların yüksek otları arasında ayağa kalkma ihtiyacı, "evrimsel bir baskı"dır.) "Gerekli mutasyonların kullanıma hazır olduğunu varsaymak" ise, sadece Darwinizm'e körü körüne inanmakla mümkün olabilir. Böylesine körü körüne bir dogmatizme kapılmayan herkes, "işte öylesine hikayeler"in bilimle ilgisi olmayan uydurmalar olduğunu görecektir. Nitekim "işte öylesine hikayeler"in içyüzünü artık evrimci bilim adamları da yüksek sesle ifade etmeye başlamış durumdalar. Bunun yeni bir örneği, New York Times'da yayınlanan tipik bir "işte öylesine hikaye" üzerine Amerikan Doğa Tarihi Müzesi Antropoloji bölümü başkanı Ian Tattersall'un yaptığı yorum oldu. New York Times'da yayınlanan haberde, "İnsanlar evrim sürecinde neden tüylerini yitirdiler?" diye soruluyor ve buna dair anlatılan çeşitli avantajlılık senaryoları aktarılıyordu. Tattersall ise şöyle diyordu: "Tüy kaybının avantajlarına dair her türden fikir mevcut, ama bunların tümü 'işte öylesine hikayeler'."121 Mutasyon ürünü olan sakat eller. Ünlü Nature dergisinin bilim editörü ve evrim konusundaki pek çok makale ve kitabın yazarı Henry Gee, bir evrimci olmasına rağmen, bir organın kökenini onun yararlarından bahsederek açıklamaya çalışmanın ne kadar yanlış olduğunu 1999 basımı kitabında şöyle açıklıyordu: ... Burunlarımız gözlük taşımak için yapılmıştır, dolayısıyla gözlüklerimiz vardır. Evet, evrimci biyologlar herhangi bir yapıyı onun mevcut yararından söz ederek açıklamaya çalıştıklarında bu mantığı kullanmış oluyorlar. Oysa söz konusu mevcut yarar, bize o yapının nasıl evrildiği hatta o yapının evrimsel tarihinin onun şeklini ve özelliklerini etkileyip etkilemediği konusunda hiçbir şey söylemez.122 Bu açıklamalar çok önemlidir. Çünkü muhtemelen bundan sonra da başta bir kısım medya olmak üzere evrimci kaynaklarda "işte öylesine hikayeler"e rastlayabilirsiniz. Bunların hiçbir kanıtı olmayan içi boş masallar olduğuna dikkat etmek gerekir. Bu hikayelerin oluşturulmasında hep aynı yöntem izlenir. Önce bir canlıya ait bir özelliğin avantajlı yönü veya yönleri tarif edilir. Sonra bu avantajın nasıl evrimleşmiş olabileceğine dair bir senaryo uydurulur. Elbette bu şekilde üretilecek evrimci tezlerin pratikte bir sınırı yoktur. "Filin hortumu yerden yiyecek toplamada avantaj sağlar o halde filin hortumu yerden yiyecek toplamak için evrimleşmiştir" veya "zürafanın boynu yüksekteki dallara ulaşmasını mümkün kılar o halde zürafanın boynu yüksekteki yapraklara uzanmak için evrimleşmiştir" gibi… Bunlara inanmak, doğada canlıların her ihtiyacını karşılayan bir "sihirli evrim değneği" olduğuna inanmaktır. Yani hurafeye inanmaktır. Bu hurafenin içyüzü ise her geçen gün biraz daha ortaya çıkmaktadır. Bölüm başından bu yana incelediklerimize bakarak diyebiliriz ki; "Türlerin Kökeni"nin rastlantısal bir evrim süreci olduğu iddiası, Darwin'in 19. yüzyılın ilkel bilim düzeyi içinde yaptığı yanlış çıkarımların bir sonucudur. 20. yüzyıl boyunca yapılan tüm gözlem ve deneyler, doğada yeni türler ve daha üst kategoriler üreten bir mekanizma olmadığını göstermiştir. Bilim, Darwinist yanılgıyı yıkmıştır. Ve türlerin gerçek kökeninin "bilinçli tasarım" (yani yaratılış) olduğu, tüm canlıları üstün ilim sahibi Yüce Allah'ın yarattığı gerçeği açığa çıkmıştır.

http://www.biyologlar.com/bir-zamanlar-turlerin-kokeni-turlesme-saniliyordu

İlk plazmid nasıl oluşmuştur

*Plazmidler, çoğu bakteri türünde bulunan,ancak her suşta bulunmayan halkasal veya süper sarmallı DNA molekülleridir. *Plazmitler, küçük moleküllerdir; bu açıdan bir karşılaştırma yapılırsa, bakteriyel kromozomun %20’si ile %4′ü arasında büyüklüklerde olduğu görülür. *Plazmidler, bazı üreme koşullarında konakçı hücre için mutlaka taşınması gereken yapılar değildir. Bununla birlikte, pek çok plazmid, özel koşullara uyum sağlamak için önemli olan genler içerir. Bu genler,çoğu kez bakterinin plazmiti taşıdığına dair temel işaret olurlar. Örneğin R plazmid taşıyıp, çeşitli antibiyotiklere dirençli olan bakteriler, aynı plazmiti taşımayan bakterilerin yaşayamadığı antibiyotikli ortamlarda yaşayarak diğerlerinden ayrılırlar . *Bir çok bakteride plazmid, hücreler arası gen transferinin özel bir tipinden sorumludur. Plazmidlerin bu özellikleri, 1950′lerde ilginç bir çalışma konusu olmalarına sebep olmuştur. Plazmidler, normalde konakçının replikasyon sistemini büyük ölçüde kullanmaları sebebiyle bakteriyel DNA replikasyonunun anlaşılması için iyi modeller olmuşlardır. Ayrıca, mikrobiyal genetikte kısmi diploidlerin yapılmasına yönelik çalışmalarda kullanıldıkları için önemlidirler. ***Başka bir önemleri de, genetik mühendisliğinde klonlama vektörü olarak kullanılmalarıdır. Plazmit Tipleri Farklı tiplerdeki plamitlerle ilgili genel bilgi Plazmitlerin Saptanması Bir bakteri suşunun plazmit taşıyıp taşımadığının, taşıyorsa bu plazmitin ne gibi özelliklerinin olduğunun bakteri genetiği yöntemleri ile belirlenmesi. Plazmitlerin Saflaştırılması Plazmit DNA’nın saflaştırılması: Moleküler biyolojide temel ve vazgeçilmez tekniklerden biri, Alkali lizis yöntemi. Plazmit Transferi Bakterilerde gen aktarımı. Plazmitlerin Replikasyonu Plazmit DNA nasıl çoğalır, yavru hücrelere nasıl dağılır? Önemli Plazmitler Önemli plazmit tipleri hakkında daha ayrıntılı bilgi. F, R, Col; ek olarak Ti ve Degredasyon Plazmitleri Kaynakça PLAZMİD TİPLERİ Çetitli E.coli suşlarında bir çok plazmit tipine rastlanmıştır. Ancak en çok bilinenleri, F, R ve Col plazmidleridir. Bu plazmidler, bazı özellikleri paylaşsalar da, önemli farklılıklara sahiptirler. Bir bakteride F, R ya da Col plazmidinin bulunup bulunmaması aşağıdaki özelliklerden yararlanılarak anlaşılabilir: 1. F ; Fertilite veya Seks Plazmidleri: Bu plazmidler, konakçılarına, kromozomal genlerini F plazmidinden yoksun hücrelere aktarma yeteneği kazandırırlar. F plazmidi, bu gibi durumlarda kendisini de alıcı hücreye transfer edebilir. 2. R ; Direnç Plazmidleri: R plazmidleri, konakçıyı bir veya daha fazla antibiyotiğe karşı dirençli kılar. Bu tip plazmidler, transfer edilerek başka hücrelerin de direnç kazanmasına yol açabilirler. 3. Col; Kolisinojenik Plazmidler: Col plazmidleri, “kolisin” adını alan bir grup proteinin sentezinden sorumlu genleri içerirler.Kolisinler,yakın suşlardan aynı tip Col plazmitini taşımayan bakterileri öldürme özelliğindedirler. Öldürme mekanizmasi, Col plazmidinin tipine göre değişiklik gösterir. Bu plazmit tipleri hakkında daha ayrıntılı bilgi, Önemli Plazmitler bağlantısında bulunabilir. Sonraki Konu: Plazmitlerin Saptanması PLAZMİDLERİN SAPTANMASI Plazmidler,hem genetik,hem de fiziksel yöntemler kullanılarak saptanabilirler.İlk olarak F plazmidi keşfedilmiştir. Met-Bio-Thr+Leu+ fenotipineki bir E.coli sutu (A),Met+Bio+Thr-Leu- fenotipindeki diğer bir suşla karıştırılarak minimal agara ekim yapıldığında minimal agarda yaklaşık 10-7 frekansında koloniler teşekkül etmiştir. Bu koloniler, Met+Bio+Thr+Leu+ fenotipinde; dolayısıyle, rekombinant kolonilerdi. Karıştırma işleminden önce A suşu streptomisinle muamele edilince,rekombinant koloniler yine oluşmuş; ancak ,B suşuna streptomisin uygulanınca koloni gözlenmemiştir. Bu deney, rekombinantların B suşundan türediğini olayın tek yönlü bir genetik bilgi akterımı olduğunu göstermiştir. Başka bir deneyde B’ye genetik bilgi aktaramayan bir suş, “C” suşu, A ile karıştırılıp uzun süre bir arada üretilmiş ve daha sonra karışımdan izole edilen C kolonilerinin B’ye gen aktarımı yaptığı gözlenmiştir.Bu deney sonuçlarından anlaşılmıştır ki, A suşu, B’ye gen transferini sağlayan bir fertilite elementine; “F” faktörüne sahiptir, C suşunda da F faktörü bulunmamaktadır; A ve C suşlarının bir arada üretilmeleri halinde F faktörü, A suşundan C suşuna transfer edilmekte, buna bağlı olarak da, genetik markırları B suşuna aktarabilen yeni bir C suşu ortaya çıkmaktadır. Başlangıç çaprazlaması: F+Met-Bio-Thr+Leu+ X F-Met+Bio+Thr-Leu- şeklindeydi. Transfer tek yönlü olduğu için F faktörü taşıyan hücreye donör (erkek), taşımayan hücreye ise resipient (dişi) adı verilmiştir. F’ adını alan F varyantlerı, plazmid üzerinde kromozomal genler de taşırlar.Bu konudaki ayrıntılı çalışmalardan biri, lac operonu ile ilgilidir ve kısmi diploidlerin elde edilmesimde kullanılmıştır. Bu deneyde, F’ lac bakteriler tasarlanmıştır. F’ ın transferi, bir antibiyotik içeren minimal laktoz katı kültür ortamına duyarlı donör ve dirençli resipient hücrelerin ekilmesiyle kolayca anlaşılabilir. çapraz tekli: F’ lac+ / lac- Strs X lac- Strr Plazmid üzerinde lac+ markırı taşıyan donör hücrelerle kromozomda lac- markırı taşıyan resipient hücreler karıştırılıp streptomisinli minimal laktoz agara ekilince rekombinant koloniler oluşmuştur (F’ lac+ / lac- Strr rekombinantları). Yalnızca donörün ekildiği kontrolde hücreler streptomisine duyarlı oldukları için; yalnız resipientin ekildiği kontrollerde ise hücreler laktozu kullanamadıkları için koloni oluşmamıştır. Burada, streptomisin markırının donör üremesini engelleyici özelliği önemlidir ve böyle markırlara “counterselection” ya da “counterselective” markırlar denir. Counterselective amaçlı olarak antibiyotik resistansı sıklıkla kullanılsa da diğer fenotipler de iyi sonuç verir. Örneğin, F’ transferi, F’ lac+ / met- X lac- met+ çaprazları minimal laktoz katı besiyerine ekilerek kontrol edilebilirler. Donörler, ortamda methionin olmadığı için (methionin eksiklği, counterselectiondur); resipientlerse laktozu karbon kaynağı olarak kullanamadıkları için üreyemezler. Yalnızca, F’ transferi yapan rekombinantlar üreyebilir. Bu durumda seçilmiş markır, lac+ ‘tir. F içeren A ve B suşları arasındaki çaprazlama ve F’ suşlarıyla yapılan deneyler arasında,önemli sayısal farklılıklar gözlenmiştir. Suşlar,ekilmeden önce yarım saat karıştırılırsa A X B deneyinde rekombinantların donör hücreye oranı 10-7; F’ deneyinde ise % 50′dir.Farklılığın sebebi, genetik markırın F’ bakterilerde plazmit üzerinde olmasından kaynaklanır. A X B deneyinde resipientlerin yarısı F faktörünü alsalar da çok az bir kısmı kromozomdaki markırları alabilmiştir. Plazmid Nasıl Transfer Edilir ? F’ lac+ / lac- Strs tsxr X F’ lac- Strr tsxs Eşletmesi gerçeklettirilmit, tsxr taşıyanlara Faj T6′nın absorbe olamadığı gözlenmiştir.Eşleşmeden bir süre sonra, bakteri karışımının bir kısmı streptomisinli laktoz kolorindikatör katı besiyerine ekilmiş ve kolonilerin %90′ından çoğunun lac+ olduğu gözlenmiştir.Bu da, donörlerin büyük kısmının F’ lac+ transferi yaptığını gösterir. F’ lac+ i trensfer eden bakterilerin hala plazmidin bir kopyasını taşıyıp taşımadığını belirlemek için, eşleşme karışımının bir kısmı T6 fajı ile muamele edilmiştir. tsxs bireyler,resipientler gibi viruslar tarafından lizise uğratılmıştır. tsxr donörü olup hayatta kalan hücreler, laktoz indikatör besiyerine ekilince, lac+ koloniler oluşmoştur. Sonuçta, donör hücrenin transferden sonra da plazmidin kopyasını taşıdığı; yani,transferin DNA replikasyonu ile birlikte geçekleştiği görülmüştür. Basit bir fenotip göstermeyen plazmitlerin varlığı ise, başka bir yöntemle saptanır. Hücre kültüründen DNA izole edilerek agaroz jel elektroforezi ile analiz edilir. Bakteri kromozomu büyük olduğu için jele giremez. Oysa plazmid, jelde yürüyecek kadar küçüktür. Eğer plazmid varsa, molekkül ağırlığına göre belirli sınırlar içinde band verir. Band, jelin EtBr ile boyanması durumunda UV ışığında görülür. Plazmid DNA büyüklüğü, molekül ağırlığı bilinen ve aynı jelde yürütülen DNA fragmentleriyle karşılaştırılarak hesaplanabilir. Sonraki Konu: Plazmit DNA’nın Saflaştırılması PLAZMİD DNA’nın SAFLAŞTIRILMASI Plazmid izolasyonu için, bakteriler,deterjan uygulamasıyla parçalanır. Elde edilen solüsyon (hücre lizatı), santrifüj edilir. Protein ve RNA ile kompleks yapmış olarak bulunan bakteri kromozomal DNA’sı, büyük olduğu için, santrifüj tüpünün altındaki tabakada yer alır. Daha küçük olan plazmid DNA ise,temiz süpernatanda (temiz lizat) kalır. Plazmitlerin izolasyonu için kullanılan yöntemler, mini prep ve large scale olmak üzere iki şekilde uygulanır. En çok kullanılanlar, alkali lizis ve boiling lizis yöntemleridir. PLAZMİT DNA İZOLASYONU (ALKALİ LİZİS YÖNTEMİ) 1.Gecelik kültürden bir miktar alınarak 6000rpm.’de 5 dakika santrifüj edilir. 2.Süpernatan atılararak çökeltiye 100 ml.G.T.E.eklenir.(1.çözelti) 1.Çözelti (GTE.): 50 mM Glukoz 25 mM. Tris Cl (pH 10 mM. EDTA (pH 3.Tüpe 200 ml.2. çözelti eklenir. 2. Çözelti: 0.2 N NaOH %1 SDS (2. Çözeltinin taze hazırlanması gerekmektedir.Hazırlandıktan sonra buzda bekletilir.) 0.91 ml. dH2O 0.05 ml. NaOH (5 M stoktan) 0.04 ml. SDS (%20’lik stoktan) 4.Tüpe 150 ml.3. çözelti eklenerek 5 dakika buzda bekletilir. 3.Çözelti: 5M (molar) Potasyum asetat Glecial asetik asit dH2O 5. Tüpler,12000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilerek supernatan yeni tüpe alınır.400 ml.fenol ve 400 ml.kloroform eklenerek 12000 rpm’de 2 dakika sanntrifüj edilir. Üst faz yeni bir tüpe alınarak 2 hacim etanol eklenip düşük hızda vortekslenerek 2 dakika oda sıcaklığında bekletilir. 6.12000 rpm’de 5 dakika santrifüj uygulanır,süpernatan atılarak çökeltiye 1 ml. %70′liketanol eklenir. 7.12000 rpm’de 2 dakika santrifüj edilir. 8.Süpernatan atılarak çökelti vakum altında kurutuldu.Kuruduktan sonra distile suda çözülür. Sonraki Konu: Plazmit DNA’nın Transferi PLAZMİD DNA’nın TRANSFERİ Donör ve resipient Hücreler arasındaki rekombinasyona ilişkin ilk bulgulardan biri, rekombinasyon için hücreler arasındaki bir bağlantının gerekliliğidir. Bu durum,F+ ve F- hücre kültürlerinin porlu filtre ile ayrıldığı deneyde gösterilmiştir. Bu durumda, hücre hücreye bağlantı engellenerek rekombinant oluşumunun engellendiği görülmüş ve olay için bakteriyel konjugasyon ya da çiftleşme terimi kullanılmaya başlanmıştır. Bir dizi deneyle, plazmid transferinin dört adımda gerçekleştiği gösterilmiştir. Bu adımlar: 1.Özel donör-resipient etletmesi (efektif kontakt) 2. DNA transferi için hazırlık (mobilizasyon) 3.DNA transferi 4.Replike olabilen fonksiyonel plazmidin resipient içinde tekillenmesi. F ya da F’ içeren hücreler,bir resipientle kontakt kurdukları zaman bu dört adım gerçekleşir. Bazı plazmit tipleri, bu işlemlerin tamamını gerçeklştirmek için genetik olarak yeterli değildirler. Plazmidler, bu özelliklerine göre dört gruba ayrılırlar: · 1. Nontransmissible Plazmitler:Efektif kontakt ve DNA transferi için gerekli olan genleri içermezler. 2. Konjugatif plazmidler: Efektif kontakt itleminin gerçeklettirilmesi için gerekli genleri içerirler. 3. Mobilisable Plazmidler: Plazmid DNA’ sını transfer için hazırlayan genleri taşır. 4. Self Transmissible Plazmidler: Hem konjugatif, hem de mobilize özellik taşırlar (F plazmitler gibi). Konjugatif fonksiyonlar, çoğu kez, plazmide özel değildir ve bundan dolayı, bir plazmid, ikinci bir plazmidin transferine yardımcı olabilir. Örneğin, bir tek hücre, hem F plazmid, hem de Col E1 plazmid taşıyabilir. F plazmid, hem konjugatif hem de mobilisable’dir. Oysa Col E1, mobilisabledir, fakat konjugatif değildir. Bu nedenle,sadece Col E1 plazmidi taşıyan bir hücre, plazmid transferi yapamaz. Her iki plazmidi içeren bir hücrede, F plazmidi,Col E1′de olmayan konjugatif fonksiyonu sağlayabilir, böylece Col E1 plazmiti, her iki plazmitten de yoksun olan bir hücreye aktarılabilir. Bu şekilde nonkonjugatif bir plazmidin, bir konjugatif plazmit sayesinde kurulan efektif kontakt yoluyla transfer edilmesine “donation” denir. Mobilizasyon fonksiyonları ise, genellikle plazmite özeldir; yani, bir self-transmissable plazmid, nonmobilisable bir plazmiti transfer etme yeteneğine sahip değildir. Bununla birlikte, bazı örneklerde, frekans düşük de olsa transfer gerçekleşebilir. Transferin olması için, iki plazmid arasında rekombinasyon yapılarak transfer edilebilir tek bir DNA molekülünün oluşturulması gerekir.Sonuçta, ortaya nonmobilisable plazmidin tamamını taşıyan bir selftransmissible plazmit çıkar. Bu işleme,”kondüksiyon” adı verilir. F aracılığı ile transfer edilen kromozom, kondüksiyonla mobilize edilir. F’teki dizilerle kromozom arasında bir genetik rekombinasyon meydana gelir ve f faktörü, kromozom boyunca resipient hücreye geçer. EFEKTİF KONTAKT ve PİLİ Efektif kontakt için ilk adım, donör ve resipient hücrelerin çift oluşturmasıdır. Çift oluşumu için, donör üzerinde seks pilus adı verilen kıl benzeri bir protein ilaveye ihtiyaç vardır. F içeren ve R içeren hücrelerde, F piluslar ve R piluslar bulunur. F pilus, izole edilmit ve pilin adı verilen tek bir hidrofobik proteinden oluştuğu saptanmıştır. F piliye bağlanan bazı fajlar bulunmaktadır (male spesific fajlar). Bu fajlar iki tiptir.Bir kısmı pilusun ucuna, bir kısmı da dibine bağlanır. Uca bağlananlar, eşleşmeye engel olurken; dibe bağlananlar olmaz.Eşleşme sistemlerinin tümü piliye bağımlı değildir. Örneğin, Streptococcus fecalis, bir selftransmissible plazmit taşır. Plazmitsiz resipientler, dişi böceklerdeki feromona benzer şekilde bir eşleşme proteini üretirler. Bu protein,plazmit içeren (donör) hücrelerde yapılmaz. Feromon, donör hücrede adhesin denilen bir proteinin sentezlenmesine sebep olur.Adhesin, donör hücreyi çevreleyerek donör-reipient çiftinin oluşmasını sağlar. Plazmid transferi tamamlandıktan sonra feromon sentezi durur. MOBİLİZASYON ve TRANSFER Mobilizasyon, plazmitte kodlanıp muhtemelen rilaksasyon kompleksinde nik oluşturan proteinin özel baz dizisine sahip transfer orijininde (oriT) bir tek zincir (single strand) kırık oluşturmasıyla başlar. nik, dönen halka (rolling circle) replikasyonunu başlatır ve dönen halkanın lineer kolu transfer ediliri. Nik oluşturan protein, 5′ ucuna bağlı kalır ve replikasyon şekli, FX 174 fajının rolling circle mekanizmasına benzer. Burada önemli bir özellik, DNA sentezinin hem donör, hem de resipient hücrede gerçekletmesidir. Donördeki sentez, donör konjugal DNA sentezi adını alır ve transfer edilen tek zincirin yerini doldurur. Resipient hücredeki sentez ise (resipient konjugal DNA sentezi), alınan tek zinciri çift zincire çevirir. Genellikle, transfer edilen zincirin donör konjugal sentezle yer değiştirmesi ve resipient hücrede çift zincir DNA’ya çevrilmesi eş zamanlıdır. F PLAZMİDİNİN tra GENLERİ Genetik madde transferi, fin genlerinin kontrolündedir. Temel transfer (tra) fonksiyonları, bir operonda kodlanmaktadır. tra genlerinin çoğu,pili sentezinde görevlidir. Örneğin. tra A geni, pilin proteinini kodlar ve tra B,C,D,E,F,G,H,K,L,Q,U,V,W genleri ise, fonksiyonel bir pilusun oluşması için gereklidir. Diğer genler, eşleşme, transferin başlaması, transferin gerçekleşmesi, oriT’de nik oluşturulması, normal replikasyon orijini oriV’den DNA replikasyonu, iki f+ hücrenin eşleşmesinin engellenmesi (surface exclusion) ve plazmit uyuşmazlığında gereklidir. TRANSFERDE KONAKÇI KISITLAMASI Bazı durumlarda transfer edilen plazmit,konakçının restriksyon endonükleaz enzimleri tarafından parçalanır. Bu gibi durumları engellemek için, transfer edilen DNA, çift zincire çevrildikten sonra metillenmelidir. Bir zincirden metillenen DNA, restriksiyon endonükleaz enzimlerinden etkilenmez. Sonraki Konu: Plazmit Replikasyonu PLAZMİD REPLİKASYONU Bir plazmid, ancak konakçı hücre içinde replike olabilir. Plazmid, hangi tipte olursa olsun,replikasyonun doğru şekilde gerçekleşmesi için “replikasyon orijini ” adını alan belirli dizilere sahip olması gerekir. Plazmitler, replike olabilmek için, konakçının replikasyon proteinlerine gereksinim duyarlar. DNA polimeraz III, E.coli kromozomal DNA’sı için ana replikasyon proteinidir. Ancak, bazı plazmitler, onun yerine DNA polimeraz I’i kullanırlar. Örneğin, pol A mutantlarında, Pol-I düzeyinin düşüklüğünden F plazmitinin replikasyonu etkilenmezken Col E1 plazmiti, replike olamaz. Bunun sebebi, F plazmiti replikasyonunda pol-III; Col E1 replikasyonunda ise pol-I’in kullanılmasıdır. Bazı plazmitler, yalnızca konakçı genlerinin ürünlerini kullanırlar. Col E1 DNA saflaştırıldıktan sonra Col E1 yada diğer bir plazmid taşıyan hücrelerden elde edilen ekstrakta eklenirse replike olabilir. Diğer plazmidlerse, plazmitte kodlanan gen ürünlerine ihtiyaç duyarlar. Tüm plazmitlerin replikasyonu, semikonservatiftir. Farklı plazmitlerin replikasyon modelleri arasında önemli farklar vardır.Bazıları tek yönlü (unidirectional); bazıları çift yönlü (bidirectional) replike olurlar. RK 6 plazmidi, önce bir yönde, sonra da aynı orijinden ters yönde replike olur. Çift yönlü replike olan plazmidlerde, replikasyon iki şekilde sonlanır. Birinci tipte, terminasyon, büyümekte olan çatallar çakıştığı zaman olur. Diğerlerinde ise sabit bir terminasyon bölgesi vardır. Replikasyon halkası tamamlandığı zaman, halkalardan biri, yeni sentezlenen DNA’ların ayrılması için kırılır. Replikasyon sonucunda, bir nik açılmış molekül, bir de süper koil molekül meydana gelir. KOPYA SAYISININ KONTROLÜ Bir plazmid, hangi tipte olursa olsun, replikasyonun başlangıcını,dolayısıyle hücre içindeki sayısını kontrol eden genlere sahiptir. Plazmidler,hücre içindeki sayılarına göre, stringent yani düşük kopya sayılı (hücrede 1-2 kopya) veya relaxed yani, yüksek kopya sayılı (10- 100 kopya) plazmidler olarak iki gruba ayrılırlar. Plazmidler, replikasyonun başlangıcını negatif kontrol eden bir repressör kodlarlar. Bu, kopya sayını denetleyen bir mekanizmadır. Repressörün aktivitesi, konsantrasyonuna bağlıdır. Hücre gelişirke hacim artar, repressör konsantrasyonu düşer ve replikasyonu inhibe edemez. Bu nedenle plazmid sayısı, repressör gen sayısı ve buna bağlı olarak da repressör protein konsantrasyonu iki katına çıkar. Konsantrasyon belirli düzeye erişinde, replikasyon engellenir. Benzer olaylar zinciri, yüksek kopya sayılı plazmidlerin hücrede tek bulunması halinde de cereyan eder ve repressör konsantrasyonu replikasyonu inhibe edecek seviyeye çıkana dek plazmid, çoğalmaya devam eder. Plazmidlerin farklı kopya sayılarında bulunmalarını açıklamak üzere ileri sürülen bir modele göre, yüksek kopya sayılı plazmitlerin represyonu için gereken repressör konsantrasyonu, düşük kopya sayılıların repressör konsantrasyonuna göre daha yüksektir. PLAZMİD AMPLİFİKASYONU Plazmid içeren bir bakteri kültürüne, kloramfenikol gibi protein sentez inhibitörleri eklenecek olursa, kromozomal DNA replikasyonu inhibe edilir, ancak plazmit DNA, hücredeki sayısı bin, hatta daha fazla oluncaya kadar replike olmaya devam eder. Kromozomal DNA replikasyonun durma sebebi, bu reaksiyonların başlaması için protein sentezine gerek olmasıdır. Eğer plazmit, bakteriyel ya da plazmitte kodlanan dayanıklı proteinleri kullanıyorsa replike olmaya devam edebilir. Bunun yanında, konsantrasyona bağlı etki gösteren regülatör proteinlerin sayıları artamayacağı için plazmit replikasyonu baskılanamayacaktır. Plazmit amplifikasyonundan,genetik mühendisliğinde yararlanılır; kullanılacak plazmid, saflaştırılmadan önce bu yöntemle sayısı arttırılabilir. İNKOMATİBLİTE Birbirine yakın, ilişkili plazmidler, aynı hücre içinde stabil kalamazlar. Böyle plazmidlere “incompetable” denir.Plazmid replikasyonunun başlangıcında işlevi olan repressör modeli de bu durumu açıklar. İki plazmid taşıyan bir hücre düşünelim. Bu plazmidler, farklı repressörlere sahip olan F ve Col E1 plazmidleri olsun. Repressörler farklı olduğu için,bir plazmidin repressörü, diğerini regüle edemez ve plazmidler birbirinden bağımsız olarak replike olurlar. Bu durumda,F ve Col E1 plazmidleri uyumludur (competable); başka bir deyişle, farklı inkompatiblite gruplarına aittirler. Çetitli Enterobacteria’lar, bir çok plazmidi aralarında transfer edebilirler.Bu plazmidler, 25 inkompatiblite grubunda sınıflandırılırlar.Plazmidler, oluşturdukları pilus tipine göre de sınıflandırılırlar. AKRİDİNLERLE REPLİKASYONUN İNHİBE EDİLMESİ Çeşitli ajanlar, DNA’daki bazların aralarına girerler. Özellikle akridinler, kromozomal DNA’yı etkilemeden plazmid replikasyonuna engel olurlar. Bu inhibisyonla hücrenin plazmidi kaybetmesi sağlanabilir (acridin curing). Üreme ortamındaki akridin konsantrasyonu çok yüksek olursa kromozomal; düşük olursa plazmid DNA’nın replikasyonu durur. HÜCRE BÖLÜNMESİNDE PLAZMİDLERİN PAYLAŞILMASI Bir dizi deney,düşük kopya sayılı plazmidlerin bölünme sırasında kardeş hücrelere dağılmasının kontrol altında olduğunu göstermiştir. Şöyle ki, bölünmeye hazır bir hücre, plazmid DNA molekülünün iki kopyasını taşır ve yeni oluşan hücrelere bu kopyalardan biri gider (F plazmitte olduğu gibi). Eğer böyle bir kontrol olmasaydı, yeni hücrelerden bazıları plazmit taşımazdı. Plazmitsiz hücre sayısının artışını engellemek için, düşük kopya sayılı plazmidlerde bulunan paylaşım fonksiyonu, yüksek kopya sayılı plazmidler için gerekli değildir. Sonraki Konu: Önemli Plazmitler ÖNEMLİ BAKTERİYEL PLAZMİTLER ve ÖZELLİKLERİ F PLAZMİDLER F plazmidlerin en büyük özellikleri, bakteri kromozomuna entegre olabilmeleridir. Bu integrasyon sonucunda, Hfr hücreler oluşur. İntegrasyon, l fajının bir bakteride lizojenize olmasına benzer; ancak, F’in E.coli kromozomuna integrasyonu, l DNA’nın integrasyonundan farklıdır. F, kromozomal DNA’da bir çok bölgeye bağlanabilir. Kromozom üzerinde yirmiden fazla mamajör ve yaklaşık yüz minür bölge bilinmektedir. F’in her bir bölgeye affinitesi aynı değildir. F’in kromozomdan ayrılması, nadir de olsa gerçekleşir. Ayrılma frekansı, bazı lokalizasyonlarda, diğerlerine göre yüksektir. Çoğu kez, F’in ayrılması hatasız olmaz. Böyle durumlarda, iki kesimden biri entegre olmuş F’in içinde; ikincisi ise kromozomal DNA’nın F’e bitişik parçasında olur. Bu tip ayrılmalar, F’ plazmidlerin orijinini oluşturur. F faktörünün DNA replikasyonunda defekti olan mutant bakteri kromozomuna entegre olması, integratif süpresyon adı verilenolayda artışa sebep olur. F faktörü,replike olmak için E.coli’nin çeşitli replikasyon proteinlerini kullansa da, kromozomal DNA replikasyonunun başlamasını sağlayan dnaA geninin ürününe ihtiyacı yoktur.Yani, F faktörü,dnaA (Ts) mutantında serbest bir protein olarak bulunuyorsa, sıcaklık 42oC’ye yükseltildiği zaman (yükseltmenin amacı,mutant DnaA proteinini inaktive etmektir) kromozomal replikasyonun gerçekleşmesi, pek olası değildir; ancak, F plazmid, hala replike olabilir. F faktörü, dnaA (Ts) mutant suşta kromozoma entegre olmuşsa (hücre Hfr ise) Kromozomal replikasyon,yüksek sıcaklıkta da olur. Böyle bir durumda replikasyon, E.coli replikasyon orijininden değil, F faktörünün oriV bölgesinden başlar. Sonuçta,F faktörünün entegre olması, dnaA (Ts) fenotipini DnaA-bağımsız replikasyon orijini sayesinde baskılar. İntegratif süpresyonun gözlenmesi, F faktörü kromozoma entegre olmuş bir suşu izole etmek için kullanışlı bir yöntemdir. Örneğin, bir F’ Lac+ / Strs sutu, bir lac- DnaA (Ts) Strrsutuyla çiftlettirilebilir ve Lac+ Strr hücreler, 42oC’de streptomisinli minimal laktoz agara ekilerek seçilebilir. Hayatta kalan kolonilerin tümü, entegre olmut F’ lac içeren Hfr koloniler olacaktır. DİRENÇ (R) PLAZMİDLERİ R plazmitleri, ilk defa Japonya’da bir dizanteri salgını sırasında S.dysenteriae bakterilerinden izole edilmit, daha sonra, E.coli ve bir çok bakteride bulunmuştur. R plazmitler, konakçılarına bir grup fungal antibiyotiğe karşı direnç kazandırırlar ve genellikle self-transmissible özelliktedirler. Çoğu R plazmiti, bitişik iki DNA segmentinden ibarettir. Bu fragmentlerden biri, resistans transfer faktör (RTF) olup, DNA replikasyonunu, kopya sayısını, gen transferini ve kimi zaman tetrasiklin resistans genin regüle eder. R determinant olarak da adlandırılabilen öbür segment ise, antibiyotik resistansı için gereken diğer genleri taşır. R plazmitleri, genellikle, bir grup kombinasyonla, ampsilin (amp), kloramfenikol (Cam), streptomisin (Str), kanamisin (Kan) ve sulfonamid (sul) resistans genlerini taşır. İki bileşenli R plazmitleri, F’ plazmitlerden farklı olarak integrasyondan sonra gelen bir eksidasyonla oluşmazlar. Bu mekanizmanın yerine, transpozonlarla resistans genleri taşınabilir. R plazmitler,tıp alanında da büyük öneme sahiptir. Çünkü, bakteriler arasında transfer edilebilme özelliklerinden dolayı, büyük epidemilere sebep olmuşlardır. KOLİSİNOJENİK PLASMİDLER Col plasmidleri , kolisin üretme yeteneği sağlayan E.coli plasmidleridir.Kolisin, Col plasmidi taşımayan duyarlı bakterilerin çoğalmasını engelleyen bir proteindir. Col plasmidleri çeşitli bakteri türlerinde bulunan ve baktriosin üreten bakteriosinojenik plasmidler gurubundadır. Bakteriosinler, ki kolisinler bunlara bir örnektir; duyarlı bakterilerde etkileşime girerek birçok temel işlevi inhibe ederler. DNA replikasyonu, transkripsiyon, translasyon veya enerji metabolizması, kolisinlerin kötü yönde etkilediği işlevlerdendir.Kolisinlerin birçok tipi vardır. Her tip bir harfle belirtilir ve duyarlı hücrelerde özel şekillerde inhibisyona neden olurlar. Kolisin üretiminin saptanması, faj saptanmasına benzer bir yöntemle yapılır. Kolisin üreten hücre, duyarlı hücre kültürü üzerine konulur; kolisin, etraftaki bakterilerin çoğalmasını engeller.Koyu bakteri tabakasında “lacuna” olarak bilinen temiz bir bölge oluşturur. Col plasmidler, konakcılarının , doğada kolisine duyarlı hücrelere göre avantajlı olmalarını sağlar. Saflaştırılan kolisinlerde yapılan çalışmalar,bu proteinlerin gerçek kolisin ve defektif faj partikülleri olmak üzere iki tipte olduğunu göstermiştir. Bazı kolisinler, basit proteinlerdir. Diğerleri, elektron mikroskobu ile incelendikleri zaman faj kuyruklarına benzedikleri görülmüştür.Böyle plazmidler, eski profaj kalıntılarının gen ürünleri olabilirler; replikasyon ve baş ünitelerinin üretiminden sorumlu genleri kaybetmiş, ancak ve bir represör sistem, lizis enzimi ve kuyruk kodlayan gen bozulmadan kalabilmiştir. Faja benzer şekilde , kolisin hücre duvarı üzerinde özel reseptör bölgelere bağlanır.Ek olarak, bazı kolisinlerin ekspirasyonu normalde represe edilmiş olsa da UV ışığı gibi DNA bozan ajanlarla indüklenebilirler. Genellikle kolisinler, Col ilişkili bir hücreye karşı inaktiftirler.Bu olaya immünite denir. Çoğu kez, immünite, salınan küçük bir proteinin büyük kolisin proteinine bağlanması ile gerçekleşir. İmmünite proteini, yalnızca Col + hücrelere immünite sağlamaz, bunun yanında Col- hücrelerin öldürülmesinde degörev yaparlar. Örneğin, kolisin kloasin DF 13 proteini , üç bölgeden meydana gelir. Bu bölgeler, bir reseptöre bağlanan bölge, bir RNase ve immünite proteinine bağlanan bir segmentir. Reseptöre bağlana uç, hidrofobiktir ve hücre zarı ile interaksiyona girmesi olasıdır. İmmünite bağlayan segment, güçlü bir negatif yüke sahiptir; böylece pozitif yüklü immünite proteini ile nötralize olur. Kolisin bir reseptöre bağlandıktan sonra, parçalanır. N terminal bölgesi hücre dışında kalır, RNase segmenti hücreye girer, hücre yüzeyindeki immünite proteininden ayrılır. RNase, ribosomdaki RNA yı etkiler ve böylece duyarlı hücreyi öldürür. Col plasmidler, çok büyük boydadırlar. En çok çalısılan Col plasmidi, Col E1 dir.6646 baz çiftlik tam sekansı bilinmekte ve rekombinant DNA araştırmalarında çok sık kullanılmaktadır. Büyük self transmissible Col plasmidlerin çoğu, küçük Col plazmidler ile F veya F’ plasmidler arası hibritlerdir. Col E1, mobilize olabilen ancak konjugatif olmayan bir plasmittir. Plasmidde kodlanan bir nükleaz( Col E1 için nükleaz, mob geni tarafından kodlanır) ve bom (basis of mobility) adını alan özel baz dizisi üzerinde aktivite gösterir. Bu dizi kolisin bölgesini içerir. Mob geni transkribe edilir, mob ürünü, bom bölgesinde nik açar (nik gerçek kesim bölgesidir) ve süperkoil Col E1 DNA sı niklenmiş bir halkaya dönüşür.Bu olayları gerçekleştiren hücre F- ise, Col E1 plasmidi, pili yapma yeteneğine sahip olmadığı için konjugasyon çifti olusturamaz, transfer gerçekleşmez. Ancak hücrede hem Col E1 hem de F plasmidi varsa, F plasmidi, pilus ve transfer aparatının sentezini sağlayacağı için Col E1 transfer edilebilir. Mob- mutantı Col E1 ler, F plasmidi varlığında da transfer edilemezler. F+ mob+ bom- mutantlarında da transfer gerçekleşmez. Agrabacterium Ti PLAZMİTİ Bir çok Dictyledonus bitkisinde Agrabacterium tumefaciens bakterisinin sebep olduğu bir crown gall tümör bulunur. Tümörü oluşturan özellik, Ti adı verilen bir plazmite bağlıdır. Bitki enfekte olduğu zaman, bazı bakteriler bitki hücrelerinin içlerine girer,orada büyür ve lizise uğrarlar. Bunun sonucunda DNA’lar, hücre içine salınır. Bu noktadan sonra, tümör oluşumu için bakteriye gerek yoktur. Ti plazmitinin, replikasyonds görevli genler içeren küçük bir fragmenti, bitki hücresinin kromozomuna entegre olur ve hormonların etkisiyle hücre bölünmesini kontrol eden sistemin etkisini azaltır. Böylece hücre, tümör hücresine dönüşür.Bu plazmidler, bitki kültürlerinin geliştirilmesinde önemlidir. Özel genler, rekombinant DNA teknikleriyle bu plazmitlere takılabilir ve bu genler,bazen bitki kromozomuna entegre olabilir. Sonuçta,bitkinin genotip ve fenotipi değiştirilebilir. KONAKÇI SINIRI GENİŞ PLAZMİDLER Bazı plazmidler, sadece sınırlı sayıda, ilişkili bakteride bulunabilir. Bu plazmitlere, konakçı sınırı dar plazmitler denir. E.coli Inc P ve Pseudomonas aeruginosa Inc P1 inkompatiblite gruplarındaki self transmissible R plazmidleri ise, çok sayıda bakteri türüne transfer edilebilirler. Bunlar da, konakçı sınırı geniş plazmidler olarak adlandırılırlar. Neden bazı plazmitlerin konakçı sınırı dar, bazısının geniş olduğu bilinmemektedir. Plazmid: Büyüklük (Kb): Kopya Sayısı: Self-Transmissible Fenotipik Özellikler: Col plazmidler ColE1 6.4 10-15 Colicin E1,enerji gradientini parçalar,konakçyya Colicin E1′e ba?y?yklyk sa?lar. ColE2 7.6 10-15 Colicin E2,bir Dnase’dyr;konakçyya Colicin E2 ba?y?ykly?y. ColE3 7.6 10-15 Colicin E3 bir ribozomal Rnase’dyr;konakçyya ColicinE3 ba?y?ykly?y. F plazmid 94.5 1-2 F-pilus , konjugasyon. R plazmidler R100 106.7 1-2 Camr,Strr,Sulr,Tetr RK2 56.0 5-8 Geni? konakçy siniri pSC101 9.0 <5 Faj plazmidler ldv 6.4 50 l genleri cro,cl,O,P Rekominant plazmidler pBR322 4.4 20 Orta kopya sayysy,ColE1 tipi replikasyon,Ampr pUC18 2.7 200-500 Yüksek kopya sayysy,kopya sayysyny yükselten bir mutasyonla ColE1 tipi replikasyon Ampr pACYC184 4.0 10-12 Camr, Tetr DİĞER PLAZMİDLER Kimi plazmitler,zararsız bakterilere girerek onları patojen hale getirirler.E.coli Ent plazmitler, bu gruptadır ve diareye sebep olan enterotoksinlerin sentezini sağlarlar.Hly adında bir plazmid (hemoliz yapan plazmid), domuzdan izole edilen E.coli’lerde bulunmuştur.Hemolizin, kan örneklerindeki eritrositleri yıksa da Hly plazmitinin herhangi bir patojeniteye sebep olduğu görülmemiştir. Çoğu Pseudomonas türü, yüzlerce çeşit organik bileşiği karbon kaynağı olarak -özellikle, toluen, oktan gibi zehirli olanları- kullanabilmektedir. Bu metabolik yetenek, degredasyon plazmidleri tarafından sağlanır. Her bir plazmid,bu bileşikleri yıkmaya yarayan bir veya daha fazla metabolik yolda görevlidir. Bu tipteki bazı plazmitler,bakteriye sentetik bileşikleri yıkma yeteneği kazandırır. Başka bir plazmit grubunun üyeleri ise, toksik metal iyonlarına karşı direnç sağlar. bu plazmidler, direnç sağladıkları iyonun var olduğu ortamda bulunurlar. Hg++ iyonlarına karşı direncin biyokimyasal mekanizması iyi çalışılmıştır. Olay, plazmitte bulunan ve Hg++ iyonlarını metalik merküriye çeviren redüktaz enzimi sayesinde gerçekleşir. KAYNAKLAR: 1.Microbial Genetics; Stanley R.Maloy; John E. Cronom; David Frefeld 2.Biochemistry; Geoffrey Zubay 3.Concepts of Genetics; William S.Klug; Michael R.Cummings 4. Molecular Cloning; J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis   Plasmid zaten bakteri hücresi içerisinde, bakteri kromozomundan bağımsız genellikle dairesel yapıda, replikasyon yapabilen bir DNA parçası. Yani oluşturulmaktan öte bakterinin kendi doğasında olan bir yapı. Bakteri plasmidlerinden tra genlerini taşıyanlar, bakterinin kromozomuna eklenip, tekrar ayrılabilme özelliğine sahip. Bazıları da fertilizasyon plasmidi olarak, replikasyon sonucu bir kopyasını başka bir bakteriye aktarabiliyorlar. Üzerinde antibiyotik üreten genler( ki bakteriler antibiyotiği diğer bakterilere karşı kendilerini koruma aracı olarak kullanırlar) ya da antibiyotik direnç genleri mevcut. Bu haliyle plasmid bakterinin doğal parçası. Bugün bizim klonlama için kullandığımız yapay plasmidler de, bakterilerdeki doğal plasmidlerden esinlenilerek düşünülmüş. Bakteri plasmidlerinin kendilerini çoğaltabilme özelliği ve antibiyotik direnç genleri klonlama vektörlerinin anahtar kısımlarını oluşturup, bunlar üzerinde çeşitli düzenlemeler ile istenen klonlama plasmidleri elde edilmiş durumda.   Bu konuda plazmidlerin kromozomal DNA'dan koparak oluştuğuna dair bir teori var. bu kopan DNA parçalarının replikasyon orijinleri de mevcut. bazı bakterilerde tekrar kromozom DNA'sına entegre olabilen plazmidler mevcuttur. bunlara epizom denir. umarım sorunuzun cevabı olmuştur.

http://www.biyologlar.com/ilk-plazmid-nasil-olusmustur

DNA'nın Yapısı ve Özellikleri

Bütün tek ve çok hücreli organizma ile bir kısım virüslerde genetik materyal DNAdır. DNA yapı ve özellikleri başlığı altında, DNAnın moleküler yapısı, deoksiriboz, fosfat ve pürin ve primidin bazlarının yapıları ve birbirleri ile verdikleri reaksiyonlardan başlanarak anlatılmaktadır.nükleozid, nükleozit fosfat, nükleotid ve nükleozid-tri-fosfatlar hakkında bilgi verilmekte, nükleozit-tri-fosfatların DNA polimerini oluşturma reaksiyonları, purin pirimidin eşleşme özellikleri anlatılmaktadır. DNA çift sarmalının özellikleri, çeşitli ortam koşullarında biarbirine dönüşebilen DNA formları hakkında bilgi verilmektedir. DNA replikasyonunun yarı koruyucu (semikonservatif) özelliği deneysel örnek verilerek; ökaryotik ve prokaryotik DNA replikasyonu basamakları karşılaştırmalı olarak ve görev alan proteinlerle ilgili bilgileri de kapsamak üzere açıklanmaktadır. Ayrıca bu başlık altında DNA hasar tipleri, bunlara neden olan etkenler ve tamir mekanizmaları açıklanmakta; genom DNAsının farklı bölgeleri (tekrar dizinleri, gen aileleri, satellit DNA, gen kontrol bölgeleri, sessiz bölgeler gibi terimlere de açıklık getirilerek) ayrıntılı bir sınıflandırma yapılarak anlatılmaktadır. Gen aktivitelerinin ayarlanması (Genetik kontrol mekanizmaları) Dr.N. Cücer Çok hücreli bir organizmdeki bütün hücreler aynı genoma sahiptirler. Ancak, bu hücrelerdeki gen ürünleri ve bu ürünlerin düzeyleri hücreden hücreye, ya da aynı bir hücrede bir andan diğerine farklılık göstermektedirler Hücrelerin özelleştikleri fonksiyonlara ve o andaki gereksinimlere uygun ürünleri, uygun düzeylerde bulundurdukları gözlenmektedir.çok ya da tek hücreli organizmalarda her bir hücredeki gen ifadesi çeşitli mekanizmalarla ayarlanmaktadır.Bu kontrol mekanizmaları. Tek hücrelilerin çevre koşullarına; çok hücrelilerde ise hücrelerin birbirlerine uyumunu sağlamaktadır. Konunun kapsadığı alt başlıklar şunlardır: Bakteride enzim (protein) sentezinin ayarlanması, 1)Laktoz operonu örneğiyle anabolik/katabolik operon; konstitutif (zorunlu)/fakültatif (seçimli) enzim; katabolit aktivator proteini; indüktör; regülatör bölge; triptofan operonu örneğiyle, repressör; korepressör; son ürün inhibisyonu, genetik polarite terimleri ve mRNA düzeyinde genetik kontrol mekanizması, 2) arabinoz operonu örneği üzerinden ise gen aktivitesinin, gen ürünü tarafından negatif /pozitif kontrolu; RNA yapısına bağlı; küçük RNAlar ya da ribozomal proteinler veya alarmonlar aracılığı ile translasyon düzeyindeki kontrol ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Ökaryotlarda gen aktivitesinin ayarlanması ise, 1)Duplikasyon ya da amplifikasyon, 2)Metilasyon/demetilasyon v.b yollarla selektif gen inaktivasyonu/aktivasyonu, 3)Gen yeni düzenlenmeleri (rearrangement) ile kontrol, 4)Arttırıcı (enhancer) ve susturucu (silencer) DNA bölgeleri ile aktivite ayarlanması, 5)Posttranskripsiyonel kontrol ve 6)Hormonal kontrol ikincil başlıkları ile anlatılmaktadır.

http://www.biyologlar.com/dnanin-yapisi-ve-ozellikleri

HAYVAN VE İNSAN KOPYALAMA

Organ nakli, doğum kontrolü, büyük ameliyatlar derken genetikçiler, hayvan kopyamayı da başardı. İskoçya’da Ian Wilmut, Dolly adını verdiği kuzuyu kopyaladı. Sonra Hawai’de fare, Kore’de inek, İskoçya’da domuz kopyalandı.Güney Kore de türü azalan bir kaplan türünü kopyalamaya hazırlanıyor (Hürriyet, 24 Mayıs 1999) “... Bizim (biyologların), hapsedilme tehditini de içeren sayısız ve kesin kuralla dizginlenmesi gereken büyük işadamları olduğumuz söylenir. Tüm bunlar genlerimizi oluşturan DNA’nın olası en kötü şeyleri kışkırtabileceğinin düşünülmesi nedeniyledir. Bu tamamen aptalca; çevremizde beni, DNA’dan daha az ürküten başka bir öğe düşünemiyorum.” James Watson, 1977 “Uyarı profesyonellerinin genetekçilerin uğursuz güçlerini lanetlemeleri için, 1970'li yılların başında, biyologların, DNA rekombinasyon tekniklerini oluşturarak laboratuvarlarında doğayı taklit edebileceklerini keşfetmeleri ve böylece moleküler biyolojiyi kuramsal gettosondan çıkarmaları yetti. Bilimi, özellikle de insanın bilinmesiyle ilgili olduğunda, şeytanlaştırmaya çalışan insanlara daima rastlanır. On beş yildir, genetikçilerin uluslarasi küçük toplulugu, bilimsel perhiz, sakinimlilik, otosansür, kendini sinirlama, erteleme, yani kisacasi, Watson’in bu bölümün epigrafi olan sözlerini kendisinden aldigim, rasyonalizmin canlandiricisi Fransiz filozof Pierre- Andre Taguieff’in güzel bir biçimde söyledigi gibi, araştirmalarin gönüllü olarak kesilmesini buyuran bir entellektüel baskiyla karşi karşiyadir.Taguieff’in dedigi gibi: Fransiz usulü bilim karşiti vahiycilik, birçok açidan, 60'li yillarin sonunda ABD’de başlatilan büyük “acemi büyücü” avinin küçük ve gecikmiş bir yansimasindan başka bir şey degildir. Belki gecikmiş yansima; ama şu son yillarda Avrupa’da, şimdi de bizi yüzyil sonu korkularimizdan kurtarmaya yazgili, ahlaki uzmanligini tuhaf bir biçimde biyoloji ve tisbba bakmiş tüm bu “etik komiteler”i-de Gaulle’ün deyimiyle bu yeni tür “ivir zivir”i- yaratan, bu gecikmiş yansimadir.Sirasi gelmişken, tüm sanayileşmiş ülklerin bilimsel bütçelerinin çok büyük bölümünü yutan nükleer ve askeri araştirmalar gibi diger gerçek tehlike ve sapmalar konusunda bu komiteleree danişmayi düşünen var mi? Oysa bana, insanligin gen sagaltimindan çok askeri elektronikten kaygi duymasi gerekirmiş gibi geliyor. Hiç şüphesiz, bilimin şeytanlaştirilmasindaki bu yeni akim amacina ulaşamiyor; perhize çagri, dogum kontrolünde oldugu gibi bilimsel kontrol için de zavalli bir yöntemdir.Ama gelinb de, Taguieff’in terimleriyle, yalnizca kuşkunun mantigina boyun egen, kaygan zeminden başka kanit tanimayan ve sapmalari önleme adina, mutlak tutuculugun biyoloji sapagina, hatta bilimin totaliter denetimine dogru bizzat sapan yeni lanetçilere laf anlatin. Biyolojideki ilerlemeler ve insanın kendi üzerinde edindiği yeni olanaklar, ahlakçıların hayal güçlerini her zaman çalıştırmıştır. Bazıları bizi, geleceğin doktor Frankenştayn’larının korkunç bir “biyokrasi”si olarak betimlemekten çekinmiyorlar. Sanki gerçek bir saygısızlık olanağı varmış gibi, bizi “insan genomuna ve bütünlüğüne saygı”nın kutsal ilkesiyle tehdit ediyorlar. Böyşle bir yaklaşım, bu alandaki ilk sorumsuzun bir takım kopyalama hataları yapmadığı, onlarsız biyolojik evrimin asla olamayacağı “mutasyonlar”a başvurmadığı zamanlar, her döllenmede her zaman farklı yerni bir varlık oluşturan ve “ufak tefek düzeltmeler”le yetinen doğa olduğunu unutmak demektir. Ayrıca, aynı zamanda hekim de olan bir başka filozofun, François Dagognet’nin söylediği gibi, bizim genetik konusundaki kaygımız, temmodel olarak, türün üreme engeline takıldığı hayvanlara gönderimde bulunmak gibi bir dar görüşlülüğü yansıtmaktadır. Ama bakış tarzı, karışma ve melezleşmenin sıkça görülen fenomenler haline geldiği bitkisel alan da dahil, canlıların bütününe doğru genişletildiğinde söz konusu tabu ortadan kalkmaktadır. Ve nedeni bellidir: çok eski zamanlardan beri insanlar, bitki türleri üzerinde kasıtlı değiştirmeler uyguladılar. İnsanın canlıya ilişkin mantığı bu yolla sarsıldı. Ve sonra, canlının doğal düzenini kutsallaştırmak niye? Biyolojik yönden, programlanmış olmamaya programlanmış insan, niçin başarısızlıkları da dahil olmak üzere, genetik lotarya karşısında diz çökmek ve ona saygı göstermek zorunda olacaktır kı? Genetik kalıtımıza egemen olmak hiç şüphe yok ki, insanın evriminde yeni bir evreyi işaretleyecektir; buna döneceğim. Bu evrimi bir kabusmuşçasına tasarlamak zorunda değiliz. İnsan genomunun bilinmesiyle ortaya çıkan kaygılar şu soruyla özetlenelir: -Şimdilik bize yalnizca hastalarin iyimleştirilmesinin söz konusu oldugunu söylüyorsunuz. Çok iyi. Buna karşi çikmak zor. Ama, siz genetikçilerin az ya da çok yakin bir gelecekte, insani kendi karariniza göre dönüştürme erkine, cüce ya da devlerden, güçlü ya da zayiflardan, üstün zekali ya da ilkel kölelerden oluşacak “irklar” yaratma erkine sahip olmayacaginizi bize kim garanti ediyor? Megalomaniniz ya da ittakarliginiz sonucu, davraniş genlerimizle, hatta zeka genlerimizle “oynama” egilimi duymayacaginizi bize kim söylüyor? Şimdiden “gen nakledilmiş” fareler yapiyorsunuz, “gen nakledilmiş insan” cehennemi ne zaman? Bu kaygılar, insanın genetik kalıtına ilişkin olarak geri, kolaycı ve biyolojik bilgiye dayanmayan bir bakışı yansıtır. Son yirlmi beş yıldır moleküler biyolojinin gelişimi, bize genetik rekombinasyon mekanizmalarının ve genlerin dışavurumunun iki şeyi güvence altına aldığını öğretti: insanın sonsuz çeşitliliği ve insan fenotipinin(Dip not:Fenotip, bireyin gelişimi sırasında ve çevresel etkenlerin denetimi altında genotipinin-gen kalıtının- gerçekleşmesine uyan belirgin vasıflarının bütünüdür) bozulamayacak karmaşıklığı.Bu iki biyolojik gerçekten bir parçacık haberdarn olan herkes, Jim Watson gibi, hiçbir şeyin üzerinde çalıştığımız o molekülden, yani DNA’dan daha az ürkütücü olmadığı ve bunda yeni bir Pandora kutusu(Dip not: Yunan mitolojsinin güzel Pandora’sı. Prometheus’un tanrı katından çaldığı ateşi getirdiği insanları cezalandırmak için dünyaya gönderilmişti. tanrılar Pandora’ya içinde bütün kötülüklerin bulunduğu bir kutu emanet etmişti. Merakını yenemeyen Pandora kutuyu açtı ve böylece tüm kötülükler dünyaya yayıldı. Biraz da acıyarak, bilimin bu yeni engizisyoncularının kafalarının da evrensel ilk günah mitosu tarafından kurcalandığını düşünüyorum!) görmenin gülünç olacağı sonucuna varacaktır.(236-238) Karmaşik tahrip edilebilir; ama onu kolaylaştirmak, onunla “oynamak “, onu azaltmak istemek hiç de gerçekçi degildir. Insanligin genetik olarak tekbiçimlileştirilmesi fantezisi bir tür biyolojik anlamsizliktir.Bunu istesek bile yapamazdik. İnsanlık, genetik yasaları kendi yararına kullanabilir, kullanabilecektir; ama onları değiştiremeyecektir. Anımsatmak gerekir mi; dönemin yaygın yinelemesine uygun biçimde, “bir üstün ırk”ın ayıklanması yoluyla türün iyileşktirilmesi anlamındaki Nazi tipi öjenizm, tam bir fiyasko olmuştur.Psikopat diktatörün sanrıları, genetiğin bilgisine hiçbir şey borçlu değildi. Bu sanrılar, toplama kampları ve gaz odaları aracılığıyla girişilen bir soykurumun sözümona bilimsel doğrulanışından başka bir şey değildi. Ekonomik bunalım ve milliytçiliklerle her türlü karanlıkçıların tırmanış dönemlerinde, ırkçı ve totaliter tüm ideolojik hortlamaları bıkıp usanmadan ifşa etmek, entellektüellerin ve bilimcilerin görevidir. Ama geçmişin vahşeti geleceğin açılımları karşısında bizi dehşetten donakalmış bir halde bırakmamalı, tabu haline gelmiş sözcükler aracılığıyla hedefimizi şaşırtmamalıdır... En son tıbbi tekniklere başvurarak ağır hastalıkları olmayan bir çocuğa sahip olmak, gebeliği önleyebilmek, çocuk düşürme hakkı, yani iyi anlaşılmıyş öjenizm, kuşkusuz bireyin tümüyle özgür seçimiyle uygulandığında iyi bir şeydir. Biz zengin ülke topluluklarının bu tartışmaları, bizim kendi ülkelerimizde yararlandığımız doğum kontrol sisteminin olanaklarına ulaşmaya çamlışan yoksul ülkelerin kadın ve erkeklerine oldukça şaşırtıcı gelebilecektir... Gerçekte, totaliter rejimlerin normalleştirici fantezilerin çok ötesinde, yüzyilin bu son çeyreginde biyoloji, insan düşüncesini çeşitlilik ve karmaşikligin mantigina aliştirmak için hiç şüphesiz en fazla ugraşmiş olan bilimdir. Kendimi geleceğin ahlaki sorunlarını çözmek için hiçbir şekilde yetkin görmüyorum. Ben daha çok, gelecek kuşakların neyi kabul edilebilir ya da edilemez sayacaklarını bulmek için o kuşakların kendilerine güvenme eğilimindeyim. Ahlakın kendi değişmezleri vardır; ama bunlar, bilim ve bilgiyle birlikte evrimleşirler. Bugün bilgisizlikle kendimize yasakladığılmız şeylere, belki de yarın, daha iyi bir bilmenin ışığında izin vereceğiz. Okuru rahatlatır mı bilmem; ama genetiğin yasalarına egemen olmanın kaygılanacak fazla bir yanı bulunmadığını, buna karşılık umut verecek çok yanı olduğunu bana düşündüren nedenleri, burada gözden geçirmek isterim. Çeşitliligin Genetigi Buraya kadar patolojilere yol açan mutasyonları, genomun oyunbozanlık rolünü üstlenenleri gördük. Gerçekten de genom programının en acil hedefi, bizi genetik hastalıklara karşı silahlandırmaktıdr. Ama uzun dönemli hedefi daha temellidir ve biyolojik düzenlenişimizin bütününü daha iyi anlamayı amaçlıyor. kuşaklar boyu biriken mutasyonlarin hepsi (bu ortalama olarak her 300 bazda bir degişiklik noktasi, yani genomun bütününde yaklaşik on milyon polimorf nokta eder) hastaliklara yol açmaz. Çok şükür. Kalitimla aktarilan bu mutasyonlarin büyük çogunlugunun hiçbir kötü sonucu yoktur.(Ek Not:Genomun 3 milyar bazi arasindan, ortalama olarak 300 bazdan biri insandan insana degişir. Bunlar mutasyon noktalaridir.Bu noktalirn herbirinde baz “degişir”; ama yine de, genetik alfabenin yalnizca dört harfi oldugundan, seçim yalnizca dört olasilik arasinda yapilir: A,T,C,G. Örnegin A harfi yerinde bir T, bir C, ya da bir G olacaktir. Her bir degişiklik bölgesi için, topluluk içinde en fazla yalnizca dört allel vardir..s:291) Öncelikle, mutasyohlardan çoğu basit bir istatistik olgu sonucu genomun kodlayıcı olmayan bölgelerini (DNA’nın yüzde 90'nından fazlası) etkiledikleri ve uslu uslu sessiz kaldıkları için: gözlemlenbildiği üzere fenotipte kendilerini dışa vurmazlar. Sonra da bu kez asıl genlere (protein kodlayan, DNA dizilerinden yaklaşık yüzde 10'una) düşkün mutasyonların çoğu “nötr” oldukları için... Ya ana babanın alleliyle kodlanan proteinlerle aynı işleve sahip “eş anlamlı” bir protein kodlayan geni değişime uğratırlar. Ya da organizmanın düzgün işleyişinde bir değişiklik yapmaksızın, yalnızca insanların çeşitliliğine yol açan farklı proteinleri kodlarlar. En sonunda, geriye genomu bozan mutasyonlar kalır. Yüz bin genimizi etkileyen yaklaşık bir milyon mutasyon noktası olduğu varsayılabilirken, tek ya da çok etkenli, yaklaşık üç bin genetik hazstalık saptanmıştır. Mutasyonların çeşitlendirici rollerinin, bozucu rollerinden daha ağır bastığı görülüyor. Bozuk kabul edilen genlerin sayısı hesaplanmak istenirse, kafanızda genlerimizin bir milyon ya da yalnızca 997 000 polimorf noktasını gönlünüzce birleştirmeye çalışın [Dip not: Bu sayıları yalnızca büyüklüğü göstermek için veriyorum. Gerçekte her genetik hastalık ille de bir nokta mutasyonuna denk gelmez;ama bir mutasyonlar biyeşiminin ya da kromozomların rekombinasyonu sırasında ortaya çıkan kazalırın sonucu da olabilir.)Genetik rulet düşleyemeyeceğimiz kadar çok fazla sayıda bireysel bileşim sağlar. Biz, şu ya da bu deri rengi ya da başka bir yapısal özelliği sağlayan on kadar özel allele ayrıcalık tanımak isteseydik bile geriye kalan milyonlarca allel sonsuz çeşitliliği güvenceye almaya yetecekti. İnsan türünü tekbiçimlileştirmek hiç de kolay değildir. En fazlası ve biraz kötü bir şansla, bazı çekinik hastalıkları kolaylaştırmayı başaracaktık ki, bu da esasen, çok sınırla bir topluluk içinde kuşaklar boyu uygulanan her endogamide ortaya çıkan bir şeydir ve değişkenliğin, potansiyel mozayikliği de diyebileceğimiz genel kaynağına gerçek bir zarar vermez. Bireysel değişiklikle her türlü genetik akıl yürütmenin başlangıç noktasıdır.Bu temel gözlem verisi Darwin’in ilk esin kaynağ oldu; bu veri olmaksızın onun doğal ayıklanma kuramının hiçbir anlamının olmayacağı çoğu kez unutulur.”En uygun olanın ayıklanmasıW”na gelince, türün ortamın sonsuz çeşitliliğine uyum sağlamasına izin vermesi nedeniyle, Darwin’den sonra ileri sürüldüğünün tersine, çok daha az tekbiçimlileştiricidir. Evet, biz farklı olmaya mecburuz! Birkaç saniye için (daha fazlasına dayanılmaz) tamamen özdeş varlıklarla dolu bir dünya düşlemeye çalışalım! Rahatlayalım. Böyle bir olasılık, bir biyolojik olanaksızlıktır. Sonuçta kendimizi paylamaya, farklılık “hakkı”mızı ileri sürmeye, bizi sağduyuya zorlaması için tüm etik kaynakları harekete geçirmeye hiç gerek yok. Hoşumuza gitsin ya da gitmesin, her birimiz insan türünü ayni büyük izlegi üzerindeki farkli birer degişikligiz. Şu son yirmi otuz yillik biyolojik araştirmanin en şaşirtici keşiflerinden biri (60'li yillarda Jean Dausset’nin öncülügünü yaptigi HLA sisteminin aydinlatilmasiyla), yalnizca protein düzeyinde degil, genlerimiz düzeyinde de söz konusu oldugu anlaşilan bu olaganüstü insani polimorfizmdir. Mutasyonlar ve DNA rekombinasyonlari bizim en iyi korumalarimiz, normalleşitici heveslerimizin karşisindaki en etkili engellerdir. Farkliliga ve dolaysiyla bireye saygi içinde özgürlük, bundan böyle bir hümanist talepten daha fazla bir şeydir: hakliligini genlerimizde bulmuştur. Genetik kalıtımızın olağanüstü değişkenliğinin keşfi, yalnızca ırk kavramını değil, türe özgü temel özellikler dışındaki biyolojik “norm” kavramını da sonsuza kadar yıktı. Leonardo da Vinci güzelliğin ölçütü olacak bir altın sayı bulunduğuna inanıyordu. Çabalarına rağmen onu asla bulamadı.Çok mükemmel bir nedenden dolayı: ideal norm, bizim basitlmeştirici zihnimizce yaratılmış bir soyutlamadan başka bir şey değildir. Mükemmellik gibi güzelliğe atfettiğimiz kurallar da bir kültürden diğerine, bir dönemden diğerine, hatta bir bireyden diğerine göre değişir. İnsanın özdeş baskısı yoktur! Kuşkusuz, evrim her yeni türe ait yeni işlevlerin ortaya çıkmasına katkıda bulunur. Ama her türün ne bir ana öbeği ne de modeli vardır. Büyük evrim kuramcılarından biri olan Theeodosius Dobzansky’nin yazdığı gibi, genetik koşullanma yalnızca, tek bir insan doğası değil, ama insan doğaları olduğu anlamına gelir . Norm, norm olmamasıdır. Bu biyolojik gerçek, evrimin mantığını dile getirmekten başka bir şey yapmaz.(S:243) Farklılık, türün devamı için zorunludur. Öğrencilerimle beraberken daima şu düşüncenin üzerinde dururum: hepimiz farklı olduğu için hala buradayız. Aksi halde, ne iz ne de ben olacaktık. Burada olmamı, benim gibi olmamış (bugün de benim gibi olmayan ), ama belki de benim bizzat dayanamayacak olduğum bir saldırıdan sağ kalabilmiş olan ötekine borçluyum. Doğada saf soy yoktur. Olsaydı, hayatta kalamazdı. Laboratuvarda üretilenler, iste hücreler, ister drosofiller (sirke sineği) ya da beyaz fareler söz konusu olsun, özgürlüğün bedelini hemen yaşamlarıyla öderler. Eğer sivri sinekler farklı böcekölrüncülerine karşı şeytansı bir direnç gösteriyorlarsa, bu onların genetik polimorfizmlerinin her defasında bazılarının kendilerini kurtarmalarını, sonra da gelecek yok edici bombardımana kadar büyüyüp çoğalmalarını sağlaması nedeniyledir.Gelecek, dirençli azınlıklarda, marjinallerde ve uyum göstermeyenlerdedir! Buna göre, insan sivri sinakten daha az polimorf değildir. Yoksa, dünyanın bizzat yaratmış olduğu çetrefil karmaşıklıklarına nasıl uyum sağlardı? Bu polimorfizm, elli bin ya da yüz bin yıl önce homo sapiens ’in ilk marifetleri döneminde olduğu gibi, bugün için de doğrudur. küçük avcı-toplayıcı gruplar neden yaşamlarını sürdürebildiler? Tüm erkeklerav için uygun bacaklara ve gözlere, tüm kadınlar yenebilecek ot ve taneleri kesin olarak tanıma yeteneğine ve hep birlikte ateşi ya da barutu yeniden icat etme becerisine sahip olmaları nedeniyle mi? Tam olarak böyle değil. Bunu iyi biliyoruz. Her insan grubu, tıpkı bugünkü gibi, miyoplarına, artiritlilerine, keskin gözlülerine ya da koşu şampiyonlarına; yavaş düşünenlerine, hızlı düşünenlerine, liderlerine ve diplomatlarına, melankoliklerine ve neşelilerine, sanatçılarına ve eylem adamlarına, serserilerine ve ahlak hocalarına vb.. sahipti. kısacası her türden ve özellikle de her konumdan insanlar bulunuyordu. Dönemin küçük sürüleri, en azından benim gibi Roy Lewis’in olağanüstü romanı Babamı Niçin Yedim’ e inanırsanız, muhtemelen kendi “tutucular”ına ve “ilerlemeciler”ine bile sahipti. Onların da, vanya dayı gibi, toplanma çığlığı(s:244) “Ağaçlara Dönüş!” olan kendi tepkicileri ve baba Edouard gibi ateşi icat edip çayırları yaktıktan sonra, “Olanaklar olağanüstü !” diye haykırmaktarn geri durmayan dirençli icatçıları vardı. Tarihöncesine dair çalakalem yazılmış bu gülünç yapıtta bilerek başvurulmuş anakronik öğelerin ardında, yazarın derin bir antropolojik gerçekliğe parak bastığına inanıyorum.Hiç şüphe yok ki, yazarın kendilerine atfettiği bilgece dilin ötesinde, ilkel (ve yine de biyolojik olarak bizim kadar ya da az farkla evrimleşmiş) insanlar, Roy Lewis’in yeniden keşfettiği gibi, bugün bizi bölen davranışlarımızı aratmayan farklılık ve incelikteki davranışlarıyla insani entrika ve gülünçlüklere sahip bir çeşitlilik içindeydiler. Musee de l’Homme’ un son sergilerinden birinin, Hepimiz akrabayız, hepimliz farklıyız şeklindeki güzel başlığını açıklamak gerekirse, biz birbirimize benzeriz ve hepimiz farklıyız. Evt. Bunan yakınmak için ve bunun gizlenmesi için hiçbir neden yok. Mavi gözlü mü kara gözlü mü, ince-uzun mu kısa mı, beyaz tenli mi siyah ya da esmer mi.. olmak daha iyidir? Herkesin, en azından bir parça uygar olduğunu ileri süren herkesin hemfikir olacağı gibi, bunlar saçma sapan sorulardır. Ama zihinsel yeteneklerle, zekayla ve davranışlarla ilgili sorunlara gelince, karışıklık genel bir hal alır. Bazıları, yetenek ve zeka farklılıklarında genetik bir kökeni kabul etmekle insanlığa karşı bir suç işlediklerini düşüneceklerdir. Diğerleri, genlerimizin bazı sorumlulukları olduğunu bahane ederek tüm güçleriyle herkesin zekasını kendi ölçütlerine göre ölçmek ve davranışlarımızın tüm gizini hayvanlarda keşfetmek isteyeceklerdir. Gerçekte bunlar nedir? Örneğin zeka diye adlandırılan şey, doğal ya da insanın yarattığı çevrenin kavranmasını hedefleyen bir yetenekler mozayiğidir. Bu yeteneklerin bireşim mekanizması hiç şüphesiz tükenmez olanaklara sahiptir. Bir zeka geni değil, ama daha çok her insanın zekasının tek, karmaşık ve dinamık düzenlenişini oluşturan onbinlerce özellik temelindeki bir gen yığınının olması, gerçeği daha uygundur. Akla uygun tek çıkarsama bir zeka bulunmadığı, zekanın sayısız biçimlerinin olduğudur. Ortam burada fazlasıyla rol oynar. Bazı halklar, diğerleri tarafından ayırıcalıklı kılınandan farklı zeka biçimleri geliştirmek zorunda kalabilirler. Bir grup insana yaşamını Kalahari çölünde ya da Ekvator ormanlarında sürdürmesi için gereken zeka, elbette New York ya da Paris’teki bir büroda çalışmak için gereken zkanın eşi değildir. Aynı zeka değildir; ama kesinlikle eşdeğeridir. Boşimanların ya da Pigmelerin gözünde bizler cahil kişileriz. Boşimanların birbirinden ince farkları olan ve sabah ya da akşam çiğinin damıtılabileçcceği bsayısız bitkileri ayrıştırdıkları yerde, biz yalnızca çöl görürüz. Pigmeler ise, Joseph Conrad’ın Karanlığın Yüreği ’nden (Çev: Sinan Fişek, İletişim Yay: 1994) başka bir şey görmediği yerde, ormanı kolayca okurlar. Ama genetik çeşitlilik ayni kültür içindeki bireyler arasinda da rol oynar. Zeka burada da,genetikçilerin polimorf diyecekleri gibi çok biçimlidir. Müzisyenin zekasi matematikçinin zekasiyla belli bir benzerlige sahip görünür;ama matematikçlerin ve müzisyenlerin kendileri çok çeşitli mizaçlara sahiptiler. Ressamin zekasi yöneticinin, organizatörün, diplomatin, düzenbazin,filozofun, deneycinin,çalgi yapimcisinin,icatçiin, hatibin, eğitimcinin vb zekalarından başka ve şairinkiyle biraz benzerliği olabilen romancınınkiyle aynı değildir. Diğerlerinin zekasından yararlanabilme zekasına da sahip olmak ve bu durumda, anlaşılacağı üzere, en büyük çoğulculuğu savunmak mümkündür! (Daniel Cohen, Umudun Genleri s:236-246...) Bilim ve Çevre Bilimin gelişmesi ve onun teknolojik uygulamalari, doganin kirlenmesinde ve kirletilmesinde rol oynuyor. Bu doğru. " Diğer taraftan bilim adamları da bilmeceleri yanıtlayarak işe başlarlar, ondan sonra da ya küçük parmaklarını ya da tüm dünyayı havaya uçurabilecek deneylere girişirler. Bilim daha sorumlu bir biçimde davranmak zorunda değil midir? Bu sorunun yanıtı açıktır: bilim tümüyle ahlak dışı ve tümüyle sorumsuzdur. Bilim adamları, gerçi davranışlarında kendi ahlak kuralları ve sorumluluk duyguları (ya da bunların yokluğu ) tarafından yönlendirilirler ama sonuçta kendilerini bilimin temsilcileri değil, insan olarak görür ve buna uygun bir davranış biçimi gösterirler. Örneğin bir zamanlar D o ğ a adını verdiğimiz şeyi bugün Çevre' ye indirgemiş bulunuyoruz ve yakında belki de Çöplük olarak adlandırmamız gerekecektir. Peki bu bilimin suçu mu? Doğru, bilim doğanın ölümüne yolacan koşulların ortaya çıkmasında rol oynayabilir, ama unutmayalım ki doğayı yaşatacak çözümler de yine bilimin elindedir. Bilim, bize ancak çevrenin korunması ya da kirliliğin önlenmesi için gereken önlemleri sağlayabilir- karar insanlarındır. Bilim, soruları ( en azından bazı soruları) yanıtlar, ama karar alamaz. Kararları (ya da en azından bazı kararları ) ancak insanlar alabilir." (Raslantı ve Kaos s: 162-163) D. Ruelle, bilimin bu savunmasını son derece belirsiz ve karamsar bir yorumla bitiriyor: " Ama fiziksel ve kültürel çevremize vermekte olduğumuz zararlara karşın varlığımızı sürdürmeyi başarabilecek miyiz? İşte bunu bilmiyoruz. Geçmişte olduğu gibi bugün de insanlığın geleceğini kestirebilme olanağına sahip değiliz ve daha güzel bir geleceğe mi yoksa önüne geçilemez bir sona mı yaklaşmakta olduğumuzu bilmiyoruz" (s:163) Bu görüşler eleştirilmeye değer. İşçilerin tulumları beyazdı; ellerinde soğuk, kadavra rengi kauçuk eldivenler vardı. Işık donuktu, ölüydü: Bir hayalet sanki!.. Yalnız mikroskopların sarı borularından zengin ve canlı bir öz akıyor, bir baştan bir başa uzanan çalışma masalarının üzerinde tatlı çizgiler yaratarak, parlatılmış tüpler boyunca tereyağ gibi yayılıyordu. "Bu da" dedi Müdür kapıyı açarak, "döllenme odası işte..." Doğal olarak, ilkin döllenmenin cerrahlığa dayanan başlangıcından söz etti, derken "Toplum uğruna seve seve katlanılan bir ameliyattır bu" dedi, "altı maaşlık ikramiyesi de caba... Bir yumurta bir oğulcuk, bir ergin; bu normal... Oysa, Bokanovskilenmiş bir yumurta tomurcuk açar, ürer bölünür. Eş ikizler yalnız insanların doğurduğu o eski zamanlardaki gibi yumurtanın bazen rastlantıyla bölünmesinden oluşan ikiz, üçüz parçaları değil, düzinelerle yirmişer, yirmişer." Müdür "yirmişer" diyerek sanki büyük bir bağışta bulunuyormuş gibi kollarını iki yana açtı; "yirmisi birden!.." Ama öğrencilerden biri bunun yararının ne olduğunu sormak gibi bir sersemlikte bulundu. "İlahi yavrucuğum!" Müdür olduğu yerde ona dönüvermişti. "Görmüyor musun? Görmüyor musun, kuzum?" Bir elini kaldırdı; heybetli bir duruşa geçmişti. "Bokanovski süreci toplumsal dengenin en başta gelen araçlarından biridir! Milyonlarca eş ikiz; toptan üretim ilkesinin sonunda biyolojiye uygulanmış olması..." YUKARIDAKİ PARÇA, Aldous Huxley’in 1930’larda yazdığı, geçtiğimiz ay bilim gündemini birdenbire fetheden "koyun kopyalama" deneyine değinen haberlerde sıkça gönderme yapılan, Brave New World (Cesur Yeni Dünya) romanının girişinden kısaltılarak alınmış bir bölüm. Huxley, olumsuz bir ütopya (distopya) niteliği taşıyan romanında, Alfa, Beta, Gama, Delta ve Epsilon adlarıyla, kendi içinde genetik özdeşlerden oluşan beş farklı sınıfa bölünmüş bir toplum tablosu çiziyor. Özdeş vatandaşların üretildiği bu hayali "Bokanovski Süreci", çağdaş anlamıyla klonlama (veya genetik kopyalama) olmasa da, sürecin yolaçtığı etik (ahlaki) ve toplumbilimsel kaygılar, sekiz ay önce İskoçya’da gerçekleştirilen ve geçtiğimiz ay kamuoyuna duyurulan gelişmelerin doğurduklarına denk düşüyor. Şimdi herkesin tartıştığı, son gelişmelerin insanlık için daha insanca bir dönemin mi yoksa, hızla gerçeğe dönüşen korkunç bir distopyanın mı kapısını araladığı. Şubat ayinin 22’sinden itibaren, Iskoçya’nin Edinburg kentinde, biyoteknoloji alaninda tuhaf bir gelişme kaydedildigi, "Dünyanin sonu", "Frankenstein" gibi ifadeleri de içeren dedikodularla birlikte etrafta konu olmaya başladi. Bilim çevreleri de basin da şaşkindi, çünkü, seçkin yazarlarin ve bazi bilim adamlarinin birkaç gündür zaten haberdar olduklari ve konuyu "patlatmayi" bekledikleri bu gelişme, bir biçimde basina sizmiş, dilden dile dolaşmaya başlamişti bile. Normalde pek de ciddiye alinmayacak böyle bir "dedikodunun" bu denli yayilabilmesi, işin içine çeşitli dallarda makalelere yer veren saygin bilimsel dergi Nature’in adinin karişmasiyla olmuştu. Gerçekten de Nature, dedikodu niteligini fersah fersah aşan bir bilimsel gelişmeyle ilgili bir makaleyi 27 Şubat’ta yayinlayacagini bilim yazarlarina duyurmuş ve bu tarihe kadar "ambargolu" olan bir basin bülteni dagitmişti. Bati ülkelerinde yazarlar normal olarak bu ambargolara uyar, hazirladiklari yazilari, ambargonun bittigi tarihte, ayni anda yayina verirler. Ancak, aralarinda ünlü The Observer’in da bulundugu bazi dergi ve gazeteler ambargoyu çoktan delmiş, konuyu kamuoyuna duyurmuştu bile. Haberin, kaynagi olan Nature ve ambargoya saygi gösteren çogu nitelikli dergi ve gazetede yer almamasi da, dedikodu trafigini artirmiş, ortaya atilan spekülasyonlarla beklenenden fazla ilgi toplanabilmişti. Hatta, Mart ayının başlarında, koyun klonlama haberinin yarattığı ilgi ortamını değerlendirmek isteyen bazı haberciler, aynı yöntemle Oregon Primat Araştırmaları Merkezi’nde maymunların klonlandığını öne sürdüler. Oysa, Oregon’da gerçekleştirilen, embriyo hücrelerinin oldukça sıradan bir yöntemle çoğaltılmasıyla yapılmış bir deneydi. Klonlama, yetişkin bir canlıdan alınan herhangi bir somatik (bedene ait) hücrenin kullanılmasıyla canlının genetik ikizinin yaratılmasını açıklamakta. Kavramsal temelleri çoktandır hazır olan bu işlemin uygulamada gerçekleştirilemeyeceği düşünülüyordu. Edinburg’daki Roslin Enstitüsünden Dr. Wilmut ve ekibi bunu başarmiş gibi görünüyor. "Ben bu filmi daha önce seyretmiştim!" diyenleri rahatlatmak için hemen belirtelim ki, ayni ekip 1995 yilinda embriyo hücrelerini kullanarak yine ikiz koyunlar üretmiş ve bunu duyuran makaleyi yine Nature dergisinde yayimlatmişti. Bu deney de basina yansimiş, ancak, son gelişmeler kadar yanki uyandirmamişti. Ne de olsa bu yöntem, döllenmiş yumurtanin kazayla bölünüp tek yumurta ikizlerine yol açtigi bildik süreçlerden farksizdi. Siklikla unutuldugu için tekrarlamakta yarar var ki, Wilmut’un son başarisinin önemi, işe somatik bir hücrenin çekirdegiyle başlamasinda yatiyor. Bu başarinin ortaklarini anarken PPL Tibbi Araştirmalar şirketini de atlamamak gerek. Borsalarda tirmanişa geçen hisseleriyle gelişmenin meyvelerini şimdiden yemeye başlayan PPL, projenin hem amaçlarini belirleyerek hem de maddi olanaklari yaratarak kuzu Dolly’nin varliginin temel sebebi olmuş. Dr. Wilmut’un gerçekleştirdigi başari şöyle özetlenebilir: Yetişkin bir koyundan alinan somatik bir hücrenin çekirdegini dahice bir yöntemle, başka bir koyuna ait, çekirdegi alinmiş bir yumurtaya yerleştirmek ve bilinen "tüp bebek" yöntemiyle yeni bir koyuna yaşam vermek. Adini, ünlü şarkici Dolly Parton’dan alan kuzu Dolly, isim annesinin degilse de, DNA annesinin genetik ikizi. Dolly, sevimli görünüşüyle kamuoyunun sempatisini kazanmiş ve tüm bu süreç ilginç bir bilimsel oyun olarak sunulmuşsa da gerçekte deney oldukça iyi belirlenmiş bilimsel ve maddi hedefleri olan, sogukkanli bir süreç. Zaten Dolly’nin araştirmacilar arasindaki adi da en az varligi kadar "sogukkanlica" seçilmiş: 6LL3... PPL’in idari sorumlusu Dr. Ron James, şirket sirlarini kaybetme kaygisiyla maddi hedeflerini pek açiga vurmamakla birlikte, hemofili hastalari için koyunlara insan kani pihtilaşma faktörü ürettirmeyi de içeren pek çok önemli ticari hedefin ipuçlarini veriyor. PPL ve Roslin Enstitüsü’nün çalışmaları, geçmişi çok eskilere dayanan ve önemli gelişmelerin kaydedildiği bir alan olan transjenik (gen aktarılmasıyla ilgili) araştırmaların bir üst aşamaya, nükleer transfer (çekirdek aktarılması) evresine doğru ilerletilmesinden başka birşey değil. Yıllardır başarıyla sürdürülen transjenik çalışmalarda tek boynuzlu keçi, üç bacaklı tavuk gibi görünüşte çarpıcı, yararı kısıtlı çalışmaların yanı sıra, insan proteinlerinin hayvanlara ürettirilmesi gibi, modern tıp için çığır açıcı sayılabilecek başarılar kaydedildi. Son gelişmelere imzasını atan ekip, daha önce insan bünyesince üretilen molekülleri gen transferi yöntemiyle bir koyuna ürettirmeyi başarmıştı. Söz konusu deneyde gerek duyulan moleküllerin koyunun tüm hücrelerinde değil, sadece süt bezlerinde sentezlenmesinin sağlanması, koyunun "ilaç fabrikası" olarak değerlendirilmesini beraberinde getiriyordu. Dolly başarısının en önemli potansiyel yararı da bununla ilgili zaten. Gen transferi yöntemiyle, istediğiniz maddeyi sentezleyebilen bir canlıya sahip olduğunuzda, madde verimini artırmak üzere aynı süreci zaman ve para harcayarak yinelemeye çabalamak yerine elinizdeki canlının genetik ikizlerini yaratabilirseniz, ticari değer arz edebilecek miktarda ilaç hammaddesi üretimine geçebilirsiniz. Elinizde birkaç on tane genetik özdeş canlı biriktikten sonra, bu küçük sürüyü doğal yollardan üremeye bırakacak olursanız, hem "yatırımınız" kendi kendine büyüyecek, hem de genetik çeşitlilik yeniden oluşmaya başlayacağından, tek bir virüs tipinin tüm "fabrikayı" yok etmesinin önünü alacaksınız demektir. Biraz Ayrıntı İskoç ekibin gerçekleştirdiği klonlama deneyinin, dünyanın pek çok bölgesine dağılmış sayısız standart biyoteknoloji laboratuvarında "kolayca" gerçekleştirilebileceği söyleniyor. Yine de uygulanan yöntem, günlük gazetelerdeki basit şemalarda anlatıldığı kadar kolay ve hemen tekrarlanabilir türden değil. İskoç ekibin başarısı ve önceki sayısız benzeri çalışmanın başarısızlığı, Wilmut’un, verici koyundan alınan hücre çekirdeğiyle, kullanılan embriyonik hücrenin "frekanslarını" çok hassas biçimde çakıştırabilmesine dayanıyor. Bu yöntemle araştırmacılar, yetişkin çekirdeğin genetik saatini sıfırlamayı, tüm gelişim sürecini başa almayı becerebilmişler. Yöntemin ayrıntılarına girmeden önce bazı temel kavramlara açıklık getirmekte yarar var. Çoğu memeli canlı gibi insan bedeni de milyarlarca hücreden oluşuyor. Bu hücrelerin milyonlarcası her saniye bölünmeyi sürdürerek beden gelişimini devam ettiriyor ve yıpranmış hücreleri yeniliyor. Bu hücrelerin önemli kısmı bedenimizin belli başlı bölümlerini oluşturan "somatik hücreler." Tek istisna, üreme hücreleri. Eşeyli üreme, gametlerin (sperm ve yumurta) ortaya çıktığı "mayoz bölünme"yle başlıyor. Cinsel birleşme sonucunda, spermin yumurtayı döllemesiyle de yeni bir canlının ilk hücresi "zigot" oluşuyor. Bu noktadan sonra gelişmeye dönük hücre bölünmeleri, "mayoz" değil, "mitoz" yoluyla ilerliyor. Koyun ve insan hücrelerinin de dahil olduğu ökaryotik yani, çekirdeği olan hücreler, farklı gelişim evreleri içeren bir yaşam döngüsü geçiriyorlar. Bu döngüyü, hücrenin görece durağan olduğu "interfaz" ve belirgin biçimde bölünmenin gerçekleştiği mitoz evrelerine ayırmak mümkün. Hücre, yaşam döngüsünün yüzde doksan kadarını interfaz evresinde geçiriyor. Aslında, bu duraklama evresi göründüğü kadar sakin değil; hücre, tüm bileşenlerini DNA’yı sona bırakacak biçimde çoğaltarak, bölünmeye hazırlanıyor. Alt evreleri son derece iç içe girmiş olan interfaz evresini işlevsellik açisindan G1, S ve G2 alt evrelerine ayirmak yerleşmiş bir gelenek. Yani, hücrenin yaşam döngüsü bu üç evre ve M (mitoz)’dan oluşuyor. G1 evresi, DNA dişindaki bileşenlerin çogaldigi bir dinlenme dönemi. S, DNA’nin bölünmesiyle sonuçlanan bir geçiş evresi. G2 ise, iç gelişmenin tamamlanip, hücrenin mitoz yoluyla bölünmeye hazirlandigi süreci içeriyor. Hücrelerin hangi evreyi ne kadar sürede tamamlayacakları bir biçimde programlanmış durumda. Belli bir organizmanın tüm hücreleri bu evreleri aynı sürede tamamlıyorlar. Yine de, ani çevresel koşul değişiklikleri hücreleri G1 evresinde kıstırabiliyor; sözgelimi, besleyici maddelerin miktarı birdenbire minimum düzeye düştüğünde. G1 evresinin belli bir aşamasında, öncesinde bu duraklamaya izin verilen sabit bir kritik noktası var. Bu kritik nokta aşılırsa, çevresel koşullar ne yönde olursa olsun, DNA replikasyonunun önü alınamıyor. İleride göreceğimiz gibi, bu noktanın denetim altında tutulabilmesi, Wilmut ve ekibinin başarılı bir klonlama gerçekleştirebilmelerinin altın anahtarı olmuştur. Bu noktada bir parantez açarak G1, S, G2 ve M evrelerinin denetim altına alınmasının, hücrenin yaşam döngüsünü olduğu kadar, hücrenin özelleşmesini, sözgelimi beyinden veya kas hücrelerinden hangisine dönüşeceğini de kontrol altına alabilmeyi, bir başka deyişle, hücrenin genetik saatini sıfırlamayı sağladığını ekleyelim. Wilmut ve ekibi Dolly’i klonlayıncaya kadar bu sürecin tersinmez olduğu, söz gelimi, bir defa kas hücresi olmaya karar vermiş bir hücrenin yeniden programlanamayacağı zannediliyordu. Peki Wilmut bunu nasıl başardı? Soruyu tersinden cevaplayacak olursak, diğerlerinin bunu başaramamalarının nedeninin, kullandıkları somatik hücrelerin çekirdeklerini S veya G2 evrelerindeki konakçı hücrelere yerleştirmeleri olduğunu söyleyebiliriz. Eski kuramsal bilgilere göre bu yöntemin işe yaraması gerekiyordu, çünkü çekirdeğin mitoza yaklaşmış olması avantaj olarak görülüyordu. Ancak bu denemelerde, işler bir türlü yolunda gitmedi. Kaynaştırmadan sonra, hücre fazladan bir parça daha mitoz geçiriyor ve yararsız, kopuk kromozom parçaları meydana geliyordu. Bu "korsan" genler, gelişimin normal seyrini sürdürmesi için ciddi bir engel oluşturuyordu. Dersini çok iyi çalışmış olan Wilmut, bu olumsuz deneyleri değerlendirerek hücreyi G1 evresinin kritik noktadan önceki duraksama döneminde, "G0 evresinde" kıstırmaya karar verdi. Verici koyundan alınan meme dokusu hücrelerini kültür ortamında gelişmeye bırakan Wilmut, hücrelerin geçirdiği evreleri sıkı gözetim altında tutarak bir hücreyi G0 evresinde kıstırıp bu haliyle durağanlığa bırakmayı başarmıştı. Bunun için, hücrenin besin ortamını neredeyse öldürme sınırına kadar geriletmiş, tüm süreci dondurarak bir anlamda genetik saati de sıfırlayabilmişti. Üstelik bu evre, kaynaştırılacağı yumurta hücresinin mayoz gelişim sırasında girdiği, bu işlem için en uygun olan metafaz-II evresiyle de mükemmel bir uyum içindeydi. İşlemin diğer kısımları yemek tariflerinde olduğu kadar sıradan ve kolay uygulanabilir nitelikte. G0 evresindeki çekirdek metafaz-II evresindeki yumurtayla kaynaştırılıp, normal besin koşulları ve hafif bir elektrik şoku etkisiyle olağan çoğalma sürecine yeniden sokulduğunda, her şey tüp bebek olarak bilinen, in vitro fertilizasyon sürecindeki işleyişe uygun hale geliyor. Zigot, anne koyunun rahmine yerleştiriliyor ve gerekli hormonlarla normal hamilelik süreci başlatılıyor. Wilmut ve ekibinin gerçekleştirdikleri hakkinda bilinenler, yukarida kaba hatlariyla anlatilanlarla sinirli. Sürecin duyurulmayan kritik bir evresi varsa, bu ticari bir sir olarak kalacaga benziyor. Ancak, herkesin olup bitenler hakkinda ayni bilgilere sahip olmasi, deneyin başarisi konusunda kimsenin şüphe duymamasini gerektirmiyor. 277 denemeden sadece birinin başarili olmasi başta olmak üzere, çogu uzmanin takildigi pek çok soru işareti var. Herşeyin ötesinde, herhangi bir olgunun bilimsel gelişme olarak kabul edilmesi için, sürecin yinelenebilirliginin gösterilmesi gerekiyor. Bir embriyolog, Jonathan Slack, çok daha temel şüpheleri öne sürüyor: "Araştirmacilar, yumurta hücresindeki DNA’lari tümüyle temizleyememiş olabilirler. Dolayisiyla Dolly, siradan bir koyun olabilir." Slack, alinan meme hücresinin henüz tamamen özelleşmemiş olabilecegini, böyle vakalara meme hücrelerinde, bedenin diger kisimlarina göre daha sik rastlanilabildigini de ekliyor. Zaten Wilmut da, bedenin diger kisimlarindan alinan hücrelerin ayni sonucu verebileceginden bizzat şüpheli. Örnegin, büyük olasilikla kas veya beyin hücrelerinin asla bu amaçla kullanilamayacaklarini belirtiyor. Üstüne üstlük, koyun bu deneylerde kullanilabilecek canlilar arasinda biraz "ayricalikli" bir örnek. Koyun embriyolarinda hücresel özelleşme süreci zigot ancak 8-16 hücreye bölündükten sonra başliyor. Geleneksel laboratuvar canlisi farelerde ise ayni süreç ilk bölünmeden itibaren gözlenebiliyor. Insanlarda ise ikinci bölünmeden itibaren... Bu durum, ayni deneyin fare ve insanlarda asla başarili olamamasi olasiligini beraberinde getiriyor. Dile getirilen açık noktalardan biri de, hücrelerde DNA barındıran tek organelin çekirdek olmayışı. Kendi DNA’sına sahip organellerden mitokondrinin özellikle önem taşıdığı savlanıyor. Memeli hayvanlarda mitokondriyal DNA, embriyo gelişimi sırasında sadece anneden alınıyor. Her yumurta hücresi, farklı tipte DNA’lara sahip yüzlerce mitokondriyle donatılmış. Bu mitokondriler zigotun bölünmesinin ileri evrelerinde, embriyo hücrelerine dengeli bir biçimde dağılıyor; ancak, canlının daha ileri gelişim evrelerinde, bu denge belli tipteki DNA’lara doğru kayabiliyor. Parkinson, Alzheimer gibi hastalıkların temelinde bu mitokondriyal DNA kayması sürecinin etkileri var. Bu yüzden kimileri, sağlıklı bir kuzu olarak doğan Dolly’nin, zigot gelişimine müdahele edilmiş olması yüzünden sağlıksız bir koyun olarak yaşlanabileceğini öne sürüyorlar. Şimdilik Dolly’nin tek sağlıksız yönü, basına teşhir edilirken sabit tutulması amacıyla fazla beslenmesi yüzünden ortaya çıkan tombulluğu.

http://www.biyologlar.com/hayvan-ve-insan-kopyalama

Sitokinin (Cytokinin)

Stokininler (Cytokinin) bilim adamlarının bitkilerde hücre bölünmesi üzerine araştırmalar yaparken rastlantı eseri keşfettikleri bitkisel hormon grubudur.Sitokinin hücre bölünmesinde etkilidir ve bu fonksiyonunun yanı sıra bitkilerde üstlenmiş olduğu farklı rollerde mevcuttur. Sitokininler bitkilerde nutrient elementlerin dağıtımını,bazı bitki organlarının yaşlanmasını(Senesens) geciktirmeyi,bitki şekillenmesini ve kotiledonlarin gelişimini sağlar. Genel olarak bitkilerde bulunan en yaygın sitokinin hormonu 'Zeatin' hormonudur.Zeatinin kimyasal formülü 6-(4-hidroksi-3-metilbüt-trans-2 enil amino)purin 'dir.Zeatinin hormonunu Miller ve Letham isimli bilim adamlarının Zea mays (Mısır) bitkisi üzerinde yaptıkları çalışmalarda keşfetmişlerdir.Zeatinin bitkilerde hücre bölünmesini teşvik ettiğini bulmuşlardır. Stokininler sentetik olarak da üretilir ve 'Kinetin' adını alır.Kinetin doğal olarak da bulunur ve tütün bitkisinde yapılan araştırmalarda bulunmuştur,kinetin bitkilerde hücre bölünmesini hızlandırıcı etkiye sahiptir. Stokininler bitkilerde yoğunlukla bitki köklerinde sentez edilerek bitkilerde gerekli bölgelere ksilem dokusuyla iletilir. Stokininler hücre siklusunu(Döngüsünü) düzenler, mitoz bölünmenin ve DNA Replikasyonunun birçok fazını düzenleyici rol oynar. Bilim adamları doku kültürlerinde (laboratuar ortamında) bitki sekilenmesi ile ilgili yaptıkları deneylerde ,bitki kök-gövde oluşumunun kültür ortamındaki oksin/stokinin oranına bağlı olduğunu buldular.Oksin hormonu kinetine göre yüksek olduğunda bitki kökü oluşumunu teşvik eder,tam tersi durumda ise kök oluşumu baskılanır ve gövde oluşum hızı artar. Bitkilerde normal koşullarda sonbaharda yapraklar sararak dökülür.Bunu sebebi ise Bitkinin tüm besinsel ihtiyaçları düzgün karşılansa bile bitkide programlanmış olan döngü içerisinde yapraklardaki klorofil hücreleri yaşlanır(senesens) ve zamanla bu hızlanır ölüm gerçekleşerek yapraklar dökülür.Bu safhada yapılan araştırmalarda sitokinin oranının azaldığı gözlenmiştir.Stokinine maruz bırakılan bitkilerde hücre bölünmesini teşvik eder ve klorofillerin olgunlaşmasını sağlar.Bunların sonucunda da senesensi(yaşlanmayı) geciktirir.

http://www.biyologlar.com/sitokinin-cytokinin

DNA YAPISI VE ÖZELLİKLERİ

Bütün tek ve çok hücreli organizma ile bir kısım virüslerde genetik materyal DNAdır. DNA yapı ve özellikleri başlığı altında, DNAnın moleküler yapısı, deoksiriboz, fosfat ve pürin ve primidin bazlarının yapıları ve birbirleri ile verdikleri reaksiyonlardan başlanarak anlatılmaktadır.nükleozid, nükleozit fosfat, nükleotid ve nükleozid-tri-fosfatlar hakkında bilgi verilmekte, nükleozit-tri-fosfatların DNA polimerini oluşturma reaksiyonları, purin pirimidin eşleşme özellikleri anlatılmaktadır. DNA çift sarmalının özellikleri, çeşitli ortam koşullarında biarbirine dönüşebilen DNA formları hakkında bilgi verilmektedir. DNA replikasyonunun yarı koruyucu (semikonservatif) özelliği deneysel örnek verilerek; ökaryotik ve prokaryotik DNA replikasyonu basamakları karşılaştırmalı olarak ve görev alan proteinlerle ilgili bilgileri de kapsamak üzere açıklanmaktadır. Ayrıca bu başlık altında DNA hasar tipleri, bunlara neden olan etkenler ve tamir mekanizmaları açıklanmakta; genom DNAsının farklı bölgeleri (tekrar dizinleri, gen aileleri, satellit DNA, gen kontrol bölgeleri, sessiz bölgeler gibi terimlere de açıklık getirilerek) ayrıntılı bir sınıflandırma yapılarak anlatılmaktadır. Gen aktivitelerinin ayarlanması (Genetik kontrol mekanizmaları) Çok hücreli bir organizmdeki bütün hücreler aynı genoma sahiptirler. Ancak, bu hücrelerdeki gen ürünleri ve bu ürünlerin düzeyleri hücreden hücreye, ya da aynı bir hücrede bir andan diğerine farklılık göstermektedirler Hücrelerin özelleştikleri fonksiyonlara ve o andaki gereksinimlere uygun ürünleri, uygun düzeylerde bulundurdukları gözlenmektedir.çok ya da tek hücreli organizmalarda her bir hücredeki gen ifadesi çeşitli mekanizmalarla ayarlanmaktadır.Bu kontrol mekanizmaları. Tek hücrelilerin çevre koşullarına; çok hücrelilerde ise hücrelerin birbirlerine uyumunu sağlamaktadır. Konunun kapsadığı alt başlıklar şunlardır: Bakteride enzim (protein) sentezinin ayarlanması, 1)Laktoz operonu örneğiyle anabolik/katabolik operon; konstitutif (zorunlu)/fakültatif (seçimli) enzim; katabolit aktivator proteini; indüktör; regülatör bölge; triptofan operonu örneğiyle, repressör; korepressör; son ürün inhibisyonu, genetik polarite terimleri ve mRNA düzeyinde genetik kontrol mekanizması, 2) arabinoz operonu örneği üzerinden ise gen aktivitesinin, gen ürünü tarafından negatif /pozitif kontrolu; RNA yapısına bağlı; küçük RNAlar ya da ribozomal proteinler veya alarmonlar aracılığı ile translasyon düzeyindeki kontrol ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Ökaryotlarda gen aktivitesinin ayarlanması ise, 1)Duplikasyon ya da amplifikasyon, 2)Metilasyon/demetilasyon v.b yollarla selektif gen inaktivasyonu/aktivasyonu, 3)Gen yeni düzenlenmeleri (rearrangement) ile kontrol, 4)Arttırıcı (enhancer) ve susturucu (silencer) DNA bölgeleri ile aktivite ayarlanması, 5)Posttranskripsiyonel kontrol ve 6)Hormonal kontrol ikincil başlıkları ile anlatılmaktadır. Mitoz ve amitoz bölünmeler Girişte, bilinen hücre bölünmesi tiplerinin genel sınıflandırması ve tanımları yapıldıktan sonra, insan dahil çok hücrelilerin kimi hücrelerinde normal olarak, kimi hücrelerinde ise kanser ya da çevre koşulları nedeniyle normal dışı gerçekleşen amitoz bölünme kısaca anlatılmaktadır. Konunun devamında ayrıntılı olarak, hücre döngüsü,ve bu döngünün G1, G0, G2, S (DNA biyosentezi) ve M (mitoz) bölümleri; mitoz bölünme fazların ve bu fazlar sırasında hücrede gerçekleşen moleküler olaylar, çekirdek ve hücreye ait hareket ve değişimler, ayrıca mikrotübüllerin yapımı, moleküler yapıları, S ve M fazlarına geçişleri kontrol eden moleküller ve çalışma prensipleri anlatılmakta; hücre döngüsü sırasında her bir basamakta hücrenin DNA düzeyi (n, 2n, 4n), çeşitli proteinlerin düzeylerindeki değişiklikler; kromozom, kromatid, sentromer, kinetokor, metafaz ve interfaz kromozomu ile kardeş kromatid değişimleri üzerinde durulmaktadır... Mayoz bölünme, ovogenez ve spermatogenez Mayotik bölünme, ovogonyal ve spermatogonyal kök hücrelerin ard arda geçirdikleri mitoz bölünmeler sonucunda oluşan ve özel moleküler sinyallerle uyarılan hücrelerin bir S fazı sonrasında geçirdikleri ard arda iki bölünmeyi (mayotik I. Ve Mayotik II. Bölünmeler) kapsar, birinci bölünme daha uzun sürmekte ve kendine özgü alt fazları, tamir mekanizmaları, sinaps, kiazma, krossing/over ve gen dönüşümü (gene conversion), sentromer bölünmesinin olmaması gibi olay ve özelliklerle mitoz bölünmeden ayrılır. İkinci bölünme ise mitoz bölünmenin aynıdır. Mayotik bölünmenin en önemli sonuçları, türe özgü kromozom sayısının korunması ve rekombinantların orta çıkmasıdır... Konu, birbirine paralel çizilmiş mitoz bölünme, mayoz bölünme, ovojenez ve spermatojenez şemaları üzerinden karşılaştırmalı ve ayrıntılı olarak sunulmakta, bu olaylar sırasında gerçekleşen hücre ve kromozom hareketleri, kromozom ve gen hareketlerinin ilişkileri, bu hareketlerin ovojenez ve spermatojenezdeki zamanlamaları ve farklılıkları üzerinde durulmaktadır... Mozaiklik ve şimerizm Bu başlık altında, aynı bir organizmde, farklı kromozom kuruluşlu hücrelerin birlikte bulundukları mozaiklik (mikzoploidi) ve şimerizm (freemartinizm) karşılaştırmalı olarak ele alınmakta, oluşum mekanizmaları, oluştukları düzeyler (gametik, zigotik, somatik gibi) ve bunlara göre etkileri, ayrıca mozaikliğin özel bir tipi olan Lyonizasyon ve kromozom sapmalarının saf formlarının oluşturdukları etkilerle karşılaştırmalar yapılmaktadır. Mendel Genetiği Konunun girişinde, Genetiğin babası olarak adlandırılan Mendel’in yaptığı deneyler, elde ettiği sonuçlar, başarılı olmasını sağlayan etkenler ve Mendel’in sonuçlarından, günümüzdeki DNA; gen; hücre bölünmeleri; kromozom hareketleri ve kalıtım arasındaki ilişkiler anlayışına ulaşılana kadar yapılanlar kısaca özetlenmektedir. Daha sonra, mayotik kromozom hareketleri ile allellerin ve farklı genlerin hareketleri karşılaştırılarak Mendel’in birinci ve ikinci kuralları verilmektedir... gen, allel, hibrit, parental döl, filial döl, çaprazlama, genotip, fenotip gibi terimler konunun akışı içerisinde açıklanmakta, genotiplerden gametlerin saptanması, mono-, di- ve trihibrit çaprazlama, kendileştirme, test çaprazlaması, çaprazlama tablolarının hazırlanıp, sonuçların değerlendirilmesi örnek problem çözümleri ile anlatılmaktadır. Alleller arasındaki ilişkiler (dominantlık, intermedier kalıtım, multipl allelizm gibi alt başlıklarla), farklı genler arasındaki ilişkiler (epistasi, modifikatör,süpressor genler letal genler gibi alt başlıklarla) ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca bağlı (linked) genler ile krossing/over ilişkisinden yararlanılarak, incelenen genlerin kromozom üzerinde birbirlerine göre yerleşimlerinin bulunması, örnek problemlerle anlatılmaktadır. DNA metilasyonu Çoğu ökaryotik organizmanın DNAsı, replikasyon sonrasında bir takım değişikliklere uğrar. Bu değişikliklerden biri de baz metilasyonudur. Metilasyona uğrayan baz genellikle CG (sitozin_guanin) ikililerindeki C bazıdır. DNA metilasyonundan sorumlu enzimlerin genel adı, metil transferazlardır. C metilasyonu gen ifadesinin kontrolunda rol oynayan mekanizmalardan biridir. Bu konu başlığı altında, gen aktivitesinin kontroluyla ilgili metilasyonun DNA daki yerleşimi, nasıl rol oynadığı, DNA metilasyonu ile sınırlayıcı (restriction)enzimlerinin ilişkilerinden yola çıkılarak DNA metilasyonunun incelenmesinin temel prensipleri, bu inceleme metodlarının, onkogenlerin demetilasyonları ya da tümör supressör genleri metilasyonu ile ortaya çıkabilen kanser tiplerinin ve başka hastalıkların tanı ve sınırlı da olsa tedavisinde yararlı olabileceğini gösteren bulgular tartışılmaktadır... Hücreler arası haberleşme Tek hücrelilerde gözlenen fototaksi, kemotaksi gibi hücre-çevre ya da feromenler aracılığı ile olduğu gibi hücre-hücre haberleşmesi, çok hücrelilerde daha da gelişmiş ve karmaşıklaşmış bir organizma içi sosyal kontrol mekanizması şeklinde karşımıza çıkmaktadır. Hücreler arası haberleşme, büyüme; yaşama; çoğalma; ölüm v.b. olayların düzenlenmesini ve hücreler arasındaki koordinasyonu sağlar. Konunun akışı içerisinde, sinyal molekülleri (ligandlar), alıcı moleküller (reseptörler)in çeşitler, özellikleri ve çalışma mekanizmaları, hücreler arası haberleşmenin genel prensipleri, sinyal kaynağı ve hedef hücrelerin özelliğine göre haberleşme tipleri (parakrin, sinaptik, endokrin ve otkrin haberleşme gibi), hücre içerisindeki sinyal akışı ve enerji kullanımı modelleri ile hücresel aktivitelerin, diğer hücrelerin aktiviteleri ile uyumluluğunun nasıl sağlandığını gösteren örnekler konu kapsamına alınmıştır.      

http://www.biyologlar.com/dna-yapisi-ve-ozellikleri

DNA Sentezindeki Katalizörler ve Replikasyon Merkezleri

KORNBERG ve arkadaşları tarafından, 1957 yılında, DNA'nın ilk defa Escherichia coli'den izole edilen 'DNA polimeraz' denen bir enzim sistemi tarafından katalizlendiği bulunmuştur. Bu enzim, deoksinukleotit yapı taşlarını 3'-5' yönünde okuyarak, 3'-5' fosfodiester bağlarıyla birbirine bağlar. Dolayısıyla yeni oluşan poli-deoksinukleotit dizisi 5'-3' yönünde gelişir. DNA polimeraz, kendi başına yalnız nukleotitlerin şeker ve fosfat gruplarını tanıyabilir. Bazların hangi sıraya göre dizilmeleri gerektiğini bilemez. DNA polimerazın, düzenli bir sentezleme için, substrat olarak dört çeşit deoksinukleozidin trifosfatına (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP), magnezyum iyonlarına, tepkimeler için kalıp ve alfabe görevi yapacak DNA polimerinin bir kısmına gereksinimi vardır. Tepkimenin sonunda DNA polimeri ve tepkimeye katılan her deoksiribonukleotit için bir molekül pirofosfat meydana gelir. Mitokondriyal DNA replikasyonunun, çekirdekteki DNA replikasyonundan farklar gösterdiği varsayılmaktadır. dATP DNA Dgtp Mg++ N à DNA + nPP dCTP DNA polimeraz dTTP Bakteriyofaj (T2) DNA'sının replikasyonu, yaklaşık her üç dakikada bir olmaktadır. Yanı, faj DNA'sındaki 8 x 104 kıvrım, 3 dakika içerisinde çözülmektedir. Bu ise mekanik ilkeler ve enerji yönünden çok zor görülmektedir. Bu nedenle çeşitli modeller yada modellere ilave yeni görüşler ileri sürülmektedir. Büyük bir olasılıkla DNA'nın kolları bir fermuarın açılması gibi bir uçtan, yada reptikatör denen birkaç yerden birden birbirinden ayrılmakta ve ayrılan kollar kendini replike ederek statik durumlarını sürdürebilmektedir. iyon derişiminin değişimi ile DNA zincirinin belirli bölgelerinde açılım sağlanabilmektedir. Replikalûrler, DNA üzerinde, metillestirilmis dizilim ile işaretlenebilmekte ve bu replikatörlerden itibaren, DNA zinciri kollarının açıldığı görülmektedir. Bu noktalar, replikasyon merkezleri olarak bilinmektedir. Replikasyon merkezleri, bakterilerde, mesosom denen belirli bir zar bölgesiyle, memeli hayvanlarda ise çekirdekteki bir zar bölgesiyle temas halindedir. Yavaş çoğalan bakterilerde, DNA üzerinde kural olarak ancak bir replikasyon merkezi, hızlı çoğalanlarda ise hıza bağlı olarak daha fazla replikasyon merkezi bulunur (6 kadar olabilir). Bu ise, DNA replikasyon hızının değişmediğini, ancak çoğalan zincir sayısının değiştiğini gösterir. Eskiden DNA'nın çoğalması ile hücre bölünmesinin aynı zamanda yürütüldüğüne inanılmaktaydı. Gerçekte DNA sentezinin zaman olarak hücre bölünme süresini aştığı gözlenmiştir.

http://www.biyologlar.com/dna-sentezindeki-katalizorler-ve-replikasyon-merkezleri

Kromozomların Yapısı ve Replikasyon

DNA moleküllerinin hücre içerisinde en büyük makromoleküllerden olduğu anlaşıldıktan sonra bu moleküllerin hücre içerisindeki sitoplazmaya veya nukleusa nasıl sığdıkları akla gelmiştir.Örneğin en uzun insan kromozomunun 85 mm,haploid dna miktarının 2,75x109 bç(baz çifti) ve bununda yaklaşık olarak 94 cm uzunluğundadır.Mısırda 2,74x109 bç olduğundan 93 cm’ye yaklaştığı,zambak bitkisinin en büyük genoma sahip olduğu 3x1011 bç bu da yaklaşık olarak 100 m olduğu hesaplanmıştır.Bir prokaryot olan E.coli ise DNA 4,6x106 bç yaklaşık 1,4 mm uzunluğuna eş geldiği hesaplanmıştır.1 nukleotidin 3,4Ao olduğu hesaplanmıştır(0,34 nm).Bunlar sarmal yapıya,sarmal yapılarda süper sarmal halini alarak yerden kazanmayı sağlamışlardır.Histon proteinleri bu sarmal yapının oluşumunu sağlar. Bunlar aynı zamanda replikasyon ve transkripsiyon olaylarında da histon proteinleri yer alır. E.coli’de histon yoktur.Histon benzeri proteinler vardır.E.coli bakterileri üzerinde çalışma yapmak çok kolaydır.Çünkü bunların DNA’ları paketler halinde değil halkasaldır.Bunlar 7 saatte 1 tane bakteri 1.000.000’a ulaşmaktadır.Fazla yer kaplamazlar.Ekonomiktir. Replikasyonda DNA’nın kopyası yapılacaktır.Bunun yapılabilmesi mitoz ve mayoz olaylarına bağlıdır.Bu mekanizmanın gerçekleşebilmesi için Nükleotid,enzim ve DNA sentezi için bir kalıp DNA’ya ihtiyaç vardır. DNA Replikasyon Modelleri İlk olarak Watson-Crick’in sundukları DNA modeli aslında ifade edilmişti.Bu araştırmacılar DNA replikasyonunun Semikonservatif olması gerektiğini söylemiştir.Fakat farklı araştırmacılar Farklı DNA modelleri üzerinde durmuşlardır.Sonuçta 3 DNA replikasyon modeli ortaya konulmuştur. 1)Semikonservatif(Yarı Korunmuş) 2)Konservatif(Korunmuş) 3)Dispersif(Karışık) Günümüzde geçerli olan Meselson ve Stahl,1958 yılında deneysel olarak kanıtlanmış Semikonservatif DNA replikasyon modelidir.Bunlar E.coli bakterilerini tek besin maddesi 15NH4Cl içeren besi yerinde çoğalmaları sağlanıyor.Burada büyütüldükleri zaman DNA olarak ağır izotop içeren DNA’lar içeriyorlar(Bu radyogram ile tespit ediliyor).   Modellere göre ayrı ayrı yukarıdaki sonuçlar tahmin edilmiştir.Fakat her generasyonda bakteri kültürleri santrifüjden geçirilerek bakterilerdeki radyoaktiviteyi ölçmüşlerdir. İzole edilen DNA’lar santrifüjden geçiriliyor. Santrifüj tüpünden Ağır DNA molekülleri tüpün altında yer alıyor.Bir ağır bir hafif DNA içerenler ortada kalıyor.Üstte ise hafif DNA lar kalır.Sıfır generasyonda radyoakti-vite dipte,1 generasoynda tüpün orta kısmında bir kısmı ise dipte olduğu fark ediliyor.Bu çalışmada DNA’ların replikasyonda bir eski bir yeni zincir alacağı gözlemleniyor.Replikasyon enzimatik olarak yürür.DNApolimeraz enzimi tarafından yürütülür ve ilk kez Arthur Kornberg tarafından E.coli’den izole edilmiştir.Bu buluş moleküler biyolojide devrim niteliğindedir.Çünkü DNA sentezinde rol oynaya enzim elde edilmiştir.DNA sentezinde metdana gelen reaksiyonlar:             d(NMP)n + dNTP + Kalıp DNA àd(NMP)n+1 + PPi                 DNA replikasyonu gerçekleşmesi için öncelikle bir kalıp DNA’ya ihtiyaç vardır.Bu kalıp DNA’ya RNA’dan oluşan 4-6 nükleotidlik bir polinükleotide ihtiyaç vardır.DNA polimeraz enzimi ancak primer oluştuktan sonra primere bağlanarak replikasyonu devam ettirir.Primer DNA zincirine Primaz adı verilen enzimler bağlanır.Primerler oluştuktan sonra DNA polimeraz enzimi Primere bağlanarak onun 3’OH Ucundan başlayarak yeni nükleotidleri Watson-Crick modeline göre yerleştirir.DNA sentezinin bir yönü vardır(5’à3’). Bunun nedeni DNApolimerazın 3’ ucuna bağlanabilmeleridir.Arthur’un bulduğu enzim DNApolimeraz I olarak adlandırılır.Daha sonraki çalışmalarda DNApolimeraz II ve III enzimleri bulunmuştur.Bu 3 enzimde DNA sentezini 5’à3’ yönünde yaparlar ve aynı zamanda bu 3 enzim ekzonükleaz dediğimiz DNA’nın uç kısmını kesme aktivitesi gösteren enzim yapısına sahiptirler.DNApolimeraz II ve III enzimleri ekzonükleaz aktivitesini 3’à5’ yönünde gösterirler.DNApolimeraz I ise Her iki yönde ekzonükleaz aktivitesini gösterebilir.E.coli bakterisinde DNA replikasyonu gerçekleştiren esas enzimin DNApolimerazIII olduğu,DNApolimerazI ise daha çok DNA sentezi sırasındaki hataları giderici görev yaptığı anlaşılmıştır.DNApolimeraz II enziminin işlevi anlaşılamamıştır. Yapısal olarak bakıldığı zaman DNApolimeraz III enziminin oligometrik olduğu,DNA polimeraz I ise monomerik olduğu anlaşılmıştır.             Prokaryotlarda Replikasyon             Prokaryot organizmalarda DNA(Kromozomal DNA) çift zincir sarma yapılı ve çembeseldir.E.coli bakterisi üzerinde yapılan replikasyon çalışmalarında,replikasyonun DNA zincirinde her iki zincirde aynı anda başladığı ve aynı yöne ilerlediğini göstermiştir.               Okazaki,replikasyon üzerine yaptığı çalışmalarda DNA sentezinin zincirlerden birisinin üzerinde parçalı ya da kesintili olduğunu fark etmiş. “lagging” zünciri üzerindeki parçalı DNA’ya Okazaki fragmentleri adı verilmektedir.Detaylı çalışmalar sonunda replikasyonun sadece 5’ den 3’ e doğru olduğu iyice anlaşılmıştır.             DNA sentezi iki şekilde meydana gelir.5’ den 3’ e çatal yönünde,5’ den 3’ e çatalın ters yönünde.DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz I,II ve III enzimleri replikasyonu tek başına başlatamıyor.Bunların özelliği DNA zincirindeki bir primere bağlanarak onun uzatılmasından ibarettir.Yapılan çalışmalarda bütün canlılarda DNA replikasyonu sırasında kullanılan enzimlerin 4-6 nükletidden oluşan enzimler olduğu anlaşılmıştır.Akla gelen soru primerler DNA zincirine nasıl bağlanır?Bu görevi üstlenen bir enzim vardır ve primaz olarak adlandırılır.Bu enzim kendisi DNA zincirine yardımcı olan diğer proteinlerle birleşerek primozom adı verilen yapıları oluştururlar.Bir primozom kalıp DNA’ya bağlanır ve kalıp DNA üzerinde 5’à3’ yönünde hareket eder.Bu hareketi sırasında belli aralılarla durarak bir adet primer sentezi yapar ve daha sonra yoluna devam eder.Daha sonra DNA polimeraz enzimleri bu primerleri kullanarak DNA replikasyonunu devam ettirirler.DNApolimeraz I enzimi primerleri kaldırarak yerine DNA nükleotidlerinin yerleştirir ve daha sonra boş kalan ya da ayrı kalan nükleotidler birbirlerine DNAligaz enzimi tarafından yapıştırılırlar.Devam eden araştırmalar replikasyon işleminin sanıldığında da karmaşık olduğunu ve bu replikasyon sırasında pek çok protein veya enzimin görev aldığını göstermiştir.örneğin DNA polimeraz I,II,III,DNAligaz,primaz gibi enzimlerin yanında görevlerinin çift zincirleri birbirinden ayrı tutmak olan sarmal yapıyı giderici olan proteinlerde ve enzimlerinde görev aldığı bulunmuştur.Replikasyon sırasında görev alan enzimlerden helikaz enzimi DNA’daki sarmal yapıyı giderici ve zincirleri birbirinden ayıran enzimdir.SSB proteinleri ise ayrılmış olan DNA zincirine bağlanarak onların tekrar çift zincir oluşturmalarını engeller.DNAgiraz enzimi ise topoizomeraz enzim olup bakterilerde bulunur.Replikasyon sırasında sarmal yapının tekrar oluşmasını engeller.DNAligaz enzimi DNA zincirindeki 3’ – OH ile 5’ – PO4-2 fosfodiester bağlarıyla birbirine bağlar.

http://www.biyologlar.com/kromozomlarin-yapisi-ve-replikasyon

Dünyanın En İyi Korunan Veri Bankası: DNA

Lineer kromozomların sonlarında, tekrar eden DNA dizilimleri vardır. Bu dizilimlere, Telomeres adı verilir. Telomeres’lerin önemli bir fonksiyonu bulunur. Savunmasız kromozom sonlarını, moleküler saldırılardan korurlar. Ancak, telomereslerin kendilerinin de bir korumaya ihtiyaçları vardır. Telomeresler, düzensiz genom parçacıklarına benzerler. Ancak, onları bir arada tutan bir protein vardır. Bu protein DNA replikasyonunun kromozom sonuna kadar kusursuz bir şekilde işlenmesi ile sorumludur. TRF1 isimli bu protein, shelterin isimli altı proteinli bir yapının parçasıdır. Bu protein, telomeresler boyunca DNA replikasyonunun hatasız çalışmasını sağlamak için özel olarak yaratılmıştır. Bu proteinin bulunmaması durumunda, telomeresler savunmasız kalacak, DNA replikasyonu tamamlanamayacaktır. DNA, son derece hassas dengelere dayalı bir sisteme sahiptir. Bu sistemde, replikasyonun tamamlanaması gibi en ufak bir aksaklık, kanser gibi çok ciddi hastalıklara yol açar. TF1 isimli protein, genetik çoğaltmanın (replikasyonun) devam etmesi için adeta tüm engelleri ortadan kaldırmaktadır. Bilindiği üzere, DNA’da çok sayıda tamir mekanizması bulunmaktadır. Bu protein ile birlikte, DNA’da sadece mutasyonlara ve dış etkenlere karşı tamir mekanizmalarının değil koruma mekanizmalarının da bulunduğu keşfedilmiştir. Bu, son derece önemli bir bilgidir. Dünyanın en iyi yazılım programlarının bile, açıkları vardır. İçlerindeki bilgiler kolaylıkla hasara uğrayabilir, veri kaybı yaşanabilir ya da heklenebilir. Bu durumu önlemek için, geliştirilen her antivirüs programı düzenli güncellenmek zorundadır. Çünkü veri bankasına yapılan saldırılar, sürekli güçlenir. DNA’da da durum aynıdır. DNA, dünyanın en büyük veri bankasıdır. Ve dünyadaki en iyi yazılım programlarından bile daha korunaklıdır. Bir bilgisayarın işlem kapasitesi ile DNA’nın işlem kapasitesi arasında elbette ki kıyas yapılamaz. DNA, her saniye kendini kopyalamaktadır. Verilerini sürekli aktarmakta, sürekli işlem yapmakta ve hayatımız boyunca bir an bile durmadan dinlenmeden çalışmaktadır. O hiç durmadan çalışırken, sürekli saldırılar olur. Moleküler saldırılar, DNA’yı heklemeye, şifresini kırmaya ve sarmallarındaki bilgilerin arasına sızmaya çalışırlar. Ancak, ne kadar sızmaya çalışırlarsa çalışsınlar, bu imkansızdır. Çünkü DNA, hem tamir mekanizmalarıyla hem de TRF1 proteinin de olduğu gibi çok özel koruma sistemleriyle donatılmıştır. Üstelik, herhangi bir güncelleme yapmak da gerekmez. Sistem, hatasız ve açıksız olarak kusursuzca işler. DNA gibi ufacık bir bilgi parçasında, her biri ince ince işlenmiş böyle yüz binlerce detay vardır. Evrimciler tarafından, insan vücudunda kusurlu zannedilen pek çok mekanizma ve sistemin son derece detaylı olarak yaratılması çok özel bir durumdur.

http://www.biyologlar.com/dunyanin-en-iyi-korunan-veri-bankasi-dna

DNA Replikasyonu

DNA, bazı virüsler hariç, tüm canlıların genetik maddesidir. Hücresel aktiviteyi yönlendiren bir program ihtiva eder. Bu program RNA da kopya ve proteinde tercüme edilir. DNA ilk defa 1869'da F. Miescher tarafından beyaz kan hücrelerinde bulunmuştur. Önceleri DNA'nın sadece hayvansal, RNA'nın da sadece bitkisel hücrelerde bulunduğu zannedilmiş, fakat yıllar sonra hem DNA ve hem de RNA'nın her iki hücre çeşidinde de bulunduğu anlaşılmıştır. 1944'de O. Avery ve arkadaşları, saf DNA'nın, zararsız R-tipi pnömokokun virulen S-tipi haline dönüşmesine sebep olduğunu bildirmelerinden sonra, DNA'nın genetik bir madde olduğu ortaya çıkmıştır. 1952'de A. Hershey ve M. Chase, bazı virüslerin bakterileri, DNA'larını bakteri içine dış kılıflarını ayırmak suretiyle yerleştirerek enfekte ettiklerini bulmuştur. Bu sırada E. Chargaff, DNA'nın baz kompozisyonunun türden türe değişiklik gösterdiğini, fakat adenin /timin ve guanin /sitozin oranının bütün türler için hemen 1.00 olduğunu göstermiştir. Nihayet J. Watson ve F.H.C. Crick, DNA'nın çift helezon yapısını ortaya koymuştur. DNA'nın Semikonservatif Replikasyonu DNA replikasyonunun çeşitli modelleri vardır: "Semikonservatif" replikasyon modelinde yeni meydana gelen her bir DNA çifti, ana DNA'dan bir şerit ihtiva eder. Veya DNA replikasyonu "dispersif" bir mekanizma ile olur. Bu mekanizmada ana DNA'nın iki şeridi birden, rasgele dağılır ve yeni yapı, ana DNA'yı değişik miktarlarda ihtiva eder. Yahut ta replikasyon konservatif olabilir. Bunda da orijinal ana yapı bütünlüğünü muhafaza eder ve yeni DNA çifti, orijinalden farkı olmayan 2 şerit ihtiva eder. Şekil 29.1 bu 3 çeşit replikasyon modelini göstermektedir. DNA Polimeraz Bu enzim, bir primer ve kalıp görevi yapan bir DNA şeridi mevcut olunca dezoksiribonukleosid trifosfatın polimerize olmasını katalize eder. Kalıp DNA şeridi, daima adenin timin ile ve guanin de sitozin ile eşleştiğinden yeni sentezlenmiş zincirin sırasını belirler. Kalıp şerit, henüz olgunlaşmamış zincire eklenecek nükleotidil artığını tayin ettiğinden, DNA polimeraz DNA ya yöneliktir. Bu primer, bir köşebent görevi yapar. Zincir daima 5'-3' yönünde büyür. Büyüyen zincirin fosfodiester bağları, bu zincirin terminal kısmındaki 3'-OH grubunun, dezoksinükleosid trifosfatın pirofosfatını yerinden oynatarak α-fosforu üzerine nükleofilik saldırısını gerçekleştirmesiyle teşekkül eder. Bu reaksiyon bir "nükleotidil transfer" reaksiyonudur. Şekil 29.2, DNA polimeraz aktivitesi için gerekli kalıbı ve primeri göstermektedir. A. E. colinin DNA Polimerazları E. coliden izole edilen 3 DNA polimeraz vardır. Bir E. coli hücresi yaklaşık 400 molekül DNA polimeraz I, 40 molekül DNA polimeraz II ve 10 molekül DNA polimeraz III ihtiva eder. DNA polilimerazlar birden fazla katalitik aktiviteye sahiptirler. 5'-3' yönünde fosfodiester bağını katalize ettikten başka, DNA polimeraz I ve III 3'-5' ekzonükleolitik parçalanmayı da katalize eder. Ayrıca DNA'nın 5'-3' ekzonükleolitik ve endonükleolitik parçalanmasını da katalize ederler. DNA polimeraz II sadece 3'-5' ekzonükleolitik aktiviteye sahiptir. DNA replikasyonundan sorumlu başlıca enzim DNA polimeraz III'tür. DNA polimeraz I, Zn (II) iyonu ile sıkı sıkıya bağlı olup aktivitesi için Mg (II) gereklidir. DNA polimeraz I'in aktivitesi, tabii haldeki enzimin tek bir polipeptid zincirinde görülür. DNA polimeraz I, II ve III'ün 3'-5' ekzonükleaz aktivitesi düzeltici bir fonksiyona sahiptir. Büyümekte olan DNA zincirinde yanlış baz çiftleşmesi oluyorsa yani karşı karşıya gelen bazlar, Watson-Crick'in (adenin-timin) ve (guanin-sitozin) kuralına uymuyorsa, 3'-5' ekzonükleaz aktivitesi, fosfodiester bağını hidrolize ederek yanlış bazı zincirden uzaklaştırır. DNA polimeraz I'in yanılma oranı 1/100.000 dür. Bu suretle DNA polimerizasyonu olayı, kendi kendisini düzeltebilen bir olaydır (Sekil 29.3). 5'-3' nükleaz aktivitesi de DNA biyosentezinde düzeltici görev yapar. Bu enzim, bir oligonükleotidi 10 parçaya kadar ayırır. 5'-3'-endonukleaz aktivitesi ultraviyole radyasyondan ortaya çıkan timin dimerini ayıramaz. 5'-3' endünokleolitik aktivite timin dimerini ayırdıktan sonra meydana gelen eksiklik DNA polimeraz tarafından doldurulur. 5'-3' nükleolitik aktivite bir parçayı çıkararak, 3'-5' ekzonükleolitik aktivite ise düzelterek görev yapar. DNA'nın düzeltilmesinden DNA polimeraz I sorumludur. DNA polimeraz III'ün vivo DNA replikasyonunu gerçekleştirir. B. Ökaryotik DNA Polimerazlar Hayvansal hücrelerde α-, β- ve γ- ile gösterilen 3 DNA polimeraz bulunur, α- ve β- nükleusta, γ- ise mitokondride yer alır. α-DNA polimeraz, kromozomların replikasyonunda DNA biyosentezini sağlar. Oysa bu olayda β-DNA polimeraz önem taşımaz, fakat hatalı DNA'yı düzeltir. Miktarı α-formuna göre 1/10 kadardır. γ-DNA polimeraz ise mitokondride DNA replikasyonundan sorumludur. Prokaryotik hücrelerdeki DNA polimerazların aksine hayvansal DNA polimerazların hiçbiri ekzonükleolitik aktiviteye sahip değildir. E. coli'de DNA Replikasyonu A. E. coli Kromozomunun Yapısı ve Bakteri Hücresi E. colinin ana kromozomu, tek bir dairesel DNA molekülünden ibarettir. Bu molekül bakteri hücresinin içinde "nükleoid" denen bir boşluğa yoğun bir şekilde yerleşir. Nükleoid membrana bağlı değildir. E. coli ve birçok diğer bakteriler "plazmid" denen küçük kromozomlara sahiptirler. Plazmidler, en az 3 proteini, en çok ta toplam hücre proteininin %20'sini kodlayabilen genleri ihtiva ederler. Plazmidlerin her hücrede 50'ye kadar kopyası bulunabilir ve plazmid DNA sı, ana kromozomdan bağımsız olarak replike olur. E. coli hücreleri, 20-60 dakikada bir replike olur. Hücre bölünmesi olayı birkaç aşamada gerçekleşir: 1. DNA replikasyonu 2. İki kromozomun ayrılması 3. Fizyolojik bölünme 4. Hücrenin ayrılması Herhangi bir sebeple DNA sentezi durursa, hücre de bölünmez. B. Tek Bir Orijinden 2 Yönlü Replikasyon E. coli kromozomunun semikonservatif replikasyonu için birkaç ihtimal vardır 1. Dairesel kromozom, dairenin açılan bir ucundan diğerine lineer bir DNA replikasyonu şeklinde olur. 2. Replikasyon, dairesel kromozomun bir noktasından başlayıp, tüm kromozom kopya edilinceye kadar tek yönde devam edebilir. 3. Replikasyon, dairesel kromozomun tek bir noktasından başlar ve tüm kromozom kopya edilinceye kadar 2 yönlü olarak devam edebilir. DNA replikasyonu, E. coli kromozomunda "ilv geni" nin yakınında bir noktadan başlar. Bu gen; izolösin ve valin biyosentezinden sorumlu enzimleri kodlar. Bu noktaya ''replikasyon başlangıcı" denir. DNA sentezi saat yelkovanı ve aksi yönünde ve aynı hızda meydana geldiğinden, DNA sentezi, başlangıç noktasına göre iki zıt yönde "trp geni" yakınında son bulur. Bu gen de triptofan biyosentezini gerçekleştiren enzimleri kodlar. C. DNA Replikasyonu 5 aşamada olur: 1. Parental çift helisinin açılması. 2. Bir oligonükleotid primerinin sentezi 3. DNA-zincirinin 5'-3' yönünde büyümesi 4. Primerin çıkması 5. Yeni sentez edilen DNA zincirinin birleşmesi. a. Parental Çift DNA Helis Kıvrımlarının Açılması E. coli kromozomunun 4 x 106 baz çifti in vivo 40 dakikada (37°C'de) replike olur (Dakikada 50.000 baz çiftinin replikasyonu) Bu olaya birkaç protein yardımcı olur. Helisin kıvrımlarını açan proteine "helikal denir. Bu protein, tek şeritli DNA ya sıkı sıkıya bağlanarak açılmayı kolaylaştırır. "DNA-giraz"ı DNA'nın negatif aşırı kıvrımını sağlar. Yeni bir DNA şeridi sentez edildikten sonra DNA giraz da replike olmuş DNA'nın tekrar tabii haline kıvrılmasına yardımcı olur. Önceleri DNA açılmasını sağlayan enzim olarak bilinen ve diğer bir helikaz olan "rep protein" şeridin ayrılmasını temin eder. Rep protein, DNA'yı ATP'den güç alan bir olayda denatüre eder (rep protein ismi, DNA replikasyonu vuku bulacak E. coli kromozomunda gerekli geni ifade eden bir genetik isimdir). rep protein, fibröz kümelenmeler teşkil eder. b. Oligonükleotid Primerlerinin Sentezi. DNA polimeraz aktivitesi için hem bir primer ve hem de üreyen bir şerit gerektirir. Bir defa DNA kıvrımı açıldıktan sonra spesifik bir RNA polimeraz (primaz), replikasyonun başlangıcını temsil eden kromozom DNA sının özel bir bölgesini tamamlayıcı kısa bir şerit sentez eder (Şekil 6). Primaz, genetik kodun tercümesinden sorumlu RNA-polimerazdan farklı olup, bu enzim E. colinin "dnaG proteini" olarak identifiye edilmiştir. DNA replikasyonunun başlangıcında bir primer RNA sentezinin anahtarı "dnaB proteini" dir. Her bir hücrede 20 molekül kadar dnaB proteini vardır. dnaB proteini, DNA'yı bağladıktan ve primaz etkisini başlattıktan sonra artık replikasyon kavşağına bağlı kalır. c. Replikasyon Çatalında Sentezin Durması Bir defa DNA dubleksi, çatallanma noktasında açılınca artık primaz aşamaları tamamlanır ve DNA polimerizasyonu başlar. Parental şeritler zıt kutuplu olduklarından, devamlı DNA sentezi, bir şerit üzerinde 3'-5' aktivitesi olan polimeraza, diğer şeritte de 5'-3' aktivitesi olan polimeraza ihtiyaç duyar. Bilinen bütün polimerazlar, zincir büyümesini özellikle 5'-3' yönünde katalize ettiklerinden, böyle devamlı bir sentez cereyan etmez. DNA polimeraz primer yapıda serbest 3'-OH grubunu gerektirir ve devamlı zincir uzaması bir şeritte sadece 5'-3' yönünde meydana gelir. Bu şeride "öncü şerit" denir. Diğer şeritteki zincir büyümesi, ise kesintili devam eder. Bu şeride de "geciken şerit" denir. DNA biyosentezinde küçük polinükleotid parçalarına bulunan isimden esinlenilerek "okazaki parçaları" denmiştir. Bunlar ara ürünlerdir. d. Primerin Çıkması ve Fosfodiester Teşekkülü Bir defa Okazaki parçaları sentez edilince artık üç aşama kalır: 1. Bir ribonükleaz, RNA primerini uzaklaştırır. 2. DNA polimeraz I, küçük boşluğu doldurur. 3. DNA ligaz, kalan çentikleri kapatır Bir nükleotidil artığının 3'-OH grubu ile komşu artığın 5'-fosfat esteri arasında fosfodiester bağının sentezinde DNA ligaz kofaktör olarak E. coli de NAD ya, ökaryotik hücrelerde de ATP a ihtiyaç duyar. Ökaryotik Kromozomların Replikasyonu Ökaryotik hücreler, prokaryotik hücrelere göre binlerce katı daha fazla DNA ihtiva eder. Ökaryotik kromozomlara "Kromatin" denir. Bunlar "histon" adı verilen bazik proteinlerle kompleks halinde bulunurlar. A. Nükleozomlar ve Kromatinin yapısı a. Histonlar Kromatinlerin yapısı iki kısma ayrılabilir: " Nükleozomlar" protein ve DNA parçacıklarıdır. Bağlayıcı bölge, nükleozomu bağlayan DNA aralığıdır. Histonlar denen küçük molekül ağırlıklı bir grup protein, kromatinin hem nükleozom bölgesine ve hem de bağlayıcı kısımla bağlanır. Histonlar, kromatinin esansiyel komponentleridir. Hl., H2A, H2B, H3 ve H4 olmak üzere 5 tip histon mevcuttur. Hl, kromatinin bağlayıcı kısmına bağlıdır; diğer 4 ü ise nükleozomun yapısının bir parçasını teşkil eder. Nükleozom histonlarına "internalhiston" denir. Histonlar arjinin ve lizinden zengin bazik proteinlerdir. Histonlar, aminoasit sıvısının korunmasında görev yapmazlar. Bunlar, sentez edildikten sonra, kovalent olarak değişikliğe uğrarlar. Bu olaya "tercüme sonrası değişiklik" denir. b. Kromatinlerin Yapısı Kromatin, DNA ve histonların nükleoprotein kompleksidir. Bunlar nükleozom denen boncuk benzeri tanecikler ve bağlayıcı DNA şeridinden ibarettir (Şekil 29.9). Histonlar, nükleozomun merkezinde, DNA ise yüzeyinde yer alır. Metafazda, kromatin yaklaşık 1000 defa daha kondanse olur. Silindirik iplikçiğin helisinin her bir turu, 6-7 nükleozom ihtiva eder. B. Ökaryotik DNA'nın Replikasyonu Ökaryotik hücrelerin hayat süresince aktif DNA replikasyonu periyoduna "S-fazı" denir. DNA replikasyonu, prokaryotik hücrelerde olduğu gibi ökaryotik hücrelerde de semikonservatiftir ve çift yönlü cereyan eder. DNA biyosentezi ökaryotik hücrelerde öncü şeritte devamlı, geciken şeritte kesintili meydana gelir. Kromatin replikasyonu, nükleozomların da replikasyonunu içerir. Nükleozom histonlarının bundan dolayı, sentez edilmiş olmaları ve yeni sentez edilmiş DNA ya yerleşmek üzere bir araya gelmeleri gerekir. Ökaryotik hücrelerde DNA replikasyonu ile birçok protein ilgilidir. Bunlar nispeten daha az karakterize edilebilmişlerdir. Ökaryotik DNA biyosentezinde DNA replikasyonunun modeli, E. coli' deki DNA replikasyonuna ait olayların sırasına benzer. Bu olaylarda DNA polimerazlar önemli rol oynar. Bu enzimin α-formu nükleustaki DNA replikasyonunda, β-formu DNA onarımında ve γ-formu da mitokondrideki DNA replikasyonunda görevlidir. DNA sentezi, öncü şeritte 5'-3' yönünde devamlı geciken şeritte ise 5'-3' yönünde kesintili cereyan eder. Kesintili DNA sentezi beş aşamalıdır: 1. Özel bir RNA polimeraz, ribonükleotid primerini sentez eder. 2. DNA polimeraz α, Okazaki parçalarının sentezini katalize eder. 3. RNA primeri hidrolize olur. 4. DNA polimeraz boşluğu doldurur. 5. DNA ligaz, çentikleri kapatır. Histon sentezi ile DNA sentezi aynı zamanda ve aynı hızda cereyan eder. Kromozom duplikasyonunun her bir turunda histon sayısı iki katı artar. Eski nükleozomlar, yeni sentez edilmiş DNA ile parental DNA arasında rastgele dağılmışlardır. Buna "rastgele ayrılma" denir. Parental DNA'ya bağlı olan histonlar bağlı olarak kalırlar ve yeni sentez edilmiş bütün histonlar, yeni DNA ya bağlanırlar. Buna da "konservatif dağılım" denir. Mutasyon ve Mutajenler DNA replikasyonunda kopya edilen her 109-1010 baz çifti için ortalama 1 hata görülebilir. Fakat DNA'nın baz sırasını değiştiren herhangi bir hata, genetik haberi de değiştirir. Bunlardan başka, hücre ultraviyole ışınları ve bazı kimyasal etkilerin altında DNA yapısını değiştirebilir. Azotlu baz sıralanmasındaki değişikliklere "mutasyon" denir. Genel olarak iki tip mutasyon vardır: 1. Baz Substitüsyon Mutasyonu (Nokta Mutasyonu): Bir baz diğeri ile total baz sayısı değişmeksizin yer değiştirir. Şayet pürin pürinle veya pirimidin primidinle yer değiştirirse bu substitüsyona "geçiş mutasyonu (transisyon) denir. Eğer pürin ve pirimidinden biri diğerinin yerine geçerse buna da "çapraz mutasyon" ( transversiyon) adı verilir. 2. Kalıp Değiştirme Mutasyonu: Bunda bir veya daha fazla baz ilave olur. Bu tip mutasyon, proteini kodlayan baz sıralanmasını değiştirir. Dış çevre etkileri olmaksızın kendiliğinden meydana gelen mutasyona "spontan mutasyon" adı verilir. Bunda çoğu kez baz sübstitüsyonu olur. DNA replikasyonu sırasında baz sübstitüsyonunun bir kaynağı, bazların "laktam-laktim" tautomerizasyonudur. Örneğin, timinin laktim şekli, adeninden çok guaninle eşleşir. Mutasyona sebep olan veya mutasyonun hızını artıran bir dış etkiye "mutajen" denir. Ultraviyole ışınları, X-ışınları ve birçok kimyasal madde mutajen etki gösterirler. Bu kimyasal maddeler, baz analoğudurlar. 5-bromourasil böyle bir maddedir. Yapısındaki (Br) atomu, timindeki (-CH3) grubu ile aynı van der Waals yarıçapına sahiptir. Bunun mutajenitesi, laktam-laktim tautomerizasyon dengesinin laktime kaymasından ortaya çıkar. 5-Bromourasilin laktim tautomeri adeninden ziyade guanin ile eşleşir ve 5-bromourasilin DNA'ya girerek 5-bromourasil-guanin ve 5-bromourasil-adenin baz çiftleşmesine yol açar. Keza DNA, asit çözeltilerde NaNO2'e maruz kalırsa nitröz asit teşekkül eden serbest nitröz asit, DNA'daki bazların dezaminasyonuna sebep olur. Sitozinin dezaminasyonundan urasil meydana gelir. O takdirde de urasil-adenin baz çiftleşmesi olur. Hidroksilamin (H2N-OH), sitozinle reaksiyona girip N4-hidroksisitozin hasıl eder. Bu da guanin yerine adeninle eşleşir. Ultraviyole ışınları, bitişik timin bazlarının siklobutil dimerleri oluşturmasına sebep olur. Alkilleştirir etkenler de diğer bir sınıf mutajenlerdir. Guaninin özellikle N-7 pozisyonu kolayca alkilleşebilir. DNA'nın Onarılması Şayet genetik haber hatalı ise, bunu izleyen her şey hatalı olacaktır ve böyle bir mutasyon öldürücü olabilir. Hücrenin onarılabilen tek molekülü DNA'dır. A. Timin Dimerlerinin Fotoreaktivasyonu: Bazen ultraviyole ışınların meydana getirdiği timin dimerleri, fotokimyasal olarak tersine bir dimerizasyon reaksiyonu ile tek bir aşamada bir enzim tarafından onarılabilir. Bir defa dimerizasyon reaksiyonu geri dönünce, artık enzim DNA'dan dissosiye olur ve komşu timinler adenin ile tekrar çift bir helis içinde -H- bağları teşkil ederler. B. DNA'nın Onarılan Kısmının Çıkarılması: Genellikle şu dört aşamada gerçekleşir: 1.Çift şeritli DNA'da bir çentik açılması 2. Çift şeritli DNA'da bir boşluk meydana getirmek üzere ikinci bir fosfodiester bağının kopararak ayrılması, çıkarılması. 3. Yeni DNA sentezi 4. Yeni DNA'nın yerleşmesi ve çentiği kapatması. Memelilerde DNA şeridinde hatalı kısmın çıkarılması ve yeniden sentezi, hem çıkarmayı ve hem de polimerizasyonu katalize edebilecek iki fonksiyonlu enzimler bulunmadığından oldukça komplekstir. Son aşamada yeni sentez edilen DNA yerinden çıkarılmış hatalı DNA'nın yerine yerleşir, mevcut şeritle birleşir ve bir ligaz aktivitesiyle çentik kapanır. Hidroksilamin etkisiyle sitozinin dezaminasyonu ile urasilin meydana geldiği ve daha çok adeninle eşleştiği hatalı bir baz çiftleşmesinin onarımı buna bir örnektir. Genetik Rekombinasyon Bu deyim, tam bir çift helisli DNA molekülünden diğerine DNA'nın yer değişmesini belirler. Olayın iki tipi vardır: 1. Genel rekombinasyon: Meiosis sırasında bir diğeri ile eşleşen kromozomlar arasında DNA değişimidir. Bu çiftleşmiş kromozomlar ayni şekle ve aynı genetik habere sahip olduklarından homologdurlar. Genel rekombinasyon, yumurta ve sperm meydana gelmesi sırasında genlerin yeni kombinasyonlar üretmesinde önem taşır. 2. Bölgeye Özel Rekombinasyon: Bir DNA parçasının genomdaki özel bir bölgeye yerleşmesi şeklinde olur. A- Genel Genetik Rekombinasyon: Genel rekombinasyonda homolog kromozomlar arasında, tek bir şeridin transfer mekanizması aşağıda Şekil 29.10 da gösterilmiştir. Önce, bir nükleaz 2 çift helisten birinin şeridine bir çentik açar ve ikinci bir protein de çentikli çift helisi açar. Sonra, DNA polimeraz I, tamamlayıcı bir şerit sentez eder ve 3 şeritli bir ürün meydana gelir. Bir "rec A proteini" ATP ye bağımlı olarak, serbest üçüncü şeridi 2. çift helise D ilmik yapısını vermek üzere asimle eder. Bu yapının ömrü kısadır ve çabucak "rec AB proteini" denen dimerik bir enzim tarafından hidrolize edilir. D ilmiğinin tek şeridi sindirilince yapı, bir şerit çaprazına sahip olur. Bir şeridin izomerizasyonu, 2 şeritli çapraz hasıl eder. B- Bölgeye Özel Rekombinasyon: DNA molekülünün bir başka özel bölgeye katılmasıdır. Bu rekombinasyon modeli, "birleştirici bir mekanizma" tarafından meydana getirilir. Şayet 2 molekül DNA'nın tek şeritli uçları açılmış ve bunların baz sıraları tamamlayıcı ise eklenme reaksiyonu gerçekleşebilir. Bu uçlar arasındaki bölgeye "birleşme yeri" (eklem) adı verilir. Parçaların birbiri üstüne geldiği bölgeye "eklenme yeri" denir. RNA tümör virüslerinin genetik bilgisi RNA'da bulunur. Virüs, reverse transkriptaz enzimini meydana getirmek üzere konakçı tarafından tercüme edilen bir gen ihtiva eder. Bu enzim, RNA'yı kalıp olarak kullanır ve RNA'yı tamamlayıcı cDNA'yı sentez eder. Genetik haberin tercümesinde, DNA önce mRNA denen RNA kopyasına tercüme edilir. Böylece sentez edilen cDNA molekülü tek bir şeridinde orijinal genin bütün haberlerini ihtiva eder. Genler kimyasal yolla sentez edilebilir. Bunun için, somatostatin ve insülin gereklidir. Virüsler Virüsler çok sayıdaki enfeksiyon hastalıklarının etkenleridir, Hayvanlar üzerinde yapılan araştırmalar, tümörlerin de belirli virüsler tarafından meydana getirildiğini ortaya koymuştur. Virüsler, üreme yeteneğine sahip, en küçük bağımsız birimlerdir. Virüsler, haber taşıyan nükleik asitlere sahiptirler, fakat bu genetik haberi realize edecek bir enzim sisteminden yoksundurlar. Küçük virüsler sadece bir nükleik asit ve proteinden, büyük olanları da bunlara ilave olarak lipid ve karbonhidratlardan kuruludurlar. Protein kısmı, nükleik asit kısmını çeviren bir kılıf gibidir. Bu kılıf (kapsül) çok sayıda küçük identik protein birimlerinden (kapsomer) ibarettir. Virüsler ihtiva ettikleri nükleik asit çeşidine göre DNA virüsleri veya RNA virüsleri diye ikiye ayrılabilirler. Çiçek, adenom ve papillom virüsleri DNA virüsleri, mikso virüsler (kabakulak, kızamık vb.) pikoma virüsleri (poliomyelitis, nezle vb.) reo virüsler (solunum yollarının hastalıkları) ise RNA virüsleridirler. DNA virüsleri açık ya da kapalı bir çift şeritten ibaret olabildikleri gibi, halka şeklinde tek bir şeritten de kurulmuş olabilirler. RNA virüsleri da tek bir nükleotid şeridinden ibarettirler. Tamamlanmamış genetik haber ihtiva eden virüs türleri de vardır. Örneğin, Rous sarkom virüsü sadece nükleik asit kısmının replikasyonu için gerekli olan, fakat protein kısmının sentezi için gerekli olmayan haberi ihtiva eden bir RNA ya sahiptir. Böyle bir virüs, genetik olarak ta tam değildir ve hücre içinde çoğalması için aynı zamanda bu hücre içinde çoğalmak zorunda olan bir başka virüsün yardımına muhtaçtır. Virüslerin çoğalması: Virüs çoğalması, zamanla sınırlı olarak, tamamıyla kontrol altında bulunan çeşitli fazlarda olur. Bir çoğalma fazı genellikle 7-8 saat sürer ve şu beş basamakta cereyan eder: a- Virüsün Hücreye Adsorbe Edilmesi: Hücrenin moleküler şartlarının, elektrostatik gücünün ve özel hücre reseptörlerinin rolü vardır. b- Virüsün Hücreye Girmesi: Her virüs için farklı şekillerde olur. Bazıları protein kılıflarını dışarıda bırakacak şekilde sadece nükleik asit kısmı ile hücreye girerler, bazı virüsleri da hücre, fagositoz yolu ile kendisi alır. c- Hücrede Virüs Çoğalmasının Başlaması: DNA virüslerinde hücre çekirdeğinde; RNA virüslerinde da ya çekirdekte ya da sitoplazmada başlar. d- Virüsün Hücre içinde Olgunlaşması: Virüs nükleik asidi, olgunlaşmak için ihtiyaç duyduğu yapı taşlarının sentezini uyarır. Virüs çoğalmasının gerektiği gibi olması ve yeterli protein tabakasının hazırlanması suretiyle virüsün yapısı tamamlanır. e- Yeni Teşekkül Eden Virüsün Hücre Dışına Çıkması: Bu iş ya parçalayıcı enzimlerin yardımı ile hücrenin tahrip olması sonunda, ya da aktif bir salgılama olayı ile gerçekleşir. Bakterileri konakçı hücre olarak kullanan virüslere "bakteriyofaj" adı verilir. Bakteriyofajların DNA'sı, bakterilerin DNA'sı ile eşleşebilir ve orada varlığını gizli olarak sürdürebilir. Böyle fajlara "pro faj" denir. Bölünmede daha sonra bakteriler, profajları tüm yavru hücrelere nakleder. Bu olayların cereyan ettiği döngüye "lizojen döngü" denir. Profaj, yine de spontan olarak veya deneysel şartlar altında (ultraviyole ışınları etkisi gibi) tekrar üreme döngüsüne girebilir ve fajların çıktıkları hücreler erime nedeniyle tahrip olurlar. Bu olaya da "litik döngü" adı verilir. İnterferon Hücreler, virüs enfeksiyonlarına karşı doğal bir savunma mekanizmasına sahiptirler. Bu yeteneklerini interferon teşkil ederek gösterirler. İnterferon, virüslerin faaliyetini önleyici özelliğe sahip bir proteindir. İnterferon, enfekte olmuş hücreden enfekte olmamış hücreye geçer ve orada hücrenin protein sentezine yardımcı olan özel bir mRNA sentezine sebep olur ki virüse özel olan bu protein de sentezi önler. Bu proteine "tercümeyi önleyen protein" (Translation Inhibiting Protein) (TIP) denir. Bu protein, ribozomlarda depo edilir. Hücre bir virüs tarafından enfekte edilince virüs mRNA-TIP ribozom kompleksi nedeniyle virüs özel hiçbir proteini sentez edemez. İnterferon, belirli bir hücre için özel değildir, yani çeşitli virüslere karşı koyar, fakat neve özeldir. Yani içerisinde meydana geldiği nevin bireylerine etkilidir. DNA'nın bir hücreden diğer hücreye taşınma mekanizması şöyle özetlenebilir: Değişim Yoluyla: Bir pnömokok türünden elde edilen saf DNA, diğer bir pnömokok türüne eklenirse, bunlar mutasyona uğrayarak tipik özelliğini (örneğin; kapsül teşkil etme yeteneğini) kaybederler. Bu suretle mutasyona uğramış hücreden izole edilen DNA molekülü, sonradan kapsül teşkil etme yeteneğini tekrar kazanacak şekilde konakçı hücrenin DNA'sı ile elde edilmiş olan DNA arasında yeni bir kombinasyona girer. İki Faj Arasında Taşınarak: Genetik materyalin (DNA), bir bakteriden diğerine bakteriofajlar aracılığı ile taşınmasıdır.  

http://www.biyologlar.com/dna-replikasyonu-1

DNA Replikasyonunda Rol Alan Enzimler

DNA molekülünün replikasyonunda, DNA zincirinin uzatılmasını DNA polimerazlar katalizlemekle birlikte, replikasyonda rol alan başka enzimler de bulunmaktadır. Bu enzimler ve özellikleri ise: i. DNA Primaz: Replikasyon sırasında, DNA polimerazın DNA zinciri sentezini başlatabilmesi için kullandığı RNA primerleri, DNA primaz adı verilen özel RNA polimerazlar tarafından sentezlenir (bkz. kısım 4.3). Bu enzim çoğunlukla DNA’ya bağlanır, fakat kalıp olmaksızın da primer sentezini başlatabilir. İn vitro substrat olarak, NTP veya dNTP’ları kullanabilir ve DNA kalıbının tamamlayıcısı olan 10-15 nükleotid uzunluğundaki primerleri sentezler. ii. DNA ligaz: DNA ligaz veya kısaca ligaz adı ile bilinen bu enzimler, bütün hücrelerde bulunmaktadır ve replikasyonda kritik bir role sahiptirler. DNA ligazlar, nükleik asitlerin onarım ve rekombinasyonlarında önemli bir rol oynarlar. Bilinen bütün DNA ligazlar, DNA’da bulunan bir kırıktaki komşu deoksiribonükleotidlerin 5' P ve 3' OH grupları arasında fosfodiester bağının oluşumunu katalizlerler. Bütün ligazların gereksinimi, ligasyon için yan yana gelen iki DNA molekülünün uçlarında en az bir fosfat kalıntısına gereksinim duymasıdır. Bu enzimler, serbest durumdaki tek zincirli iki DNA parçacığını birbirine bağlayamazlar, bu DNA zincirlerinin çift sarmal yapıdaki bir DNA molekülünün parçaları olması gerekir (ligazlar hakkında daha detaylı bilgi için bkz. kısım 13.1.2). iii. DNA Helikaz: Replikasyon çatalına yakın yerden DNA molekülüne bağlanarak repilasyonu yapılacak olan DNA zincirlerini birbirinden ayırır. iv. Deoksiribonükleazlar (DNaz’lar): DNA zincirlerinde nükleotidler arsındaki fosfodiester bağlarını kırarak DNA’nın hidrolizine yol açarlar. Endonükleaz ve eksonüklez aktivitesi gösteren DNaz’lar ise daha detaylı olarak sırasıyla kısım 13.1.1. ve 13.1.7’de daha detaylı olarak ele alınmıştır. v. DNA giraz (topoizomeraz II): Lineer DNA moleküllerinde ikili sarmalın çözülmesi, molekülün kendi ekseni etrafında dönmesiyle teşvik edilir ve kolaylaşır. Fakat kapalı, dairesel DNA moleküllerinin çözülmesi esnasında moleküldeki negatif dönümler azalırken, pozitif süper dönümlerin de sayıları artmaya başlar. Pozitif süper dönümlerin artması ise replikasyon çatalının ilerlemesine engel teşkil eder. Bu sorunun giderilmesi, yani pozitif süper dönümlerin yok edilmesi ise DNA giraz tarafından sağlanır (bkz. kısım 2.3.1.2.1.). DNA giraz, DNA omurgasındaki fosfodiester bağlarını önce kesip sonra kapatarak pozitif süper dönümleri yok eder ve reaksiyon sırasında ATP’ye gereksinim göstermez. DNA giraz bu aktivitesine ek olarak, ATP’nin hidrolizi yardımı ile kapalı halka şeklindeki DNA’da negatif süper dönümler de meydana getirebilir. Bu dönümler ise ana molekülün replikasyon çatalındaki çözülmesini teşvik eder. DNA replikasyonu esnasında görev alan enzim ve proteinlerin adları ve fonksiyonları ise Tablo 4.2’de özetlenmiş olarak verilmektedir. Enzim-protein Aktivite Hücredeki fonksiyon Restriksiyon endonukleaz DNA ligaz DNA polimeraz I DNA polimeraz III DNA giraz (topoizomeraz II) DNA helikaz DNaz DNA metilaz Primaz (RNA polimeraz) Topoizomeraz I DnaA DnaB (rep protein) DnaC SSBP DNA’yı spesifik baz sekanslarından keser. DNA moleküllerini ekler. Büyümekte olan DNA nükleotidlerine bağlanır, primer RNA’yı uzaklaştırır. Büyümekte olan DNA nükleotidlerine bağlanır, her eklenen nukleotidin doğruluğunu kontrol eder. DNA katlanmasını artırır, süper katlanmayı sağlar. Replikasyon çatalına yakın yerden DNA’ya bağlanır. DNA’yı nükleotidlerine parçalar. DNA bazlarını metiller, böylece endonukleaz aktivitesini inhibe eder. DNA kalıbını kullanarak kısa RNA zincirlerini sentezler. Katlanmış olan DNA’yı açar. DNA’da tekrarlanan dizilere bağlanarak açık kompleks oluşturur. Helikaz aktivitesi gösterir DnaB ile kompleks oluşturur Tek zincirli yapıyı sabitleştirir. Yabancı DNA’yı parçalar. Replikasyonu tamamlar. DNA tamiri esnasında DNA’daki boşlukları doldurur, primerleri uzaklaştırır. DNA’yı replike eder. DNA’nın kompakt yapısını korur. DNA zincirlerini ayırır. DNA’yı parçalar. Hücresel DNA’yı metilleyerek hücrenin kendi nukleazlarından korur. DNA polimerazların gereksinimi olan RNA primerlerini oluşturur. DNA katlanmasının doğru olarak korunmasına yardım eder. Replikasyonun başlamasında görev alır. Replikasyon çatalının oluşumunu sağlar. Replikasyonun başlamasında görev alır. DNA zincirinin açılan bölgelerinin stabilizasyonunu sağlar 4.3. Prokaryotik DNA Replikasyonunun Temel İlkeleri DNA molekülünün replikasyonu ile ilgili problemlerin en basit ifadesi: DNA ikili sarmalının her bir zincirinde yan yana yer alan baz sekanslarının doğru olarak duplikasyonu sonucunda yeni DNA moleküllerinin oluşumu sağlanmalıdır. Hücre, çok kompleks görünen bu problemi çözmek için mükemmel bir sistem olan komplementer baz eşleşmesi sistemini geliştirmişitr. Daha önceki kısımlarda da ele alındığı gibi, adenin bazı spesifik olarak timin ile, sitozin ise guanin ile komplementer oluşturmaktadır (bkz. kısım 1.4.1.1). Şayet, DNA ikili sarmalı açılırsa, her bir diziye komplementer olan yeni dizi sentezlenecektir. Kısım 1.7.1.1’de incelendiği gibi replikasyon, senikonservatif replikasyon mekanizması ile gerçekleştirilmektedir. 1956’lı yıllardan günümüze kadar yapılan replikasyon çalışmalarının moleküler seviyede nasıl gerçekleştiği ve olaya katılan moleküller hakkındaki bilgilerin hemen hemen tamamı prokaryotlardaki araştırmaların sonuçlarına dayanmaktadır. Bu nedenle, günümüzde konuya ilişkin bilgilerin çoğu prokaryotik DNA replikasyonuna aittir. Bundan dolayı, çift sarmallı DNA molekülünün replikasyonunun anlaşılabilmesi için en kolay yol ise gerçek bir örneğin seçilmesi olacaktır. E. coli ile yapılan replikasyon çalışmaları, replikasyonun temel ilkelerinin aşağıdaki gibi olduğunu ortaya koymuştur: i. DNA replikasyonu, kromozom üzerinde belirli ve spesifik nükleotid dizilerinin bulunduğu orijin noktalarından başlar ve yine belirli bitiş-tamamlama noktalarında tamamlanır. Bakteri ve virüs kromozomlarında, genellikle bir orijin (başlama) bir tane de bitiş noktası bulunmaktadır. E. coli’nin dairesel olan kromozomunun replikasyon orijininde ise yaklaşık olarak 300 baz çifti bulunmaktadır ve bu orijin noktası, replikasyonu başlatan proteinler tarafından spesifik olarak tanınmaktadır. Son yıllardaki araştırma sonuçlarına göre, E. coli’de oriE olarak adlandırılan başlangıç bölgesinde, replikasyonun başlatılabilmesi için en az 6 proteinden oluşan bir kompleksin görev aldığı anlaşılmıştır. Tek bir ökaryotik kromozomda ise, çok sayıda orijin noktası vardır ve bunlar birbirlerine 30-40 kbp uzaklıktadırlar. Ökaryotik kromozomlarda çok sayıda orijin noktalarının bulunmasının tek nedeni ise sadece ökaryotik DNA moleküllerinin prokaryotlarınkine oranla çok daha uzun olması değildir. Bunun nedenlerinden birisi, belki de ökaryotik DNA polimerazlarının prokaryotlardaki DNA polimerazlar kadar hızlı sentez yapamamalarıdır. Orijin bölgelerindeki çözülmeler ise temelde, bu bölgeya bağlanan protein kompleksi içerisinde yer alan DNA helikaz enzimleri tarafından sağlanır. Bu proteinler, DNA molekülünün çözülmesi için gerekli olan enerjiyi ATP’nin hidrolizinden sağlarlar. Çözülmenin oluşumunda ilk aşama, DnaA proteininin orijin noktasındaki yaklaşık 300 bp’lik bir bölgede yer alan AT’ce zengin ve tekrarlanma gösteren iki ayrı diziye bağlanmasıdır. Bu bağlanma sonucunda DNA, bu noktalarda açık bir kompleks oluşturur. Daha sonra ise DnaB ve DnaC proteinleri, bu açık kompleks ile etkileşime girerek DnaB’nin helikaz aktivitesi ile DNA molekülünün tam olarak çözülmesi sağlanır. DnaB, büyük bir olasılıkla potansiyel replikasyon çatalının tek zincirli yapısını tanıyarak DnaA’nın yerini almakta ve DNA molekülünün esas çözülmesini gerçekleştirmektedir. ii. Replikasyonun bir yönü vardır. Replikasyon, kromozom üzerinde belirli bir yerden (orijin) başlar ve her iki yönde birbirine zıt olarak ilerler (Şekil 4.5 ve 4.6). Dairesel DNA moleküllerinde iki yölü devam eden replikasyon ise teta yapısı olarak adlandırılan karakteristik yapının oluşmasına yol açar (Şekil 4.5). İç kısımda bir ilmeği kapsayan bu yapı, bakterilerdeki DNA molekülünün replikasyon sırasında dairesel yapısını koruduğunu göstermektedir. Aynı zamanda, yeni DNA zincirleri sentezinin ana moleküldeki bölgesel çözülmelerle sıkı ilişki gösterdiğini de kanıtlamaktadır. Replikasyonun bizzat devam ettiği bölgelerde, atasal DNA zincirleri birbirlerinden ayrılıp, yeni zincirlerin sentezi için kalıplık ederler. Replikasyon çatalı (Şekil 4.7) adını alan bu bölgelerin sayısı ve başlama noktasına olan uzaklıkları, replike edilen DNA’nın uzunluğuna göre değişir. Replikasyon çatalında DNA ikili sarmalı helikaz adı verilen özel bir enzim ile açılarak DNA molekülünün kısa, tek zincirli bölgeler oluşturması sağlanır. Helikaz, ATP’ye bağlı bir enzim olup, ATP moleküllerini hidroliz ederek replikasyon çatalının ilerlemesini sağlamaktadır. Kapalı halka şeklindeki DNA moleküllerinin çözülmesi esnasında, negatif dönümlerin azalarak pozitif süper dönümlerin sayısının giderek artmasıyla ortaya çıkan ve çatalın ilerlemesini engelleyen topolojik sorun ise DNA giraz (topoizomeraz II) tarafından giderilir. DNA giraz ise çatalın ilerlemesi esnasında ortaya çıkan pozitif süper dönümleri giderir (bkz. kısım 4.2.3). Replikasyon çatalında açılmış olan tek zincirli DNA bölgeleri ise tek zincir bağlama proteinleri (SSBP = Single Strand Binding Protein) ile kaplanarak, molekül içi H bağlarının oluşması önlenmektedir. Bu proteinlerin, DNA zincirinin şeker-fosfat omurgasına bağlandığı ve tutunma noktalarındaki bazların çeşidiyle ilişkili olmadığı düşünülmektedir. Şekil 4.5: Dairesel DNA moleküllerinin orijin noktalarından başlayarak iki yönlü ilerleyen replikasyonu Yunan alfabesindeki teta () harfine benzer bir ara ürün oluşturduğu için bu ara ürün teta formu olarak adlandırılmaktadır (Madigan ve ark.’dan). Şekil 4.6: Orijin noktasından itibaren DNA replikasyonunun iki yönlü olarak ilerlemesi (Alberts ve ark.’dan modifiye edilerek çizilmiştir). Şekil 4.7: E. coli’de replikasyon çatalının şeması (Alberts ve ark.’dan). iii. DNA molekülünün sentezini, yani nukleotidlerin birbirine eklenmesini katalizleyen enzimler DNA polimerazlar olarak adlandırılırlar. Bütün DNA polimeraz enzimleri, yeni DNA molekülünün sentezini 5' 3' yönünde gerçekleştirmektedirler. E. coli’de üç tip DNA polimeraz enzimi bulunmakta olup bunlar, DNA polimeraz I, II ve III olarak adlandırılırlar (bkz. kısım 4.2.1). Replikasyon çatallarında kalıp DNA zincirlerine komplementer olarak sentezlenecek yeni DNA zincirinin sentezi, primer RNA’lar ile başlatılır. Bilinen hiçbir DNA polimeraz enzimi, kalıp DNA zincirlerinin karşısında yeni bir DNA zincirinin sentezini başlatamamaktadır. Çünkü, tüm DNA polimeraz enzimleri, bir kalıp DNA’dan başka serbest 3' OH grubu taşıyan bir primer (başlatıcı) moleküle de gereksinim duyarlar. Halbuki, RNA polimeraz enzimleri bir başlatıcı moleküle ve serbest 3' OH grubuna gerek duymadan RNA sentezini başlatabilmektedirler (bkz. kısım 5.1). Onun için, orijin noktalarında DNA zincirleri birbirlerinden ayrılır (Şekil 4.5 ve 4.6) ve ayrılan her bir DNA zincirinin karşısında, RNA polimeraz (primaz) enzimi küçük bir RNA ipliğinin (yaklaşık 10-15 nükleotid uzunluğunda) sentezini başlatır. Primer sentezini katalizleyen primaz, tek zincirli DNA’daki özel dizileri tanıyan bir RNA polimerazdır. Primazın fonksiyonunu etkin bir şekilde yapabilmesi için 6-7 kadar proteinle bir kompleks oluşturması gerekmektedir. Primer sentezi için gerekli reaksiyonlara katılan bu protein kompleksine primozom adı verilir. Primozom, DNA boyunca hareket ederek tek zincir bağlama proteinlerinin yerini alır ve bu şekilde primaz için uygun başlangıç noktası tanınır. Primaz, kalıp DNA’yı kullanarak yaklaşık 10-15 bazlık kısa bir RNA primeri sentezlemeye başlar. RNA primerinin sentezi sırasında, hangi ribonükleotidlerin hangi sırada yer alacakları, kalıp DNA’da Okazaki başlangıç noktalarında bulunan nükleotidler tarafından belirlenir. Ribonükleotidlerin sayısı 10-15 nükleotide ulaşınca, primer RNA’nın 5' 3' yönündeki sentezi de tamamlanmış olur (Şekil 4.6 ve 4.7). Daha sonra, bu primer RNA’nın 3' OH ucuna, DNA polimeraz III enziminin katalizörlüğünde deoksiribonükleotid monomerleri eklenmeye başlar ve bu sentez replikasyon çatalının sonundaki bitiş noktasına kadar devam eder. iv. DNA nükleotidleri, büyüyen yeni DNA zincirinin 3' OH ucuna DNA polimeraz III enziminin katalizörlüğünde tek tek eklenerek zincirin yapısına katılırlar. Böylece, DNA sentezi 5' 3' yönünde devam eder. DNA sarmalında iki zincirin birbirine zıt yönde parelel olması nedeni ile (3'5' veya 5'3') bu zincirleri kalıp olarak kullanan bir replikasyon kompleksi, yeni zincirlerin sentezini de birbirlerine zıt yönde yürütmek zorundadır. Teorik olarak, 3' 5' yönündeki kalıp DNA zincirinin üzerinden yeni DNA zincirinin sentezi, RNA primerleri yardımı ile başlatılıp 5'3' yönünde ve kesintisiz bir şekilde devam ettirilebilir. Fakat, DNA’nın 5' 3' yönlü öteki zinciri kalıp olarak kullanılırken, yeni sentezlenecek zincirin yönü 5'  3' yönünde, buna karşılık genel büyüme 3' 5' yönünde gerçekleştirilmek zorundadır. Acaba bu nasıl başarılmaktadır? Bu sorunun cevabı, bakteri ve faj kromozomları üzerine yaptığı otoradyografik çalışmalar sonucu, Okazaki ve arkadaşları (1968) tarafından verilmiştir. Okazaki’ye göre, yeni sentezlenen DNA, 1000-2000 (7-11S) baz uzunluğundaki kısa iplikçikler (Okazaki parçacıkları) halinde sentezlenmektedir ve bu DNA parçacıkları daha sonra birbirlerine eklenerek uzun zincirleri meydana getirmektedir. Okazaki parçacıkları, replikasyon çatalı bölgesinde çok kısa bir süre bulunurlar. Replikasyon devam ettikçe, DNA ligaz tarafından kovalent olarak birbirine bağlanan Okazaki parçacıkları yavru zincirlerden birisini oluştururlar. Diğer zincir ise kesintisiz olarak sentezlenir. Böylece, 5' 3' yönlü kalıp DNA zinciri üzerinden yine 5'3' yönlü yeni DNA sentezi sağlanmaktadır (Şekil 4.6 ve 4.7). Kesik kesik yapılan bu DNA sentezi işlemi için de, yine 3' OH uçlu primer RNA’lara gereksinme vardır. Gerçekten de Okazaki kendi adı ile anılan bu parçacıkların 5' uçlarında 10-15 nükleotid uzunluğunda RNA primerlerinin varlığını göstermiştir. Bu primer RNA’nın 3' OH ucuna, DNA polimeraz III enziminin katalizörlüğünde deoksiribonükleotid monomerleri eklenmeye başlar. DNA polimeraz III, daha önce sentezlenen Okazaki parçasının başlangıç kısmına yaklaşınca yerini DNA polimeraz I enzimine bırakır. DNA polimeraz I enzimi, bir taraftan önündeki primer RNA iplikçiğini monomerlerine parçalarken (3'  5' eksonukleaz aktivitesi göstererek) bir taraftan da boşalan yerlere deoksiribonükleotidlerin bağlanmasını kataliz eder. RNA primerinin yok edilmesi ile DNA parçaları arasında meydana gelen boşluklar yine DNA polimeraz I tarafından onun zincir uzatma ve nick translation* aktivitesi ile doldurur. Buna göre DNA polimeraz I, nükleotidleri DNA parçalarının 3' ucuna eklerken aynı anda da RNA primerini 5' 3' eksonukleaz aktivitesiyle parçalar. DNA polimeraz I, en son primer RNA nükleotidini de kırdıktan sonra yerini DNA ligaz enzimine bırakır. Böylece, parça parça sentezlenmiş olan yeni DNA parçalarının 3' ve 5' uçlarının birbirlerine fosfodiester bağları ile bağlanması, DNA ligaz enzimi tarafından katalizlenir. Bu ekleme, kalıplık eden DNA zincirindeki baz sırasının komplementeri olacak şekilde, aradaki boşluklara yeni deoksiribonükleotidlerin doldurulması ile yapılmaktadır. Buradan da anlaşılmaktadır ki, DNA yapısından çıkarılan RNA primerlerinin replikasyondaki görevi, DNA sentezini başlatmaktan ileri gitmemektedir. v. Tek ve dairesel bir kromozoma sahip olan bakterilerde replikasyon, aynı anda zıt yönde ve yaklaşık olarak aynı hızda devam eder. Zıt yönde ilerleyen replikasyon çatalları bir yerde karşılaşırlar. Örneğin, E. coli’de bu karşılaşma yeri trp geni (E. coli genom haritasının 25. dakikasında) yakınında olmaktadır. Bu nokta ise replikasyon başlangıç yerinin (oriE) hemen hemen tam karşısına gelmektedir. Buna göre, replikasyonun sona ermesi için özel tamamlanma işaretleri gerekli olmayabilir. Bununla beraber, yeni sentezlenmiş olan DNA moleküllerinin ayrılması kendiliğnden gerçekleşmez. Çünkü, bu moleküller birbirlerine yaklaşık olarak 20-30 kadar dönümle bağlı kalırlar. Bu iç içe geçmiş olan halkaların birbirinden ayrılması, topoizomeraz II benzeri enzimlerin (bkz. kısım) çift zincir kırıkları oluşturması ve sonra da çift sarmalları birbirinin içinden geçirip kırıkları kapatmalarıyla mümkün olmaktadır. Bunun dışında, replikasyonun başlama ve uzama reaksiyonları için gerekli proteinler oldukça iyi bilindiği halde, tamamlamayla ilişkili proteinler ve şayet varsa, terminus bölgedeki dizi spesifikliği hakkında henüz hiç bir bilgi bulunmamaktadır. Sürekli ve kesikli sentez özellikleri, zincirlerin ilerleme hızlarını bir ölçüde etkileyeceği için, 5'  3' yönünde ve kesintisiz olarak sentezlenen zincire önde giden zincir, Okazaki parçacıklarından oluşan 3' 5' yönündeki zincire ise arkadan gelen zincir denmektedir. Semikonservatif replikasyon mekanizması, replikasyon sırasında DNA zincirlerinin birbirlerinden ayrılıp, her birisinin sentezlenecek yeni zincirler için kalıplık ettiğini açıklamakta, fakat DNA sentezinin gerek fiziksel olarak ve gerekse moleküler düzeyde nasıl yürütüldüğü konusunda pek bir açıklık getirmemektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bu olayın yalnızca karmaşık olduğunu göstermekle kalmayıp, aynı zamanda mutasyon ve DNA onarımı gibi önemli hücresel olaylarla olan ilişkisini de ortaya koymaktadır (bkz. mutasyonlar ve DNA onarımı). Replikasyon çatalında açılan atasal DNA zincirlerinin kalıp olarak kullanılmasıyla, biri sürekli olarak (3'5' zincirine komplementer olanı) diğeri parça parça, (5'3' zincirine komplementer olanı) iki yeni DNA zinciri sentezlenir. Sentezlenen biri yeni ve biri eski DNA zincirinde A ile T ve G ile C karşı karşıya gelerek aralarında hidrojen bağları kurulur (bkz. kısım 1.4.1.1). Böylece, çift sarmallı bir atasal DNA molekülünden yine çift sarmallı iki DNA molekülü sentezlenmiş olur. Tüm bu olaylar Şekil 4.5; 4.6 ve 4.7’de görülmektedir. E. coli polimeraz II enziminin DNA replikasyonuna katılmadığı bilinmektedir. Buna rağmen, bu enzim Arkebakteriler ve Ökaryotlardaki temel kromozomal DNA polimeraz enzimine oldukça benzemektedir. Replikasyon çatallarında DNA sentezi gerçekleştirilirken DNA molekülünün heliks yapısı da değişmekte ve kıvrım açıcı ve topoizomeraz enzimleri aracılığı ile DNA molekülü modifiye edilmektedir (bkz. kısım 1.4.1.2). DNA, replikasyonla kendisinin kopyasını meydana getirebildiği gibi transkripsiyon ile de taşıdığı bilgiyi m-RNA’ya aktarabilir. m-RNA daki bilgi ise translasyon ile protein sentezine dönüştürülür. DNA’nın tüm bu işlevlerine ise sentral dogma denir (bkz. Şekil 1.2). 4.4. Lineer Genetik Elementlerin Replikasyonu DNA replikasyonunun aşamaları incelenirken, dairesel DNA molekülleri ele alınmış bulunmaktadır. Prokaryotik organizmalar arasında dairesel DNA molekülleri oldukça yaygın olup, plazmidlerin çoğu ve bazı viral genomlar da dairesel olarak bulunmaktadır. Kromozomal DNA’lar ister dairesel ister lineer olsun, neredeyse bütün replikasyon basamakları birbirinin aynıdır. Buna rağmen, lineer kromozomların replikasyonunda dairesel kromozomların replikasyonunda rastlanmayan bir problem bulunmaktadır. Bu problem ise, her DNA molekülünün iki ucunda yer alan 5' uçlarıdır. Problemin daha iyi anlaşılabilmesi için Şekil 4.9’a bakmak yararlı olacaktır. Şekil 4.9’daki diyagramın sol ucunun lineer bir DNA molekülünün gerçekten bir ucu olduğunu düşünelim. Bu uçta yer alan 5' ucu ile başlayan dizinin komplementer zincirinin sentezini başlatan primer RNA molekülü, çok kısa dahi olsa ve bu primeri uzaklaştıran spesifik enzimler bulunsa dahi bütün DNA polimeraz enzimlerinin aktivite gösterebilmesi için serbest 3' OH ucuna, yani bir primere gereksinim duyması nedeni ile hiçbir DNA polimeraz enzimi bu primer RNA molekülünü buradan uzaklaştırarak bunun yerine deoksiribonükleotidleri ekleyemeyecektir. Bu nedenle, bu primer RNA’nın yeni sentezlenen DNA zincirinden uzaklaştırılması için hiçbir şey yapılmayacak olursa, DNA molekülü her replikasyon sonunda bir miktar kısalacaktır. Oysa ki lineer olan genetik elementler bu problemi çok net bir şekilde çözmüşlerdir. Şekil 4.8: DNA sentezinin başlangıcı esnasında oluşan RNA-DNA kombinasyonu (Madigan ve ark.’dan). Gerçekte bu problemin çözümü çok farklı şekillerde gerçekleştirilmektedir. Lineer kromozoma sahip olan bazı virüsler, kromozom uçlarında yer alan yapışkan uçlar aracılığı ile kromozomlarını replikasyondan önce dairesel duruma getirebilmektedirler (bkz. Şekil 1.13). Bazı virüsler ise kromozomlarının uçlarında tekrarlamalı dizilere sahiptirler. Bu virüslerde, farklı DNA moleküllerinin uçlarında yer alan tekrarlamalı dizilerin birbirine eklenmesini sağlayan bir rekombinasyon prosesi gerçekleştirilmektedir. Böylece, uç uca eklenen ve çok uzun olan bu bileşik DNA molekülünden kopyalanan DNA’lar endonukleazlar tarafından kesilerek yeni genomik DNA’lar oluşturulmaktadır. Lineer DNA molekülüne sahip olan birkaç virüs ile çok sayıdaki plazmid ise replikasyon problemini RNA primerleri yerine protein primerler kullanarak çözmüşlerdir. Bütün DNA polimeraz enzimleri, nükleotidleri sadece serbest 3' OH ucuna ekleyebildikleri halde bazı DNA polimerazlar ilk nukleotidi lineer kromozomların uçlarında bağlı bulunan spesifik proteinlerin uçlarında yer alan –OH gruplarına ekleyebilmektedirler (Şekil 4.10). Lineer kromozomların uçlarına bağlanan proteinler ise virüsler veya plazmidler tarafından kodlanmaktadırlar ve bu proteinler, kromozomların uçlarına bağlanma fonksiyonuna sahiptirler. Lineer kromozomların uçlarında yer alan bu primer proteinler ise primer RNA’larda olduğu gibi uzaklaştırılmazlar. Bu nedenle, lineer kromozom taşıyan bu virüs ve plazmidlerin DNA molekülleri, 5' uçlarında kovalent olarak bağlanmış olan bu spesifik proteinleri sürekli olarak taşımaktadırlar. Bu olay Streptomyces lividans gibi bazı bakterilerde de kromozomal DNA’nın replikasyonu sırasında kullanılmaktadır. Lineer DNA replikasyonunda kullanılan bu metotların hiç birisi, ökaryotik kromozomların uçlarında yer alan baz dizilerini (telomerler) tamamlamak için kullanılmamaktadır. Ökaryotik kromozomların telomerleri ise tekrarlamalı DNA dizileri içermektedir. Bu diziler ise genellikle 6 bp’den meydana gelen kısa diziler olup, birbiri arkasına 20 ila birkaç yüz defa tekrarlar oluşturacak şekilde yer almaktadırlar (Şekil 4.11, a). Farklı ökaryotların telomerlerinde yer alan sekanslar ise birbirine oldukça benzemekte olup, DNA molekülünün zincirlerinde birisi her zaman birkaç guanin taşımaktadır. Guanin bakınından zengin olan bu sekanslar ise telomeraz enzimi aracılığı ile DNA molekülünün 3' OH ucuna eklenebilmektedirler (Şekil 4.11). Telomerazlar lineer DNA molekülünün 3' uçlarına ekleme yapan enzimler olup, ko-faktör olarak küçük bir RNA kalıbına sahip oldukları için DNA kalıbına gerek duymazlar. Bu enzimler, daha uzun uzantıların oluşturulması için tekrar tekrar çalışabilirler. Uzantılar yeterli uzunluğa eriştiğinde, diğer diziye ise normal replikasyonda olduğu gibi bir RNA primeri eklenebilir. Telomerlerde yer alan tekrarlamalı dizilerin uzunlukları için tam bir sınır bulunmamaktadır. DNA replikasyonu esnasında genetik bilginin eksilmesine neden olmayacak kadar uzunluktaki bir tekrarlamalı dizi genellikle yeterli olmaktadır. Şekil 4.9: Protein primerleri kullanılarak DNA replikasyonunun gerçekleştirilmesi. Yeni sentezlenecek olan DNA dizisi kalıp zincirin 5' ucuna kovalnet olarak bağlana proteini primer olarak kullanır (Madigan ve ark.’dan). Şekil 4.10: Telomeraz enziminin, ökaryotik kromozomların bir ucundaki aktivitesini gösteren model. (a) Bir DNA telomerinde 4 G bakımından zengin olan tekrarlamalı sekans ve kısa bir RNA kalıbı içeren telomeraz enzimi. (b) G bakımından zengin olan dizinin telomeraz enzimi tarafından uzatılması (Madigan ve ark.’dan). 4.5. Ökaryotlarda DNA Replikasyonu Ökaryotlarda DNA moleküllerinin replikasyonu, prokaryotik hücre DNA’sının replikasyonundan daha kompleks bir olay olmakla beraber, büyük ölçüde ona benzer şekilde cereyan eder. En azından ökaryotik organizmaların DNA’larının da semikonservatif replikasyon mekanizmasına göre replike olduğu yapılan deneysel çalışmalar ile gösterilmiştir. Ökaryotlarda DNA replikasyonu, hücrenin hayat döngüsünün S (sentez) fazında gerçekleşir ve bu evre, gelişmiş yapılı bir ökaryotik hücrede genellikle en az birkaç saat sürer. S fazının sonunda hücre tetraploid (4C*) durumundadır ve bu şekilde G2 fazına başlar. Daha sonra da mitoz bölünmeyle (M fazı) kromozomlar, dolayısı ile genetik materyal yavru hücrelere diploid sayıyı (2C) koruyacak şekilde paylaştırılır. Ayrıca, ökaryotik hücreler prokaryotlara oranla çok fazla miktarda DNA içerirler. Bu nedenle, ökaryotik hücrelerin DNA molekülleri, E. coli’deki gibi tek bir orijin (oriE) noktasından başlayarak replikasyonlarını gerçekleştirseler idi, S fazının oldukça uzun sürmesi gerekirdi. Oysa ki, ökaryotik hücreler bu sorunu her bir DNA molekülü üzerinde çok sayıda replikasyon başlangıç noktasına sahip olarak çözmüşlerdir. Bu nedenle, ökaryotik hücrelerin DNA molekülleri üzerinde prokaryotların DNA’larında olduğu gibi bir tane değil de çok sayıda replikasyon orijini bulunmaktadır. İlk kez 1968 yılında Huberman ve Riggs, ökaryotik DNA moleküllerinin arkası arkasına dizilmiş çok sayıda replikasyon çatallarına sahip olduğunu göstermişlerdir. Gerek elektron mikroskobu ve gerekse otoradyografik araştırmalar örneğin, Drosophila’nın yumurta hücrelerindeki DNA replikasyonunun prokaryotlarda olduğu gibi iki yönlü ve birbirine zıt olarak gerçekleştiğini göstermektedir. Bu nedenle, ökaryotik DNA moleküllerindeki her bir replikasyon çatalında gerçekleşen DNA sentezi, yarı kesikli biçimde yürütülmektedir. Bu kesikli sentez mekanizmasında oluşan Okazaki parçacıklarının uzunlukları ise prokaryotlardakilerine oranla daha kısa olup, 100-200 nükleotid uzunluğundadırlar. Replikasyonun tamamlanma noktalarında ise komşu replikasyon çatalları birleşir. Buna göre, tamamlanma noktaları (terminus) büyük bir olasılıkla sabit değildir. Ayrıca, ökaryotik DNA moleküllerindeki replikasyon orijinleri arasındaki mesafe, oldukça kısa olup replikasyon hızları da prokaryotlarınkinden tamamen farklıdır (Tablo 4.2 Temizkan 6.4). Prokaryotik DNA moleküllerinde bir tane replikasyon orijini bulunurken, ökaryotik kromozomların her birinde organizmanın genom yapısına bağlı olarak değişen ve yaklaşık olarak birkaç bin kadar olan replikasyon başlangıç noktaları bulunmaktadır. Ökaryotik DNA moleküllerinin replikasyon hızı ise prokaryotlardaki DNA moleküllerinin replikasyon hızına oranla çok daha yavaştır. Örneğin, bakterilerde 50 000 bp dak-1 olan replikasyon hızı memelilerde 1000-3000 bp dak-1’ya düşmektedir. Bitkilerdeki replikasyon hızı ise hem prokaryotlardaki hem de memelilerdeki replikasyon hızına oranla çok daha düşüktür. Ökaryotlardaki replikasyon hızının prokaryotlara oranla çok daha yavaş olmasına rağmen, ökaryotik DNA molekülleri üzerinde çok sayıda replikasyon orijinlerinin bulunması ve bu orijinlerin hepsinde de replikasyonun aynı anda devam etmesi nedeni ile ökaryotik DNA moleküllerinin replikasyonu da uygun bir sürede tamamlanabilmektedir. Ökaryotik DNA moleküllerinin replikasyonu ile ilgili olarak bu özelliklerinden de anlaşıldığına göre, kromozomlardaki DNA replikasyonunun süresi, replikasyon başlangıç noktalarının sayı ve replikasyon çatallarının kapladığı alan tarafından kontrol edilmektedir. Ayrıca, ökaryotik hücrelerdeki DNA moleküllerinin kromatin yapısında oluşu, çözülme ve replikasyonun başlaması için gereksinimleri daha da karmaşıklaştırmaktadır. Bu durumda, kromatindeki yoğun histon-DNA komplekslerinin ortadan kaldırılması, daha sonra ise replikasyon devam ederken oluşan yeni DNA moleküllerinin ise eş zamanlı olarak kromatin yapısını kazanmaları gerekmektedir (Şekil 4.8). Bütün bu sorunlara ilave olarak, ökaryotik DNA moleküllerinin lineer yapıda olması, replikasyonun tamamlanmasına ilişkin bazı sorunları da ortaya çıkarmaktadır. Oysa ki lineer yapıda olan prokaryotik DNA moleküllerinin replikasyonunda ortaya çıkabiliecek olan bu sorunlar çeşitli mekanizmalar ile çözülmüş bulunmaktadır (bkz. kısım 4.7). Ökaryotların lineer olan DNA moleküllerinin replikasyonunda ortaya çıkan sonlandırma problemi ise kromozom uçlarında (telomerlerde) replikasyonun tamamlanabilmesi için bazı özel mekanizmaların geliştirilmesinin zorunluluğunu ortaya çıkarmaktadır. Son zamanlarda elde edilen bulgulara göre, ökaryotik kromozomların uçları farklı bir mekanizma ile replike edilmektedir. Mayalar, omurgasızlar, omurgalılar ve bitkilerde kromozoların uçlarında biribirne benzeyen ve değişik özellikte bir yapının bulunduğu anlaşılmıştır. Bu bulguların ilki ise bir protozoon olan Tetrahymena ile yapılan çalışmalardan elde edilmiş olup, bu protozoonun kromozomlarının telomerlerinde DNA çift sarmalının 3' ve 5' uçlarını bir arada tutan saç tokası biçiminde bir ilmeğin ve çok sayıda (30-70 defa) arkası arkasına tekrarlanan kısa bir dizinin (5'-TTGGGG-3') varlığı tesbit edilmiştir. DNA zincirlerinden birinde, saç tokası ilmeğinin yakınındaki tekrarlanan dizi kümesi içinde, çok sayıda zincir kırılmaları da vardır (bkz. kısım 2.3.1.3). Telomerlerde, replikasyonun tamamlanmasına ve sonuçta bu yapısal özelliklerin meydana gelmesine ise bir terminal deoksinükleotidil transferaz olan (bkz. kısım 4.7) telomeraz enziminin yol açtığı anlaşılmıştır. Buna göre, ribonükleoprotein yapıdaki telomeraz, replikasyondan sonra 3' ucu kullanarak ve bu uca tekrarlanan 5'-TTGGGG-3' dizileri ekleyerek zinciri uzatır. Daha sonra, primaz ve DNA polimeraz bu kalıptan yararlanarak yeni 5'-CCCCAA-3' dizileri sentezler. Ligasyonun tamamlanmaması, C bakımından zengin olan zincirde kırıklara yola açar. Ayrıca, 5'-TTGGGG-3' dizili zincirin 3' ucundaki ilmek, G-C eşleşmesiyle oluşur. Tek hücreli ökaryotlarda açıklanan ve doğrulanan bu mekanizmanın büyük olasılıkla tüm ökaryotlar için geçerli olduğu düşünülmektedir.

http://www.biyologlar.com/dna-replikasyonunda-rol-alan-enzimler

HÜCRE DÖNGÜSÜNÜN KONTROLÜ

Dört aşamada hücre döngüsü kontrol noktaları bulunur: 1.G1 kontrol noktası: DNA hasarına ve olumsuz koşullara duyarlıdır. DNA tamiri, G0 ya da apoptozagiriş. 2.S-fazı kontrol noktası: DNA’nın devamlı olarak bütünlüğü sağlanır ve replikasyonsonucu oluşan hatalar kontrol edilir ve onarılır. 3.G2 kontrol noktası: Replikeolmamış ve hasarlı DNA’ya duyarlıdır. Tamamlanmadan mitoza geçişe izin verilmez. 4.İğ-ipliği oluşumunda kontrol noktası:Kromozomların mitotikipliklere düzgün tutunamamasına duyarlıdır. -Her bir kontrol noktası evreler arasındaki koordinasyonu sağlar: **Devam etmekte olan evre tamamlanmadan hücrenin bir sonraki faza girmesini engeller. **Replike olmamış ve hasarlı DNA’ya duyarlıdır **DNA replikasyonunu ve tamirini koordine eder. -1. Hücre çevresini kontrol eder: *besin *hormon *büyüme faktörleri vb. yeterlimi? 2. DNA replikasyonu için karar verir. __G1 KONTROL NOKTASI Replikasyonun başlaması için karar verilen geç G1 evresindeki özel kontrol bölgesine “restriksiyon noktası” denir.G1 kontrol noktasında DNA’nın hasarı kontrol edilir. Bu noktada hasarın onarılması ile ilgili hücreye zaman tanınır.P53 mutasyonları hücresel genomda mutasyonları arttırır. *G0 evresine dönüş yok. Döngü tamamlanır. Hücre bölünmenin olmadığı uzun sessiz G0 evresine; *uygun olmayan koşullar *büyümeyi engelleyici sinyal varlığında girer. Not:Bazı koşullar ya da sinyaller ise hücrenin G0 yerine apoptoza girmesini tetikler. DNA hasarı apoptozu tetikleyen bir sinyal olabilir. -Her bir döngüde DNA replikasyonunun sınırlandırılması **Helikaz enzimlerinin (MCM) aktivitesi belirler. **Replikasyon orijinini tanıyan proteinlerle birleşir. **Yalnızca G1 fazında kompleks oluştururlar. **Birleşmeleri hücre döngüsü regülatörleri olan protein kinazlar tarafından kontrol edilir. -HÜCRE DÖNGÜSÜ DÜZENLEYİCİLERİ Hücre döngüsündeki evrelere geçiş ve döngünün tamamlanması protein grupları tarafından kontrol edilir.Olgunlaşmayı ilerleten faktör (MPF): Sitoplazmada bulunur. İki alt ünite içerir: 1.Siklin proteinleri (cyclin): cyclinA, cyclinB, cyclinD ve cyclinE. 2.Siklin-bağımlı protein kinazlar(Cdk): Cdk1, Cdk2, Cdk4 ve Cdk6 Periyodik aktivasyon-inaktivasyon(fosforilasyonve defosforilasyon) gösterirler. ___Not:Cdk’ların Kontrol Mekanizmaları 1.Siklinlerle birleşme 2.Threonin 160’da fosforilasyonun aktivasyonu 3.Threonin 14 ve tirozin 15’de engelleyici fosforilasyon 4.Cdk inhibitörleri ile birleşme. ALINTIDIR...

http://www.biyologlar.com/hucre-dongusunun-kontrolu

Çiftli Geçiş Sistemi ve pORI plazmit sistemi

Plazmit vektörler kullanılarak klonlanmış genler kromozoma entegre edilebilir ve kromozomdan hedef gen mutasyona uğratılabilir. pORI plazmit sistemi kromozom üzerinden gen mutasyonunda kullanılan sistemdir. pORI plazmitleri replikasyonunu başlatacak repA genini içermemektedir (Leenhouts ve ark., 1998). Dolayısıyla RepA proteini kromozomdan veya diğer bir yardımcı plazmitten (pVE6007) sağlandığı sürece replike olabilmekte, aksi durumda kromozoma entegre olmaktadır (Leenhouts ve ark., 1990). pVE6007 plazmiti sıcaklığa hassas RepA proteinini sentezlediğinden plazmit 30°C’ye kadar olan sıcaklıklarda replike olabilmektedir. Sıcaklığın 30oC’den 37oC’ye yükseltilmesi ile RepA replikasyonu önlenmektedir (Maguin ve ark., 1992). Sıcaklığa hassas plazmitin replikasyonunun sıcaklık değişiminden dolayı sonlanması, pORI plazmitine klonlanan hedef geni üst veya alt bölgelerden birinin yardımıyla kromozoma entegre olmaya mecbur bırakacaktır. pORI plazmitinin taşıdığı lacZ geni sayesinde tekli geçit (single cross over) sistemiyle bakteri X-gal bulunduğu ortamda mavi renkte görünecektir. Bir ileriki safha olan çiftli geçiş sistem (double cross over) safhasında kromozoma entegre olan pORI plazmitine ait alt ve üst bölgeler kromozomda bulunan homologları ile eşleşerek lacZ, antibiyotik dirençli ve hedef genin kromozomdan koparılmasını sağlayacaktır. Çiftli geçiş sistemi sonucunda oluşacak beyaz renkli bakteri kolonileri ya başlangıç veya mutant formundadır ve antibiyotik dirençli geni ve LacZ enzimi içermemektedir. Mutant bakteriler PCR yöntemiyle başlangıç formundaki bakterilerden ayırt edilebilmektedir (Gasson ve ark., 1996).

http://www.biyologlar.com/ciftli-gecis-sistemi-ve-pori-plazmit-sistemi

HEPATİT B

Siroz ve karaciğer kanserinin önde gelen nedenlerinden biri olan hepatit B, tüm dünya için ciddi bir sağlık sorunu oluşturmaktadır. Dünyada yaklaşık 350 milyon kişi hepatit B hastası ya da taşıyıcısı durumundadır. Dünya nüfusunun üçte biri yüksek enfeksiyon riski olan bölgelerde yaşamaktadır. Her yıl 4 milyondan fazla akut klinik HBV vakasıyla karşılaşılmaktadır ve 1 milyon insan kronik aktif hepatit, siroz veya primer karaciğer kanseri nedeniyle hayatını kaybetmektedir. Hepatit B virüsünün (HBV) dünya çapındaki hepatosellüler karsinom vakalarının %80’inden sorumlu olduğu ve insanı etkileyen karsinojenler arasında sigaradan sonra ikinci sırada olduğu bildirilmiştir. (WHO/CDS/CSR/LYO/2002,2: Hepatitis B ). HEPATİT B BULAŞMA YOLLARI 1. Perkütan (parenteral) bulaşma •Çoklu transfüzyon yapılan hastalar •Hemodiyaliz hastaları •Damar içi uyuşturucu bağımlıları •Dövme yaptıranlar •Sağlık personeli 2. Cinsel temasla bulaşma •Erkek eşcinseller •HBV taşıyıcılarının cinsel partnerleri •Çok partnerli heteroseksüeller 3. Perinatal bulaşma •HBV taşıyıcısı annelerin bebekleri 4. Horizontal bulaşma •Kötü hijyen ve düşük sosyoekonomik durum HEPATİT B’NİN BELİRTİLERİ: Hepatit B hastaların çoğunda belirti vermez. Bir kısım hastada ise non-spesifik bulgular görülebilir. Bunlar: •Aşırı halsizlik •Hafif derecede ateş •Baş ağrısı •Bulantı, kusma, iştah kaybı •Özellikle karaciğer bölgesinin üzerinde ağrı ve hassasiyet •Kabızlık veya ishal •Kas ve eklemlerde yaygın ağrı •Deride kızarıklık 5 yaşın üzerindekilerin ve yetişkinlerin % 40’ında sarılık ortaya çıkabilir. Bebeklerin ise ancak % 10’unda sarılık görülebilir. HASTALIĞIN SEYRİ: Hepatit B, akut ve kronik seyir gösteren bir hastalıktır. Akut formu, hiç belirti vermeden geçirilebildiği gibi birkaç hafta süren hafif belirtilerle de seyredebilmektedir. Bu süreç genelde 4-8 hafta olabilir. Ancak HBV, 6 aydan fazla sürede bir kişinin kanında ve karaciğerinde tespit edilirse hastalık kronikleşmiş demektir. Kronikleşmiş hepatit B siroz veya karaciğer kanserine sebep olabilmesi nedeniyle önemlidir. Doğum sırasında bulaşan hepatit B’nin kronikleşme olasılığı %90 olduğu için çocuklar daha riskli grupta yer almaktadır. Yine 1-5 yaş arasındaki çocuklarda hepatit B’nin kronikleşme olasılığı %30’dur. 5 yaşından sonra ise bu rakam % 7’lere kadar gerilemektedir. HEPATİT B VE KAN TESTLERİ: Gerek fizik muayene sonucunda, gerekse başvurma sebebiniz göz önünde bulundurulduğunda eğer Hepatit B şüphesi var ise hekiminiz hepatit B ile ilgili testler isteyecektir. Bu testleri iki ana başlık altında toplamamız mümkündür: Hepatit Testleri Serolojik Testler Vücudumuzun bağışıklık sistemi tarafından, hastalık yapıcı ajanlara karşı oluşan antikorları tespit eden testlerdir. Pozitif seroloji testi, bir kişinin hepatit virüsüyle karşılaşmış olduğunu, kanında virüse karşı antikor oluştuğunu ve buna bağlı olarak da vücudunda bağışıklık kazandığını gösterir. Moleküler Tabanlı Testler Virüsün vücutta antikor oluşturmasına gerek yoktur. Moleküler yöntemlerle virüsün kalıtsal materyalinin varlığı ve miktarı saptanabilmektedir. Erken aşamada tanı için önemlidir. Virüs miktarının belirlenmesi ise tedavi için gereklidir. HEPATİT B SEROLOJİK TESTLER •Hbs-Ag: Hepatit B (surface) yüzey antijeni •Anti-Hbs: Hepatit B yüzey antijenini nötrleştirmek için vücut tarafından üretilen koruyucu proteindir. •Hbe-Ag: Hepatit B antijenlerinden biri, “early” antijeni olarak adlandırılır. •Anti-Hbe: Hepatit B Hbe-Ag antijenini nötrleştirmek için vücut tarafından üretilen koruyucu proteindir. •Anti-Hbc(Ig-M) : Hepatit B “core” antijeni (erken dönemde çıkar). •Anti-Hbc(Ig-G) : Hepatit B “core” antijeni (Geç dönemde çıkar). MOLEKÜLER TABANLI TESTLER HBV’ye ait antijenlerin veya antikorların hasta serumunda saptanmasını sağlayan serolojik testler, infeksiyonun hangi evrede olduğunu belirlemede veinfektivitenin değerlendirilmesinde yaygın olarakkullanılmaktadır. Serolojik testlerin yetersiz kaldığı durumlarda, atipik serolojik vakalardatanıya gitmede, antiviral tedavinin izlenmesinde veçeşitli mutasyonların tespitinde moleküler biyolojiteknikleri kullanılmaktadır. HBV-DNA PCR: PCR (Polymerase chain reaction) ya da polimeraz zincir reaksiyonu, moleküler biyolojide uygulanan bir teknik olup, basitçe nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması olarak tanımlanabilir. Yani elimizdeki mevcut DNA’dan milyonlarca kopya elde etmemizi sağlayan bir tekniktir. HBV-DNA PCR, hepatit B virüsünün saptanmasında rutin olarak kullanılan, analitik duyarlılığı oldukça yüksek olan bir testtir. Testin amacı, analiz edilen numunede hepatit B virüs DNA’sını (HBV-DNA) saptamaktır. Böylece virüsün varlığı da saptanmış olmaktadır. Bu yöntemle çok düşük miktarlarda HBV-DNA (10-50 kopya/ml) tespit edilebilmektedir. HBV-DNA KANTİTATİF KantitatifPCR metotları yüksek sensitivitelerinden dolayıHBV DNA seviyelerini ölçmek için dekullanılmaktadır. Son zamanlarda kullanımıgittikçe yaygınlaşan real-time PCR (RT-PCR)tekniği, HBV DNA’nın kantitasyonuna imkansağlayan hızlı ve basit bir testtir. HBV-DNA Kantitatif testi viral yük miktarını tespit etmek için kullanılmaktadır. Bu yöntem, termocyle süresince oluşan PCR ürününün vermiş olduğu fluoresansın belirli zaman aralıklarında ölçülmesi temeline dayanır. Sonuçta, HBV yüzey geni için düzenlenmiş bir proba ve bilinen konsantrasyonları içeren referans standartlarla HBV DNA kantitasyonun(miktarına) ulaşılır. Bu teknikle serumda çok az miktarda HBV DNA genom kopyası varsa bile tespit edilebilir. HBV-DNA Kantitatif testinin isteneceği durumlar: •HBV-DNA PCR testi pozitifliğinde, •Hastalığın aktif (viral replikasyonun devam ettiği) veya inaktif durumunun tespitinde, •Viral yük miktarına göre tedavi stratejilerinin belirlenmesinde, •İlaç tedavisi gören hepatit B hastalarında, tedaviye verilen yanıtın sorgulanmasında, •Kronik hepatit B hastalarında hastalığın hangi düzeyde olduğunun belirlenmesinde. HBV-DNA ANTİVİRAL İLAÇ DİRENCİ MUTASYON TESTLERİ Antiviral ilaçlar, virüs replikasyonunu hücre düzeyinde inhibe eder. Modern antiviral ilaç geliştirmenin zemininde yatan temel düşünce, bloke edilebilen viral protein veya protein kısımlarının belirlenmesidir. Hepatit B virüsüne karşı geliştirilmiş antiviral ajanlar mevcuttur. Bu antiviral ilaçların klinik kullanımı sırasında, antiviral ilaçlara dirençli virüsler gözlenebilmektedir. Viral genomdaki mutasyonlar ve selektif ilaç baskısı, dirençli bir virüs populasyonunun ortaya çıkmasına neden olur. Dirençli virüs türlerinin çoğunda spesifik ilaç hedefini veya aktivatörünü kodlayan genlerde mutasyon vardır. Antiviral ilaç direnci, viral infeksiyonların yönetimi için önemli bir problemdir. LAMİVUDİN Bir sitozin nükleozid analoğudur. HBV-DNA supresyonu, ALT normalleşmesi ve karaciğer histolojisinde düzelme açısından hem HBeAg pozitif, hem de HBeAg negatif hastalarda etkili olduğu bildirilmiştir. Lamivudin tedavisi esnasında veya kesildikten 6-9 ay sonra hepatik alevlenme ortaya çıkabilmektedir. Bunun nedeni lamivudine dirençli HBV mutantlarının (YMDD Mutasyonu) ortaya çıkmasıdır. HBV infeksiyonunda lamivudin direnci; in vitro duyarlılığının 40-104 kez azalması anlamına gelmektedir. 552 ve 528 no’lu kodonlardaki mutasyonlar lamivudin duyarlılığının azalması ile sonlanır ve bu HBV-DNA polimerazın YMDD motifindeki değişiklik ile beraberdir. Sekans analizleri ile virüsün geçirdiği mutasyonlar tanımlanarak genotipik direnç olup olmadığı tespit edilebilir. ADEFOVİR DİPİVOKSİL Adefovir dipivoksil, hücresel kinazlar tarafından fosforillendikten sonra Adefovir difosfat halinde viral DNA’ya inkorpore olur. Böylece HBV-DNA polimerazı (reverse transcriptase) doğal substratı deoksiadenozin trifosfat ile yarışarak inhibe eder. Adefovir dipivoksil Eylül 2002’de FDA tarafından onaylanarak kronik HBV’de kullanılmaya başlandığı bildirilmiştir. Lamivudin-rezistan suşlara da in vitro ve in vivo etkili olduğu bilinmektedir. 4 yıllık adefovir dipivoksil kullanım sonucunda % 29 oranında direnç geliştiği bildirilmiştir. Adefovir direnci, HBV polimerazın D domainindeki rtN236T ve B domainindeki rtA181V/T mutasyonları ile karakterizedir. ENTECAVİR DİRENCİ Entecavir bir guanozin nükleozid analoğu olup, 2005 yılında FDA tarafından kronik HBV tedavisinde kullanılmak üzere onaylanmıştır. Entecavir; HBV replikasyonunun üç aşamasında etkilidir: HBV reverse transcriptase etkinliğinin başlamasını önler, reverse transcriptase aktivitesini bloke eder ve DNA’ya bağımlı DNA sentezini inhibe eder. Entecavire karşı direnç, lamivudine dirençli hastalarda sonradan görülebilmektedir. Yapılan çalışmalar, lamivudine dirençli suşların adefovire ve tenofovire duyarlı, entecavire ise duyarlılığının daha az olduğunu bildirmektedir. Lamivudine dirençli hastalarda tedavinin ikinci yılından sonra %10 oranında entecavire direnç gelişmektedir. Entecavir direncine; HBV polimerazın B domainindeki I169T, T184G, C domainindeki S202G/I, ve E domainindeki M250V mutasyonların sebep olduğu bildirilmiştir.

http://www.biyologlar.com/hepatit-b

Gen Tadavi

Gen tedavisi, çeşitli pek çok klinik durumun gelecekteki tedavisi için ümit vermeye devam etmektedir. Alışılmamış, biçim verilmiş gen transfer vektörlerinin gelişimi, tedaviye yönelik gen ifadelerinin verimini ve stabilitesini arttıracaktır. Doku ve organ nakli konusunda ise gen tedavisinden nakledilmiş dokunun akut ve kronik reddedilmesini engellemek amacı ile ya reddetmeyi engellemede önemli yeni genler (örneğin: yardımcı uyarıcı blokaj molekülleri yada imünosupresif sitokinez) yada adezyon molekülleri gibi reddetme ile alakalı moleküllerin üretimini engellemek için anti-duyusal nükleik asitler aşılayarak yararlanılmaktadır.Genlerin yabancı donör antijenlerini (alloantijenler) kodlayan gen tedavisi vektörleri tarafından taşınımı ayrıca alıcıda donöre özel cevapsızlık (immunolojik tolerans) oluşturmanın etkili bir yolu olup, belki de potansiyel olarak zararlı bütün vücut immunosüpresyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırabilir. Hastalıklar üzerinde yapılan yüzlerce yıllık çalışmalar teşhis, tedavi ve araştırmada bugün kullanılan çeşitli pek çok sofistike tekniğin gelişmesine neden olmuştur. 1960'larda hastalıkların nedenini anlamak üzere yapılan araştırmalar hastalıklı hücrelerin biyokimyasını analiz etmek ve çeşitli protein etkileşimlerini incelemekle sınırlı idi. Bu araştırmalar değerli idiyse de, o zamanın bilim adamları hastalık proseslerini, tam olarak anlamak üzere onları oluşturan parçalara ayırıp incelemek için gerekli teknoloji ve ajanlardan yoksundular. DNA'yı spesifik noktalarından kesen kesme enzimleri ilk olarak 1970'lerde keşfedildi ve moleküler biyolojide kullanılmaya başlandı. Genleri kesmek, ayırmak ve bir araya getirmek için bu kesme enzimlerini kullanarak, araştırmacılar, genetik faktörlerin hastalıklarda oynadığı önemli rolleri anlamaya başladılar. Şu anda, İnsan Genom Projesi tamamlanmak üzereyken, bize açık olan bilgi hazinesini yorumlamaya çalışıp, hastalıklar ve genler arasında yeni bağlar kurabiliriz. Bir kere kurulduktan sonra, bu bilgi gen tedavisinin bir tedavi stratejisi olarak kullanımını hızlandırmaya yarayacaktır. Allograft reddedilmesi ve immonolojik toleransÖngörülebilen gelecekte, hastalara allojenik yani “major histocompatibility complex locus”ta aynı olmayan organlar nakil edilmeye devam edilecektir. İmmunnosupresif ilaçların verilmesi gibi herhangi bir tedavi uygulamadan, ana olarak T-hücrelerinin arabuluculuk yaptığı bağışıklık cevabı, böyle bir aşılamayı reddedecektir.?Şekil 1??Kendine tolerans (vücüdün kendi T hücrelerinin vücut dokularına reaksiyon gösterememesi) olgunlaşmamış T hücreleri, gelişip timustan geçerken kazanılır. Bunun olmasının nedeni potansiyel olarak otoreaktif T hücrelerinin çoğunun klonal silme işlemi ile "negatif olarak seçilmiş olmalarıdır" fakat klonal anerji (antijene karşı cevapsız kalan, varlığını sürdürebilen T hücrelerinin varlığı) ve düzenleyici T hücreleri populasyonu yaratılmasının bu konuda bir rolü olabilir. Nakil İmmünologlarının en büyük hedefi doku alıcılarında, alloantijenlere karşı uzun zamanlı nakil toleransı yaratmaktır. Bu tür bir bağışıklık durumunda hasta, yabancı antijenlere (örn. bakteriler, virüsler ve ortaya çıkan kötü niyetli hücreler) karşı normal reaksiyon gösterirken, doku naklini reddetmek yerine tolere edecektir. Bu tür ideal bir durumda, sistemsel immunosüpresif ilaçlara (getirdikleri bütün dezavantajlarla birlikte) gerek kalmayacak, ve doku alıcıları tüm fonksiyonlarını yerine getirebilen, sağlıklı bir bağışıklık sistemi sahibi olacaklardır. Gen tedavisi nedir?Bir gen, belirli bir proteini kodlayan çizgisel bir DNA zinciridir. Bazı nadir durumlarda, genellikle hücre bölünürken, bir genin nükleotit zinciri (DNA taban çiftlerinin sırası) birbirine karışıp, mutasyon geçirebilir ve böylece oluşan protein hatalı olur. Bu tür mutasyon olayları sistik fibrosis, adenosine deaminase (ADA) yetersizliği ve orak hücresi anemisi gibi genetik hastalıkların ana nedenidir. Örneğin sistik fibrosisten rahatsız kişiler, sistik fibrosis transmembran iletim düzenleyicisi adındaki hücresel taşıma proteinini hatalı olarak üretirler, ki bu akciğerlerinde mukoza birikmesine yol açar. Gen tedavisinin ilk uygulamaları, hatalı bir genin (ya da gen kombinasyonunun) neden olduğu bir hastalığın, eğer genler “doğru” versiyonları ile değiştirilebilirlerse kontrol altına alınabileceği, engellenebileceği yada tedavi edilebileceği prensibi üzerine kurulmuştu. Gen tedavisi doğuştan var olan yada sonradan edinilen pek çok genetik hastalık için kullanılmaktadır. Fakat pek çok hastalık birden fazla genetik faktör ile bağlantılıdır (polijeniktir). Hastalık sürecindeki çeşitli genlerin ve kodladıkları proteinlerin bağlantıları hatasız olarak kurulana dek, gen tedavisi klinik olarak, ancak ADA yetersizliği, familial hypercholesterolaemia ve sistik fibrosis gibi tek gen hataları için önleyici ve iyileştirici tedavi olarak etkili olacaktır. Gen tedavisi protokollerini kullanan pek çok klinik deneme zaten tamamlanmıştır, genel olarak kullanılan gen transfer vektörlerinin yetersizliği yüzünden protokollerin etkisi önceden öngörüldüğü kadar dramatik olmamışsa da sistik fibrosis ve ADA yetersizliğinden şikayetçi hastalarda bir takım başarılar elde edilmiştir. 1980’lerde aslen “gen değiştirme tedavisi” olarak bilinen gen tedavisi, ilk tanımını aşmıştır ve in vivo yada ex vivo, bir gen transferi öğesi içeren her türlü protokole uygulanmaktadır. Bu genlerin mutlaka hastalığa yol açıyor olması da gerekmemektedir. In vivo gen transferi genlerin hücrelere vücutta bulundukları yerde aşılanmasıdır. (örneğin: kol üzerindeki deri hücrelerine yada gen transfer vektörünün ciğerlere çekilmesinden sonra akciğer epitel hücrelerine) Ex vivo gen transferi, genlerin geçici olarak hastadan alınmış hücrelere verilip, tekrar hastaya aşılanmasıdır (örneğin: kemik iliği hücreleri). Gen tedavisi somatik hücre gen transferi (normal diploid hücrelere yapılan transfer), ve germline gen transferi (üreme sisteminin haploid sperm yada yumurta hücrelerine yapılan transfer) olarak alt gruplarına ayrılabilir. Germline gen transfer hakkındaki etik konular somatik gen transferi ile ilgili olanlardan çok daha karışıktır çünkü genler sadece alıcılara değil aynı zamanda onların çocuklarına da aktarılır. Germline gen transferi araştırmalar için transgenik hayvan üretiminde, tarım ve biyoteknoloji için çeşitli alanlarda gittikçe artarak kullanılmaktadır, fakat hayvanlarda transfer edilen her genin uzun dönem etkileri dikkatlice gözlenip analiz edilmelidir, eğer varsa kalmış olan vektör DNA’larda büyük önem taşır. Germline gen tedavisinin insanlara getirebileceği yararlar kayda değerdir. Ciddi ve acı verici kalıcı genetik hastalıkların gelişimi doğumdan önce önlenebilir ve izleyen kuşaklarda ortadan kaldırılabilir. Fakat, hatalı kullanım ve öjenik potansiyeli yüzünden, insanlarda gen tedavisi geniş bir biçimde tartışılmalı ve alakalı güvenlik konuları değerlendirilmelidir. Ancak bundan sonra bu yaklaşım hastalıkların tedavisinde kullanılabilir. Nakilde gen tedavisi kullanımıDNA’nın nakil araştırmalarında kullanımının kayıtlı ilk denemesi Haskova, onun meslektaşları ve verici soydan DNA naklinin, takip eden bir nakile karşı bağışıklığa (ani reddetmeye) neden olup olmayacağını araştırmakta olan Medawar tarafından uygulandı. Medawar tarafından yürütülen deneylerde, soy A bir verici farenin dalağından alınan DNA arındırılıp, 5 mg’ı daha önceden müdahale edilmemiş bir farenin (CBA soyu) peritoneal (karın) boşluğuna enjekte edildi. Alıcı fareye 3-5 gün sonra verici soy A farenin derisi nakledildi ve aşılamalar zaman içinde gözlendi. Aşılamalar DNA almayan farelerle aynı zaman içinde reddedildi, herhangi bir artış gözlenmedi. Medawar, nakil toleransı yaratmak için verici soy hücrelerini neonatelere enjekte etmekteki başarısının ardından gerçekleştirdiği bir başka deneyde, yine nakil toleransı yaratmak için yeni doğmuş farelere tekrar tekrar “yüksek dozlarda” verici soy DNA’sı aşılanmıştı; fakat bu yaklaşım deri aşılamalarının kabul edilme sürelerini uzatmadı. Bu erken deneylerin negatif sonuçları Medawar tarafından saf olmayan DNA preparatlarına ve polisakkaritlerle kontaminasyona bağlanmış olsa da, şimdi anlayabiliyoruz ki, kas içi enjeksiyon gibi farklı enjeksiyon yolları seçilseydi, - Geissler ve meslektaşları tarafından yakın zamanda ortaya konduğu gibi - çok daha değişik sonuçlar elde edilebilirdi. Organ nakli şu anda son safhasındaki organ yetersizlikleri için iyice yerleşmiş bir tedavidir. İmmünosupresif ilaçlardaki kayda değer gelişmeler (örneğin. Siklosporin, kortikosteroidler ve rapamisin) 1 yıllık ve 5 yıllık böbrek nakillerinin başarı şansını sırasıyla %85 ve %75’e çıkarmıştır. Bu etkileyici bir başarı olsa da, sağlıklı nakiller hala reddedilebilmektedir ve sistemsel immünosupresif ilaçların kullanımı da beraberinde kanser oluşumu riskinin artması, enfeksiyonlar ve iskemiye bağlı kalp hastalığı gibi kayda değer riskler getirir ve bu riskler uzun zamandır sorunsuz nakiller için de geçerlidir. Gen tedavisi var olan nakil ile alaklı problemlere yaklaşım için iyi bir stratejidir fakat genellikle sadece tamamlayıcı bir yaklaşım olarak kullanılmaktadır. Örneğin, nakil edilecek organların immünojenliklerini azaltmak amacıyla bu organlara, T-hücresi aktivasyonunu engelleyecek genler aşılanabilir yada alıcıya, vericiye ait Major Histocompatibility Locus (MHC) antijenleri aşılanıp nakil toleransı yaratılabilir. Her iki yöntemde potansiyel olarak kuvvetlidir. Nakil ile alakalı genlerMHC iyi korumalı fakat polimorfik bir gen lokusudur. MHC molekülleri, hücre içinde işlenmiş peptitleri heliksel bir yivde ligantlarına, T-hücresi alıcısına (TCR) sunan yüzey proteinleridir. Eğer uygun ko-uyarıcı moleküller antijen sunan hücrenin üstünde mevcut ise, antijen sunan hücreye peptit sunan MHC molekülü ve T-hücresi üzerinde belli bir TCR arasında “akrabalık etkileşimi” T-hücresi aktivasyonuna yol açabilir. MHC sınıf I molekülleri 3 alfa alanı ve MHC gen lokusu tarafından kodlanmamış bir ?2 mikroglobulin zincirinden oluşur. MHC sınıf II molekülleri iki alfa alanı ve iki beta alanından oluşur. Sınıf I molekülün üstünde sunulan peptitler genellikle hücre içi proteinlerden gelirken, sınıf II moleküller hücre dışı kaynaklı peptitler sunarlar. Peptitlerin gelişmemiş MHC moleküllerine taşınma mekanizması da bu iki sınıf molekül için çok farkldır. MHC, allograft (Bir canlıdan, genetik yapısı farklı başka bir canlıya doku yada organ nakli/aşılanması) reddini tetikleyen ana tanıma molekülüdür çünkü kendi (sinjeneik) ve kendi olmayan (allojeneik) arasındaki farkı saptar. Uygun bir organ vericisi aranırken, nakil edilen organa mümkün olduğu kadar çok çalışma şansı yaratabilmek için verici ve alıcı arasında karşılaştırılan antijenler MHC antijenleridir. Bahsi geçen durumlarda, MHC’nin bu potansiyelinden bağışıklık sistemininin dengesini bağışıklıktan toleransa kaydırmak için yararlanılmıştır. Tolerans yaratmak maksadıyla organ alıcısının, vericinin MHC antijenlerine maruz bırakılması, ilk olarak 1953’te Billingham ve meslektaşları tarafından bir fare modelinde, verici soydan hücreler alıcı farenin uterusuna enjekte edilmesiyle gerçekleştirildi. Bu ilk denemenin ve takip eden araştırmaların ardından nakil öncesi kan nakilleri (mutlaka organ vericisinden olması gerekmeden) MHC alloantijenlerini alıcıya verebilmek için klinik olarak kullanılmaya başlandı ama sınırlı başarı elde edildi. Fakat kan ürünlerinin kullanılması beraberinde enfeksiyonlar, nakil reaksiyonları gibi doğal riskler getirdiğinden, özelleşmiş bir yaklaşım kullanan daha yenilikçi bir tedavi organ alıcılarını kanda bulunan alloantijenlere karşı duyarlı hale getirme riskini ortadan kaldırmış olur. Verici genlerinin, alıcının hücrelerine yada dokularına verilmesi gayet özelleşmiş bir tedavidir, yabancı hücrelerle alakalı riskler taşımaz ve alıcıların verici dokusu vücuda girmeden önce yabancı genlerle ön-tedavi edilmesine olanak verir. Hayvan modellerdeki MHC gen transferleri ayrıca allojenik MHC antijenlerinin, diğer antijenlerin etkisi olmadan alıcının bağışık hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için yararlıdır. Bu tür bir yaklaşım ilk olarak Madsen ve meslektaşları tarafından, vericiden alınan tek bir MHC sınıf I geni, alıcı türü bir farenin hücre hattına transfekt edilip, ardından alıcıya verildiğinde yürütülmüştü. Bu çalışma ile takip eden kalp nakline karşı cevapsızlık sağlanmasının yanında alıcının, vericinin uyuşmayan her türlü MHC moleküllerine maruz kalmasına gerek olmadığı anlaşıldı. Bu deney bu yöntemin işe yarayabileceğini kanıtlamış olsa da, transfekt edilmiş alıcı hücrelerini kullanmak klinik olarak pratik bir çözüm değildir. Bundan sonraki adım Wong ve meslektaşları tarafından atılmıştır; alıcı fareden alınan kemik iliği hücreleri MHC sınıf I gen ile retroviral bir gen tedavisi vektörü kullanılarak ex vivo transdüksiyona uğratılmış (virüs ile enfekte edilmiş) Bu yaklaşım tarzı da tamamen allojeneik bir kalp naklinde uzun dönem cevapsızlık yaratmıştır ama alıcı daha önce MHC sınıf I genlerine maruz kalmadığı bir vericiden alınan 3. parti bir nakli reddetmiştir. MHC moleküllerinin bir başka enteresan özelliği de çözünebilir yada zara bağlı olmalarına bağlı olarak bağışıklık sisteminin cevabını değiştirebilme yeteneğidir. İnsan karaciğeri naklini izleyen gözlemler ortaya koymuştur ki, çözünebilir insan verici lökosit antijenleri (HLA; insan MHC antijenleri) nakil sonrasında yüksek konsantrasyonlardadırlar. Bu toleranslı duruma sadece verici lökositlerinin mikrokimerizminin (düşük düzeylerde verici hücrelerinin alıcıda varlığını sürdürmesi) yol açtığı hipotezi ileri sürülmektedir; lakin eşit miktarda geçerli başka bir açıklama ise bu toleransın karaciğerin doğal olarak salgıladığı bol miktarda çözünebilir MHC molekülünün etkisi olduğudur. Çözünebilir vericiye ait MHC sınıf I moleküllerin immünosupresif etkileri olabilir, ve bu organ nakillerinde, organın fonksiyonunu sürdürmesini iyileştirebilir. Geissler ve meslektaşları, alıcı soydan gelen hepatositlerin lipofektin ile zara bağlı yada çözünebilir MHC sınıf I molekülleri kodlanan plazmit kullanılarak bir fare modeli kullanmışlardır. Zara bağlı MHC sınıf I moleküllerini belirten hepatositlerin, sitotoksik T-lenfosit (CTL) öncü hücrelerini primelarken, çözünebilir MHC sınıf I hücrelerine maruz kalmanın CTL öncülerin sayısını (frekansını) düşürdüğü gözlendi ki bu çözünebilir HLA sınıf I hücrelerinin insan alloreaktif CTL’lerde apoptoza neden olabileceğinin göstergesidir. İmmunosüpresif Sitokinezİmmuno-ayarlayıcı moleküller kodlayan genlerin nakledilen organ civarına verilmesi, yada direkt nakledilen organa verilmesinin, akut yada kronik reddetmede yabancı dokuya karşı oluşan bağışıklık cevabını azaltmada geniş bir faaliyet alanı vardır.Sitokinezler bağışıklık sisteminin çözünebilir ayarlayıcılarıdır ve bazılarının immünosüpresif etkileri vardır. Interlökin 10’un viral formu (vIL-10) Epstein-Barr virüsü tarafından kodlanmış olan bir proteindir, yapı olarak insan ve fare için homologdur ve IL-10’un sahip olduğu T-hücresi ko-uyarıcı özelliklerine sahip değildir. T-hücresi aktivasyonun kapatılması yada aşağı çekilmesinin gerektiği dokulara gen transferi yapılmasında yararlı bir araçtır. DeBruyne ve meslektaşları, nakil edilecek sıçan kalbine DNA-lipozom kompleksleri kullanılarak vaskülater perfüzyon aracılığı ile yapılan vIL-10 gen transferi nakil edilen organın hayatta kalma süresini uzattığı görülmüştür. (8 gün yaşayan muamele görmemiş organlara karşı 16 gün) Sonuç vIL-10 genine bağlandı, çünkü vIL-10’a bir anti-duyu plazmidiyle yapılan tedavi yada vIL-10’a hedeflenmiş bir monoklonal antikor nakil-uzatma etkisini tersine çevirdi. Dönüşüm büyüme faktörü beta (TGF) gibi diğer sitokin genleri de ayrıca kayda değer immünosupresif etkiler göstermişlerdir. Lakin bu yaklaşım tarzının amacı immünologikal tolerans yaratmak değildir, fakat yine de yerel immünosüpresyon yaratmak için yararlı olabilir. Ko-uyarıcı sinyalin engellenmesiKendine özgü TCR-MHC etkileşiminden oluşan hücre içi ilk sinyalden ayrı olarak bir T-hücresinin tam aktivasyonu CD28 ve B7-1 yada B7-2 (sırasıyla CD80 yada CD86)nin etkileşiminden oluşan ikinci bir ko-uyarıcı sinyal gerektirir. Sitotoksik T-lenfosit antijen 4 (CTLA-4 yada diğer adıyla CD152) CD80 ve CD86 için alternatif bir liganttır ve CD28 ile homologdur. CTLA-4 ün T-hücresi aktivasyonu aşağı çekmekle ilgili bir rolü olduğu düşünülmektedir. Bu ko-uyarıcı sinyalin mesela bir füzyon proteini kullanarak engellenmesinin, pek çok mürin ve primat çalışmalarında hücre arabuluğunda oluşan in vivo hümoral bağışıklık cevaplarını engellediği görülmüştür. CTLA-4Ig genini [CTLA-4 ve bir immunoglobulin (Ig)] bir kalp naklinin ardından damar içinden vermek üzere adenoviral bir vektör kullanan bir çalışmada, ortalama yaşama süresi kontrol grubundaki 6 güne göre, CTLA-4Ig transgenin ifade eden adenoviral vektörle tedavi edilen grupta 23 gün saptandı. Chahine ve meslektaşları tarafından yapılan bir başka çalışmada ise, CTLA-4Ig transgeni sinjeneik ve allojeneik iki grup fare kas öncü hücresine (lökoblastlar) transfekt edildikten sonra, diabetik bir farenin böbrek kapsüllünün altına allojeneik pankreas adacık(?) hücreleriyle beraber nakil edilmiştir. Sinejeik lökoblastlar adacıkların yaşama süresinde kayda değer bir artışa neden olmuşlar ve 11 günden 31.7 güne çıkarmışlardır, allojeneik lökoblastların yararlı bir etkisi görülmemiştir. Sinejeik lökoblastlar aktif olarak CTLA-4IG salgılamışlar ve allojeneik adacıkların olduğu çevrede immünosüpresyon yaratmışlar ve onların fonksiyonlarına devam etmelerine izin vermişlerdir. Lökoblastlar allojeneik olduğunda ise, alıcıdaki MHC eşitsizliği onları yok etmeye yetmiş ve CTLA-4IG’nin üretimini engellemiştir. Kronik reddetmeyle alakalı genlerİmmünosupresif ilaçlar ve organ korumasındaki gelişmelere rağmen bir allograft nakilden yıllar sonra hasar görmeye devam edebilir, bu yüzden kronik reddetme nakledilen organların başarısız olmasındaki en önemli etkendir. Histolojik olarak, kronik reddetme sırasında düz kas hücrelerinin nakil edilen organın damar ağı(?) etrafında hızla çoğaldığı ve bazen nakil aterosklerozuna (Atar damar duvarının esnekliğini yitirmesi ve sertleşmesi) neden olduğu görülmüştür, durumun bu son noktaya gelmesine pek çok faktör katkıda bulunur. Hücreler arası yapışma molekülü 1 (ICAM-1) gibi yapışma molekülleri ve vasküler endotelial-hücre büyüme faktörü gibi büyüme faktörleri artar ve teşvik edilebilir (inducible) nitrik oksit sintazın dengesi bozulur. ICAM-1ICAM-1 Ig süperfamilyasının bir üyesidir ve hücresel yapışma ve T-hücresi ko-uyarılmasında çok önemlidir. ICAM-1’in etkilerini ortadan kaldırıp T-hücresi aktivasyonunu azaltmaya yönelik yöntemler, böbrek allograftı hastaları ve ICAM-1 molekülüne karşı hedeflenmiş antikorlar kullanan klinik deneyler başarıyla yürütülmüş durumda. 18 hastalık bir çalışmada, anti-ICAM-1 antikoru (BIRR1) ölü vericilerden böbrek nakledilen ve nakil fonksiyonu gecikmesi riski yüksek olan hastalara verildi. BIRR1 serumunun yeterli bir miktarı (>10?g/ml) hem nakil fonksiyonu gecikmesi hem de reddetme olaylarının (p<0.01) kayda değer bir miktarda azalmasına neden oldu. Bu terapi mürin modellerde ICAM-1’in mRNA’sına hedeflenen anti-duyu oligonükleotitleri kullanmak için geliştirildi. Nitrik dioksitNakledilen organlardaki, vesselların intimal (iç) çoğalmaları kronik reddetmenin başka bir göstergesidir. İç kaplar tabakadan kaynaklanan nitrik dioksidin vasküler yara oluşumunun endojen bir inhibitörü olduğu hipotezini test etmek için, bir Sendai virüs virosomu iç kaplar tabaka hücreleri kaynaklı nitrik dioksit sintaz genini in vivo olarak nakletmek için kullanılmıştır. Von der Leyen ve meslektaşları, bir balon yara modeli kullanarak farenin karotid arterinin iç kaplar tabakasının bozulmasının ardından endothelial-hücresi nitrik oksit sintaz geninin transfer edilmesinin neointimal çoğalmayı %70 kadar düşürdüğünü ortaya koydular. Oksijen serbest radikalleriNakilden önce, çoğu organlar soğuk ortamda, tam bir kan kaynağı olmadan saklanır, bu olay soğuk iskemi etkisine neden olur. Bu, yeniden bağlanan kan kaynağını reperfusionu ile birleşince oksijen serbest radikallerinin neden olduğu hücre hasarı yaratabilir. Bu durumun kronik reddetme şansını kuvvetlendirdiği düşünülmektedir. Ciddi bir hasarı önlemek için, serbest radikalleri temizlemek üzere çözünebilir süperoksit dizmutaz (SOD) ex vivo olarak nakledilecek organa verilmiştir. Bugüne kadar, gen transferinde SOD’un kullanıldığı birkaç çalışma yapılmıştır. Bir araştırmada oksidasyon hasarı ile ilgili hastalıklar için SOD (yada aynı etkiye sahip katalaz) şifreleyen rekombinant adenovirüs kullanıldı. Farelerdeki bu akciğer-perfüzyon modelinde, iskemi-reperfüzyon hasarı değerlendirildi; ve sürpriz bir şekilde SOD’un fazla ifadesi iskemi-reperfüzyon hasarını kötüleştirdi. Hem SOD hem katalaz transgenlerinin ifadesi iskemi-reperfüzyon hasarındaki bu artışı engelledi fakat ondan koruyamadı. Uygulama yöntemleri ve gen tedavisi vektörleri için hücre hedefleriTimus içi uygulamaTimusiçi T-hücresi gelişimi prosesinin, nakil ve tolerans yaratma için kullanımı ilk olarak Posselt ve meslektaşları tarafından betimlenmiştir. Kendine tolerans (kendi dokusunda meydana gelmiş antijene cevap verememe) CD4- ve CD8- (çift negatif) olan T-lenfosit öncü hücreleri timustan geçerken oluşur. T-hücreleri timik epitel hücrelerindeki antijene maruz kaldıkları için, timustaki atijenle etkileşmeye yüksek eğilimi olan ve bu nedenle otoreaktif olan hücreler klonal silme prosesiyle negatif seleksiyona uğrar. TCR’leri timusiçi antijenlere eğilimi olmayan (yada çok az olan) fakat kendi MHC’sine karşı etkileşime yüksek eğilimi olan hücreler pozitif seleksiyona uğrarlar; ve bu hücreler gelişip, çoğalabilir ve çevrede daha büyük klonal populasyonlara genişleyebilirler/yayılabilirler. Knechtle ve meslektaşları, bir fare modelinde, bir gen tedavisi yöntemi kullanarak tolerans yaratmanın mümkün olduğunu gösterdiler. İlk olarak sinejeik alıcı kas hücreleri aldılar ve in vitro olarak bu hücreleri vericiden alınmış olan MHC sınıf I genleri ile transfekt ettiler. Bu hücreler daha sonra alıcının timüsüne enjekte edildi. Daha sonra alıcının çevresel bağışıklık sistemi, anti-lenfosit serumu kullanılarak potansiyel alloreaktif T-hücrelerinden temizlendi. Bunu alıcının bağışıklık sisteminin cevapsız kaldığı bir karaciğer nakli izledi. Takip eden bir çalışmada, verici soydan fareden MHC sınıf I tamamlayıcı (koplementer) DNA (cDNA), timik hücreleri yerlerinde transfekt etmek için, direkt olarak alıcının timüsüne verildi; polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak yapılan analizde timüste geçici olarak verici DNA’sına rastlandı (timositlerin timüsten dışarı verilmesi nedeniyle de bir süre daha sonra dalakta) Yukarıdaki yaklaşımlar ya DNA ile transfekt edilmiş hücreler yada çıplak DNA’nın kendisini kullanarak verici MHC genlerini alıcıya ulaştırmışlardır. DNA transfeksiyonu kullanılarak başarılmış gen tedavisinin verimi adenovirüs kullanılarak arttırılabilirdi. Adenovirüs vektörleri (yada sadece “Adenovirüs”) timüs içi uygulamalar için idealdir çünkü yüksek titrelerde üretilebilir ve çok çeşitli hücre türlerini transdüse edebilir. Genler, antijen sunan timik epitel hücrelerine değil gelişmekte olan timositlere de transfer edilebilir fakat immünojenik adenoviral antijenlere karşı merkezi tolerans (timüs, dalak ve kemik iliği gibi merkezi lenfoid organlardaki lenfositlerde oluşan tolerans) Ilan ve meslektaşları tarafından da ortaya konduğu gibi yaratılabilir. Çalışmalarında, rekombinant adenovirüsün timüs içine aşılanmasının nötralize edici antikorlar ve rekombinant adenovirüse karşı CTL’lerin orataya çıkışını inhibe ettiğini ortaya koymuşlardır. KaraciğerGen transferi ve organ nakliyle ilgili olarak karaciğerin pek çok ilginç özelliği vardır. Bazı durumlarda karaciğer organ nakli alıcılarının MHC-uyuşmazlığı olan nakilleri, nakil sonrası sistemik immünosupresyona gerek bırakmadan kendiliğinden kabul ettikleri olmuştur. Bu gözlemin nedeninin nakil sonrası verici MHC moleküllerinin çözünerek kan dolaşımına karışmasının ardından alloreaktif CTL cevabını aşağıya çekmesi olduğu hipotezi ortaya atılmıştır. Karaciğer kapı venası yada karaciğer arteri veya ikisi birden, viral yada non-viral gen tedavisi vektörlerinden herhangi birinin perfüzatını in vivo olarak vermenin en iyi yollarıdır. Chia ve meslektaşları bir çalışmalarında, perfüzyondan sonra etkili gen transferinin bir rapörtör gen kodlayan adenovirüs, tespit edilmiş soğuk korunmuş karaciğere hem karaciğer kapı venası hem de hepatik arterden verilerek elde edilebileceğini gösterdiler. Bu verim artışının nedeninin kısmen karaciğer içi mikro dolaşıma daha iyi ulaşımdan ve böylece virüs, hücre temaslarının artışından dolayı olduğu söylenmiştir.Fare modellerinde hepatik gen transferi için retroviral vektörlerde kullanılmıştır, lakin bu hücreler sadece aktif olarak bölünen hücrelerin transdüksiyonunda etkilidir bu yüzden hepatositleri bölünmeye teşvik etmek için retroviral transdüksiyondan önce kısmi bir hepatektomi gerçekleştirilmelidir. Kemik iliği hücreleriKemik iliği hücrelerinin, özelliklede haematopoietik gövde hücrelerinin önemi gen tedavisi de azımsanmaz. Kendini yenileme ve tüm kan hücresi yapıcı türlere farklılaşabilme potansiyeli, uzun dönem transgen ifadesi gerektiği durumlarda (genetik bozukluklar gibi) onları çok çekici hedefler haline getirir. HSC’lerin kemik iliği ve çevresindeki kanda aşırı düşük bir frekansta bulunması nedeniyle ne yazık ki ex vivo transdüksiyondan sonra takip eden in vivo bir biyolojik etki yaratacak kadar çok miktarda elde etmek çok zordur. HSC’lerin gen tedavisi için arındırılması ana olarak granülosit makrofaj koloni uyarma faktörü gibi bir ajan kullanarak, gövde hücrelerini kemik iliğinden hareketlendirip, çevre dolaşıma yöneltmek üzerine kuruludur; bundan sonra hücreler florasan-aktivasyonlu hücre sıralama yada antikor kaplı manyetik bilyalar gibi yöntemlerle seçilirler. Bu tür pozitif seleksiyon yöntemleri c-kit (faredeki gövde-hücresi faktörü alıcısı) ve CD38 (insanlarda) gibi gövde hücreleri için özel hücre yüzeyi izleri gerektirir. Negatif tüketme (kesinlikle gövde hücresi olmayan hücreleri dışarı atan) genellikle pozitif seleksiyonla kombine olarak kullanılan ayrı bir metottur. Gövde hücrelerine özgü yeni işaretler arama şu an üzerinde aktif olarak araştırma yapılan bir alandır. Klinik nakilleri göz önünde tutarsak, kemik iliği çok sık nakledilen bir dokudur, örneğin lökemiya yada başka hemotolojik hastalıklara karşı köklü bi sitotoksik terapi uygulanan hastalar için. Alıcıya, vericinin kemik iliği aşılanarak, alıcının nakilden önce uyumsuz bir organın alloantijenlerine maruz kalmasını sağlamak için kullanıldı. GvHD oluşması ihtimaline rağmen, bu yaklaşım harcanan emeğe değer. Alıcıların, vericilerden alınmış MHC transgenlerine maruz bırakılması daha özelleşmiş ve güvenli bir metottur; ayrıca canlı verici lenfositlerinin aşılanmasına gerek bırakmadığı için GvHD yaratan hücrelerin transferi olmadığı için bir risk taşımaz. MHC genlerinin sinejeik kemik iliğine ex vivo yada in vivo olarak transferi alıcıyı alloantijenlere maruz bırakma için bir yöntem olarak kullanılabilir. Kemik iliğine gen transferi kan yapıcı hücrelerdeki bağışıklık fonksiyonunu ayarlayan immüno düzenleyici molekülleri (sitokinler gibi) şifreleyen genleri nakletmek için kullanılabilir. Sykes ve meslektaşları radyasyona maruz bırakılmış bir fare üstüne ortaya koydular ki, retroviral bir gen tedavisi vektörü kullanarak, verici MHC sınıf I geninin verici soyu kemik iliği hücrelerine ex vivo olarak nakil öncesi transferi tek bir alloantijen yüzünden uyumsuzluk çıkaran deri aşılamalarının yaşama süresini arttırdı, fakat çoklu uyumsuz, tamamen allojeneik deri aşılamaları reddedildi.Wong ve meslektaşları, verici MHC sınıf I molekülü şifreleyen retroviral bir vektör kullanan benzer bir sistem üzerinde çalışma yaptılar. Bu sefer MHC haplotip H2k’li bir CBA fareleri nakil alıcıları olarak kullanıldı. İlk olarak 28 gün boyunca iki doz anti-CD4 monoklonal antikoru ve 5 X 106 kemik iliği hücreleri ile ön tedavi edildiler. Bu hücreler vericiye özel MHC sınıf I geni Kb taşıyan retroviral vektörlerle ex vivo olarak transdüksiyona uğratıldılar. Bu tolerizasyon rejiminin sonucu olarak, fareler vericiye özel [C57BL/10 (H2b)] kalp nakillerini süresiz olarak kabül edebildiler. Bu çalışmanın önemli bir klinik manası vardır, çünkü nakledilen bir organın uzun süreli kabul edilmesi için alıcının nakil edilen organ üzerinde bulunan her tür verici MHC molekülüne maruz bırakılmasına gerek olmadığını ortaya koymuştur. Bu tolerejenik (yada cevapsız) durum, bağışıklık sisteminin gücünü azaltmamaktadır; bağışıklık sistemi her hangi bir üçüncü parti antijene karşı yine tüm gücüyle saldırmaktadır. Gen transferi vektörleriVektörler gen tedavisinde, daha sonradan transgen(ler) trafından şifrelenmiş tedavi edici proteinleri ifade edecek alakalı genleri nakleden araçlardır. Alakalı genlerden ayrı olarak bir gen tedavisi protokolünde en önemli faktör vektör seçimidir ve bu başarı yada başarısızlığı belirler. Ne yazık ki, “iyi evrensel vektör” diye bir şey yoktur; şu anda kullanımdaki tüm vektörler hem avantajlara hem dezavantajlara sahiptirler. Örneğin bir vektör, hedef hücrelere çok etkili bir şekildi girebilir, fakat girdikten sonra güçlü bir bağışıklık cevabına neden olur ve bu da hücrenin bağışıklık sistemi tarafından yok edilmesine neden olur. Vektör seçerken pek çok faktörün göz önünde tutulması gerekir. En önemlileri: 1- transgenin ifade edilmesi gerekli zaman uzunluğu2- hedef hücrenin bölünme durumu3- hedef hücrenin türü4- transgenin büyüklüğü5- aşılanacak vektöre karşı bir bağışıklık cevabı oluşma potansiyeli ve bunun zararlı olup olmadığı6- vektörü birden fazla kez uygulama imkanı7- vektörün üretim kolaylığı8- mevcut tesisler9- güvenlik unsurları10- düzenleyici unsurlar Viral gen transferiMilyonlarca yıldır, virüsler bitki, hayvan ve insan hücreleri dahil her türlü hücreye gen transfer ediyorlar. Viral gen transferi deneysel tekniği bu doğal yetenekten gelişmiştir, ve bilim adamları ile hekimlere gerçek avantajlar sunmaktadır:1- özel hücre bağlama ve giriş özellikleri2- transgenin hücrenin çekirdeğine etkili bir şekilde hedeflenmesi3- hücre içi degradeden kaçınabilmesiViral vektör sistemlerinin çoğunun geliştirilmesinde kullanılmış olan genel prensip, yaban tipinde (doğada bulunan değişmemiş hali) bozulmamış bir virüsün güvenli ve etkili gen transferi için modifiye edilmesidir. Örneğin, viral replikasyonla ilişkili genler modifiye edilebilir yada silinebilir, ve böylece yeni rekombinant virüs “replikasyon arızalı” hale gelir ve gen tedavisi protokollerinde kullanılmak için daha güvenli hale gelir. (Şekil 4)Genelde, virüs tarafından nakledilmesi gereken transgen moleküler biyolojik teknikler kullanılarak viral genomun içine konmalıdır; transgenler genellikle viral replikasyon genlerinin çıkarılmasıyla oluşan boşluğa eklenir. Genelde, viral vektörün doğal hali ne kadar azaltılmışsa, (virulansla ilgili genlerin ne kadar büyük kısmı çıkarılmışsa) virüs gen tedavisi protokollerinde kullanılmak üzere o kadar emniyetlidir. Genin boyutu, viral genomdaki potansiyel boşluğa uydurulmalıdır, eğer yeni viral genom çok büyük ise, enfekte edici bir partiküle sığdırılamaz. Vektör olarak kullanılan virüslerin çoğu replikasyonyon genlerinden mahrum olup, kendilerini normal hücrelerde kopyalayamadıkları için, transgene sahip rekombinant virüs, hücre hattında daha yüksek titrelere kadar büyütülmelidir. Bu hücre hattı, virüsün replike olabilmesi için gereken tüm tamamlatıcı genleri (daha önceden çıkarılan genler) içeren bir hücre hattıdır. Rekombinant viral partiküller, daha sonra paketleyici hücre hattından canlı bulaşıcı virüsler olarak arındırılıp, in vivo yada ex vivo olarak hücreleri yada dokuları enfekte etmek (transdüksiyona uğratmak) için kullanılır. Retroviral VektörlerRetroviridae spumavirüs (köpüklü virüsler), Moloney-mürin-lentivirüs-ilişkili virüsler [örneğin, Moloney mürin lökemya virüsü (MMLV) ve insan endojen retrovirüsleri C familyası (HERV-C)] ve lentivirüsleri [örneğin. Human immünodeficiency virus tip 1 (HIV-1) ve tip 2 (HIV-2)] içeren geniş bir RNA virüsleri familyasıdır. Retroviral virionların çapları 80 nm’den 130 nm’e kadar değişir, ve genomları uzunlukları 3.5 ila 10 kb arasında olan, iki eş pozitif-duyu tek-iplikli RNA moleküllerinden oluşur. Genomlar, entegraz ve ters transkriptaz enzimleri ile birlikte bir kapsid ile örtülüdür. Retroviral vektörler şu an için klinik denemelerde en yaygın olarak kullanılan viral vektörlerdir.Retrovirüsler, sadece aktif olarak mitoza uğrayan hücreleri transdüksiyona uğratırlar, pluripotent (bir çok çeşitli hücre tipine gelişme yeteneğinde olan hücreler) HSC’lere gen transfer eden protokollere uygundurlar. Retroviral vektörler uzun dönemde iyi gen ifadesi oluştururlar ve teknik olarak üretilmeleri kolaydır. Fakat düşük viral titreler (genelde ml’de 1 x 107 koloni oluşturan ünite) verirler ve çok nadir olsa da yardımcı virüs kontaminasyonu olasıdır ve dikkatle izlenmelidir. MMLVMiller labaratuvarından LNSX serisinden vektörler gibi, bugün gen tedavisi uygulamalarında kullanılan retroviral vektörlerin çoğu MMLV bazlıdır. Replikasyon gag, pol ve env bölgeleri çıkarılarak engellenmiştir. gag bölgesi kapsid proteinlerini kodlar, pol bölgesi RNA bağımlı DNA polimeraz (ters transkriptaz) ve entegraz kodlar, env bölgesi ise alıcı tanıma ve kılıf demirleme içik gerekli proteinleri kodlar. Genom ayrıca, her iki ucunda uzun son tekrarları (LTR’ler) içerir ki bunlar DNA sentezlemede ve viral genlerin transkripsiyonun düzenlenmesinde hayati rol oynarlar. Örneğin, LNSX vektöründe, LTR bir neomisin-direnç işaretleyici geninin [neomycin-resistance-marker gene] (transdüksiyona uğramış hücreleri seçmek için kullanılan) transkripsiyonunu yürütür, bir iç Simian virüs 40 (SV40) promoteri ise transgenin transkripsiyonunu yürütür. gag, pol ve env gen ürünleri, daha önce bu genlerin transger edilip stabil bir biçimde ifade edildiği tamamlayıcı paketleme hücre hattı tarafından sağlanmalıdır. Bir retroviral vektör plazmidi paketleyici hücre hattına (pA317 gibi) sokulduğu zaman viral RNA üretilir, virionların içine yerleştirilir, ve ortama salgılanır. Ml başına 1 x 107 koloni-oluşturan üniteye kadar viral titreler bu şekilde elde edilebilir. Elde edilen viral partiküller gag, pol ve env genlerinden yoksun olduğu için her partikül sadece kendini hücrenin genomuna entegre edebilir, daha fazla viral partikül üretemez. Transdüksiyonla nakledilmiş DNA zincirleri kararlı bir şekilde hedef hücrenin kromozal DNA’sına entegre edilirler ve böylece hücrenin bölünmesiyle oluşacak oğul hücrelere de geçerler. LentivirüslerRetrovirüsler ailesinin en yeni keşfedilen üyeleri retrovirüsleri lentivirüsler olarak bilinen bir alt sınıfında üye olan insan bağışıklıkyetersizliği virüsleridir(HIV’ler). HIV’lerden türetilmiş olan gen tedavisi vektörleri, MMLV retrovirüs vektörlerine göre pek çok avantaja sahiptirler. Lentivirüs vektörleri aktif olarak bölünen hücrelerin yanı sıra, bölünmeyen hücreleri de transüksiyona uğratabilirler, bu yüzden gen transferi araçları olarak çok daha yararlıdırlar. Genetik materyallerini host hücrenin genomuna entegre ettikleri için, lentivirüslerin transgenlerin uzun zamanlı, stabil ifadesini sağlayacak potansiyel vardır. Lentivirüslerin, immünolojik amaçlarla gen tedavisi vektörleri olarak kullanılması çok heyecan vericidir çünkü lentivirüslerin CD4+ T hücreleri, makrofajlar ve HSC’lere karşı olan doğal bir tropizmaları vardır; bu lentivirüsleri HIV ve AIDS enfeksiyonunu önlemek yada tedavi etmek amacında olan gen tedavisi yaklaşımları için çok yararlı araçlar kılar. Vestikuler stomatitis virüsü G proteininin lentiviral kılıfa verilmesi gibi gen modifikasyonları bu vektörün tropizmasını genişletmiştir. Bu vektörler şimdi sistik fibrosisin gen tedavisi için solunum epitel hücrelerini hedeflemek üzere kullanılabilmektedir. AdenovirüslerAdenovirüsler, kapsid çapı 70-100 nm, 252 kapsomerden (240 hekzon, 12 penton) oluşan, kılıfsız, ikozahedral, çift iplikli DNA’lı virüslerdir. Hedef hücrenin genomuyla birleşmezler, bunun yerine host hücrenin çekirdeğinde ekstrakromozal bir yapı olarak kalırlar. Replikasyon-kusurlu rekombinant adenovirüsler klinik denemelerde en çok kullanılan ikinci viral vektör grubudur. Adenovirüsler insanları yaygın olarak enfekte ederler, ilk izole edilebilmeleri 1953’te aküt solunumsal semptomları olan ABD acemi erlerinden, Rowe ve meslektaşları tarafından başarıldı. Temel (dönüşmemiş) hücre kültürleri bu erlerin adenoitlerinden elde edilmiştir, ve kültürdeki hücrelerin virüsün varlığı yüzünden kendiliklerinden dejenere olduğu gözlenmiştir. Bugüne kadar 47 adenovirüs serotipi tanımlanmıştır, hafif soğuk algınlığından febrile paryngtise kadar pek çok rahatsızlıkla ilişkileri saptanmıştır. Ad2 ve Ad5 üzerlerinde en çok çalışılanlardır ve gen tedavisi uygulamalarında en yaygın olarak kullanılan serotiplerdir. Ağır rahatsızlıklarla alakaları yoktur, sadece hafif soğuk algınlığı oluştururlar. Adenovirüsün 36-kb genomu iki ana bölgeye bölünebilir, virüsün replikasyon çevrimi sırasında genlerin ifade edildiği zamana göre, erken (E) geç (G). Erken genlerin 4 bölgesi vardır, bunlar E1, E2, E3 ve E4 olarak isimlendirilirler, geç genlerin ise G1, G2, G3, G4 ve G5 (L1-5 ingilizce) 5 kodlama ünitesinde oluşan bir tek bölgesi vardırAdenovirüslerin E1 bölgesi E1A ve E1B olarak ikiye ayrılır. E1A gen ürünü viral prometerler bağlayarak diğer adenoviral transkripsiyon ünitelerinin ifade edilmesini aktive eden bir viral transkripsiyon ünitesidir. E1B bölgesi hücresel p53 tümör bastırıcı proteinle etkileşime giren 55-kD proteinini kodlar. p53, host hücrenin devrinin ilerleyişini G1 fazından S fazına ki bu faz viral replikasyon için optimaldir, regüle eder. E1B p53’den ayrı olarak viral E4 proteinlerini de bağlar, bu iki madde ortak olarak çalışıp hostun protein sentezini kapatırlar. E2 bölgesi viral DNA polimeraz ve anenovirüs tek iplikli DNA bağlama proteinini kodlar. E3 bölgesi adenovirüsün in vitro replikasyonu için gerekli değildir fakat virüse enfekte hücrelerin CTL’ler ve TNF-a tarafından öldürülmesini engelleyerek, host defans mekanizmalarına karşı bir miktar koruma sağlar. E4 bölgesi (1) viral ve hücresel protein ifadesi (2) viral DNA replikasyonu (3) host proteinlerinin sentezinin kapatılmasıile alakası olduğu bilinen proteinler kodlar. Geç genler (G1-G5) viral DNA replikasyonunun ilk adımında ifade edilir, ve virion oluşumu için gerekli yapısal polipeptitleri kodlarlar. Yeni sentezlenmiş viral partiküllerin birikmesinden kaynaklanan hücre iskeleti ve zarının bozulması, hücrenin çökmesine ve virüsün yayılmasına neden olur.E1 bölgesi viral replikasyon için gereklidir; bu yüzden E1 bölgesi suni olarak çıkarılmış adenovirüsler, replikasyon kusurlu olarak görülür. Replikasyon-kusurlu bir adenovirüste, E1 bölgesi ifade edilecek trangen ile doldurulabilir. Daha büyük genler yerleştirebilmek için ve bunun yanında virüsün immünojenliğini azaltmak için vektörden E3 ve E4 bölgelerinin silinmesi gibi bir işlemle daha fazla genetik materyal çıkarılması daha önce uygulanmıştır; bu tür rekombinant virüslere genelde “bağırsaksız” denir. Gen tedavisi için, hem in vivo hem de ex vivo olarak neredeyse her türlü hücre cinsinde adenovirüslerin transdüksiyon verimi diğer viral vektörlerle karşılaştırıldığında yüksektir. Nakiller için, adenovirüslerin belirgin bir avantajı düşük sıcaklıklarda (örneğin. 4ºC) hedef hücrenin yüzeyine tutunabilmesidir. Adenovirüsün kapsid polipeptitlerinin yapısal stabilitesinden dolayı, viral partiküller ml başına 1 X 1013 plak oluşturan ünite (pfu) gibi yüksek bir titreye arındırılıp konsantre edilebilirler, fakat ml başına 1 X 1010 pfu gibi bir titre daha alışılmıştır. Retroviral titreler çok daha düşüktür (ml başına 1 X 107 pfu) çünkü kapsidleri yapısal olarak kararsızdır ve sezyum klorid gradyanında arındırılıp, konsantre edilemezler. Adenovirüslerin bir başka avantajı da adenovirüs genomunun insan genomuna entegre olmayıp, hedef hücrenin çekirdeğinde kendini eşlemeyen ekstrakromozal bir yapı olarak kalmasıdır; lakin bunun ayrıca çok düşük bir ihtimalle de olsa, insan onkojenlerini aktive etme ve insan tümör bastırıcı genin işleyişini bozma ihtimali vardır. İn vivo olarak bir vektör olarak adenovirüs kullanılmasının bir büyük dezavantajı, kapsidden türemiş peptitlere karşı oluşan CTL cevabıdır; bu cevap vektör tarafından transdüksiyona uğratılmış hücrelerin yok edilmesine, lokal doku kaybına ve iltihaba neden olabilir. Adenovirüs tarafından kodlanan yabancı transgen ürünlerinin peptitlerini sunan host hücrelerin, CTL’nin aracılık yaptığı yıkıma hedef olduğu gösterilmiştir. Adenovirüsler çok rastlanan virüsler olduğu için, insanları büyük bir çoğunluğu spesifik serotiplerden en az bir tanesinin bağışıklığına sahip. Gen tedaviside bu aynı serotipin kullanılması durumunda neredeyse her zaman hızlı ve güçlü bir bağışıklık cevabı oluşur, öyle ki adenovirüs vektörünün verilmesinden günler sonra bile hastanın serasında yüksek miktarda anti-adenovirüs antikoruna rastlanır. Bu tür vektörlerin alıcılarını screen’erek daha önceden karşılaştıkları serotipler belirlenebilir, ve başka bir serotip vektör olarak kullanılabilir. Fakat, bu yaklaşım değişik serotiplerden çok geniş bir rekombinant vektörler panelinin mevcut olmasını gerektirir. Bir başka potansiyel problem ise, aynı serotipteki vektörün tekrar verilmesi ile oluşacak güçlü ikincil bağışıklık cevabıdır. Adenovirüs tarafından kodlanmış bir transgenin ifade edilme periyodu oldukça kısadır. İfade rapor edildiğine göre “makul” bir seviyede in vivo olarak 14 gün sürmektedir; ancak bağışıklık cevabının manipulasyonu daha uzun ifade periyotlarına da neden olmuştur. Bu kısa ifade süresi ana olarak bir ölçüye kadar da transgenin kendisine (özellikle transgen normalde kişide ifade edilmiş değilse [yabancı] CTL cevabına neden olan viral polipeptitlerin ifade edilmesinden kaynaklanır. Adenoviral genom kendisini hedef hücrenin genomuna entegre etmediği için, sadece oğul hücrelerden (eğer hedef hücreler bölünüyorsa) birisi transgene sahip olacaklardır ve böylece transgene sahip hücrelerin sayısı yarıya inecektir. Adenoviral gen transferi trangenin sadece bir kerelik transferinin gerektiği, büyüme faktörü terapisi gibi, uzun dönem ifadenin tersine büyüme faktörünün geçici ifadesinin gerektiği durumlar için idealdir. Nakil toleransı yaratmaya yönelik protokollerde, adenoviral vektörün alıcıya nakilden önce verilmesi, alıcıda uzun dönem immmünolojik tolerans yaratacak düzenleyici T-lenfosit populasyonunun oluşmasını sağlamaya yetecektir. Adeno-benzeri virüslerAdeno-benzeri virüs (AAV) vektörleri adenovirüs vektörlerinin sunduğu, geniş host hücre spektrumu dahil avantajların çoğuna sahip olup, bazı durumlarda nispeten daha yüksek transdüksiyon verimine sahiptirler. Ayrıca, yüksek derecede hücre ölümüne (sitopatojenisite) neden olan adenovirüsün tersine, AAV’ler hedef hücrelerde çok az hasara neden olurlar. AAV ayrıca stabil olarak belli yerlerde, host hücrenin genomuna (insanlarda kromozom 19’da) entegre olur ki bunun daha uzun süren transgen ifadesi gibi yararlı bir etkisi vardır. Bununla beraber, AAV’lerin ana-hücre kültürlerinin transdüksiyonunda retroviral vektörlere göre kayda değer bir biçimde düşük verimli olduğuna dair kanıtlar vardır. Ana-hücre transüksiyonlarında, AAV vektörlerinin çoğu host genomun içine entegre olmaz, onun yerine ekstrakromosal olarak kalır, bu verimsizlik in vivo uygulamalardaki yararlılığını azaltmaktadır. Herpes simpleks virüsüHerpes simpleks virüsü (HSV) vektörleri çeşitli uygulamalar için geliştirilmektedir, bunların içinde Parkinson hastalığı, habis gliomas (bir nevi beyin tümörü), beyinsel iskemisi (gerekli gıdayı alamayan beyin dokusunun beslenememekten zarar görmesi) gibi hastalıkların tedavisi gibi nöronal dokuyu hedefleyen gen transfer protokolleri vardır. HSV, host hücrenin çekirdeğinde ekstrakromosal bir DNA elemanı olarak kalır, çevre sinir sistemindeki duyusal nöronlarda ve bazı merkezi sinir sistemi dokularında uzun ömürlü belirtisiz enfeksiyonlar yaratma gibi kusursuz bir yeteneğe sahiptir. Bu olay, hedef nöronal dokuda uzun zamanlı gen ifadesi için fırsat yaratır. HSV vektörlerinin ayrıca geniş host hücre spektrumları vardır, ve büyük gen eklemelerini kabul edebilirler, ve replikasyon için gerekli en-erken (IE) genlerinden çoklu silme işlemleri ile hedef hücrelere karşı daha az sitotoksik hale getirilmişlerdir ve güvenlikle ilgili kaygılar azalmıştır. Şu anda HSV nin bir gen tedavisi vektörü olarak kullanılmasıyla ilgili en önemli sorum klinik kullanımındaki güvenliktir, çünkü bu virüsün yaban tipinin insan beyninde lytical bir şekilde çoğalıp, potansiyel olarak çok ciddi ensefalit (beyinin iltihabi lezyonu) e neden olduğu bildirilmiştir. Vaccinia virüsüVaccinia virüsü (ineklerde çiçek hastalığına neden olan virüs) şu anda nakil çalışmaları için vektör olarak kullanılmasada, kanser gen tedavisisi için geliştirme altındadır. Vaccinia virüsü, dünya çapında çiçek hastalığının yok edilmesinde kullanılmıştır, ve güvenli bir canlı aşı maddesi olduğunu ortaya konmuştur. Vaccinia virüs vektörleri host hücrenin genomuna entegre olmazlar, bununla birlikte büyük transgenler barındırabilirler ve aşırı şekilde immünojeniktirler. Vaccinia virüsü hastaları tümör antijenlerine karşı bağışık hale getirmek üzere büyük genomuna tümör antijen genleri yada bağışıklık cevabını kuvvetlendiren proteinler kodlayan genler yerleştirilerek kullanılabilir. Transgenlerin çoğu in vivo olarak yüksek seviyelerde ifade edilirler, bu tümor antijenine karşı normal durumda kanserli hücreyi öldürmeye yetmeyecek kuvvette olan, spesifik bir bağışıklık cevabına neden olur. Eğer gerekli ise, geniş kapasitesi sayesinde vektöre birden fazla gen klonlanabilir. Viral olmayan gen transferiViral vektörlerden transgenlere yer açmak, iltihabi cevapları azaltmak, yada güvenliklerini arttırmak amacıyla gerekli olmayan genler çıkarılabilir; bu virüsün basitleştirilmesini gerektirir, bazen de aşırı bir şekilde. Geri kalan, ilgili genlerin yüksek seviyelerde, yüksek bir derecede düzenlenmiş kendine özgü bir biçimde, kontrollü bir periyot boyunca (uzun yada kısa olabilir) ifade edilmesi için dizayn edilmiş suni bir vektör kabuğu olabilir. Aynı sonuçları elde etmek için başka bir yaklaşım tarzı ise, hücrelerin çekirdeklerine genetik materyali basit bir şekilde aşılayan bir sistem yaratmaktır. Bu bakış açısı, geçtiğimiz birkaç yılda yoğun araştırmaların odağı olmuştur ve bu araştırmalar birkaç viral olmayan vektörün geliştirilmesiyle sonuçlanmıştır. LipozomlarEn temel formunda, lipozomlar bir katyonik amfifil ve bir nötral fosfolipid (tipik olarak, dioleoyl- fosfatidiletanolamin) olmak üzere iki lipid türünden oluşurlar. İkiside de ticari olarak mevcuttur. Lipozomlar, kendiliklerinden DNA’ya bağlanıp, yoğunlaştırarak hücrelerin plazma zarlarına yüksek eğilimi olan kompleksler oluştururlar; bu endositoz olayı ile lipozomların sitoplazmaya alınmasına neden olur. Bu temel protokolün pek çok adaptasyonu denenmiştir ve değişen seviyelerde gen ifadesine neden olmuşlardır. Fuzijenik virozomlarÇok yakın geçmişte, viral transfer vektörlerinin bazı avantajları, lipozomların basitlik ve güvenliği ile birleştirildi ve ortaya fuzijenik virozomlar çıktı. Virozomlar, Sendai virüsünün zar birleşme proteinleri, plasmit DNA’yı kaplamayan lipozomlarla yada antiduyu uygulamaları için oligodeoksinükleotitlerle birleştirilerek oluşturuldu. Virozomlardaki viral proteinlerin doğasından kaynaklanan hücre zarlarıyla birleşme yeteneği sayesinde bu hibrid vektörler nükleik asitlerini hedef hücreye çok etkili bir şekilde transfer ederek, iyi gen ifadesi veriyorlar. Her viral vektörün genomuna eklenebilen transgenin büyüklüğü ile ilgili bir limiti vardır, virozom ve lipozom teknolojilerinde böyle bir limit bulunmamaktadır. 100 kilobaz çifte kadar genler ex vivo ve in vivo olarak fuzijenik virozomlar kullanılarak nakledilebilmiştir. DNA-ligant birleşmesi/çiftiDNA-ligant çifti iki ana bileşenden oluşur: DNA-bağlayıcı bir alan ve hüce-yüzeyi alıcıları için bir ligant. Transgen bu şekilde spesifik olarak hedef hücreye yönlendirilebilir ve orada alıcı-aracılığında endositoz ile ilçeri alınır. DNA-ligant kompleksi endositik yola girdikten sonra, çift, endozom lizozomla birleştiğinde muhtemelen yok olacaktır. Curiel ve meslektaşları, adenovirüsten türemiş bir domaini ligantın hücre yüzeyi alıcısı parçasıyla birleştiren bir metod kullanarak bundan kaçınabilmişlerdir. Çiftin bu noktadan sonra, özelleşikliği adenovirüsler kadardır, geniş bir host hücre spektrumuna bağlanabilirler; ayrıca çiftin endozom bir lizozom tarafından yok edilmeden önce endozomu terk edip sitoplasmaya (endozomoliz diye bilinen bir proses ile) girmesini sağlayan bir adenovirüs karakteristiğine sahiptirler. Çıplak DNAViral olmayan gen transferi teknikleri için en basit fikirlerden biri arındırılmış DNA’nın plazmitler şeklinde kullanılmasıdır. Bu yaklaşım, DNA aşılamaları için, diğer protokollerle birlikte kullanılmıştır, ve gen tedavisi ile ilgili pek çok durumda denenmiştir. Bu yaklaşımın basitliğine rağmen çalışmalar transfeksiyon veriminin çok düşük olduğunu ortaya çıkarmıştır ve kullanımını sınırlandırmıştır. Verici fare ırkından alınan MHC sınıf I antijenini kodlayan plazmit DNA’nın, bir doz anti-lenfosit serumu ile birlikte aşılanması, takip eden karaciğer nakillerinde vericiye özel tolerans yaratmıştır. Verici DNA’sına timüste enjeksiyondan 4 gün sonrasına kadar, dalakta ise enjeksiyondan 7 gün sonrasına kadar rastlanmıştır. Balistik gen nakliBu fiziksel metod mikro taşıyıcıların kullanımı gerektirir. (genelde altın partikülleri yada herhangi bir başka inert madde) Bu partiküller DNA ile kaplanır ve gen tabancası denilen patlayıcı yada gaz-itmeli bir balistik cihaz ile yüksek hızlarda ateşlenir. Partiküller hedef hücreye girdikten sonra, DNA micro taşıyıcılardan yavaşça ayrılır, ve yararlı olacak seviyelerde gen transkripsiyonu ve tercümesine neden olur. Bu teknik deneysel olarak geniş çapta kullanılmıştır, ama klinik kullanımı ortaya çıkarılabilir yüzeylerle sınırlıdır çünkü ateşlenen partiküller, dokunun derinliklerine ulaşamazlar. Muhtemel klinik kullanım alanları sidik torbası üretelyumu, kornea, epitel hücreleridir. CaPO4 transfeksiyonuCaPO4 transfeksiyonu, moleküler biyologlar tarafından transgenleri hücrelere in vitro olarak aşılamada yıllardır başarıyla kullanılan nispeten verimli kimyasal bir metottur (%10). Takip eden deneylerde ve klinikte kullanılan vektörlerin çoğunun üretimindeki protokollerin önemli bir parçası olsa da, bu metod in vivo uygulama için uygun değildir. Promoter daraltılmasıGen tedavisi vektörlerinin başarısı için alakalı gene uygun bir promoter bağlanması şarttır. Bir promoter genin üstünde bulunan, mRNA ve ardından protein sentezi için üzerine proteinlerin (transkripsiyon faktörleri, DNA polimeraz) bağlandığı düzenleyici bir DNA zinciridir. Deneysel ifade vektörlerinin ve gen tedavisi vektörlerinin çoğu, klonlayacakları esas (sürekli) genlerin yüksek seviyesi yüzünden patojen virüslerden elde edilen promoter elemanları kullanırlar Çeşitşi gen transfer çalışmalarında sitomegalovirüs(CMV), Rous sarkoma virüsü (RSV) ve SV40’tan elde edilen promoter ve arttırıcı elemanlar kullanmışlardır ve cesaret verici başarılar elde edilmiştir fakat ifade seviyesi, kullanılan vektör, vektörün verilme şekli ve transdüksiyona uğratılan hücrenin türü dahil pek çok faktöre bağlıdır. Araştırmacılar tarafından en çok karşılaşılan problemlerden biri trangenlerin çok düşük seviyelerde ve geçici olarak ifade edilmeleridir. Bu kötü ifadelerden sorumlu moleküler mekanizma çok yetersiz bir biçimde tanımlansa da, ana neden promoterin daraltılması olabilir. Promoter daraltmanın gen tedavisi alanındaki önemi göz önüne alınınca, bu problemle direkt olarak ilgilenmek için dikkate değer birkaç çalışma yapılmıştır. Deneysel sistemlerde gösterilmiştir ki, adenoviral vektörlerin in vivo olarak uygulanması belirli yada belirsiz bağışıklık cevapları aracılığıyla sitokin üretimine neden olmaktadır. Bu sitokinler daha sonra transgeni taşıyan adenovirüs tarafından enfekte edilmiş hücreleri etkileyip, sitokinlerin arabululuk ettiği hücresel sinyaller başlatacaklar ve transgen ifadesini ayarlayacaklardır/kontrol altına alacaklardır. Qin ve meslektaşları, pek çok viral promoter tarafından kontrol edilen transgen ifadesinin IFN ve TNF inhibe edildiğini ve bu iki sitokininde birlikte işleyen etkileri olduğunu keşfetmişlerdir. CMV ve RSV’den türetilen promoterler sitokin uygulamasına karşı en hassas olanlardır Yine rekombinant adenovirüs kullanan başka bir fare modelinde Harms ve Splitter, nötralize edici anti-IFN monoklonal antikorunun in vivo olarak verilmesinin transgen ifadesini arttırdığını göstermişlerdir. Moleküler seviyede, SV40, CMV ve RSV’den türetilen promoterlerin hepsi aynı interferon cevap zincirine sahiptir. IFN’in hücre yüzeyinde etkileşime girmesinden dolayı oluşan çekirdeksek faktörler bu viral promoterlerdeki elemanlara bağlanırlar ve bu transgenin ifade edilmesini inhibe eder. Yangıya neden olan sitokinlerin olmadığı bir ortamda güçlü, ana viral promoterler in vitro olarak memeli ifadelerinde kullanılmıştır ve başarı elde edilmiştir. Bu güçlü viral promoterlerin kullanımı doğal olarak klinik gen tedavisi protokollerinin geliştirilmesi bakımından ideal olarak kabul edilmiştir. Bununla beraber, transgen ifadesinin düşük seviyede olması genellikle rastlanan bir olgudur ve bunun nedeninin vektörün belirli bir bileşeninden çok, tamamının dizaynından kaynaklandığı düşünülmektedir. Gen tedavisi ifade sistemlerinin de yaygın iki olgu da viral promoter ve arttırıcı elemanlardır. İn vitro ifade vektörlerinde ve in vivo gen tedavisi vektörlerinde kullanılan virüsler ve izole edilmiş viral promoterler enfekte olmuş hücrelerin ürettiği sitokinlerden ters bir biçimde etkilenebilirler. Bu yüzden gen transferi için trangenin ifadesinin gerektiği anda ve yerde vektörün verileceği ortamda olacak faktörler tarafından yukarı çekilebilecek promoterler seçmek mantıklıdır. Örneğin MHC sınıf I promoteri immüno-ayarlayıcı gen tedavisi uygulamaları için daha uygun olacaktır çünkü, IFN gibi yangısal sitokinler aslında transkripsiyonu arttırmak için bu promoter üzerine tesir ederler. İlk Gen Tedavisi İnsanda ilk gen tedavisi denemesini 1990’da Dr. French Anderson gerçekleştirdi. Ex vivo gen tedavisi stratejisinin kullanıldığı yöntemde adenozin deaminaz enziminin (ADA) eksikliğinden kaynaklanan hastalığın tedavisi amaçlanmıştı. ADA eksikliği, çok seyrek rastlanan genetik bir hastalıktır. Normal ADA geninin ürettiği enzim, savunma sisteminin, normal fonksiyonlarını yerine getirebilmesi için gereklidir. ADA eksikliği olan hastalarda genin yaban tii kopyası yoktur ve sahip olunan yetersiz ya da mutant kopyalarsa, işlevsel ADA üretememektedirler. ADA eksikliğiyle doğan çocuklarda, ciddi boyutlarda bir savunma sistemi sorunu vardır ve sık sık ağır enfeksiyonlara yakalanırlar. En ufak bir virüs enfeksiyonu bile yaşamı tehlikeye atabilir. Eğer tedavi edilmezse, hastalık genellikle çocuğun birkaç yıl içinde ölümüyle sonuçlanır. ADA eksikliğinin ilk insan gen tedavisi denemesi olarak seçilmesinin bazı nedenleri vardır.Bu hastalık, tek bir gendeki bozukluktan kaynaklanır ve bu durum olası bir gen tedavisinin başarı ihtimalini artırır. Ayrıca bu gen, çok daha karmaşık kontroller altındaki pek çok başka genin aksine, basit bir sistemle kontrol edilmektedir:Sürekli ekspresyon. Enzimin çok az miktarda üretilebilmesi bile klinik yararlar sağlamakta, yüksek miktarda üretilmesiyse zarar vermemektedir. Sonuç olarak, üretilecek ADA proteinin miktarının çok doğru şekilde kontrol edilmesi gerekmez. Bu ilk insan gen tedavisi 2 hasta çocuk üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tedavide, hastaların hücreleri (T-lenfosit) alınarak laboratuar şartlarında doku kültürü yoluyla çoğaltılmıştır. Daha sonra normal insan ADA geni, retrovirüs vektörü yardımıyla bu hücrelere nakledilmiştir. Virüs hücrelere girerek genetik materyale geni yerleştirmiştir. Genetik olarak başarıyla seçilen hücreler seçilerek, yaklaşık 10 gün boyunca çoğaltılmıştır. Son aşamada da, düzeltilmiş bu hücreler kan naklini andıran biçimde damardan hastalara geri verilmiştir. Bu işlem yani T hücrelerinin hastadan alınması, laboratuar ortamında düzeltilmesi ve hastaya geri verilmesi, tedavinin ilk 10 ayı içinde her 6-8 haftada bir tekrarlanmıştır. Daha sonraysa bu nakillere 6 ile 12 ayda bir devam edilmiştir. Tedavi sonucunda iki çocukta da iyileşme kaydedilmiştir. Bu ilk insan denemesinden sonra sistik fibrosis, yüksek serum kolesterolü (hiperkolesterolemi), bazı kanserler ve AİDS gibi hastalıklarla başa çıkmak için gen tedavileri tasarlanmıştır.

http://www.biyologlar.com/gen-tadavi


Kanserin sebepleri

Kanserin sebepleri

Kanserin esas nedeni hücre bölünmesi esnasında DNA replikasyonunun (eşlenmesi) hatalı olması sonucu hücrenin farklılaşmasıdır.

http://www.biyologlar.com/kanserin-sebepleri

DNA <b class=red>Replikasyonunun</b> 7 Büyük Adımına Ayrıntılı Bir Bakış

DNA Replikasyonunun 7 Büyük Adımına Ayrıntılı Bir Bakış

DNA kopyalama işlemi, bir hücrenin tüm genetik içeriğini çoğaltmak için dikkatle düzenlenmiş bir dizi olaydan oluşur. Mevcut makale, karmaşık DNA çoğaltma adımlarına kısa bir bakış açısı getiriyor.

http://www.biyologlar.com/dna-replikasyonunun-7-buyuk-adimina-ayrintili-bir-bakis

 
3WTURK CMS v6.03WTURK CMS v6.0