Biyolojiye gercekci yaklasimin tek adresi.

Arama Sonuçları..

Toplam 107 kayıt bulundu.
Cıvık Mantarlar Ögrendiklerini Diğer Cıvık Mantarlara Aktarabiliyorlar

Cıvık Mantarlar Ögrendiklerini Diğer Cıvık Mantarlara Aktarabiliyorlar

P. polycephalum, bir hücreli organizma, daha çok cıvık mantar olarak bilinir. Laboratuarda agarda büyütülebilir. Credit: Audrey Dussutour (CNRS)

http://www.biyologlar.com/civik-mantarlar-ogrendiklerini-diger-civik-mantarlara-aktarabiliyorlar

Zika Virüs RNA 'sının Varlığı ve Kalıcılığı

Zika Virüs RNA 'sının Varlığı ve Kalıcılığı

Barry Atkinson, Fiona Thorburn, Christina Petridou, Daniel Bailey, Roger Hewson, Andrew J.H. Simpson, Timothy J.G. Brooks, Emma J. Aarons yapmış oldukları araştırmaya göre:

http://www.biyologlar.com/zika-virus-rna-sinin-varligi-ve-kaliciligi

Histoloji Preparatlarının Hazırlanması

Canlılardan alınan doku ya da organ parçalarını mikroskopla incelenir duruma getirebilmek için takip ettiğimiz işlemlerin tümüne birden histolojik teknik adını veriyoruz. Bu amaçla kullanılan yöntemler uygulayacağımız mikroskobi tekniğine bağlı olarak ilk bakışta bazı farklılıklar görünse de temelde prensipler aynıdır. Bu konuyla ilgili temel prensipleri anlayabilmek için klasik ışık mikroskobunda inceleyeceğimiz bir preparatın hazırlanışını görelim.Tespit (Fiksasyon)Bir histolojik incelemenin sağlıklı bir şekilde yapılabilmesi için dokuya ait yapı özelliklerinin, kimyasal içeriklerinin iyi korunmuş olması gerekir. Bunun için canlılara ait preparatların hazırlanışında ilk temel prensip hücre ve dokuları canlıdakine en yakın şekilde tutabilmektir.Bunun için ilk hedef otolizi engellemek olmadır. Canlı hücre içinde, etrafı membranla çevrili, eritici enzimler içeren, lizozom adını verdiğimiz organeller vardır. Hücre bu yapıları sindirim amacıyla kullanır. Ölümden sonra eritici enzimler sitoplazma içine geçerek hücreyi eritmeye başlar. Bu olaya kendini eritme anlamına gelen otoliz adı verilir. Otolize uğramış hücreler normal görünümünü kaybederek incelenmesi imkansız hale gelir. Otolizi engellemek amacıyla kullanılan bazı maddeler lizozomların içindeki enzimlerin sitoplazmaya geçişini ve erimeyi önlerler. Bu olaya tespit ya da fiksasyon, bu amaçla kullanılan maddelere de fiksatör adı verilir. Pek çok tespit maddesi ve tespit yöntemi vardır. Uygulayacağımız tespitin sonraki işlemlere, özellikle boyama işlemine bir zarar vermiyor olmasına dikkat etmek gerekir. Örneğin, klasik yöntemlerle tespit ve takip edilen dokularda yağ hücreleri içindeki  depo yağını korumak imkansızdır. Hücrelerdeki yağ içeriği takip işlemleri esnasında akar, hücrelerin içleri sonradan boş görünür. Eğer bir çalışmada bu hücreleri yağ içerikleri ile beraber görmek istiyorsak fiziksel bir tespit yöntemi olan dondurma tekniğine başvurabiliriz.Fiziksel olarak tespit yöntemlerine örnek olarak periferik kan yayma preparatlarının boyanmadan önce ısıtılarak ya da doğrudan kurutularak tesbitini verebiliriz.Otoliz nedir? Fiksasyon hangi amaçla yapılır?Kimyasal tespit yöntemleri hem kullanılma sıklığı hem de kullanılan fiksatörlerin çeşitliliği açısından daha çok zenginlik gösterir. En bilinen ve yaygın kullanılan fiksatör formoldür. Formol genellikle %10'luk sulu çözeltisi şeklinde kullanılır. Ticari formol %100'lükmüş gibi kabul edilerek 1 kısım formol, 9 kısım suyla karıştırılarak tesbit sölüsyonu hazırlanır. Ayrıca, glutaraldehit, osmium tetraoksit, bazı asitler, alkoller ya da bunların kombine formları daha az sıklıkla kullanılan kimyasal fiksatörlere örnek olarak verilebilir. Bütün fiksatiflerin istenenözelliklerinin yanı sıra istenmeyen bazı etkileri de vardır. Değişik kombinasyonlar kullanılarak istenen tespit özelliklerinin artmasını, istenmeyen bazı etkilerin en aza indirgenmesini sağlamak mümkündür. Birleşik olarak kullanılan fiksatörler çoğu kere ilk bulup kullanan araştırıcının adıyla anılırlar (Bouin, Carnoy, Zenker gibi).Elektron mikroskopta incelenecek preparatların hazırlanmasında ultrastruktürel yapının detaylı incelenebilmesi için çift fiksasyon işlemine gereksinim vardır. Bu işlemde önce tamponlanmış glutaraldehit ilk fiksatör olarak, daha sonra tamponlanmış osmium tetroksit ikinci fiksatör olarak kullanılır.Birleşik tespitten ne anlıyorsunuz?Doku ve organlardan alınan parçaların tespitinde aşağıdaki konulara dikkat etmek gerekir:- Tespit ve takipte kullanılan sölüsyonların dokunun içine iyi işlemesi için parçaların yeterince küçültülmüş olmasına özen gösteriniz. Parçanın boyutlarının 0.5 cm. yi geçmiyor olması daha olumlu sonuç verecektir.- Parçalar alındıktan hemen sonra bekletilmeden tespit sıvısına konulmalıdır.- Parçalar büyük ve kanlı ise tespit sıvısı yenilenmelidir.- Tespit sıvısının, hacim olarak konulan parça ya da parçaların minimum kırk katı fazlalığında olmasına çalışılmalıdır.- Uygulayacağımız her tespit yöntemi için önerilen süreye uyulmalıdır.- Tespitten sonra parçalar iyi yıkanmalı, yapay görüntülere neden olmaması için tespit maddesi dokudan tamamen uzaklaştırılmalıdır.- Ayrıca SAĞLIĞIMIZ AÇISINDAN:Histoloji laboratuvarlarında kullanılan pek çok madde gibi tespit maddelerinin buharlarının canlı hücre ve organizma için son derece zararlı olduğunu aklımızdan çıkarmayıp, bu işlemlerin çeker ocak denilen yerlerde yapılmasına dikkat etmeliyiz. Eğer bu mümkün olmuyorsa laboratuvar ortamının çok iyi havalandırılıyor olmasına özen göstermeliyiz.Tespitte uyulması gereken kurallar nelerdir?Tespit işlemleri ne tür yerlerde yapılmalıdır, neden?DehidratasyonTespit edilmiş parçalar bu aşamadan sonra suyundan arındırılır. Bu işleme dehidratasyon adı verilir. Dehidratasyon işlemi için suyu kolaylıkla kendi bünyesine kabul eden etil alkol, izopropil alkol, dioksan, anilin gibi maddeler kullanılır. Bunlardan en yaygın kullanılanı etil alkoldür. Derecesi absolu alkole kadar ulaşan banyolardan geçirilen parçalar daha sonra ışığı geçirgen hale getirilir. Bu işleme şeffaflaştırma (clearing) işlemi denir. Bu amaçla en sık kullanılan madde ksiloldur. Ayrıca benzen, toluen, kloroform gibi maddeler bu amaçlakullanılan maddelere örnektir.Bu işlemler petri kutuları gibi buharlaşmayı engellemek için düzgün kapaklı cam kaplarda elle takip şeklinde yapılabildiği gibi otomatik takip makineleri ile de yapılabilir. Otomatik takip makineleri zaman ayarlaması yapılabilen, doku parçalarının istenilen kaplarda istediğmiz kadar kalmasını sağlayan makinelerdir.Dehidratasyon nedir? Hangi maddeler bu amaçla kullanılırElektron mikroskop için hazırlanan preparatlar da doku parçaları dehitratasyon işleminden geçirilir. Bu işlem için de yine ethanol kullanılır. Gömme işleminden önce plastik eritici olan propilen oksit gibi maddelerde infiltre edilir.Bloklama (Gömme)Parçalardan rahatça kesitler alabilmek, düzgün kesit yüzeyleri sağlayabilmek için gömme ya da bloklama olarak ifade ettiğimiz işleme başvururuz. Parafin, jelatin, selloidin, karbovaks gibi maddeler bu işleme uygundur. En yaygın kullanılan madde parafindir. 56-60 derecede sıvılaşan parafin etüvde hazır tutulur. Parça prizmatik kalıplar içine konur, üzerine sıvı parafin dökülür. Parafin laboratuvar ısısında mum gibi donarak sertleşir. Kalıptan çıkarınca içinde bizim doku parçamız da bulunan düzgün prizmatik bir parafin bloku elde ederiz. Parafinintersüller boşluklara hatta hücrelerin içine bile penetre olarak dokuyu daha sabit ve kesilebilir hale getirir. Elektron mikroskop için ışık mikroskobuna oranla çok daha ince kesitlere ihtiyaç vardır. Bu nedenle gömme ya da bloklama işleminde daha sert plastik maddeler gereklidir. Bunun için epon, araldit gibi epoxy plastik maddeler kullanılır.Bloklama işleminde ne tür maddeler kullanılır?Kesit AlmaBlokladığımız doku ve organ parçalarında düzgün ince kesitler almak için kullandığımız aletlere mikrotom denir. Işık mikroskop incelemeleri için kullandığımız mikrotomlar mikron düzeylerinde ince kesitler alabilirlerken elektron mikroskop araştırmalarında kullanılan ultramikrotomlar angström inceliklerinde kesitler sağlarlar. Işık mikroskobu için kesitler almakta kullandığımız mikrotomlarda çelik bıçaklar kullanılırken, EM için kesitler aldığımızultra mikrotomlarda cam ya da daha iyisi elmas bıçaklar kullanılır. Işık mikroskop çalışmalarında genellikle 6-10 mikronluk kesitler kullanılır. Mikrotomların bıçakların hareketli olduğu kızaklı mikrotom denilen tipleri ya da bıçaklarının sabit, kesilecek blokların hareketli olduğu rotari mikrotom tipleri vardır. Mikrotom aracılığıyla parafin bloklardan isteğimiz kalınlıklarda dilimler keserken blok içindeki parçadan da aynı kalınlıkta kesitler elde etmiş oluruz. Daha sonra lam üzerinde alınan kesitler boyama işlemine hazır olurlar.Xylol gibi bazı solventler doku içindeki lipidler gibi bazı maddeleri eritebilirler. Bu istenmeyen etkinin önüne geçmek için cryostat adı verilen dondurma mikrotomları kullanılır. Dokular bu yöntemle düşük ısıda aniden dondurularak takip işlemlerinden geçirilmeden ve bloklanmadan kesit alınabilir hale gelir.Mikrotom ve Ultramikrotom neye denir?Boyama (Kolorasyon)Çok ufak ayrıcalıklar dışında dokuların büyük bir kısmı renksizdir ve boyanmadığı sürece ışık mikroskobunda incelenmesi zordur. Çeşitli doku ve hücre kısımlarının yapıları nedeniyle farklı kimyasal özellikteki boyaları farklı bir şekilde tutmaları histolojide boyamanın esasını teşkil eder. Histolojik araştırmalarda kullanılan boyaların büyük bir çoğunluğu asit veya baz özelliğinde olup dokudaki ionize köklerle elektrostatik bağlantı yaparlar. Bu şekilde doku ve hücrelerin daha belirgin bir şekilde ortaya çıkması sağlanırken diğer yandan kimyasalyapısını bildiğimiz boyalarla reaksiyona giren yapıların kimyasal özellikleri ortaya konmuş olur. Histolojik boyalar renklendirici gruplarının asit ya da baz oluşuna göre asit ve bazik boyalar olmak üzere iki ana grupta toplanırlar. Bazik boyaları çeken, o boyanın renginde boyanan hücre ve doku kısımları bazofil boyanıyor ya da bazofili gösteriyor diye tanımlanır.Genel olarak granüllü endoplazmik retikulumun yoğun olduğu kısımlar, hücre çekirdeği bazofili gösteren yapılardır. Asit boyalarla reaksiyona girerek onun renginde boyanan hücre ya da doku kısımları için asidofil boyanıyor ya da asidofili gösteriyor denir. Bazı ayrıcalıkları olmakla birlikte hücre sitoplazması, kollajen lifler, mitokondrium ve lizozomlar asidofilik yapılardır. Bazik boyalara örnek olarak Metilen Mavisi, Jansiyan Viyole, Bazik Füksin, Azokarmin, Safranin, Hematoksilin, Nükleer Fast Red verilebilir. Eozin, Pikrik Asit, AsitFüksin, Oranj G, Eritrosin, Kongo Kırmızısı, Light Green gibi boyalar asit boyalara örnektir.Boyalar bazı yöntemlerde tek olarak kullanılır. Bazı yöntemlerde ikili ya da daha çok boya içeren birleşik yöntemler dediğimiz şekillerde kullanılırlar. Birleşik yöntemlerde kesitler birbiri ardından bazik ve asit boyalarla işleme tabi tutulurlar. Birleşik boya yöntemlerinden ikili olanlara örnek olarak çok yaygın bir boyama yöntemi olan Hematoksilin+Eozin (HE) yöntemi gösterilebilir. Azokarmin, Oranj G ve Anilin Mavisinden oluşan Heidenhein İn Azan yöntemi ise üçlü bir boyama yöntemidir.Asidofili ve bazofili neye denir?Birleşik boyama neye denir?Bazı boyalar, bazı yapıları boyanan çözelti renginden farklı bir renge boyarlar. Bu olaya metakromazi, böyle boyalara da metakromatik boyalar denir. Örneğin toluidin mavisi dokuya düşük konsantrasyonda bağlandığında mavi renkte boyar (ortokromatik). Oysa bir yapıya yüksek konsantrasyonda bağlandığında mor-kırmızı renkte boyar (metakromatik). Toluidin mavisinin Mast hücrelerinin granüllerini mor-kırmızı boyaması metakromatik boyanmadır.Bazı lipidler, makromoleküller metafosfat, sülfomukopolisakkaritler, nükleik asitler metakromazi gösteren yapılardır. Toluidin mavisi, Metilen mavisi, Azur A gibi boyalar ise metakromatik boyalara örnek verilebilir.Ortokromazi ve metakromazi nedir?Bazı boyalar deneysel amaçla doğrudan canlıya verilebilir. Bu renkli maddeler organizmada bazı yerlerde tutularak canlıda boyanma sağlarlar. Örneğin, tripan mavisi deney hayvanının dolaşımına verildiğnide karaciğer kupffer hücreleri tarafından tutulur. Böylece hayvan daha canlıyken sitoplazması mavi tanecikler tarzında boyunmış olur. Vital boyalardan Tripan mavisi, Kongo kırmızısı, Çini mürekkebi, Alizarin ve Lityum karmin asit karakterde vital boyalardır. Metilen Mavisi, Nötral Red, Janus Green, Krezil Viyole ve Nigrosin bazik karakterdevital boyalardır.Vital boyamanın diğer boyama yöntemlerinden farkı nedir?Boyama işleminden sonra kesitler yeni baştan dehidrate edilir ve şeffaflaştırılır. Daha sonra üzerlerine lamel kapatılarak korunur. Preparatların kapatılmasında Kanada Balsamı ya da son zamanlarda ucuzluğu ve çabuk kuruması yönünden tercih edilen bazı sentetik yapıştırıcılar kullanılmaktadır. Uzun süre saklanılması düşünülen preparatları doğrudan güneş ışığı ya da kuvvetli ışıklardan sakınmak gerekir. Aksi takdirde boya solacaktır.Dokuların renkli boyalarla boyanmasının yanı sıra altın, gümüş gibi bazı metallerin seçici olarak bazı kısımlara çöktürülmesi de o bölgelerin mikroskop altında kolayca belirlenmesini sağlayan boyadışı bir renklendirme yöntemi olarak karşımıza çıkar.

http://www.biyologlar.com/histoloji-preparatlarinin-hazirlanmasi-1

Helmintlerde Tespit, Boyama ve Kalıcı Preparat Yapımı

Ahmet GÖKÇEN Harran Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, Şanlıurfa, Türkiye ÖZET: Helmintlerin toplanma, gevşetilme, tespit, boyanma ve kalıcı preparat halinde saklama teknikleri parazitologlar için büyük önem arz eder. Parazitlerin, canlı olarak toplanmaları ve direkt tespit edilmeleri gerekir. Bu süreç, parazitlerin iç ve dış yapılarının uygun şekilde korunmalarını sağlar. Helmintlerin gevşetilmesi ve normal şekillerinin korunması için çeşitli metodlar kullanılabilir. Bu metotlar örneklerin uzun süre korunmasını sağlar. Boyama ve montaj teknikleri; örneğin türüne, büyüklüğüne ve gelişme dönemine göre değişir. Bu derlemede helmintlerin gevşetilmesi, tespiti, boyama ve kalıcı preparat haline getirilmeleri tartışılmıştır. Anahtar Sözcükler: Helmint, gevşetme, tespit, boyama, kalıcı preparat. Fixation, Staining and Preparation of Permanent Mounts of Helminths SUMMARY: The techniques for the collection, relaxation, preservation and staining of helminths are very important for parasitologists. Parasites should be collected alive and fixed directly in the living condition. These procedures insure proper preservation of internal and external details of parasites. There are various methods for relaxing and preserving the normal morphology of helminths. These methods are absolutely essential for permanent preservation of the specimens. Staining and mounting techniques vary depending upon size of specimens, species, and stage of development of the organisms. In this review, the preparation of permanent mounts, relaxation, fixation and staining methods of helminths has been discussed. Key Words: Helminth, relaxation, fixation, staining, permanent mounts GİRİŞ Helmintlerin teşhisi değişik gelişme formlarından birinin veya yumurtalarının görülmesi ile yapılmaktadır. Büyük çoğunluğu sindirim sisteminde yerleştikleri için dışkı muayenesinin teşhiste ayrı bir önemi vardır. Dışkı muayeneleri, eğitim amacıyla öğrenci laboratuarlarında yapılabildiği gibi, hastalıkların teşhisi için hastanelerin parazitoloji laboratuarlarında da sık sık yapılmaktadır (5, 8, 9, 10). Helmintlerden kalıcı preparat hazırlanması, referans laboratuvarlarında rutin olarak yapılmaktadır. Özellikle helmint enfeksiyonlarının yaygın olduğu bölgelerde gerek doğru teşhis gerekse bu alanda yeni çalışmaya başlayan teknik personel ve akademisyenlerin eğitimi amacıyla koleksiyonlar oluşturulmaktadır. Çünkü incelenecek örneği her zaman ve her yerde bulmak mümkün değildir. Ayrıca öğrenci laboratuvarlarında müfredat programına göre uygun örnekleri seçerek uygulamalı eğitim birimlerinde kullanılma kolaylığı sağlar (1). Kalıcı preparat yapmanın ön koşulu, kullanılacak helmintlerin canlı, morfolojik yapısının tam, sağlam ve konaktan elde edilmiş olmasını zorunlu kılar. Yapılan koleksiyonun da kolaylıkla ulaşılabilir, teşhis ve eğitim amacıyla kullanılabilir olmasıgerekir (1, 12). Gerekli laboratuar malzemeleri : 1. Laboratuvar önlüğü: Çalışanların üzerlerinin kirlenmemesi, çeşitli boya ve kimyasal maddelerin elbiselere zarar vermemesi için, 2. Doğal kıl ve tüylerden yapılmış değişik boyda yumuşak tüylü muhtelif fırçalar: Örneklerin temizlenmesi için kullanılır. Sentetik ve plastik fırçalar kullanılan bazı solüsyonlardan etkilenip bozulabilir. 3. Diseksiyon seti: Sindirim sistemlerinin açılması ve büyük helmintlerin kesilip bölümlere ayrılması için kullanılır. 4. Eldiven: Tek kullanımlık olanlar tercih edilir. 5. Permanent kalemler: Preparatları ve saklama şişelerini işaretlemek için kullanılır. 6. Boyama kapları: Kullanım amacına göre çeşitli büyüklüklerde olmalıdır. 7. Plastik poşet ve torbalar: Atık malzemelerin toplanması için kullanılır. 8. Kullanılacak tüm cam ve benzeri malzemelerin temiz ve kuru olması, kimyasal solüsyonların taze hazırlanmış olması, boya solüsyonlarının filtre edilmiş Makale türü/Article type: Derleme/Review Geliş tarihi/Submission date: 02 Kasım/02 November 2007 Düzeltme tarihi/Revision date: 14 Şubat/14 February 2008 Kabul tarihi/Accepted date: 06 Mart/06 March 2008 Yazışma /Correspoding Author: Ahmet Gökçen Tel: (+90) (414) 312 84 56 Fax: (+90) (414) 314 41 58 E-mail: agokcen@harran.edu.tr Gökçen A. 178 olması ve içlerinde çökelti ve tortulaşma olmaması gerekir. 9. Kaliteli ve uzun süre dayanıklı olan yapıştırıcı kullanılmalıdır. Tavsiye edilen en iyi yapıştırıcı Kanada balsamı ve Gum-damardır. Diğer yapıştırı-cılar kuruyunca veya belli süre sonra opaklaşır ya da kristalleşerek preparatın bozulmasına yol açabilir. Ayrıca hava kabarcıkları oluşturarak helmint örneğinin net görülmesine engel olabilirler (12). Örnek toplama ve preparat yapımında dikkat edilecek genel hususlar : Her hayvanda çeşitli parazit türleri bulunabilir. Ancak bir hayvanda her türden yeterli sayıda helmint olmayabilir. O zaman birkaç hayvandan toplanan türlerden preparatlar yapılabilir. Bazı helmintler (Ascaridae’lerin çoğu, Anoplocephalidae’lerin bazıları gibi) tek bir preparata sığmayacak kadar büyük olabilir. Böyle durumlarda morfolojik özelliklerine göre teşhise yardımcı olan bölümleri dikkate alınan helmintler, parçalar halinde ayrılarak kalıcı preparatlara monte edilebilir. Kayıt ve işaretleme işlemleri düzenli tutulmalı ve özellikle bölümlere ayrılan örneklerde karışmaya fırsat verilmemelidir. Buna karşın nematodların çoğu ince bir kutikülaya sahip olduklarından boyama ve montaj yapılamayabilir. Bunların tespiti, suyunun giderilmesi ve montajı çok zor olduğu için genellikle içine birkaç damla gliserin ilave edilmiş %70’lik etil alkollü şişelerde saklanabilirler. Eğitim amacıyla kullanılacakları zaman bu şişelerden alınıp ya doğrudan ya da laktofenolde şeffaflandırıldıktan sonra morfolojik özellikleri mikroskopta incelenebilir (12). Örnek toplama, gevşetme, tespit ve boyama işlemleri esnasında aceleci olunmamalı, işlem aşamaları sırası atlanılmadan ve belirtilen zaman süreçleri içerisinde tam olarak uygulanmalıdır. Örneğin alkol serilerinden tam geçirilmeyen ve bunun sonucu tam dehidrasyonu sağlanmayan örnekler preparatlarda bulanıklaşır ve boyanan materyalin tüm ayrıntıları net olarak görülemeyebilir. Bazı helmint örnekleri çok küçük olduğu için gerek temizlerken, gerekse mikroskop altında çalışırken veya örnekleri tespit ve boyama kaplarına naklederken örnekler zarar görüp teşhise yardımcı olan morfolojik özellikleri tahrip olabilir. Bu gibi olumsuzluklara yol açmamak için nazik ve kibar olunmalıdır (1, 11). Kalıcı preparat yapılacak helmintler, iç ve dış detaylarının bozulmaması için canlı olarak toplanmalı ve derhal tespit edilmelidir. Parazit öldükten sonra vücudunda otolitik reaksiyonlar başlayacağından teşhis kriterleri olan bazı detaylar da dejenere olabilir. Konak hayvan ölünce ektopara-zitler konağı terk ederken endoparazitler belli bir süre sonra ölürler ve kısa süre içinde dejenere olmaya başlarlar. En iyi örnek, konak hayvan ölür ölmez ya da otopsi veya tüketim amacıyla kesilir kesilmez elde edilen canlı helmintlerdir. Cestod ve trematodlarda dejenerasyon ölümden birkaç dakika sonra başlarken nematodlarda bu süre birkaç saate kadar uzayabilir (10, 12). Helmintlerin boyanarak kalıcı preparat haline getirilme aşamaları : a. Helmintlerin konaklardan elde edilmesi, b. Helmintlerin temizlenmesi, c. Helmintlerin relaksatiyonu-gevşetilmesi d. Helmintlerin fikzasyonu-tespiti e. Helmintlerin boyanması ve kalıcı preparatlara monte edilmesi. a. Helmintlerin konaklardan elde edilmesi: İyi bir preparat yapımı için, örneklerin bütün ve canlı olarak elde edilmesi gerekir. Örnekler yeni ölen veya otopsi için kesilen konaklardan kısa sürede toplanmalıdır. Küçük hayvan-larda tüm sindirim sistemi özafagustan rectuma kadar bütün olarak açılır. Büyük hayvanlarda ise sindirim sistemi aralarına çift ligatür konulmuş bölümlere ayrılarak bir diseksiyon makası ile açılmalıdır. Mukozaya yapışmış helmintleri çıkarmak için zorlamamalı, kendiliğinden ayrılması için içerisine fizyolojik tuzlu su ilave edilmiş bir küvete konularak, birkaç saat buzdolabında masere edilmek suretiyle serbest kalmaları sağlanmalıdır. Cestodların skoleksleri bağırsak lumanine yapışık olduğundan kıl fırça veya diseksiyon iğnesi ile çok dikkatli bir şekilde lumenden ayrılıp toplanmaları gerekir. Çok küçük helmintleri toplamak için diseksiyonun mikroskobu kullanılabilir. Canlı helmintlerin parçalanması, distorsiyonu ve iç organlarının açığa çıkarak zarar görmesini önlemek için; toplama, temizleme ve transfer esnasında küt makas, dişsiz pens, yumuşak tüylü fırça, puar ve pipet gibi malzemeler ile izotonik sıvılar kullanılmalıdır. Organın dokusu içerisinde bulunan helmintleri toplamak için bu organları küçük parçalara ayırarak incelemek gerekir. Uzun süre önce ölmüş veya dondurulmuş halde olan örnekler kalıcı preparat yapımı için uygun değildir (9, 12). b. Helmintlerin temizlenmesi: Konak hayvanlardan dikkatlice alınıp petri kutularına nakledilen helmintler; dış yüzeyine yapışmış dışkı artıkları ve benzeri yabancı partiküllerden serum fizyolojik içinde yumuşak bir fırça yardımıyla yıkanarak temizlenir. Çok küçük örnekler stereomikroskop altında temizlenebilir. Temizlik esnasında bir kaba aşırı miktarda örnek konulmamalı ve kaplar çalkalanmamalıdır (12). c. Canlı helmintlerin relaksatiyonu-gevşetilmesi: Relaksatiyon veya gevşetme, helmintlerin doğal görünümde kalmalarının yapay olarak sağlanmasını içeren bir süreçtir. Tam gevşetilmeyen helmintlerin, büzüşüp kıvrılarak bir yumak halinde toplanmaları nedeniyle montaj esnasında teşhise yarayan morfolojik özellikleri tahrip olabilir. Monogenea’lar narin yapılı trematodlar olup genellikle soğukkanlı hayvanların (Balık, kurbağa vb.) deri, solungaç ve burun boşluklarına çekmenleriyle tutunmuş olarak yaşarlar. Bunlar balıkların 1/4000’lik formalin solüsyonunda 30 dakika kadar bekletilmeleri ile gevşemiş halde toplanırlar. Küçük Helmintlerde tesbit, boyama ve kalıcı preparat yapımı 179 trematodlar preparata yerleştirilir. Üzerine birkaç damla serum fizyolojik damlatılıp lamel kapatılır ve buzdolabında bir saat kadar bekletilerek gevşetilebilir. Çok küçük olanları diseksiyon mikroskobu kullanılarak puar veya ince bir pipet yardımıyla alınıp AFA (Alkol-Formalin-Asetik asit) (*) solüsyonunda saklanırlar (3, 4, 13). Digenea’lar halk arasında kelebek olarak adlandırılan, genellikle ince bağırsak, safra kesesi, safra kanalları, idrar kesesi gibi iç organ boşluklarında bulunan trematodlardır. Bunlar yerleştiği organların diseksiyonu ve içeriğin çeşme suyu altında yıkanması ile toplanırlar. Tespit edilmeden su içinde uzun süre kalırlarsa osmotik şok sonucu yırtılmalara ve dejenerasyonlara maruz kalabilirler. Daha büyük trematodlar, ise serum fizyolojik içerisinde birkaç saat veya bir gece buzdolabında bekletilerek gevşetilebilirler. Bir lam boyutundan daha uzun olan örnekler birkaç kez katlanarak lam boyutuna getirilebildiği gibi deney tüpleri veya cam kavanozlar içinde ya da uzun cestodlarda olduğu gibi uygun yerlerinden kesilerek müstakil bölümler halinde gevşetilebilirler (1, 3, 4, 11, 13). Cestodlar, segmentli yapıda olup genellikle konakların sindirim sistemi lumeninde yapışma organelleri ile tutunmuş halde bulunurlar. Dış yüzeyine yapışan dışkı artıklarından bir fırça yardımıyla temizlendikten sonra, soğuk distile su, serum fizyolojik veya % 5-10’luk etil alkolden herhangi birisinde 5–15 dakika bekletilerek gevşetilirler (4, 6, 9, 11). Nematodlar dışkı artıklarından temizlendikten sonra doğrudan glasiyal asetik asit içine atılıp 5–10 dakika bekletilir, daha sonra kıvrılanları uzatılarak düzeltilir ve hızlı bir şekilde % 70’lik etil alkole alınırlar. Bazı nematodlar bu esnada rupture olup parçalanabilir. Buna engel olmak için temizlenen nematodlar direkt kaynama derecesindeki sıcak % 70’lik etil alkole atılıp düzeltilerek gevşetilir ve tespit edilirler. Tespitte kullanılan alkol içerisine birkaç damla gliserin ilave edilmesi, nematodların hem yumuşak ve daha elastik kalmasını sağlar hem de alkol buharlaştığında kuruyup çatlamasını önler (6, 12). Acanthocephala’ların gevşetme ve tespiti nematodlarda olduğu gibi yapılır. Ancak başlarında morfolojik teşhis kriterlerine esas olan dikencikler bulunduğu için daha fazla itina ister. Lumene yapışmış halde bulunan proboscis kısmı çok dikkatli bir şekilde kopartılmadan çıkarılmalı ve daha sonra doğrudan distile su içine alınıp 30–120 dakika kadar tutularak temizlenmelidir (1, 11). Sülükler, içerisine birkaç mentol kristali atılmış çeşme suyuna alınıp 15–60 dakika bekletilerek gevşetilirken bazen saatlerce beklemek gerekebilir. Diğer bir yöntem ise sodyum karbonatlı suda bekletme yöntemidir (1). d. Helmintlerin fikzasyonu-tespiti: Fikzasyon veya tespit dokuların canlı iken sahip olduğu özelliklerinin muhafaza edilmesini sağlayan bir süreçtir. Örneklerin uzun süre dayanıklı kalması için iyi bir şekilde tespit edilmesi gerekir. Tespitin amacı gevşetilmiş örneklerin gerçek boyutunda kalmalarını sağlamak ve bünyelerinde olabilecek metabolik ve dokusal değişiklikleri durdurmaktır (12). Tespit için kullanılan çeşitli metotlar vardır. En basit, kolay ve ucuz olanı % 5’lik sıcak formol ile tespittir. Bunun yanında AFA fiksatifi, Gilson’un fisatifi (**) veya Shaudin’in fikzatifi (***) de kullanılabilir (1). Küçük Digenea’lar dışkı ve benzeri artıklardan temizlendikten sonra doğrudan AFA solüsyonu ile tespit edilirken, büyük olanları iki lam arasına konularak 48 saat süreyle tespit edilip % 70’lik etil alkolde uzun süre saklanabilirler (12). Cestodlar canlılık belirtileri tamamen kaybolmadan ilk 5–30 dakika içinde tespit edilmelidirler. Küçük cestodlar doğrudan AFA solüsyonuna alınırken, büyük olanları morfolojik yapılarına göre 3–4 cm uzunluğunda kesilerek, ezilip parçalanmayacak şekilde iki lam arasına sıkıştırılmalıdır. Daha sonra lamların yanlarına bir pipet yardımıyla tespit solüsyonu ilave edilerek cestod yüzeyleriyle teması sağlanır. Bundan sonra Digenea’larda olduğu gibi 24–72 saat tespit solüsyonunda bekletildikten sonra % 70’lik etil alkole alınarak uzun süre saklanabilirler (12). Nematodlar glasiyal asetik asitte hem tespit edilip hem de saklanabilirler. Bunun yanında direkt kaynama derecesindeki %70’lik sıcak etil alkole atılıp düzeltilerek gevşetilir ve tespit edilirler. Tespitte kullanılan alkol içerisine birkaç damla gliserin ilave edilmesi, hem nematodların yumuşak ve daha elastik kalmasını sağlar hem de alkol buharlaştığında kuruyup çatlamasını önler (1, 6, 12). Acanthocephala’lar temizlendikten sonra direkt AFA solüsyonuna alınarak tespit edilir. AFA solüsyonunda 3–7 gün tespit edildikten sonra %70’lik etil alkole alınıp uzun süre saklanabilir. İşlemler esnasında ve bu helmintleri naklederken çok dikkatli olunmalıdır. Aksi halde pens ile baş kısmından tutulursa teşhiste yararlanılan baş kısmındaki dikencikler dejenere olabilir (12). Sülükler iki lam arasına sandviç gibi bağlanıp dış yüzeyinden AFA solüsyonu ile teması sağlanarak 15–30 dakikada tespit edilirler. Ya da bağlı şekilde AFA solüsyonunda 7 gün tespit edildikten sonra % 70’lik etil alkolde uzun süre saklanabilirler (1). e. Helmintlerin boyanması ve kalıcı preparata monte edilmesi: Monogenea’lar çift lamel arası gliserin jeli (****) ile preparat yapılıp lama yapıştırılmak suretiyle kalıcı preparat haline getirilirler. Şeffaf oldukları için iç organelleri kolaylıkla görülebilir ve boyanmadan kalıcı preparat yapılabilirler (12). Bunun için: 1. Gevşetme ve tespiti yapılmış Monogenea’ya ait helmint bir pipet veya puar yardımıyla 22 x 22 mm veya daha büyük ölçekli bir lamel üzerine yerleştirilir. 2. Hava kabarcığı oluşturmadan üzerine bir damla gliserin jeli damlatılır. Gökçen A. 180 3. Üzerine yavaşça daha küçük bir lamel kapatılıp serin bir yerde bir süre bekletilir, kenarlardan çıkan gliserin jelin fazla kısmı tıraşlanarak temizlenir. 4. Bu şekilde hazırlanan örnek daha sonra bir lam üzerine monte edilerek Kanada balsamı ile yapıştırılır. Lama montaj esnasında küçük lamelli olan taraf alta yani lama temas eden yüze gelmeli ve kenar boşlukları büyük lamel tarafından korunmuş olmalıdır. Montaj işlemi biten preparat, 37 ºC’lik etüvde bir süre kurutularak kullanıma hazır hale getirilebilir (1, 12). Digenea’ların boyanmasında Mayer’s hematoksilen, Semichon’s acetocarmine, Van Cleave’s acetocarmine veya Malzacher’s boyaması gibi çeşitli boyama metotları kullanılabilir. Aşamaları-nın karmaşık olmaması ve kolayca yapılabilmesi nedeniyle en çok tercih edilen Semichon’s acetocarmine (*****) boyama metodudur (10, 12). Bunun için: 1. Etil alkolde saklanan örnekler direkt Semichon’s asetocarmin boya solüsyonuna alınarak 2–4 saat boyanır. 2. Boyanan örnekler %70’lik etil alkolde 15–30 dakika bekletilir. 3. Boyanın sabitlenmesi için %70’lik asit alkolde trematodun büyüklüğüne göre 15 saniye – 10 dakika arasında tutulur. 4. Örnekler 15 saniye – 10 dakika arasında %70’lik bazik alkol ile muamele edilir. 5. Önce %70’lik etil alkolde 5 dakika, sonra %95’lik etil alkolde 15–30 dakika ve daha sonra %96’lık absolüte etil alkolde her biri 15–30 dakika olmak üzere üç kez alkolden geçirilir. 6. Ksilen veya toluende her biri 10–20 dakika olmak üzere iki kez tutulur. Daha sonra iki lam arasına monte edilerek Kanada balsamı veya Gum-damar ile yapıştırılır. Cestodların boyanması Digenea’lardaki gibi Semichon’s acetocarmine metoduyla yapılabilir. Bunun yanında Borax Carmine (******) ile de boyanmaktadır. Büyük cestodlarda teşhis kriterlerine esas olmak üzere morfolojik farklılık gösteren skoleks-baş bölgesi 2–3 cm aşağısındaki boyun bölümünden kesilir, 2–3 cm uzunluğunda birkaç genç halka ile birkaç olgun halka alınarak boyanıp ayrı ayrı preparatlara monte edilir. Metrelerce uzunluğundaki cestodun tamamını boyamaya gerek yoktur. Tespit ve boyama esnasında çok dikkatli olmalı, birden fazla tür varsa farklı türlerin skoleks ve halkaları birbirine karıştırılmamalıdır (12). Borax Carmin ile boyama prosedürünün aşamaları şunlardır. 1. Örnekler alkol serilerinden (%70, %80, %90 ve %96’lık) geçirilir. 2. Hazırlanan Borax – Carmin solüsyonunda 15 dakika boyanır. 3. Beşer dakikalık sürelerle üç kez distile sudan geçirilir ve %70’lik etil alkol şişelerine alınır. 4. Preparata monte edilerek kanada balsamı ile yapıştırılıp, 37 °C’lik etüvde kurutulur. Nematodların bir kısmı toprakta serbest yaşarken, önemli bir bölümü de insan ve hayvanların sindirim, kan ve lenf sistemlerinde parazit olarak yaşamaktadır (2, 3, 4, 11). Nematodların 2 cm’den küçük olanları bütün halde bir preparata monte etmek için uygundur. Buna karşın daha büyük nematodlar morfolojik yapılarına göre teşhise yardımcı olacak bölümleri kasilerek ayrı ayrı bölümler halinde monte edilmelidir. Ya da parafinli bloklarda histolojik kesitler alınarak preparatlara monte dilip hematoksilen eosin ile boyanarak teşhis edilirler (12). Tespitten sonra değişik yoğunluktaki alkol serilerinden geçirilen nematodlar ksilen veya toluende bekletildikten sonra boyanmadan direkt preparata monte edilebilirler. Eğer %70’lik etil alkolde saklanacaklarsa içerisine %5’lik gliserol ilave edilmesi gerekir (10, 12). Kalıcı preparat yapımında prosedür şu aşamalardan oluşur: 1. Nematodlar eğer tespit edilmemişse, %70’lik etil alkolde 30 dakika tespit edilir. 2. Alkol serilerinden geçirilişi. %95’lik etil alkolde 30 dakika, %96’lık absolüte etil alkolde iki kez 30’ar dakika, Ksilen veya toluende önce 15, sonra 30 dakika bekletilmeli. 3. Preparata montajı yapılıp üzerine lamel kapatılarak Kanada balsamı ile yapıştırılır. Daha sonra 37 ºC’lik etüvde birkaç hafta kurutularak kalıcı preparat haline getirilebilir. Acanthocephala’lar genellikle balık, kaplumbağa, su kuşları nadiren insan ve evcil hayvanların ince bağırsaklarında lokalize olurlar (4, 11, 13). Acanthocephala’lar boyalı veya nematodlarda olduğu gibi boyasız olarak mikroskopta incelenebilir. Boyama yapılacaksa; Van Cleave’s hematoxylin veya Mayer’s hematoxylin metodlarıyla ya da cestodlarda olduğu gibi en çok önerilen Semichon’s acetocarmine metoduyla boyanarak kalıcı preparatları yapılabilir (10, 12). Sülükler genellikle göl, havuz, bataklık gibi durgun sularda veya yavaş akan dere, ırmak ve nehirlerde; ya balık, kaplumbağa gibi konaklara yapışmış halde ya da serbest halde bulunurlar (4). Büyük sülükler boyanmadan direkt incelenip % 70’lik etil alkol konulmuş şişelerde boyanmadan saklanırken, küçük sülükler Digenea’larda olduğu gibi gibi Semichon’s acetocarmine metoduyla boyanarak kalıcı preparatları yapılabilir (10, 12). Parazitlerin iç ve dış yapılarını uygun şekilde korumak için laboratuarlarda değişik metotlar uygulanmaktadır. Teşhis ve eğitim amacıyla kullanılan ve söz konusu metotlarla elde edilen koleksiyonlardan her zaman yararlanılabilir. Sonuç olarak, bu derlemede farklı kaynaklarda dağınık şekilde bulunan Helmintlerde tesbit, boyama ve kalıcı preparat yapımı 181 helmintlerdeki gevşetme, tespit, boyama ve kalıcı preparata montaj metotlarının toplu olarak sunulması gereği vardır. Bunun zaman ve emek kaybını önlemek için helmintoloji alanında yeni çalışmaya başlayanlara kolaylık sağlayacağı düşünülmektedir. Metinde geçen kimyasal bileşikler ve formülasyonları (*) AFA (Alkol-Formalin-Asetik asit) fikzatifi 1. Ticari Formalin (HCHO) : 100 ml 2. Etil alkol (C2H5OH, % 95’lik) : 250 ml 3. Glasiyal asetik asit (CH3COOH) : 50 ml 4. Gliserin (C3H5(OH)3) : 100 ml 5. Distile su : 500 ml (**) Gilson’un fikzatifi 1. Nitrik asit (HNO3, % 80’lik) : 15 ml 2. Glasiyel asetik asit (CH3COOH) : 4 ml 3. Civa klörür (HgCl2) : 20 gr 4. Etil alkol (C2H5OH, % 60’lık) : 100 ml 5. Distile su : 800 ml (***)Shaudin’in fikzatifi 1. Civa klorür (HgCl2, Distile su ile doymuş halde) : 200 ml 2. Etil alkol (C2H5OH, % 95’lik) : 100 ml 3. Glasiyel asetik asit (CH3COOH) : 15 ml (****) Gliserin jeli bileşimi 1. Jelatin : 10 gr 2. Distile su : 60 ml 3. Gliserin : 70 ml 4. Fenol : 1gr Hazırlanışı: Kristal fenol suda çözülür ve jelâtin ilave edilir. Çözünüp homojen hale gelinceye kadar ısıtılır. Daha sonra geniş ağızlı bir cam şişeye katılıp soğutulur ve kullanılır. (*****) Semichon’s Acetocarmine (Stok solüsyonu) 1. Glasiyal asetik asit (CH3COOH) : 250 ml 2. Distile su : 250 ml 3. Carmin : 5 gr 4. Etil alkol (C2H5OH, % 70’lik) : 500 ml (******) Borax Carmine bileşimi 1. Carmine : 3 gr 2. Borax (Na2B4O7. 10H2O) : 4 gr 3. Distile su : 100 ml 4. Etil alkol (C2H5OH, % 70’lik): 100 ml Hazırlanışı: Carmin ve borax distile su ile çözünene kadar kaynatılır, soğutulur ve etil alkol ilave edilerek 1–2 gün bekletildikten sonra süzgeç kâğıdından süzülerek kullanılır. KAYNAKLAR 1. Anonim, 1961. Laboratory Procedures in Parasitology, TM 8– 227–2. Headquarters, Washington, USA. 2. Anderson RC, 1992. Nematode Parasites of Vertebrates, Their Development and Transmission, CAB Int, UK. p. 1–12. 3. Dunn AM, 1978. Veterinary Helmintology, 2nd. ed., William Heinemann, London. p. 295–304. 4. Güralp N, 1981. Helmintoloji, Ank Ünv Vet Fak Yay No: 368 Ders Kitabı: 266, İkinci baskı, Ank Ünv Basımevi, Ankara. 5. Hendrix CM, 1997. Laboratory Procedures for Veterinary Technicians, 3rd. Ed., Mosby, Inc., USA. 6. Kassai T, 1999. Veterinary Helminthology. 1st ed., Butterworth- Heinemann, Oxford. p. 181–204. 7. Merdivenci A, 1967. Türkiye’nin Marmara Bölgesinde Evcil Tavuk, Hindi, Ördek ve Kazlarda Görülen Trematod, Cestod ve Nematodlara Dair Araştırmalar, Kutulmuş Matbaası, İstanbul. 8. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food (MAFF), 1971. Manuel of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques, HMSO, Technical Bulletin No:18, London. 9. Pratt PW, 1997. Laboratory Precedures for Veterinary Technicians, 3rd. ed., Mosby Inc., Missouri. 10. Sloss MW, Kemp RL, Zajak AM, 1994. Veterinary Clinical Parasitology 6th. ed., Iowa State University, Ames, Iowa. 11. Soulsby EJL, 1986. Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals, 7th. ed., Bailliere Tindall, London. p.763–777. 12. Upton SJ, 2005. Animal Parasitology, Biology 625 Laboratory Manual, Kansas Satate University, USA. 13. Urquhart GM, Armour J, Duncan JL, Dunn AM and Jennings FW, 1988. Veterinary Parasitology. ELBS, Longman UK. p. 269–279. Kaynak: Türkiye Parazitoloji Dergisi, 32 (2): 177 - 181, 2008 PDF formatını buradan indirebilirsiniz.: www.tparazitolderg.org/pdf.php3?id=341Ahmet GÖKÇEN Harran Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, Şanlıurfa, Türkiye ÖZET: Helmintlerin toplanma, gevşetilme, tespit, boyanma ve kalıcı preparat halinde saklama teknikleri parazitologlar için büyük önem arz eder. Parazitlerin, canlı olarak toplanmaları ve direkt tespit edilmeleri gerekir. Bu süreç, parazitlerin iç ve dış yapılarının uygun şekilde korunmalarını sağlar. Helmintlerin gevşetilmesi ve normal şekillerinin korunması için çeşitli metodlar kullanılabilir. Bu metotlar örneklerin uzun süre korunmasını sağlar. Boyama ve montaj teknikleri; örneğin türüne, büyüklüğüne ve gelişme dönemine göre değişir. Bu derlemede helmintlerin gevşetilmesi, tespiti, boyama ve kalıcı preparat haline getirilmeleri tartışılmıştır. Anahtar Sözcükler: Helmint, gevşetme, tespit, boyama, kalıcı preparat. Fixation, Staining and Preparation of Permanent Mounts of Helminths SUMMARY: The techniques for the collection, relaxation, preservation and staining of helminths are very important for parasitologists. Parasites should be collected alive and fixed directly in the living condition. These procedures insure proper preservation of internal and external details of parasites. There are various methods for relaxing and preserving the normal morphology of helminths. These methods are absolutely essential for permanent preservation of the specimens. Staining and mounting techniques vary depending upon size of specimens, species, and stage of development of the organisms. In this review, the preparation of permanent mounts, relaxation, fixation and staining methods of helminths has been discussed. Key Words: Helminth, relaxation, fixation, staining, permanent mounts GİRİŞ Helmintlerin teşhisi değişik gelişme formlarından birinin veya yumurtalarının görülmesi ile yapılmaktadır. Büyük çoğunluğu sindirim sisteminde yerleştikleri için dışkı muayenesinin teşhiste ayrı bir önemi vardır. Dışkı muayeneleri, eğitim amacıyla öğrenci laboratuarlarında yapılabildiği gibi, hastalıkların teşhisi için hastanelerin parazitoloji laboratuarlarında da sık sık yapılmaktadır (5, 8, 9, 10). Helmintlerden kalıcı preparat hazırlanması, referans laboratuvarlarında rutin olarak yapılmaktadır. Özellikle helmint enfeksiyonlarının yaygın olduğu bölgelerde gerek doğru teşhis gerekse bu alanda yeni çalışmaya başlayan teknik personel ve akademisyenlerin eğitimi amacıyla koleksiyonlar oluşturulmaktadır. Çünkü incelenecek örneği her zaman ve her yerde bulmak mümkün değildir. Ayrıca öğrenci laboratuvarlarında müfredat programına göre uygun örnekleri seçerek uygulamalı eğitim birimlerinde kullanılma kolaylığı sağlar (1). Kalıcı preparat yapmanın ön koşulu, kullanılacak helmintlerin canlı, morfolojik yapısının tam, sağlam ve konaktan elde edilmiş olmasını zorunlu kılar. Yapılan koleksiyonun da kolaylıkla ulaşılabilir, teşhis ve eğitim amacıyla kullanılabilir olması gerekir (1, 12). Gerekli laboratuar malzemeleri : 1. Laboratuvar önlüğü: Çalışanların üzerlerinin kirlenmemesi, çeşitli boya ve kimyasal maddelerin elbiselere zarar vermemesi için, 2. Doğal kıl ve tüylerden yapılmış değişik boyda yumuşak tüylü muhtelif fırçalar: Örneklerin temizlenmesi için kullanılır. Sentetik ve plastik fırçalar kullanılan bazı solüsyonlardan etkilenip bozulabilir. 3. Diseksiyon seti: Sindirim sistemlerinin açılması ve büyük helmintlerin kesilip bölümlere ayrılması için kullanılır. 4. Eldiven: Tek kullanımlık olanlar tercih edilir. 5. Permanent kalemler: Preparatları ve saklama şişelerini işaretlemek için kullanılır. 6. Boyama kapları: Kullanım amacına göre çeşitli büyüklüklerde olmalıdır. 7. Plastik poşet ve torbalar: Atık malzemelerin toplanması için kullanılır. 8. Kullanılacak tüm cam ve benzeri malzemelerin temiz ve kuru olması, kimyasal solüsyonların taze hazırlanmış olması, boya solüsyonlarının filtre edilmiş Makale türü/Article type: Derleme/Review Geliş tarihi/Submission date: 02 Kasım/02 November 2007 Düzeltme tarihi/Revision date: 14 Şubat/14 February 2008 Kabul tarihi/Accepted date: 06 Mart/06 March 2008 Yazışma /Correspoding Author: Ahmet Gökçen Tel: (+90) (414) 312 84 56 Fax: (+90) (414) 314 41 58 E-mail: agokcen@harran.edu.tr Gökçen A. 178 olması ve içlerinde çökelti ve tortulaşma olmaması gerekir. 9. Kaliteli ve uzun süre dayanıklı olan yapıştırıcı kullanılmalıdır. Tavsiye edilen en iyi yapıştırıcı Kanada balsamı ve Gum-damardır. Diğer yapıştırı-cılar kuruyunca veya belli süre sonra opaklaşır ya da kristalleşerek preparatın bozulmasına yol açabilir. Ayrıca hava kabarcıkları oluşturarak helmint örneğinin net görülmesine engel olabilirler (12). Örnek toplama ve preparat yapımında dikkat edilecek genel hususlar : Her hayvanda çeşitli parazit türleri bulunabilir. Ancak bir hayvanda her türden yeterli sayıda helmint olmayabilir. O zaman birkaç hayvandan toplanan türlerden preparatlar yapılabilir. Bazı helmintler (Ascaridae’lerin çoğu, Anoplocephalidae’lerin bazıları gibi) tek bir preparata sığmayacak kadar büyük olabilir. Böyle durumlarda morfolojik özelliklerine göre teşhise yardımcı olan bölümleri dikkate alınan helmintler, parçalar halinde ayrılarak kalıcı preparatlara monte edilebilir. Kayıt ve işaretleme işlemleri düzenli tutulmalı ve özellikle bölümlere ayrılan örneklerde karışmaya fırsat verilmemelidir. Buna karşın nematodların çoğu ince bir kutikülaya sahip olduklarından boyama ve montaj yapılamayabilir. Bunların tespiti, suyunun giderilmesi ve montajı çok zor olduğu için genellikle içine birkaç damla gliserin ilave edilmiş %70’lik etil alkollü şişelerde saklanabilirler. Eğitim amacıyla kullanılacakları zaman bu şişelerden alınıp ya doğrudan ya da laktofenolde şeffaflandırıldıktan sonra morfolojik özellikleri mikroskopta incelenebilir (12). Örnek toplama, gevşetme, tespit ve boyama işlemleri esnasında aceleci olunmamalı, işlem aşamaları sırası atlanılmadan ve belirtilen zaman süreçleri içerisinde tam olarak uygulanmalıdır. Örneğin alkol serilerinden tam geçirilmeyen ve bunun sonucu tam dehidrasyonu sağlanmayan örnekler preparatlarda bulanıklaşır ve boyanan materyalin tüm ayrıntıları net olarak görülemeyebilir. Bazı helmint örnekleri çok küçük olduğu için gerek temizlerken, gerekse mikroskop altında çalışırken veya örnekleri tespit ve boyama kaplarına naklederken örnekler zarar görüp teşhise yardımcı olan morfolojik özellikleri tahrip olabilir. Bu gibi olumsuzluklara yol açmamak için nazik ve kibar olunmalıdır (1, 11). Kalıcı preparat yapılacak helmintler, iç ve dış detaylarının bozulmaması için canlı olarak toplanmalı ve derhal tespit edilmelidir. Parazit öldükten sonra vücudunda otolitik reaksiyonlar başlayacağından teşhis kriterleri olan bazı detaylar da dejenere olabilir. Konak hayvan ölünce ektopara-zitler konağı terk ederken endoparazitler belli bir süre sonra ölürler ve kısa süre içinde dejenere olmaya başlarlar. En iyi örnek, konak hayvan ölür ölmez ya da otopsi veya tüketim amacıyla kesilir kesilmez elde edilen canlı helmintlerdir. Cestod ve trematodlarda dejenerasyon ölümden birkaç dakika sonra başlarken nematodlarda bu süre birkaç saate kadar uzayabilir (10, 12). Helmintlerin boyanarak kalıcı preparat haline getirilme aşamaları : a. Helmintlerin konaklardan elde edilmesi, b. Helmintlerin temizlenmesi, c. Helmintlerin relaksatiyonu-gevşetilmesi d. Helmintlerin fikzasyonu-tespiti e. Helmintlerin boyanması ve kalıcı preparatlara monte edilmesi. a. Helmintlerin konaklardan elde edilmesi: İyi bir preparat yapımı için, örneklerin bütün ve canlı olarak elde edilmesi gerekir. Örnekler yeni ölen veya otopsi için kesilen konaklardan kısa sürede toplanmalıdır. Küçük hayvan-larda tüm sindirim sistemi özafagustan rectuma kadar bütün olarak açılır. Büyük hayvanlarda ise sindirim sistemi aralarına çift ligatür konulmuş bölümlere ayrılarak bir diseksiyon makası ile açılmalıdır. Mukozaya yapışmış helmintleri çıkarmak için zorlamamalı, kendiliğinden ayrılması için içerisine fizyolojik tuzlu su ilave edilmiş bir küvete konularak, birkaç saat buzdolabında masere edilmek suretiyle serbest kalmaları sağlanmalıdır. Cestodların skoleksleri bağırsak lumanine yapışık olduğundan kıl fırça veya diseksiyon iğnesi ile çok dikkatli bir şekilde lumenden ayrılıp toplanmaları gerekir. Çok küçük helmintleri toplamak için diseksiyonun mikroskobu kullanılabilir. Canlı helmintlerin parçalanması, distorsiyonu ve iç organlarının açığa çıkarak zarar görmesini önlemek için; toplama, temizleme ve transfer esnasında küt makas, dişsiz pens, yumuşak tüylü fırça, puar ve pipet gibi malzemeler ile izotonik sıvılar kullanılmalıdır. Organın dokusu içerisinde bulunan helmintleri toplamak için bu organları küçük parçalara ayırarak incelemek gerekir. Uzun süre önce ölmüş veya dondurulmuş halde olan örnekler kalıcı preparat yapımı için uygun değildir (9, 12). b. Helmintlerin temizlenmesi: Konak hayvanlardan dikkatlice alınıp petri kutularına nakledilen helmintler; dış yüzeyine yapışmış dışkı artıkları ve benzeri yabancı partiküllerden serum fizyolojik içinde yumuşak bir fırça yardımıyla yıkanarak temizlenir. Çok küçük örnekler stereomikroskop altında temizlenebilir. Temizlik esnasında bir kaba aşırı miktarda örnek konulmamalı ve kaplar çalkalanmamalıdır (12). c. Canlı helmintlerin relaksatiyonu-gevşetilmesi: Relaksatiyon veya gevşetme, helmintlerin doğal görünümde kalmalarının yapay olarak sağlanmasını içeren bir süreçtir. Tam gevşetilmeyen helmintlerin, büzüşüp kıvrılarak bir yumak halinde toplanmaları nedeniyle montaj esnasında teşhise yarayan morfolojik özellikleri tahrip olabilir. Monogenea’lar narin yapılı trematodlar olup genellikle soğukkanlı hayvanların (Balık, kurbağa vb.) deri, solungaç ve burun boşluklarına çekmenleriyle tutunmuş olarak yaşarlar. Bunlar balıkların 1/4000’lik formalin solüsyonunda 30 dakika kadar bekletilmeleri ile gevşemiş halde toplanırlar. Küçük Helmintlerde tesbit, boyama ve kalıcı preparat yapımı 179 trematodlar preparata yerleştirilir. Üzerine birkaç damla serum fizyolojik damlatılıp lamel kapatılır ve buzdolabında bir saat kadar bekletilerek gevşetilebilir. Çok küçük olanları diseksiyon mikroskobu kullanılarak puar veya ince bir pipet yardımıyla alınıp AFA (Alkol-Formalin-Asetik asit) (*) solüsyonunda saklanırlar (3, 4, 13). Digenea’lar halk arasında kelebek olarak adlandırılan, genellikle ince bağırsak, safra kesesi, safra kanalları, idrar kesesi gibi iç organ boşluklarında bulunan trematodlardır. Bunlar yerleştiği organların diseksiyonu ve içeriğin çeşme suyu altında yıkanması ile toplanırlar. Tespit edilmeden su içinde uzun süre kalırlarsa osmotik şok sonucu yırtılmalara ve dejenerasyonlara maruz kalabilirler. Daha büyük trematodlar, ise serum fizyolojik içerisinde birkaç saat veya bir gece buzdolabında bekletilerek gevşetilebilirler. Bir lam boyutundan daha uzun olan örnekler birkaç kez katlanarak lam boyutuna getirilebildiği gibi deney tüpleri veya cam kavanozlar içinde ya da uzun cestodlarda olduğu gibi uygun yerlerinden kesilerek müstakil bölümler halinde gevşetilebilirler (1, 3, 4, 11, 13). Cestodlar, segmentli yapıda olup genellikle konakların sindirim sistemi lumeninde yapışma organelleri ile tutunmuş halde bulunurlar. Dış yüzeyine yapışan dışkı artıklarından bir fırça yardımıyla temizlendikten sonra, soğuk distile su, serum fizyolojik veya % 5-10’luk etil alkolden herhangi birisinde 5–15 dakika bekletilerek gevşetilirler (4, 6, 9, 11). Nematodlar dışkı artıklarından temizlendikten sonra doğrudan glasiyal asetik asit içine atılıp 5–10 dakika bekletilir, daha sonra kıvrılanları uzatılarak düzeltilir ve hızlı bir şekilde % 70’lik etil alkole alınırlar. Bazı nematodlar bu esnada rupture olup parçalanabilir. Buna engel olmak için temizlenen nematodlar direkt kaynama derecesindeki sıcak % 70’lik etil alkole atılıp düzeltilerek gevşetilir ve tespit edilirler. Tespitte kullanılan alkol içerisine birkaç damla gliserin ilave edilmesi, nematodların hem yumuşak ve daha elastik kalmasını sağlar hem de alkol buharlaştığında kuruyup çatlamasını önler (6, 12). Acanthocephala’ların gevşetme ve tespiti nematodlarda olduğu gibi yapılır. Ancak başlarında morfolojik teşhis kriterlerine esas olan dikencikler bulunduğu için daha fazla itina ister. Lumene yapışmış halde bulunan proboscis kısmı çok dikkatli bir şekilde kopartılmadan çıkarılmalı ve daha sonra doğrudan distile su içine alınıp 30–120 dakika kadar tutularak temizlenmelidir (1, 11). Sülükler, içerisine birkaç mentol kristali atılmış çeşme suyuna alınıp 15–60 dakika bekletilerek gevşetilirken bazen saatlerce beklemek gerekebilir. Diğer bir yöntem ise sodyum karbonatlı suda bekletme yöntemidir (1). d. Helmintlerin fikzasyonu-tespiti: Fikzasyon veya tespit dokuların canlı iken sahip olduğu özelliklerinin muhafaza edilmesini sağlayan bir süreçtir. Örneklerin uzun süre dayanıklı kalması için iyi bir şekilde tespit edilmesi gerekir. Tespitin amacı gevşetilmiş örneklerin gerçek boyutunda kalmalarını sağlamak ve bünyelerinde olabilecek metabolik ve dokusal değişiklikleri durdurmaktır (12). Tespit için kullanılan çeşitli metotlar vardır. En basit, kolay ve ucuz olanı % 5’lik sıcak formol ile tespittir. Bunun yanında AFA fiksatifi, Gilson’un fisatifi (**) veya Shaudin’in fikzatifi (***) de kullanılabilir (1). Küçük Digenea’lar dışkı ve benzeri artıklardan temizlendikten sonra doğrudan AFA solüsyonu ile tespit edilirken, büyük olanları iki lam arasına konularak 48 saat süreyle tespit edilip % 70’lik etil alkolde uzun süre saklanabilirler (12). Cestodlar canlılık belirtileri tamamen kaybolmadan ilk 5–30 dakika içinde tespit edilmelidirler. Küçük cestodlar doğrudan AFA solüsyonuna alınırken, büyük olanları morfolojik yapılarına göre 3–4 cm uzunluğunda kesilerek, ezilip parçalanmayacak şekilde iki lam arasına sıkıştırılmalıdır. Daha sonra lamların yanlarına bir pipet yardımıyla tespit solüsyonu ilave edilerek cestod yüzeyleriyle teması sağlanır. Bundan sonra Digenea’larda olduğu gibi 24–72 saat tespit solüsyonunda bekletildikten sonra % 70’lik etil alkole alınarak uzun süre saklanabilirler (12). Nematodlar glasiyal asetik asitte hem tespit edilip hem de saklanabilirler. Bunun yanında direkt kaynama derecesindeki %70’lik sıcak etil alkole atılıp düzeltilerek gevşetilir ve tespit edilirler. Tespitte kullanılan alkol içerisine birkaç damla gliserin ilave edilmesi, hem nematodların yumuşak ve daha elastik kalmasını sağlar hem de alkol buharlaştığında kuruyup çatlamasını önler (1, 6, 12). Acanthocephala’lar temizlendikten sonra direkt AFA solüsyonuna alınarak tespit edilir. AFA solüsyonunda 3–7 gün tespit edildikten sonra %70’lik etil alkole alınıp uzun süre saklanabilir. İşlemler esnasında ve bu helmintleri naklederken çok dikkatli olunmalıdır. Aksi halde pens ile baş kısmından tutulursa teşhiste yararlanılan baş kısmındaki dikencikler dejenere olabilir (12). Sülükler iki lam arasına sandviç gibi bağlanıp dış yüzeyinden AFA solüsyonu ile teması sağlanarak 15–30 dakikada tespit edilirler. Ya da bağlı şekilde AFA solüsyonunda 7 gün tespit edildikten sonra % 70’lik etil alkolde uzun süre saklanabilirler (1). e. Helmintlerin boyanması ve kalıcı preparata monte edilmesi: Monogenea’lar çift lamel arası gliserin jeli (****) ile preparat yapılıp lama yapıştırılmak suretiyle kalıcı preparat haline getirilirler. Şeffaf oldukları için iç organelleri kolaylıkla görülebilir ve boyanmadan kalıcı preparat yapılabilirler (12). Bunun için: 1. Gevşetme ve tespiti yapılmış Monogenea’ya ait helmint bir pipet veya puar yardımıyla 22 x 22 mm veya daha büyük ölçekli bir lamel üzerine yerleştirilir. 2. Hava kabarcığı oluşturmadan üzerine bir damla gliserin jeli damlatılır. Gökçen A. 180 3. Üzerine yavaşça daha küçük bir lamel kapatılıp serin bir yerde bir süre bekletilir, kenarlardan çıkan gliserin jelin fazla kısmı tıraşlanarak temizlenir. 4. Bu şekilde hazırlanan örnek daha sonra bir lam üzerine monte edilerek Kanada balsamı ile yapıştırılır. Lama montaj esnasında küçük lamelli olan taraf alta yani lama temas eden yüze gelmeli ve kenar boşlukları büyük lamel tarafından korunmuş olmalıdır. Montaj işlemi biten preparat, 37 ºC’lik etüvde bir süre kurutularak kullanıma hazır hale getirilebilir (1, 12). Digenea’ların boyanmasında Mayer’s hematoksilen, Semichon’s acetocarmine, Van Cleave’s acetocarmine veya Malzacher’s boyaması gibi çeşitli boyama metotları kullanılabilir. Aşamaları-nın karmaşık olmaması ve kolayca yapılabilmesi nedeniyle en çok tercih edilen Semichon’s acetocarmine (*****) boyama metodudur (10, 12). Bunun için: 1. Etil alkolde saklanan örnekler direkt Semichon’s asetocarmin boya solüsyonuna alınarak 2–4 saat boyanır. 2. Boyanan örnekler %70’lik etil alkolde 15–30 dakika bekletilir. 3. Boyanın sabitlenmesi için %70’lik asit alkolde trematodun büyüklüğüne göre 15 saniye – 10 dakika arasında tutulur. 4. Örnekler 15 saniye – 10 dakika arasında %70’lik bazik alkol ile muamele edilir. 5. Önce %70’lik etil alkolde 5 dakika, sonra %95’lik etil alkolde 15–30 dakika ve daha sonra %96’lık absolüte etil alkolde her biri 15–30 dakika olmak üzere üç kez alkolden geçirilir. 6. Ksilen veya toluende her biri 10–20 dakika olmak üzere iki kez tutulur. Daha sonra iki lam arasına monte edilerek Kanada balsamı veya Gum-damar ile yapıştırılır. Cestodların boyanması Digenea’lardaki gibi Semichon’s acetocarmine metoduyla yapılabilir. Bunun yanında Borax Carmine (******) ile de boyanmaktadır. Büyük cestodlarda teşhis kriterlerine esas olmak üzere morfolojik farklılık gösteren skoleks-baş bölgesi 2–3 cm aşağısındaki boyun bölümünden kesilir, 2–3 cm uzunluğunda birkaç genç halka ile birkaç olgun halka alınarak boyanıp ayrı ayrı preparatlara monte edilir. Metrelerce uzunluğundaki cestodun tamamını boyamaya gerek yoktur. Tespit ve boyama esnasında çok dikkatli olmalı, birden fazla tür varsa farklı türlerin skoleks ve halkaları birbirine karıştırılmamalıdır (12). Borax Carmin ile boyama prosedürünün aşamaları şunlardır. 1. Örnekler alkol serilerinden (%70, %80, %90 ve %96’lık) geçirilir. 2. Hazırlanan Borax – Carmin solüsyonunda 15 dakika boyanır. 3. Beşer dakikalık sürelerle üç kez distile sudan geçirilir ve %70’lik etil alkol şişelerine alınır. 4. Preparata monte edilerek kanada balsamı ile yapıştırılıp, 37 °C’lik etüvde kurutulur. Nematodların bir kısmı toprakta serbest yaşarken, önemli bir bölümü de insan ve hayvanların sindirim, kan ve lenf sistemlerinde parazit olarak yaşamaktadır (2, 3, 4, 11). Nematodların 2 cm’den küçük olanları bütün halde bir preparata monte etmek için uygundur. Buna karşın daha büyük nematodlar morfolojik yapılarına göre teşhise yardımcı olacak bölümleri kasilerek ayrı ayrı bölümler halinde monte edilmelidir. Ya da parafinli bloklarda histolojik kesitler alınarak preparatlara monte dilip hematoksilen eosin ile boyanarak teşhis edilirler (12). Tespitten sonra değişik yoğunluktaki alkol serilerinden geçirilen nematodlar ksilen veya toluende bekletildikten sonra boyanmadan direkt preparata monte edilebilirler. Eğer %70’lik etil alkolde saklanacaklarsa içerisine %5’lik gliserol ilave edilmesi gerekir (10, 12). Kalıcı preparat yapımında prosedür şu aşamalardan oluşur: 1. Nematodlar eğer tespit edilmemişse, %70’lik etil alkolde 30 dakika tespit edilir. 2. Alkol serilerinden geçirilişi. %95’lik etil alkolde 30 dakika, %96’lık absolüte etil alkolde iki kez 30’ar dakika, Ksilen veya toluende önce 15, sonra 30 dakika bekletilmeli. 3. Preparata montajı yapılıp üzerine lamel kapatılarak Kanada balsamı ile yapıştırılır. Daha sonra 37 ºC’lik etüvde birkaç hafta kurutularak kalıcı preparat haline getirilebilir. Acanthocephala’lar genellikle balık, kaplumbağa, su kuşları nadiren insan ve evcil hayvanların ince bağırsaklarında lokalize olurlar (4, 11, 13). Acanthocephala’lar boyalı veya nematodlarda olduğu gibi boyasız olarak mikroskopta incelenebilir. Boyama yapılacaksa; Van Cleave’s hematoxylin veya Mayer’s hematoxylin metodlarıyla ya da cestodlarda olduğu gibi en çok önerilen Semichon’s acetocarmine metoduyla boyanarak kalıcı preparatları yapılabilir (10, 12). Sülükler genellikle göl, havuz, bataklık gibi durgun sularda veya yavaş akan dere, ırmak ve nehirlerde; ya balık, kaplumbağa gibi konaklara yapışmış halde ya da serbest halde bulunurlar (4). Büyük sülükler boyanmadan direkt incelenip % 70’lik etil alkol konulmuş şişelerde boyanmadan saklanırken, küçük sülükler Digenea’larda olduğu gibi gibi Semichon’s acetocarmine metoduyla boyanarak kalıcı preparatları yapılabilir (10, 12). Parazitlerin iç ve dış yapılarını uygun şekilde korumak için laboratuarlarda değişik metotlar uygulanmaktadır. Teşhis ve eğitim amacıyla kullanılan ve söz konusu metotlarla elde edilen koleksiyonlardan her zaman yararlanılabilir. Sonuç olarak, bu derlemede farklı kaynaklarda dağınık şekilde bulunan Helmintlerde tesbit, boyama ve kalıcı preparat yapımı 181 helmintlerdeki gevşetme, tespit, boyama ve kalıcı preparata montaj metotlarının toplu olarak sunulması gereği vardır. Bunun zaman ve emek kaybını önlemek için helmintoloji alanında yeni çalışmaya başlayanlara kolaylık sağlayacağı düşünülmektedir. Metinde geçen kimyasal bileşikler ve formülasyonları (*) AFA (Alkol-Formalin-Asetik asit) fikzatifi 1. Ticari Formalin (HCHO) : 100 ml 2. Etil alkol (C2H5OH, % 95’lik) : 250 ml 3. Glasiyal asetik asit (CH3COOH) : 50 ml 4. Gliserin (C3H5(OH)3) : 100 ml 5. Distile su : 500 ml (**) Gilson’un fikzatifi 1. Nitrik asit (HNO3, % 80’lik) : 15 ml 2. Glasiyel asetik asit (CH3COOH) : 4 ml 3. Civa klörür (HgCl2) : 20 gr 4. Etil alkol (C2H5OH, % 60’lık) : 100 ml 5. Distile su : 800 ml (***)Shaudin’in fikzatifi 1. Civa klorür (HgCl2, Distile su ile doymuş halde) : 200 ml 2. Etil alkol (C2H5OH, % 95’lik) : 100 ml 3. Glasiyel asetik asit (CH3COOH) : 15 ml (****) Gliserin jeli bileşimi 1. Jelatin : 10 gr 2. Distile su : 60 ml 3. Gliserin : 70 ml 4. Fenol : 1gr Hazırlanışı: Kristal fenol suda çözülür ve jelâtin ilave edilir. Çözünüp homojen hale gelinceye kadar ısıtılır. Daha sonra geniş ağızlı bir cam şişeye katılıp soğutulur ve kullanılır. (*****) Semichon’s Acetocarmine (Stok solüsyonu) 1. Glasiyal asetik asit (CH3COOH) : 250 ml 2. Distile su : 250 ml 3. Carmin : 5 gr 4. Etil alkol (C2H5OH, % 70’lik) : 500 ml (******) Borax Carmine bileşimi 1. Carmine : 3 gr 2. Borax (Na2B4O7. 10H2O) : 4 gr 3. Distile su : 100 ml 4. Etil alkol (C2H5OH, % 70’lik): 100 ml Hazırlanışı: Carmin ve borax distile su ile çözünene kadar kaynatılır, soğutulur ve etil alkol ilave edilerek 1–2 gün bekletildikten sonra süzgeç kâğıdından süzülerek kullanılır. KAYNAKLAR 1. Anonim, 1961. Laboratory Procedures in Parasitology, TM 8– 227–2. Headquarters, Washington, USA. 2. Anderson RC, 1992. Nematode Parasites of Vertebrates, Their Development and Transmission, CAB Int, UK. p. 1–12. 3. Dunn AM, 1978. Veterinary Helmintology, 2nd. ed., William Heinemann, London. p. 295–304. 4. Güralp N, 1981. Helmintoloji, Ank Ünv Vet Fak Yay No: 368 Ders Kitabı: 266, İkinci baskı, Ank Ünv Basımevi, Ankara. 5. Hendrix CM, 1997. Laboratory Procedures for Veterinary Technicians, 3rd. Ed., Mosby, Inc., USA. 6. Kassai T, 1999. Veterinary Helminthology. 1st ed., Butterworth- Heinemann, Oxford. p. 181–204. 7. Merdivenci A, 1967. Türkiye’nin Marmara Bölgesinde Evcil Tavuk, Hindi, Ördek ve Kazlarda Görülen Trematod, Cestod ve Nematodlara Dair Araştırmalar, Kutulmuş Matbaası, İstanbul. 8. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food (MAFF), 1971. Manuel of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques, HMSO, Technical Bulletin No:18, London. 9. Pratt PW, 1997. Laboratory Precedures for Veterinary Technicians, 3rd. ed., Mosby Inc., Missouri. 10. Sloss MW, Kemp RL, Zajak AM, 1994. Veterinary Clinical Parasitology 6th. ed., Iowa State University, Ames, Iowa. 11. Soulsby EJL, 1986. Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals, 7th. ed., Bailliere Tindall, London. p. 763–777. 12. Upton SJ, 2005. Animal Parasitology, Biology 625 Laboratory Manual, Kansas Satate University, USA. 13. Urquhart GM, Armour J, Duncan JL, Dunn AM and Jennings FW, 1988. Veterinary Parasitology. ELBS, Longman UK. p. 269–279. Kaynak: Türkiye Parazitoloji Dergisi, 32 (2): 177 - 181, 2008 PDF formatını buradan indirebilirsiniz.: www.tparazitolderg.org/pdf.php3?id=341

http://www.biyologlar.com/helmintlerde-tespit-boyama-ve-kalici-preparat-yapimi

HİSTOLOJİ PREPARATLARININ HAZIRLANMASI

Canlılardan alınan doku ya da organ parçalarını mikroskopla incelenir duruma getirebilmek için takip ettiğimiz işlemlerin tümüne birden histolojik teknik adını veriyoruz. Bu amaçla kullanılan yöntemler uygulayacağımız mikroskobi tekniğine bağlı olarak ilk bakışta bazı farklılıklar görünse de temelde prensipler aynıdır. Bu konuyla ilgili temel prensipleri anlayabilmek için klasik ışık mikroskobunda inceleyeceğimiz bir preparatın hazırlanışını görelim. Tespit (Fiksasyon) Bir histolojik incelemenin sağlıklı bir şekilde yapılabilmesi için dokuya ait yapı özelliklerinin, kimyasal içeriklerinin iyi korunmuş olması gerekir. Bunun için canlılara ait preparatların hazırlanışında ilk temel prensip hücre ve dokuları canlıdakine en yakın şekilde tutabilmektir. Bunun için ilk hedef otolizi engellemek olmadır. Canlı hücre içinde, etrafı membranla çevrili, eritici enzimler içeren, lizozom adını verdiğimiz organeller vardır. Hücre bu yapıları sindirim amacıyla kullanır. Ölümden sonra eritici enzimler sitoplazma içine geçerek hücreyi eritmeye başlar. Bu olaya kendini eritme anlamına gelen otoliz adı verilir. Otolize uğramış hücreler normal görünümünü kaybederek incelenmesi imkansız hale gelir. Otolizi engellemek amacıyla kullanılan bazı maddeler lizozomların içindeki enzimlerin sitoplazmaya geçişini ve erimeyi önlerler. Bu olaya tespit ya da fiksasyon, bu amaçla kullanılan maddelere de fiksatör adı verilir. Pek çok tespit maddesi ve tespit yöntemi vardır. Uygulayacağımız tespitin sonraki işlemlere, özellikle boyama işlemine bir zarar vermiyor olmasına dikkat etmek gerekir. Örneğin, klasik yöntemlerle tespit ve takip edilen dokularda yağ hücreleri içindeki depo yağını korumak imkansızdır. Hücrelerdeki yağ içeriği takip işlemleri esnasında akar, hücrelerin içleri sonradan boş görünür. Eğer bir çalışmada bu hücreleri yağ içerikleri ile beraber görmek istiyorsak fiziksel bir tespit yöntemi olan dondurma tekniğine başvurabiliriz. Fiziksel olarak tespit yöntemlerine örnek olarak periferik kan yayma preparatlarının boyanmadan önce ısıtılarak ya da doğrudan kurutularak tesbitini verebiliriz. Otoliz nedir? Fiksasyon hangi amaçla yapılır? Kimyasal tespit yöntemleri hem kullanılma sıklığı hem de kullanılan fiksatörlerin çeşitliliği açısından daha çok zenginlik gösterir. En bilinen ve yaygın kullanılan fiksatör formoldür. Formol genellikle %10'luk sulu çözeltisi şeklinde kullanılır. Ticari formol %100'lükmüş gibi kabul edilerek 1 kısım formol, 9 kısım suyla karıştırılarak tesbit sölüsyonu hazırlanır. Ayrıca, glutaraldehit, osmium tetraoksit, bazı asitler, alkoller ya da bunların kombine formları daha az sıklıkla kullanılan kimyasal fiksatörlere örnek olarak verilebilir. Bütün fiksatiflerin istenen özelliklerinin yanı sıra istenmeyen bazı etkileri de vardır. Değişik kombinasyonlar kullanılarak istenen tespit özelliklerinin artmasını, istenmeyen bazı etkilerin en aza indirgenmesini sağlamak mümkündür. Birleşik olarak kullanılan fiksatörler çoğu kere ilk bulup kullanan araştırıcının adıyla anılırlar (Bouin, Carnoy, Zenker gibi). Elektron mikroskopta incelenecek preparatların hazırlanmasında ultrastruktürel yapının detaylı incelenebilmesi için çift fiksasyon işlemine gereksinim vardır. Bu işlemde önce tamponlanmış glutaraldehit ilk fiksatör olarak, daha sonra tamponlanmış osmium tetroksit ikinci fiksatör olarak kullanılır. Birleşik tespitten ne anlıyorsunuz? Doku ve organlardan alınan parçaların tespitinde aşağıdaki konulara dikkat etmek gerekir: - Tespit ve takipte kullanılan sölüsyonların dokunun içine iyi işlemesi için parçaların yeterince küçültülmüş olmasına özen gösteriniz. Parçanın boyutlarının 0.5 cm. yi geçmiyor olması daha olumlu sonuç verecektir. - Parçalar alındıktan hemen sonra bekletilmeden tespit sıvısına konulmalıdır. - Parçalar büyük ve kanlı ise tespit sıvısı yenilenmelidir. - Tespit sıvısının, hacim olarak konulan parça ya da parçaların minimum kırk katı fazlalığında olmasına çalışılmalıdır. - Uygulayacağımız her tespit yöntemi için önerilen süreye uyulmalıdır. -Tespitten sonra parçalar iyi yıkanmalı, yapay görüntülere neden olmaması için tespit maddesi dokudan tamamen uzaklaştırılmalıdır. - Ayrıca SAĞLIĞIMIZ AÇISINDAN: Histoloji laboratuvarlarında kullanılan pek çok madde gibi tespit maddelerinin buharlarının canlı hücre ve organizma için son derece zararlı olduğunu aklımızdan çıkarmayıp, bu işlemlerin çeker ocak denilen yerlerde yapılmasına dikkat etmeliyiz. Eğer bu mümkün olmuyorsa laboratuvar ortamının çok iyi havalandırılıyor olmasına özen göstermeliyiz. Tespitte uyulması gereken kurallar nelerdir? Tespit işlemleri ne tür yerlerde yapılmalıdır, neden? Dehidratasyon Tespit edilmiş parçalar bu aşamadan sonra suyundan arındırılır. Bu işleme dehidratasyon adı verilir. Dehidratasyon işlemi için suyu kolaylıkla kendi bünyesine kabul eden etil alkol, izopropil alkol, dioksan, anilin gibi maddeler kullanılır. Bunlardan en yaygın kullanılanı etil alkoldür. Derecesi absolu alkole kadar ulaşan banyolardan geçirilen parçalar daha sonra ışığı geçirgen hale getirilir. Bu işleme şeffaflaştırma (clearing) işlemi denir. Bu amaçla en sık kullanılan madde ksiloldur. Ayrıca benzen, toluen, kloroform gibi maddeler bu amaçla kullanılan maddelere örnektir. Bu işlemler petri kutuları gibi buharlaşmayı engellemek için düzgün kapaklı cam kaplarda elle takip şeklinde yapılabildiği gibi otomatik takip makineleri ile de yapılabilir. Otomatik takip makineleri zaman ayarlaması yapılabilen, doku parçalarının istenilen kaplarda istediğmiz kadar kalmasını sağlayan makinelerdir. Dehidratasyon nedir? Hangi maddeler bu amaçla kullanılır Elektron mikroskop için hazırlanan preparatlar da doku parçaları dehitratasyon işleminden geçirilir. Bu işlem için de yine ethanol kullanılır. Gömme işleminden önce plastik eritici olan propilen oksit gibi maddelerde infiltre edilir. Bloklama (Gömme) Parçalardan rahatça kesitler alabilmek, düzgün kesit yüzeyleri sağlayabilmek için gömme ya da bloklama olarak ifade ettiğimiz işleme başvururuz. Parafin, jelatin, selloidin, karbovaks gibi maddeler bu işleme uygundur. En yaygın kullanılan madde parafindir. 56-60 derecede sıvılaşan parafin etüvde hazır tutulur. Parça prizmatik kalıplar içine konur, üzerine sıvı parafin dökülür. Parafin laboratuvar ısısında mum gibi donarak sertleşir. Kalıptan çıkarınca içinde bizim doku parçamız da bulunan düzgün prizmatik bir parafin bloku elde ederiz. Parafin intersüller boşluklara hatta hücrelerin içine bile penetre olarak dokuyu daha sabit ve kesilebilir hale getirir. Elektron mikroskop için ışık mikroskobuna oranla çok daha ince kesitlere ihtiyaç vardır. Bu nedenle gömme ya da bloklama işleminde daha sert plastik maddeler gereklidir. Bunun için epon, araldit gibi epoxy plastik maddeler kullanılır.  Bloklama işleminde ne tür maddeler kullanılır?  Kesit Alma Blokladığımız doku ve organ parçalarında düzgün ince kesitler almak için kullandığımız aletlere mikrotom denir. Işık mikroskop incelemeleri için kullandığımız mikrotomlar mikron düzeylerinde ince kesitler alabilirlerken elektron mikroskop araştırmalarında kullanılan ultramikrotomlar angström inceliklerinde kesitler sağlarlar. Işık mikroskobu için kesitler almakta kullandığımız mikrotomlarda çelik bıçaklar kullanılırken, EM için kesitler aldığımız ultra mikrotomlarda cam ya da daha iyisi elmas bıçaklar kullanılır. Işık mikroskop çalışmalarında  genellikle 6-10 mikronluk kesitler kullanılır. Mikrotomların bıçakların hareketli olduğu kızaklı mikrotom denilen tipleri ya da bıçaklarının sabit, kesilecek blokların hareketli olduğu rotari mikrotom tipleri vardır. Mikrotom aracılığıyla parafin bloklardan isteğimiz kalınlıklarda dilimler keserken blok içindeki parçadan da aynı kalınlıkta kesitler elde etmiş oluruz. Daha sonra lam üzerinde alınan kesitler boyama işlemine hazır olurlar. Xylol gibi bazı solventler doku içindeki lipidler gibi bazı maddeleri eritebilirler. Bu istenmeyen etkinin önüne geçmek için cryostat adı verilen dondurma mikrotomları kullanılır. Dokular bu yöntemle düşük ısıda aniden dondurularak takip işlemlerinden geçirilmeden ve bloklanmadan kesit alınabilir hale gelir. Mikrotom ve Ultramikrotom neye denir? Boyama (Kolorasyon) Çok ufak ayrıcalıklar dışında dokuların büyük bir kısmı renksizdir ve boyanmadığı sürece ışık mikroskobunda incelenmesi zordur. Çeşitli doku ve hücre kısımlarının yapıları nedeniyle farklı kimyasal özellikteki boyaları farklı bir şekilde tutmaları histolojide boyamanın esasını teşkil eder. Histolojik araştırmalarda kullanılan boyaların büyük bir çoğunluğu asit veya baz özelliğinde olup dokudaki ionize köklerle elektrostatik bağlantı yaparlar. Bu şekilde doku ve hücrelerin daha belirgin bir şekilde ortaya çıkması sağlanırken diğer yandan kimyasal yapısını bildiğimiz boyalarla reaksiyona giren yapıların kimyasal özellikleri ortaya konmuş olur. Histolojik boyalar renklendirici gruplarının asit ya da baz oluşuna göre asit ve bazik boyalar olmak üzere iki ana grupta toplanırlar. Bazik boyaları çeken, o boyanın renginde boyanan hücre ve doku kısımları bazofil boyanıyor ya da bazofili gösteriyor diye tanımlanır. Genel olarak granüllü endoplazmik retikulumun yoğun olduğu kısımlar, hücre çekirdeği bazofili gösteren yapılardır. Asit boyalarla reaksiyona girerek onun renginde boyanan hücre ya da doku kısımları için asidofil boyanıyor ya da asidofili gösteriyor denir. Bazı ayrıcalıkları olmakla birlikte hücre sitoplazması, kollajen lifler, mitokondrium ve lizozomlar asidofilik yapılardır. Bazik boyalara örnek olarak Metilen Mavisi, Jansiyan Viyole, Bazik Füksin, Azokarmin, Safranin, Hematoksilin, Nükleer Fast Red verilebilir. Eozin, Pikrik Asit, Asit Füksin, Oranj G, Eritrosin, Kongo Kırmızısı, Light Green gibi boyalar asit boyalara örnektir. Boyalar bazı yöntemlerde tek olarak kullanılır. Bazı yöntemlerde ikili ya da daha çok boya içeren birleşik yöntemler dediğimiz şekillerde kullanılırlar. Birleşik yöntemlerde kesitler birbiri ardından bazik ve asit boyalarla işleme tabi tutulurlar. Birleşik boya yöntemlerinden ikili olanlara örnek olarak çok yaygın bir boyama yöntemi olan Hematoksilin+Eozin (HE) yöntemi gösterilebilir. Azokarmin, Oranj G ve Anilin Mavisinden oluşan Heidenhein İn Azan yöntemi ise üçlü bir boyama yöntemidir. Asidofili ve bazofili neye denir? Birleşik boyama neye denir? Bazı boyalar, bazı yapıları boyanan çözelti renginden farklı bir renge boyarlar. Bu olaya metakromazi, böyle boyalara da metakromatik boyalar denir. Örneğin toluidin mavisi dokuya düşük konsantrasyonda bağlandığında mavi renkte boyar (ortokromatik). Oysa bir yapıya yüksek konsantrasyonda bağlandığında mor-kırmızı renkte boyar (metakromatik). Toluidin mavisinin Mast hücrelerinin granüllerini mor-kırmızı boyaması metakromatik boyanmadır. Bazı lipidler, makromoleküller metafosfat, sülfomukopolisakkaritler, nükleik asitler metakromazi gösteren yapılardır. Toluidin mavisi, Metilen mavisi, Azur A gibi boyalar ise metakromatik boyalara örnek verilebilir. Ortokromazi ve metakromazi nedir? Bazı boyalar deneysel amaçla doğrudan canlıya verilebilir. Bu renkli maddeler organizmada bazı yerlerde tutularak canlıda boyanma sağlarlar. Örneğin, tripan mavisi deney hayvanının dolaşımına verildiğnide karaciğer kupffer hücreleri tarafından tutulur. Böylece hayvan daha canlıyken sitoplazması mavi tanecikler tarzında boyunmış olur. Vital boyalardan Tripan mavisi, Kongo kırmızısı, Çini mürekkebi, Alizarin ve Lityum karmin asit karakterde vital boyalardır. Metilen Mavisi, Nötral Red, Janus Green, Krezil Viyole ve Nigrosin bazik karakterde vital boyalardır. Vital boyamanın diğer boyama yöntemlerinden farkı nedir? Boyama işleminden sonra kesitler yeni baştan dehidrate edilir ve şeffaflaştırılır. Daha sonra üzerlerine lamel kapatılarak korunur. Preparatların kapatılmasında Kanada Balsamı ya da son zamanlarda ucuzluğu ve çabuk kuruması yönünden tercih edilen bazı sentetik yapıştırıcılar kullanılmaktadır. Uzun süre saklanılması düşünülen preparatları doğrudan güneş ışığı ya da kuvvetli ışıklardan sakınmak gerekir. Aksi takdirde boya solacaktır. Dokuların renkli boyalarla boyanmasının yanı sıra altın, gümüş gibi bazı metallerin seçici olarak bazı kısımlara çöktürülmesi de o bölgelerin mikroskop altında kolayca belirlenmesini sağlayan boyadışı bir renklendirme yöntemi olarak karşımıza çıkar.

http://www.biyologlar.com/histoloji-preparatlarinin-hazirlanmasi

Kan preparatı hazırlanması

Kanı almak için parmak ucu alkolle iyice silinir. Frank iğnesi ile parmak ucu delinir. Takriben 2mm3 kan damlası lam üzerine konur. Kan damlası lamın kenarında 1cm kalacak şekilde konmalıdır.Temiz bir lam veya lamel 30-45 derece dar açı yapacak biçimde damla üzerine getirilip açının şekli değişmeksizin lam üzerine değdirilir ve lam boyunca hızlı bir şekilde geriye doğru kaydırılır.Lam özenle havada sallanarak olabildiğince çabuk kurutulur. Burada en önemli nokta kanın pıhtılaşmasına meydan vermemek için hızlı hareket edilmesi ve kurutmanın çabuk yapılmasıdır. İstenirse bu frotiler (yayılmış kan bulunan lam) saf alkol ya da alkol-eter karışımına batırılarak tespit edildikten sonra da kurutulabilir. Ancak, preparat Gieamsa ile boyanacaksa (boya alkollü bir eriyikte hazırlanacağından) daha önce bir tespit gereksizdir. Genellikle kan preparatları Giemsa veya May-Grünwald-Gieamsa ile boyanır.Boyama safhası:Giemsa ile olur. 10 damla kadar May-Grünwald damlatılır ve tüm kan kaplanır, böylece 3-4 dakika bekletilir. Sonra dökülerek giemsa ile boyanır. Giemsa eriyiği metilen azun, metilen blue ve eosin boyalarını müşterek olarak bulunduran bir solüsyondur. Bu eriyik bu şekilde satılır. Nukleusu menekşe, sitoplazmayı açık mavi veya pembe renge boyar. Azurophil tabiatındaki taneleri de koyu erguvani renkte boyar. Gieamsa’nın hazırlanması: pH=6.8 olan nötr sudan 200 cc alınır. Üzerine 20-30 damla Gieamsa damlatılır. 66 ml Gliserin + 66 ml metil alkol + 1 gr Giemsa = Stok Giemsa 10 ml suya 1 ml Giemsa katılır.Nötr suyun hazırlanması: A- Na2HPO4.2H2O----2.440 gr        sodyum hidrojen fosfat B- KH2PO4-------------2.770 gr        potasyum di hidrojen fosfot Bu maddeler 250 cc’lik balon jojeye konur ve üstü saf su ile eklenir, eritilir. A ve B solüsyonundan eşit hacimde alınarak karıştırılır. A= 50, B= 50 alınırsa üzerine 150 cm3 saf su konur. Metil alkol veya May-Grünwaldlı kanı ihtiva eden lam yüzeyi içinde cam çubuklardan yapılmış destekler bulunan petri kapları içine ters çevrilerek konur. Sonra;Petri kabı içine yukarıda hazırlanışı izah edilen giemsa solüsyonundan dökülür.Lam bu solüsyon içinde 30 dakika bırakılır.30 dakikanın sonunda lam pH= 6.8 olan nötr su ile yıkanır.Kanada balzamı ile kapatılır.

http://www.biyologlar.com/kan-preparati-hazirlanmasi-1

Kene İle Bulaşan Hastalıklar

ÖZET Parazitlerin neden olduğu hastalıklar önemli sağlık problemidir. Endoparazit ve ektoparaziter hastalıklar mevcuttur. Kenelerle bulaşan hastalıklar en sık görülen vektör kaynaklı hastalıklardır. Keneler bakteri, virüs spiroket, protozoa, nematod ve toksinler gibi patojenleri yayabilir ve böylece ektoparaziter kaynaklı hastalıklara sebep olurlar. Ülkemizde keneler için iklim koşulları, bitki örtüsü ve yüzey şekli bakımından uygun koşullar vardır. Bu makalemizde kenelerle bulaşan hastalıkları özetlemeye çalıştık. SUMMARY Paraziter diseases are important medical problems.There are endoparasitic and ectoparasitic diseases. Tick-borne diseases are the most common vector-borne illnesses. Ticks can spread bacteria, viruses, spiroketia, protozoa, nemadot and toxins and by so they made ectoparasitic diseases. Our country has suitable conditions to continue biologic activity of ticks acording to seasons, plants and surface forms. In this article we have tried to summary tick-borne diseases. İrfan Nuhoğlu1, Murat Aydın1, Süleyman Türedi2, Abdülkadir Gündüz2, Murat Topbaş3 1KTÜ Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı, 2Acil Tıp Anabilim Dalı, 3Halk Sağlığı AD, Trabzon. Anahtar Kelimeler: Kene, Kırım- Kongo Kanamalı Ateşi, Lyme Hastalığı. Key words: Tick, Crimean-Congo Haemorhagic Fever, Lyme disease. Sorumlu yazar/ Corresponding author: İrfan Nuhoğlu, KTÜ Tıp Fakültesi İç Hastalıkları AD, Trabzon irfannuhoglu@hotmail.com GİRİŞ Parazitlere bağlı hastalıklar günümüzde önemli sağlık problemlerindendir. Bu durum endoparazitlerden kaynaklanabileceği gibi; kene gibi ektoparazitlerden de kaynaklanır (1). Keneler tüm dünya üzerindeki memeli, kuş ve sürüngenlerden kan emen eksternal parazitlerdir (2). Keneler Araknidea sınıfına ait artropodlardan olup balıklar dışındaki tüm omurgalıların kanlarıyla beslenebilirler. Dünya üzerinde omurgalıları etkileyen 899 adet kene türü mevcuttur. Bunların 185’i Argasidae, 713’ü İxodidae, 1 tanesi ise Nuttalliellidae soyuna bağlıdır (5,6). Bakteri, spiroket, rickettsia, protozoa, virüs, nematod ve toksinler gibi birçok farklı patojeni taşıyabilir ve yayabilirler (3). Tıbbi ve ekonomik önemleri insanlara ve hayvanlara hastalık bulaştırabilme kabiliyetlerinin olduğunun fark edilmesiyle anlaşılmıştır. İnsanlar üzerinde oluşturdukları önemli sağlık sorunları yanında çiftlik hayvanları üzerinde büyük ekonomik kayıplara neden olabilirler. Türkiye; iklimi, yüzey şekli ve bitki örtüsü bakımından, kenelerin biyolojik aktivitelerini sürdürmeleri için uygun koşullara sahip bir ülkedir (7-9). Günümüze kadar kullanılan hiçbir mücadele yöntemi, tam bir kene eradikasyonu sağlayamamıştır. Bugünkü bilgiler ışığında kene eradikasyonunun neredeyse imkânsız olduğu kabul edilmektedir. KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ (KKKA) KKKA Afrika’nın bazı bölgelerinde, Asya, Doğu Avrupa ve Orta Doğu’da görülen ölümcül bir viral enfeksiyondur (10,11). Bildirilmiş mortalite oranı % 3-30 olan bu hastalığa neden olan virüs Bünyavirüs ailesinden Nairo virüs genusuna bağlı olup; insanda ciddi hastalığa neden olur (11-12). Tıbbi olarak önemi kene ile taşınan virüsler arasında en yaygın coğrafi dağılıma sahip olmasıdır(13). Hastalık ilk kez 12.yy’da bugünkü Tacikistan topraklarında hemorajik bir sendrom olarak tanımlanmıştır (10). KKKA ile kenelerin ilişkisi ilk defa 1944-45 yıllarında Kırım’da hasat toplayan çiftçilere yardım eden 200 Sovyet askerinde hastalığın oluşması ve etkenin kenelerden izole edilmesi sonucunda gösterildi (10,11). Virüsün yaşam çevrimi ‘kene-omurgalı-kene’ şeklinde olup; hayvanlarda hastalık yaptığına dair bir delil yoktur (11). Virüsler Hyalomma genusu keneleri ile taşınır. TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) 462 Resim 1. Türkiye’de Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Vakalarının Dağılımı Enfekte anneden yumurtaya transovarial; larvanymph- erişkin şeklinde transstadial olarak geçiş gösterirler. Virüsün Avrupa’daki ana taşıyıcısı Akdeniz hyalomması olarak bilinen H.marginatum marginatum’dur (10,11). Komşu bazı ülkelerde 1970’lerden beri epidemiler bildirilmesine rağmen Türkiye’de virüsle enfekte vakalar ilk kez 2002 yılında bildirilmiştir. 2002-2005 yılları arasında Sağlık Bakanlığı’na 500 vaka bildirilmiş ve bunların 26’sı (% 5,2) ölmüştür (Resim 1) (13-16). Türkiye’de ki salgında vakaların % 90’ı çiftçilerdi (13,14). İnsan vücudu; enfekte kenelerin ısırması ile veya hasta olan bir kişiyle enfeksiyonun akut fazı sırasında temas ettikten sonra enfekte olabilir. Ayrıca içinde virüs bulunan kan ve dokularla temastan sonra geçiş olabilir. Hastalığın ortaya çıktığı insan vücudu virüsün bilinen tek konağıdır (17). Hastalığın seyrinde 4 faz vardır: 1. İnkübasyon fazı kene ısırığını takiben 3-7 gündür (18). Bu dönemde herhangi bulgu vermez. Türkiye’de 5,5 gün olan bu fazın süresi viral doz ve bulaşma yoluna bağlıdır (12). 2. Prehemorajik faz; ani yükselen ve 39-41 derece arasında seyreden ateşle karakterizedir. Ateş 4-5 gün sebat eder(10). Baş ve kas ağrısı, baş dönmesi, ishal, burun akıntısı ve kusma olabilir (19).Yüz boyun ve göğüste hiperemi, skleral konjesyon, konjuktivit görülebilir. 1-7 gün sürebilen bu fazın ortalama süresi 3 gündür(10). 3. Hemorajik faz; genellikle 2-3 gün gibi kısa sürer. Genellikle hastalığın 3-5. günlerinde başlar ve hızlı bir seyir gösterir. Bu dönemin ateşle herhangi bir ilişkisi yoktur (10). Hemoraji peteşiden başlayarak, müköz membran ve derideki büyük hematomlara kadar ilerleyebilir. Diğer bölgelerden kanamalar vajen, diş eti ve serebral kanamaları içerir(20). En sık kanayan bölgeler ise burun, GİS (hematemez, melena ve intraabdominal), genital (menometroraji), idrar (hematüri) ve solunum yollarıdır. Türkiye’de vakaların % 20-40’ında hepatomegali; % 14-23’ünde ise splenomegali bulunur (15). 4. Konvalesan faz hastalık başlamasıyla beraber 10-20 gün içinde başlar. Bu dönemde değişken nabız, taşikardi, komplet saç kaybı, polinörit, solunum zorluğu, kserostomi, görme azlığı, işitme kaybı, hafıza kaybı olabilir(10). Tanıda trombositopeni, lökopeni, AST-ALT-LDHCKP düzeylerinde artış, PT ve aPTT sürelerinde uzama, fibrinojen düzeyinde azalma ve fibrin yıkım ürünlerinde artma görülebilir. CBC ve Biyokimyasal testler 5-9 günde normal seviyelerine inerler (21). Virüs izolasyonu 2-5 günde sağlanabilir ama hücre kültürleri sensitiviteden yoksundur ve genellikle hastalığın ilk 5 gününde karşılaşılan yüksek viremi ilişkisini gösterir (22). KKKA virüs enfeksiyonunun hızlı laboratuar teşhisi için seçilecek metot Revers Transkriptaz PCR’dir. Bu yöntem hızlı, yüksek sensitif ve yüksek spesifiktir (23). Hastalık ortaya çıktıktan sonra ilk 7 gün içinde İg M ve İg G TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) antikorları serolojik olarak ELİSA ve İmmünfloresan yöntemi ile tespit edilebilir(24). Tedavinin temeli; trombosit, TDP ve eritrosit ile yapılan destekleyici tedaviye dayanır. Hastada potansiyel kanama alanları tespit edilmeli ve bulaştırma riski için koruyucu önlemler alınmalıdır. Sıvı elektrolit dengesine dikkat edilmelidir. Etki mekanizması açık olmamakla beraber Ribavirin tavsiye edilen antiviral ajandır. Bu ilacın akut respiratuar sendrom tedavisinde kullanımına bağlı hemolitik anemi, hipokalsemi ve hipomagnezemi yan etkileri bildirilmiştir (25,26). ROCKY DAĞLARI BENEKLİ ATEŞİ (RDBA) Amerikan Köpek Kenesi (Dermecentor variabilis) ile taşınan bakteriyel (Ricketsia ricketsii) bir enfeksiyondur (27). Kan damarlarının endoteliyal ve düz kas hücrelerini etkileyen küçük, pleomorfik,zorunlu hücre içi parazitidir. Hastalık Amerika’nın kuzeybatısında ilk kez 19.yy ın sonlarında tanımlanmıştır. Hastalık etkeni ajan ise 1900’lü yılların başlarında Howard Ricketts tarafından tanımlanmıştır (28). İnsandan insana geçiş tanımlanmamıştır (29). Hastalık kuzey, orta ve güney Amerika da endemiktir. İsmine rağmen yıllık vakaların sadece % 2’si Rocky dağları bölgesinde görülür (27). 5-9 yaşlarındaki çocuklar ve 60 yaşın üstündeki erişkinler olmak üzere iki tepesi olan bimodal yaş dağılımına sahiptir. 1998 yılında 365 vaka bildirilmiştir (29). Çoğu vaka 1 Mayıs-31 Temmuz arasında bildirilir ki bu dönem köpek kenesi populasyonunun en yüksek seviyede olduğu dönemdir. Hastalık çoğunlukla vahşi hayvan ve kenelerin birlikte bulundukları alanlarda ortaya çıkar. İmmatür evrelerde keneler tarla faresi gibi küçük kemirgenler üzerinde; erişkin olanlar ise insan ve köpek gibi daha büyük canlılar üzerinde yaşarlar (27). Ricketsia ile enfekte olan hastalar genellikle ısırık sonrasındaki 5-10 günlük bir inkübasyon periyodunu takiben hastalık ortaya çıktıktan sonraki ilk hafta içinde doktora başvururlar (30). Hastalık; ateş, bulantı, kusma, iştahsızlık, baş ve kas ağrısını içeren başlangıç belirtileri verir (27,31). Ateşin 2-5’ inci gününde önkol, el ve ayak bileği üzerinde küçük, düz, pembe ve kaşıntısız noktalar şeklinde benekli bir döküntü gelişir (30,31). Bu benekler üzerlerine basınç uygulandığında solarlar. Hastalığa ait bu karakteristik döküntü genellikle 6. güne kadar ortaya çıkmaz ve hastaların % 35-65 inde görülür (31,32). Döküntü genç hastalarda yaşlılara göre daha erken gelişir (30). Döküntü daha sonra avuç içi ve ayakaltı dâhil vücudun geri kalan bölümlerine yayılır (27). Bu durum ise hastaların % 50-80’ inde ve ancak geç evrelerde görülebilir. Hastaların % 10-15’ inde ise hiçbir zaman döküntü gelişmez (30,31). Temel laboratuar testlerinde normal veya hafifçe baskılanmış WBC, trombositopeni, yükselmiş karaciğer transaminazları ve hiponatremi bulunur. BOS incelendiğinde monosit hâkimiyeti olan bir beyaz küre artışı tespit edilir (31,32). Hastalığın ensefalit, non kardiyojenik pulmoner ödem, ARDS, kardiyak aritmiler, koagülopati, GİS kanaması ve deri nekrozunu da içeren major komplikasyonları vardır. Eğer tedavi edilmezse 8-15 gün içerisinde ölüm gerçekleşebilir. Mortalite oranı tedavi edilmemiş vakalarda % 25; tedavi edilmiş vakalarda % 5 olarak rapor edilmiştir (28). Tanı öykü ve fizik muayeneye dayanır. Eğer döküntü mevcut ise rickettsial organizma deriden yapılan biyopsideki vasküler endotel içinde direk immünofloresan veya immünoperoksidaz boyama yöntemiyle tespit edilebilir (31,33). Ama bu yöntem çok sık kullanılmamaktadır (34). Seroloji tanıyı destekleyebilir ancak bu da hastalığın ortaya çıkışından 7-10 gün sonra pozitifleşir (31). Mümkün olan en kısa sürede antibiyotik tedavine başlamak önemlidir (27,35). Tetrasiklin ve kloramfenikol tedavide etkindir. Bazı hastalarda doksisiklin birinci tercihtir. Tedavi en az 5-7 gün devam etmeli veya hasta en az iki gün afebril olana kadar sürmelidir (31,36). Ölümlerin çoğu medikal tedavideki gecikme nedeniyledir. Hastalık erken fark edilip tedavi edilirse hızlı bir düzelme gösterir (27). LYME HASTALIĞI Kalp, eklem ve sinir sistemini de içeren; ciddi problemler oluşturabilen Lyme hastalığı siyah bacaklı olarak adlandırılan geyik kenesi (İxodes scapularis) ile taşınan bir bakteriyel hastalıktır (27). Sıcaklık 35 Fahrenheit üzerinde olduğu sürece tüm yıl boyunca aktif kalabilirler. Zirve aktivite ayları nymphler için Mayıs-Haziran; erişkinler için ise Ekim-Kasım aylarıdır. Borelia burgdorferi adlı spiroketin neden olduğu Lyme hastalığı hem ABD de hem de dünyada kene ile taşınan en yaygın hastalıktır (28,35,36). Birleşik devletlerde ilk kez 1975 yılında Connecticut’ta bulunan Lyme bölgesinde çok fazla sayıda çocukta görülen artrit vakaları sonucunda bildirildi (26). Borelia hastalığa neden olan ajan olarak 1980’li yılların başlarında izole edilebilmiştir (33). Hastalığın 15 yaş gençlerde ve 29 yaşlarda olan iki tepeli bimodal bir yaş dağılımı vardır ve birçok vaka Mayıs-Eylül döneminde meydana gelir. ABD’de TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) 464 1999 yılında hastalık kontrol ve korunma merkezine (CDC) 16273 vaka rapor edilmiştir (37). ABD’de ki araştırmalar kenelerin Lyme hastalığını nymph evresinde beslenmenin 2 ya da daha sonraki günlerinde naklettiklerini göstermiştir (26). Bu evrede 2 mm den küçük olduklarından sıklıkla fark edilmezler; beslenmek ve enfeksiyonu yaymak için fazla zamanları vardır. Erişkin keneler ise daha büyük olduklarından fark edilmeleri ve vücuttan uzaklaştırılmaları daha kolaydır. Kene uygun teknikle erken dönemde çıkarılırsa enfeksiyonu yayma şansı çok azdır (26). Lyme hastalığının 3 evresi bunlunur: 1. Erken lokalize evrede; kene ısırığını takiben günler içinde (7-14 gün) hastaların % 60-80 inde Eritema Cronicum Migrans adı verilen kırmızı, yavaşça genişleyen boğa gözü şeklinde döküntü meydana gelir (34,30). Isırık etrafında küçük, kırmızı bir papül olarak başlar; günler içerisinde merkezden dışa doğru genişler. Lezyonun merkezinde hiperemik, deriden kabarık bir beneklenme kalabilir ve ortalama çapı 16 cm olan lezyonun çapı bazı vakalarda 70cm’ye kadar ulaşabilir. Döküntü ile beraber yorgunluk, kas ağrısı, eklem ve baş ağrısı, ateş ve üşümeyi içeren sistemik semptomlar olabilir. Fizik muayenede boyun sertliği, bölgesel adenopati ve ısırık bölgesinden bağımsız bölgelerde, primer lezyondan daha küçük sekonder deri lezyonları görülebilir. Eğer tedavi edilmezse genellikle birkaç haftadan daha uzun bir sürede kendiliğinden iyileşir (34,35). 2. Hastalığın erken dissemine formu kene ısırığını takiben günler-aylar içinde birçok sistemi de içeren semptomlarla ortaya çıkar. Birçok hasta kene tarafından ısırılıp ısırılmadığını hatırlamaz. Hastalarda eritema kronikum migrans olmayabilir. Lenfositik menenjit, sıklıkla Bell palsi gibi kraniyel sinir palsileri, azalmış duyu, güçsüzlük ve refleks yokluğunu da içeren nörolojik semptomlar olabilir (5- 2). Kardiyak semptomlar çoğunlukla erkeklerde olur, bitkinlik ve çarpıntı şeklinde ortaya çıkar. Çeşitli derecede atriyoventriküler bloklar ve orta derecede peri/miyokardit olabilir. Artrit genelde geç ortaya çıkar ama bu evrede de görülebilir. Bölgesel veya jeneralize adenopati, konjonktivit, iritis, hepatit ve mikroskopik hematüri veya proteinüri görülebilir (32,34,35) 3. Hastalığın geç evresi sıklıkla kronik artritle karakterizedir. Bu durum tedavi edilmemiş eritema migransı olan hastaların yaklaşık % 10 unda meydana gelir. Büyük eklemleri özellikle de diz eklemini içeren mono veya asimetrik oligoartriküler artrit olarak tanımlanmıştır. Nörolojik sistem subakut ensefalopati, aksonal polinöropati ve lökoensefalopati şeklinde etkilenebilir. Geç bulgular genelde birkaç yıl içinde spontan olarak iyileşir (30,32). Teşhis edilmesi zor bir hastalıktır (38).Tanı, öykü ve fizik muayeneye dayanır. Rutin laboratuar testleri tanıda rolü azdır. Seroloji testleri tanıyı doğrular ancak hastalığın ortaya çıkmasından 4-6 hafta sonrasına kadar tanı değerleri yoktur (30). ELİSA testi % 89 sensitif, % 72 spesifiktir. Pozitif test sonuçları Western Blot ile desteklenmelidir. PCR özellikle etkilenmiş eklemlerden alınan eklem sıvılarında yararlıdır (40). Eğer nörolojik bulgular varsa BOS’tan çalışma yapılabilir. Sinoviyal sıvı artritin ayırıcı tanısını yapmak için alınır. Organizmanın doku ve vücut sıvılarından izolasyonu çok zordur (31). Hastalığın sahip olduğu ciddi sekel potansiyeli nedeniyle erken tanı ve tedavi önem taşır. Ciddi vakalarda parenteral antibiyotikler gerekir. Erken dönemde yakalanırsa oral antibiyotiklerle tedavi edilebilir(26). Amoksisilin ve doksisiklin 2-3 hafta süre ile tedavide tercih edilir. Komplike olmayan vakalarda tedavi en az 14-21 gün; ciddi veya komplike vakalarda 30 gündür (41). Hastalık nadir görülür ama oldukça fatal seyreder (30). 1998 yılında Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi hastalıktan korunma da kullanılmak üzere ilk kez bir aşıya onay verdi. Rekombinant OspA (LYMErix) aşısı üzerindeki iki çalışma aşının semptomatik enfeksiyondan korunmada % 76-92 arasında etkili olduğunu göstermiştir. Aşı keneye maruziyet açısından yüksek veya orta riskli kişilere önerilmiş, düşük riskli veya risksiz olan kişilere, 15 yaşından gençlere, 70 yaşını geçmiş yaşlılara ve yeterli çalışma olmamasından dolayı hamilelere önerilmemektedir (42). ERLİKİYOZ Hastalık küçük, gram-negatif, pleomorfik, zorunlu hücre içi bir organizma olan Ehrlichia tarafından oluşturulur. ABD’ de Ehrlichia chaffeensis ve Ehrlichia ewingii’ nin neden olduğu İnsan Monositik Erlikiyozu (İME) ve henüz isimlendirilmemiş bir ehrlichia türünün, muhtemel Ehrlichia phagocytophila/Ehrlichia equi’nin neden olduğu İnsan Granülositik Erlikiyozu (İGE) olmak üzere iki farklı formu vardır (43). Ehrlichia chaffeensis yıldız kenesi olan Amblyomma americanum tarafından taşınır. Beyaz kuyruklu geyik bu kenenin tek major konağıdır ve tek doğal rezervuardır (35). Hastalık ilk kez 1935 yılında bir grup araştırma köpeğinde tespit edildi. 1986 yılında insanda tanımlandı. Dünya çapında yaygın bir hastalık TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) olmasına rağmen vakaların çoğu ABD’ de bildirilmektedir. Her iki türün de çoğu vakası Nisan- Eylül döneminde görülür. Vakaların % 75’ten fazlası erkeklerde görülür ve yaşlılar daha sık etkilenir. Klinik her iki türde de birbirine benzer. Hastalar kene ısırığı sonrası 7-10 günlük bir inkübasyon periyodunu takiben hastalanmanın ilk haftası içinde sağlık kuruluşuna başvururlar. Belirtiler ateş, baş ağrısı, kırgınlık ve kas ağrısıdır. Buna ek olarak bulantı, kusma, ishal, öksürük, eklem ağrısı, konfüzyon ve vucutta döküntü olabilir (35). Döküntü; İME olan erişkin hastaların yarısından biraz azında; İGE olan erişkin hastaların ise % 10’ undan biraz azında görülür. Bununla beraber enfekte çocuk hastaların % 60’ında döküntü görülmeyebilir. Döküntü gövdeyi içerir ama elleri ve ayakları tutmaz ve ısırık bölgesiyle ilişkili değildir. Maküler, papüler, retiküler, makülopapüler veya peteşiyel şekillerde olabilir. İGE de respiratuar veya renal yetersizlik, fırsatçı enfeksiyonlar veya hemoraji(DİC) gibi komplikasyonlar çok sık görülür (29). Laboratuar bulguları ise lökopeni, trombositopeni ve artmış karaciğer transaminazlarından oluşur. İGE de orta derecede bir anemi; hem İGE hem de İME de artmış ESR, BUN, kreatinin; İME de ise yükselmiş protein düzeyi ve lenfositik pleositozu olan BOS bulunabilir (44). Tanı öykü, fizik muayene ve laboratuar bulgularına dayanır. Seroloji tanıyı destekler ancak 1-2 haftada pozitifleşir. PCR da tanıyı destekler ancak akut safhada yapılmalıdır. Kültürler yararlı değildir. Tanıdaki temel metot konvelasan evredeki serokonversiyonun tespitidir. Tedavide tercih edilecek ilaç Doksisiklin’dir. Alternatif olarak kloramfenikol ve rifampin kullanılabilir. Tedavi süresi en az iki hafta olmalıdır. Tedavi edilmediği zaman tüm hasta grubunun % 50 sine varan bir oranda hospitalizasyon gerektiren ciddi bir hastalık oluşabilir. Uzamış ateş, böbrek yetersizliği, DİC, ARDS, meningoensefalit, nöbet veya koma şeklinde ciddi manifestasyonlar olabilir. Öngörülen mortalite oranı % 2-3 dür ve E.chaffeensis tarafından oluşturulan enfeksiyon diğer erlikiyoz türlerinden daha ciddidir (35). TULAREMİ Tularemi; küçük, gram negatif, hareketsiz bir kokobasil olan Francisella tularensis tarafından oluşturulan enfeksiyöz bir hastalıktır. Hastalık aynı zaman da Tavşan ateşi olarakta bilinir. İnsanlara sindirim, inokülasyon, inhalasyon ve kontaminasyon yollarıyla bulaşabilir. Amerika ‘da vakaların yarısından fazlasında kene ısırığı sorumludur (31). Her yıl bu ülkede 150-300 arasında vaka rapor edilir. Hastalık erkeklerde sık görülür. Özellikle kış aylarında avcılıkla uğraşanların derilerideki küçük lezyonların avlanan enfekte tavşanla teması ile bulaşır. Yaz ve sonbahar mevsimlerinde zirve yapar (45). İyi pişmemiş enfekte etler ve kontamine sular da bulaşma nedenidir. İnkübasyon periyodu ortalama 3-5 gündür. Birçok hastada ateş, üşüme, baş ağrısı, kırgınlık, anoreksi, yorgunluk, öksürük, kas ağrısı, göğüste rahatsızlık hissi, kusma, karın ağrısı ve ishali de içeren generalize semptomlar bulunur. Bunlara ek olarak hasta 6 farklı klasik modelden biriyle gelebilir: 1. Ülseroglandüler model: en sık görülen ve en kolay fark edilendir. Hastalar içerdiği lenf bezlerine drene olan bölgedeki ağrılı deri ülseriyle beraber olan, lokalize, hassas lenfadenopatilerden sikayetçidirler. En sık tutulan lenf bezleri çocuklarda servikal ve oksipital; erişkinlerde inguinal bölgede olanlardır. 2. Glandüler tip ise ülseroglandüler tip ile benzerdir ama bunda deri ülseri yoktur. 3. Oküloglandüler tipte organizmalar konjonktivaya yerleşmişlerdir. Vakaların % 90’ında tek taraflı tutulum olur. Fotofobi ve artmış lakrimasyonu içeren erken belirtiler vardır. Geç dönemde hastalarda göz kapağı ödemi, skleral enjeksiyonu olan ağrılı konjonktivit, kemozis ve küçük yeşil konjonktival ülser veya papül gelişir. Priaurikülar, submandibular ve servikal bezler sıklıkla tutulur. 4. Faringeal tipte ise organizmalar orofarinkse yerleşmişlerdir. Ciddi boğaz ağrısı bulunur. Fizik muayenede eksudatif farenjit veya tonsilit; servikal, preparotit veya retrofarengeal lanfadenopati bulunabilir. 5. Tifoid model ise herhangi bir lenfadenopati ile ilişkili değildir. Diğer tiplerde belirtilen genel semptomlara ek olarak burada sulu ishal vardır. 6. Pnömonik tip ise akut respiratuar bir hastalık olarak ortaya çıkar. Belirtiler ateş, minimal balgamlı veya balgamsız öksürük, substernal göğüs hassasiyeti ve plörotik göğüs ağrısından oluşur. Radyografilerde lobar, apikal veya miliyer infiltrasyonlar, hiler adenopati ve plevral efüzyon bulunabilir (45). Tanı; hikâye ve fizik muayeneye dayanır. Laboratuar testleri genellikle spesifik değildir. WBC ve ESR düzeyleri normal yâda hafif yüksektir. Organizma kültürde üretilebilir ama bu yöntem laboratuar çalışanlarına bulaşma riskinden dolayı sıklıkla kullanılan bir yöntem değildir. Göğüs radyografilerinde oval opasite, hiler adenopati ve plevral efüzyon triadından oluşan bulgular olabilir. Seroloji yaklaşık iki haftalık bir süre içinde tanıyı destekler (31). TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) 466 www.korhek.org Hastada menenjit düşünülmüyorsa streptomisin ilk seçilecek ilaçtır. Alternatif olarak gentamisin, tetrasiklin, kloramfenikol ve florokinolonlar düşünülebilir. Tedavi 7-14 gün sürmelidir. Korunmada canlı aşı mevcuttur ve laboratuar çalışanları ve patojene tekrarlayan maruziyeti olan kişilere uygulanabilir. BABESİYOZ Hastalık etkeni eritrositleri enfekte eden ve hemolizlerine neden olan Babesia genusuna ait protozoal bir parazit olan Babesia divergens veya Babesia microti’ dir. Hastalık geçişi İxodes kenelerinin farklı türleri ile olur. Etken geyik kenesi ile taşınır (46). Hastaların % 5 kadarında fulminan seyrederek hospitalizasyon veya ölümle sonuçlanan bir tablo oluşturur. Özellikle splenektomi yapılmış hastalarda ciddi hastalık tablosu oluşturur. Tripanozoma’dan sonra memelilere kan yoluyla bulaşan en sık ikinci parazittir (47). Semptomlar diğer kene ile geçen hastalıklara benzer ve inokülasyondan bir hafta sonra başlayan influenza benzeri belirtiler verir. Ateş, terleme, kas ağrısı ve baş ağrısı görülür. Hemolitik anemi, hemoglobinüri, böbrek yetersizliği yapabilir. Enfeksiyon genç erişkinlerde yıllarca asemptomatik olarak kalabilir (46). Nadir de olsa oftalmik tutulum olabilir. Hastada ateş, hemolitik anemi ve uygun temas öyküsü varsa babesiyoz düşünülebilir. Tanı kan yaymalarda protozoanın tespitine dayanır. Karakteristik olarak Malta Haçı görünümü vardır. Serolojik testler ve PCR yardımcı yöntemleridir. Orta derecedeki vakalar semptomatik tedavi gerektirir. Persistan yüksek ateş, progresif anemi, yükselen parasitemi olan ciddi vakalarda Kinin+Klindamisin veya Atovaquon+Azitromisin en az 7-10 gün boyunca kullanılmalıdır. Yüksek parasitemisi olan ciddi hastalarda exchange transfüzyon yapılabilir (46). KOLORADO KENE ATEŞİ Hastalık bir ağaç kenesi olan D.andersoni tarafından nakledilen RNA orbivirus tarafından oluşturulur. Çoğunlukla Amrikadaki Rocky dağları bölgesinde her yıl 200-300 arasında vaka tespit edilir. İmmün yetmezliği olan ve splenektomi geçirmiş olan hastalar ciddi komplikasyonlar açısından risk altındadır (46). İnokülasyondan sonra bir hafta içinde influenza benzeri semptomlar başlar. Hastaların üçte birinde boğaz ağrısı bulunur. En önemli özelliği; menenjit, döküntü ve konjuktivit ile ilişkili olan bifazik ateştir. Hastalık genellikle 7-10 gün arasında sonlanır. Tanı genellikle immünfloresan boyama ile konur. Bununla beraber lökopeni ve trombositopeni bulunabilir. Spesifik bir tedavi yoktur. Destek tedavisi verilir. Belirtiler ortaya çıkmışsa diğer kene geçişli hastalıkları kapsayan ampirik olarak tetrasiklin, doksisiklin veya kloramfenikol kullanılabilir. DÖNEK ATEŞ Hastalığa Borrelia genusundan bir spiroket neden olur. Ornithodoros genus keneler esas vektördür. Tipik olarak hastalık sporadiktir (48). Ortalama inokülasyon periyodu bir haftadır. İnfluenza benzeri semptomlar, artralji, bulantı ve kusma olur. Genellikle 40 derecenin üzerinde, düzensiz ve bazen deliryumla ilişkili ateş olabilir. Hastaların çoğunda splenomegali bulunur. Meningeal bulgular olabilir. Epistaksis hemoptizi, iridosiklit, koma, kraniyel sinir palsi, pnomonit, miyokardit ve dalak rüptürünü içeren komplikasyonlar olabilir. Tanı; kan, kemik iliğinde ve ateş epizotu sırasında BOS’da spiroketin tespitiyle konulabilir. Lökosit sayısı normal veya orta derecede artmıştır. Trombositopeni tespit edilebilir. Tedavide 5-10 gün boyunca doksisiklin tercih edilir. Alternatif olarak eritromisin kullanılabilir. Eğer ilaçlar geç febril evrede verilirse Jarisch- Herxheimer reaksiyonu meydana gelebilir. Antibiyotik tedavisinin öncesi ve sonrasındaki 2 saatlik periyotlarda asetaminofen uygulanması reaksiyonun ciddiyetini azaltabilir. KOMBİNE ENFEKSİYONLAR Aynı kene birden fazla enfeksiyöz patojende taşıyabilir. Bundan dolayı bir ısırıkla birden fazla hastalığı bulaştırabilir. Örneğin İ.scapularis; erlikiyoz, lyme hastalığı ve babesiyozu bulaştırabilir. Lyme hastalığı bulunanların % 23’ünde babesiyoz; % 10-30 unda erlikiyoz bulunur. Kombine enfeksiyonların daha ciddi semptomlar oluşturacağı akılda bulundurulmalıdır. KAYNAKLAR 1. Rajput ZI, Hu S, Chen W, Arıjo AG, Xiao C. Importance of ticks and their chemical and immunological control livestock. Journal of Zhejiang University. 2006; 7(11): 912-921. TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) www.korhek.org 467 2 Furman DP, Loomis EC. The ticks of California (Ascari: Ixodida). University of California Publications. Bulletin of the California Insect Survey. 1984; 25: 1-239. 3. Edlow JA, Danzl D, Halamka J, Pollack VC. Tick- Borne Diseases. www.eMedicine.com. 4. Snelson JT. Animal ectoparasites and disease vector causing major reduction in world food supplies. FAO Plant Prodection Bulleton. 1975; 13: 103-114. 5. Barker SC, Murrell A. Systematics and evolution of ticks with alist of valid genus and species names. Parasitology. 2004; 129(7):15-36. 6. Klompen JSH, Black WC, Keirans JE, Oliver JH. Evolition of tiks. Annu Rev Entomol. 1996; 41(1): 141-161. 7. Güler S, 198. Ankara ve civarındaki koyun ve keçilerde kış ixodidaeleri üzerine araştırmalar. U. Ü. Vet. Fak. Derg. 1 :54-55. 8. Güler S, Özer E, Erdoğmş SZ, Köroğlu E, Bektaş İ. Malatya ve bazı Güneydoğu Anadolu illerinde sığır, koyun ve keçilerde bulunan kene türleri. Doğa-Tr. J. Of Veterinary and animal Science. 1993; 17: 229-231. 9. Karaer Z, Yukarı BA, Aydın L. Türkiye keneleri ve vektörlükleri. Parazitolojide Andropod Hastalıkları ve Vektörler. İzmir, Türkiye. Parazitoloji Derneği Yayın No: 13, 1997, p. 363-434. 10. Hoogstraal H. The epidemiologymof tick borne Crimean-Congo hemorrhagic fever in Asia, europe and Africa. J Med Entomol 1979; 15: 307- 417. 11. Watts DM, Ksiazek TG, Linthicum KJ, Hoogstraal H. Crimean-Congo hemorrhagic fever. In:Monath TP, ed. The arboviruses: epidemiology and ecology, volume 2. Boca Raton, FL, USA:CRC Pres, 1988, p. 177-260. 12. Ergönül O, Celikbaş A, Dokuzoğuz B, Eren S, Baykam N, Esener H. The characteristicks of Crimean-Congo hemorhagic fever in a recent outbreak in Turkey and the impact of oral ribavirin therapy. Clin Infect Dis. 2004; 39: 285-89. 13. Ergönül Ö. Crimean-Congo haemorrhagic fever. The Lancet. 2006; 6: 203-214. 14. Kartı SS, Odabaşı S, Korten V, et al. Crimean- Congo hemorrhagic fever in Turkey. Emerg Infect Dis. 2004; 19: 1379-84. 15. Ozkurt Z, Kiki I, Erol S, et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever in Eastern Turkey: clinical features, risk factors and efficacy of ribavirin therapy. J Infect. 2006; 52: 207-15. 16. Türkiye’de KKKA yayılım haritası. www.tvhb.org.tr 17. Whitehause CA. Crimean-Congo hemorrhagic fever. Antivir Res 2004; 64: 145-60. 18. Swanepoel R, Gill DE, Shepherd AJ, et al. The clinical pathology of Crimean-Congo hemorrhagic fever. Rev Infect Dis. 1989; 11: 794-800. 19. Smego RA, Sarwari AR, Siddiqui AR. Crimean- Congo hemorrhagic fever: Prevention and control limitations in a resource poor country. Clin Infect Dis. 2004; 38: 1731-35. 20. Swanepoel R, Shepherd AJ, Leman PA, et al. Epidemiologic and clinical features of Crimean- Congo hemorrhagic fever in southern Africa. Am J Trop Med Hyg. 1987;36: 120-32. 21. Ergönül O, Celikbaş A, Baykam N, Eren S, Esener H, Dokuzoğuz B. Analysis of the mortality among the patients with Crimean-Congo hemorrhagic fever virus infection. Clin Microbiol Infect (in press). 22. Burt FJ, Leman PA, Abott JC, Swanepoel R. Serodiagnosis of Crimean-Congo haemorhagic fever. Epidemiol Infect. 1994;113: 551-62. 23. Schwarz TF, Nsanze H, Longson M, et al. Polymerase chain reaction for diagnosis and identification of distinct variants of Crimean- Congo hemorrhagic fever virus in the United Arab Emirates. Am J Trop Med Hyg. 1996; 55: 190-96. 24. Ahephered AJ, Swanepoel R, Leman PA. Antibody response in Crimean-Congo hemorrhagic fever. Rev Infect Dis. 1989; 11: 801- 806. 25. Knowles SR, Phillips EJ, Dresser I, Matukas I. Common adverse events associated with the use of ribavirin for severe acte respiratory syndrome in Canada. Clin Infect Dis. 2003; 37: 1139-42. 26. Chiou HE, LiuCI, Buttrey MJ, et al. Advere effects of ribavirin and outcome in severe acute respiratory syndrome: experience in two medical centers. Chest. 2005; 128: 263-72. 27. Ticks. www.co.franklin.oh 28. Walker DH, Raoult D. Rickettsia rickettsii and other spotted fever group rickettsiae (Rocky Mountain spotted fever and other spotted fevers). In: Mandel GL, Douglas RG, Bennett JE Dolin R, eds. Mandell, Douglas and Bennett’s Principles and practice of infectious diseases. 5th ed. Philadelphia. Churchill Livingstone, 2000, p. 2393-402. 29. Walker DH. Tick-transmitted infectious diseases in the United States. Annu Rev public Health 1998; 19: 237-69. 30. Tick information. www.cdc.gov. 31. Spach DH, Liles WC, Campbell GL, Quick RE, Anderson DE Jr, Fritsche TR: Tick-borne diseases in the United States. N Engl J Med. 1993; 329: 936-47. 32. Thorner AR, Walker DH, Petri WA Jr. Rocky mountain spotted fever. Clin Ifect Dis. 1998; 27: 1353-60. TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) 468 www.korhek.org 33. Steeve AC. Lyme borreliosis. In: Kasper DL, Harrison TR: Harrison’s Manual of medicine.16th ed. New York: McGraw-Hill, 2005, p. 995-9. 34. Tick-borne diseases. www.aafp.org. 35. Centers for Disease Control and Prevention. Rocky Mountain spotted fever. Accessed online April 11 2005. at: www.cdc.gov. 36. Taege AJ. Tick trouble: overview of tick-borne diseases. Cleve Clin J Med. 2000; 67: 245-9. 37. Ticks. www.health.nsw.gov.au. 38. Centers for disease control and prevention. Lyme disease-United States, 1999. MMWR morb Mortal Wkly Rep. 2001; 50: 181-85. 39. Steere AC, Bartenhagen NH, Craft JE, Hutchinson GJ, Newman JH, Rahn DW, et al. The early clinical manifestation of Lyme disease. Ann Intern Med. 1983; 99: 76-82. 40. Beers MH, Berkow R. The Merck manual of diagnosis and therapy. 17th ed. Merck Research Laboratories. Whitehause Station, n.J, 1999. 41. Treatment of Lyme disease. Med Lett Drugs Ther. 2000; 42: 37-9. 42. Deborah SF. Prevent Tick bites: Prevent Lyme Disease. Rutgers Coperative extensions. 1992, FS637. 43. Belman AL. Tick-borne diseases. Semin Pediatr Neurol. 1999; 6: 249-66. 44. Fritz CL, Glaser CA. Erlichsis. Infect Dis Clin North Am. 1998; 12: 123-36. 45. Cox SK, Everett ED. Tularemia, an analysis of 25 cases. Mo Med 1981; 78: 70-4. 46. Bratton RL; Corey GR. Tick-Borne Diseases. www.aafp.org. 47. Kjemtrup AM, Conrad PA. Human babesiosis: an emerging tick-borne disease. Int J Parasitology. 2000; 30: 1323-1337. Kaynak:TAF Preventive Medicine Bulletin, 2008: 7(5) Konu İle İlgili PDF formatını buradan indire bilirsiniz http://www.korhek.org/khb/khb_007_05-461.pdf

http://www.biyologlar.com/kene-ile-bulasan-hastaliklar

Doğal Besi Yerleri

süt, yumurta, patates, havuç gibi doğal maddelerden yapılırlar. I-Sütlü besiyerleri Kaymağı alınmış süt besiyeri; Süt 20 dk, kaynatılıp buzdolabı veya serin bir yerde bir gece bekletilerek kaymak tutması sağlanır. Kaymağın altındaki süt pipetle alınıp, tüplere dağıtılır. Otoklavda 115°C'de 20 dk. tutularak sterillenir. Turnusollü süt; Kaymağı alınmış süte turnusolün alkolik. çözeltisinden %2 oranında konur. Üstteki gibi sterillenir. Bromkrezol morlu süt; Bir litre kaymağı alınmış süte, 0.02 gr brom krezol moru eklenir. 45-50°C'ye ısıtılıp eritilir. Üstteki gibi sterillenir. Anaeroblar için bromkrezol morlu süt; 10 cm3 bronkrezol morlu süt tüplere dağıtılır. Her tüpe bir gram indirgenmiş demir ilave edilir. Otoklavda l20°C'de 30 dk ısıtarak sterilize edilir. Metilen mavili süt; Kaymağı alınmış süte metilen mavisinin sudaki %1'lik çözeltisinden %10 oranında ilave edilir. Otoklavda 115°C'de 10 dk ısıtarak sterilize edilir. II - Yumurtalı besiyerleri Pai'nin yumurtalı besiyeri; Üç kısım yumurtaya (75 ml ye), bir kısım fizyolojik tuzlu su (25 ml) eklenerek hazırlanır. Yumurtalar su ve sabunla fırçalanarak temizlenir. %70 alkolde 5 dk. tutulup çıkarılır. Kuruduktan sonra steril bir pensle geniş ucundan büyükçe bir delik açılır. Şişenin ağzına doğru ters çevrilip sivri ucuda kırılan yumurtaların muhteviyatı boncuklu steril şişeye akıtılır. Üzerine tuzlu su ilave edilir. Homojen oluncaya kadar çalkalanır, steril gaz bezinde süzülür, tüplere 5-6 ml. olarak dağıtılır. Koagulatörde, eğri olarak 85°C'de üç gün, günde birer saat ısıtılarak koagüle ve sterilize edilir. Pai besiyeri, bakterilerin laboratuvarda, oda derecesinde saklanması ve difteri etkeninin tanınması amaçlarıyla kullanılır. Enterobakter'ler bu besiyerinde 1-2 yıl canlı kalırlar ve R şekline geçiş, jeloz besiyerinden daha azdır. Besiyerine ekilen bakterinin 37°C'de bir gece bekletilmesi ile hazırlanan kültür, karanlık ve serin bir dolapta uzun süre saklanabilir. Bu sürede besiyerinin kurumaması için, vidalı kapaklı şişeler kullanılmalıdır. Dorset'in yumurtalı besiyeri; Dört taze yumurta, Pai besiyerindeki gibi hazırlanır. Bu besiyeri Mycobacterium tuberculosis'in üretilmesi için kullanılır. Besiyerine indikatör olarak bazik füksin ilave edildiğinde pembe renk meydana gelir ve tüberküloz basilinin erken devrede ürediği görülebilir. III - Patates besiyeri; Büyük patatesler alınıp, iyice yıkanır ve kabukları soyulur. Tüpe girecek büyüklükte 5 cm uzunlukta, silindir şeklinde kesilir. Suda iyice yıkanır. Silindir şeklindeki patates uzunlamasına ve eğik olarak ikiye kesilir. Her parça kalın tarafı altta kalacak şekilde patates tüpüne yerleştirilir. Tüp steril su ile doldurulur. 100°C'de 30 dk ısıtılır. Su boşaltıldıktan sonra otoklavda 115°C'de 20 dk. tutularak sterilize edilir. Patatesler dilimlere ayrılıp, petri kutularında da besiyeri hazırlanabilir.

http://www.biyologlar.com/dogal-besi-yerleri

BAZI ÖZEL HİSTOLOJİK PREPATATLARIN YAPIMI

1-KAN PREPARATI: Omurgalı kanı iki türlü incelenir.a-Canlı olarak b-Tespit edilmiş ve boyanmış olaraka.Canlı olarak preparat hazırlanması: Doğrudan doğruya parmaktan lama alınan kan incelenir veya % 0.9’luk fizyolojik su içine kan damlatılıp , incelenir. Eritrositler birbirinden ayrıldığı için iyi görülür.Ayrıca 300 mg Ruj.nötr 100 cm3 saf suda eritilir. Bir damla lam üzerine konur sonra diğer bir lamın kısa kenarı ile bu sıvı lam üzerine yayılır ve kurutulur. Sonra bir damla kan konur ve lamel kapatılır. Bir süre sonra kan hücrelerinin bu boyayı alarak çeşitli renklerde oldukları görülür. Eritrositler bu boyayı almazlar. Sıcak kanlı hayvanların lökösitlerin ameboid hareketlerini görmek için lam hafifçe ısıtılır. Soğuk kanlılarda oda sıcaklığında bu hareketi görebiliriz.b- Tesbit edilmiş ve boyanmış olarak: Alkolde temizlenen parmak ucundan sterilize iğne ile çıkarılan kan temiz bir lam üzerine konur. Başka bir lamın kısa kenarı ile iyice yayılır. Biraz kuruması beklenir, sonra metil alkol içinde 3 dakika bekletilir. Daha sonra lam üzerine saf su damlatılır. Biraz bekletilir, suyu akıtıldıktan sonra bir kap içindeki Giemza boyasına konur (10 cc distile su+1 cc Giemsa ). 30 dakika bekledikten sonra çeşme suyunda yıkanır, kurutulur, incelenir.2-MİTOZ BÖLÜNME PREPARATIKuru soğan ya da arpacık soğanı kökleri su içine gelecek şekilde suyun içine konur. Üç hacim absolü alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içine uzayan köklerin uç kısımları kesilerek biriktirilir. Bu karışımdan çıkan kökler 3 N HCl içinde 2-3 dakika bırakılır ( 24 cc HCl alınır. 100 cc ye distile su ile tamamlanır. 100 cc % 50’ lik asetik asit içine 1 gr orcein konur. Asitten çıkarılan kökler boya içinde 1.5 saat bekletilir. Lam üzerine 1 kök konur. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit damlatılır. Üzerine lamel kapatılır. Gazlı bez yardımıyla üstten bastırılarak yayılır ve mikroskopta incelenir. 3-MAYOZ BÖLÜNME PREPARATI1-Çekirge testisleri çıkarılır.2-3 hacim alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içersinde 24 saat buzdolabında fikse edilir.3-Saklamak için % 70 ‘lik alkol kullanılır.4-Boya 1 gr orcein 100 ml % 50 ‘lik Asetik asit içinde çözülür 30 ‘ dakika5-% 45 ‘lik asetik asit damlatılıp ezilir.6-Mikroskopta incelenir. 4-DÜZ KAS PREPARATI ( KURBAĞA MESANESİNDEN )Araç ve GereçlerKurbağaŞişe mantarıLam, lamel, makas, pens, küvetBouin, etil alkol, eter veya kloroformBouin Çözeltisi9 gr pikrik asit 75 cc distile suda çözülür ( %74’ lük )% 40’ lık formol...........25 ccGlasiyal asetik asit.......5 cc Bouin taze hazırlanır. Asetik asit buharlaştığından çözeltinin yapısı bozulabilir. İyi saklanırsa uzun süre kullanılabilir. Mesaneyi iyi fikse ettiği gibi sertleştirerek kolay boyanır hale getirir. Hemalum % 1’ lik suda hazırlanmış olarak kullanılır. Eozinin ise % 70’ lik etil alkolde hazırlanmış % 1 ‘ lik çözeltisi kullanılır.Kurbağa bayıltılır. Mesanesi kesilerek alınır. Parafinde kaynatılmış veye doyurulmuş, ortası delik mantarın delik kısmı üstüne iğne ile gerilir. Bouin çözeltisine aktarılır. Mesane alt yüzeyde olmalı ve Bouin ile temas etmelidir. 1-2 saat sonra mesane sarı renk alır ve sertleşir. % 70’ lik alkole aktarılır. Objenin rengi giderilinceye kadar alkol değiştirilir. Sonra hemen hematoksilen ile istenilen mor renk alınıncaya kadar boyanır. Eozin ile 15 dakika boyanır. % 70-90-100’lük etil alkollerde 10’ ar dakika dehidre edilir. Ksilolde 5 dakika tutulur. Pensle çıkarılan materyel filtre kağıdı üzerine alınır. Mesane küçük parçalara ayrılarak lam üzerine alınır. Entellan damlatılarak lamel kapatılır. Kurutulur ve incelenir. 5-ÇİZGİLİ KAS PREPARATI (Çekirgeden): Çekirgenin abdomeni açılır. 2 kas demeti görülür. Steromikroskop altında kas çıkarılır. % 0.6’ lık fizyolojik sıvıya konur (NaCl ile hazırlanmış ). Buradan 1 hacim asetik asit+3 hacim % 96’ lık etil alkol içeren tespit çözeltisine aktarılır. Burada demet halindeki kaslar iğne veya pensle küçük parçalara ayrılır. 1 kas lifi lama alınır. Üzerine 1-2 damla asetocarmin damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Üzerine lamel kapatılır ve hafifçe bastırılır. Sonra lamelin bir tarafından asetocarmin çekilip diğer taraftan % 96’ lık alkol eklenir. Bu işlem 2 defa tekrarlanır. Lameli yavaşça kaldırıp 1 damla kanada balzamı veya entellan damlatılır ve lamel kapatılır. Bu işlemlerin lamel kapatılarak yapılmasının nedeni kas üzerinde baskı yapmaktır. Baskı olmadığı zaman kas büzülür.6-KEMİK PREPARATIAraç ve Gereçler% 5- % 7.5’ lik Nitrik asit ( 100 cc % 65’lik nitrik asit+1200 cc distile su)% 5’ lik sodyum sülfatEtil alkolKreozot (karanfil yağı )Uzun kemik (3-5 cm boyunda )Preparasyon 2 teknikle yapılabilir.1-Yumuşatma: Gerekli maddeler bulunduğu takdirde daha kolay ve uygun bir tekniktir.2-İnceltme: Daha çok el becerisine dayanır.a-Kemiğin yumuşatılarak preparat hazırlanması: Uzun kemik parçasının üzerindeki yağ, kas kısımları bistüri ile temizlenir. Kemiğin anorganik yapısını eritmek için % 5 veya 7.5 lik seyreltilmiş nitrik asit içine konur., 24-48 saat bırakılır. Sık sık çalkalanır. 5 saatte bir çözelti tazelenir. Kemikler jiletle kesilecek kadar yumuşayınca çıkarılır.. 24-48 saat kadar % 5’lik sodyum sülfat içinde bırakılır. Sonra asitin giderrilmesi için çeşme suyunda 1-2 gün yıkanır.Keskin jiletle yumuşamış ve yıkanmış kemikten çok ince kesitler alınarak % 50 ve % 70’ lik alkol bulunan petri kaplarında 10-60 dakika bekletilir. Kreozot içine alınarak 15-20 dakika şeffaflandırılır. Temiz bir lam üzerine alınan kemik kesiti üzerine entallan damlatılarak lamelle kapatılır.Kesitler düzgün ve yeterli incelikte alınmışsa Havers kanalları ve konsantrik lameller izlenir. Boyuna alınan kesitlerle de Volkman ve Havers kanalları ve lameller izlenir. Mikroskopta inceleme yaparken diyafram kısılırsa daha iyi görüntü alınır.b-Kemiğin inceltilmesi ile preparat yapımı: Uzun kemiklerden kemik testeresi ile enine parçalar kesilir. Bunlar döner zımpara taşlarında ( elektrikli veya kolla dönen ) mümkün olduğu kadar inceltilir. Daha sonra kesilen bir tahta üzerine koyarak ince dişli demir eğici ile çalışarak inceltmeye devam edilir. Bu arada kesitler incelendikce daire şeklindeki kesitten kopmalar olur. Kopan parçalar ponza taşında tekrar inceltmeye devam edilir. Ponza taşı üzerinde düzgün bir yüzey elde edilir. Bu yüzey üzerine su damlatılır. Ve kesitler parmak ucu ile taş üzerine sürtülerek daha da inceltilir.Parmak ucunda tutulan kesitlerden parmağın izleri görünüyor ise kemik parçaları yeteri kadar incelmiş demektir.İnceliği uygun görülen kesitler 5-10 ‘kadar HNO3 de bekletilir. Sonra damıtık suda birkaç değiştirme ile iyice yıkanır. Filtre kağıdından suları süzülür. Dikdörtgen veya kare şeklinde kesilerek lama yerleştirip lamel kapatılır.Kesiler saydam olduğu için kanada balzamının ksilol ile seyreltilerek kullanılması tercih edilir. 7-KIKIRDAK PREPERATIKurbağanın ön ve arka ekstremitelerinin eklem yerlerindeki kıkırdak kullanılır. Hayvan eter veya kloroformla bayılttıktan sonra ekstremitlerinden biri eklem yerinden kesilir. Kasları kemikten ayrılır. Temizlenmiş olan kemik fizyolojik suya konur (%0.8 NaCl).Keskin bir jiletle uzun kemiklerin uçlarındaki mavimsi renkli kıkırdaktan ince kesitler alınıp, fizyolojik suda lamel altında incelenir. Kıkırdak ara maddesi bu bölgede homojendir.Kapsülde genellikle bir kıkırdak hücresi bulunur. Ara maddeleri açık gri kapsül beyaz renkli , plazma ve nukleus mavimtrak görünür. Bunu boyamak için Karmin- Asetik Bunu boyamak için Karmin -Asetik asit kullanılır. Bu boya fiksatiftir. Onun için kesit lam üzerine konan 1-2 damla asetokarmin içinde 1-2 dakika bekletilir, lamel kapatılır. Bu arada materyal tespit edildiği için hücreler büzülür. Nukleus kırmızı, plazma pembe boyanır. Kapsül ve ara madde az boyanır veya hic boyanmaz. Preparatın devamlı olması için : Boyanan kesit % 96 lık alkolde 5 dakika tutulur. Sonra kreozt veya karanfil yağı içine konur. En fazla yarım saatte bu kesiler şeffaflaşır. Temiz bir lama bir damla Kanada balzamı veya entellan damlatılır. Kesit bunun üzerine yerleştirilir ve lamel kapatılır.b- Kıkırdak pikrik asit içermeyen herhangibir fiksatif içinde tespit edilir. Sonra iyice yıkanır. Aşağıda formülü verilen Von Wijre boyasında 24 saat boyanır. %70’ lik etil alkol.......................100 ccHCL.............................................0.1 ccToluidin mavisi ........................ 0.1 gr Boyadan sonra % 70 alkol içinde (0.001 HCL li) hiç boyası çıkmayıncaya kadar kalacak, % 70-80 -90-100 alkol serilerinde dehidrasyon yapılarak şeffaflaştırıcı (kreozot) içine aktarılır. Lam üzerine alınınca 1 damla Kanada balzamı veya entellan eklenerek lamel kapatılır. 8- KURBAĞA DERİSİ Kurbağanın sırt derisi kesilerek delikli bir mantar üzerine gerilir. Bouin de 3-4 saat tesbit edilir. İğneleri çıkartılarak ufak parçalara bölünür. Sarı rengi giderilinceye kadar % 70 alkolde yıkanır. % 80’lik etil alkolde 1 saat % 90’lik etil alkolde 1 saat % 100’ lık etil alkolde 1 saat Ksilol + %30’luk alkolde 15-30' Ksilolde 30 dakika Ksilol+parafinde 30 dakika Etüvdeki parafinde 24 saat Bloklanır. Daha sonra mikrotomda 12 mm’lik kesitler alınır. Kesitler bir gün bekletilir. Ksilolde 5-10 dakika Alkol serilerinde (% 100-96-80-80 ) beşer dakika Hematoksilen Akarsuda 15 dakika boyama Eosin (Eosin su ile yapıldıysa akarsudan sonra . %80’ e kadar alkol serilerinden geçirilir sonra eosinle boyanır ). % 96 - %100’ lik alkol 1-2 dakika Ksilol 2-3 dakika Kanada balzamı ve lamel kapatılması 9-DEV KROMOZOMLARIN PREPARATI: Bu teknikte absolü metil alkol sadece tespit ve lamel kapatma sırasında çözücü olarak kullanılır. Ringer çözeltisi içine alınan ganglion veya tükrük bezi temiz bir lam üzerine alınır. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit eklenerek 3-4 dakika tespit edilir. Fazla tutulursa parçalanır. Lamel kapatılır. Fiksatifin fazlası emdirilir.Kullanılan lam daha önceden albümin veya başka bir yapıştırıcı sürülmüş ve kurutulmuş olmalıdır. Lam ve lamel içinde alkol bulunan bir kaba aktarılır. 12 saat ya da daha fazla bekletilir. Lamel kendiliğinden düşmemişse ince bir iğne yardımı ile lamel alınır. Üzerine tükrük bezi yapışmış lam alkolde doyurulmuş amonyum ferri sülfat bulunan kaba taşınır. 12 saat bekledikten sonra biraz hematoksilen kristali boyaya aktarılır. Alkol banyosundan sonra 5-10 dakika alkolde doyurulmuş lityum karbonat çözeltisinde bekletilir. Kırmızı bir boyama yapılacaksa 1-3 saniye alkolik eozinde ( 100 cc % 90’ lık alkol+ 0.5 gr eosin ) bekletilir. Entellan damlatılarak lamel kapatılır.

http://www.biyologlar.com/bazi-ozel-histolojik-prepatatlarin-yapimi-1

Fotosentez

Dünya, canlı yaşamına en uygun olacak şekilde, özel olarak tasarlanmış bir gezegendir. Atmosferindeki gazların oranından, güneşe olan uzaklığına, dağların varlığından, suyun içilebilir olmasına, bitkilerin çeşitliliğinden yeryüzünün sıcaklığına kadar kurulmuş olan pek çok hassas denge sayesinde dünya yaşanabilir bir ortamdır. Yaşamı oluşturan öğelerin devamlılığının sağlanabilmesi için de hem fiziksel şartların hem de bazı biyokimyasal dengelerin korunması gereklidir. Örneğin nasıl ki canlıların yeryüzünde yaşamaları için yer çekimi kuvveti vazgeçilmez ise, bitkilerin ürettiği organik maddeler de yaşamın devamı için bir o kadar önemlidir. İşte bitkilerin bu organik maddeleri üretmek için gerçekleştirdikleri işlemlere, daha önce de belirttiğimiz gibi fotosentez denir. Bitkilerin kendi besinlerini kendilerinin üretmesi olarak da özetlenebilecek olan fotosentez işlemi, bunların diğer canlılardan ayrıcalıklı olmasını sağlar. Bu ayrıcalığı sağlayan, bitki hücresinde insan ve hayvan hücrelerinden farklı olarak güneş enerjisini direkt olarak kullanabilen yapılar bulunmasıdır. Bu yapıların yardımıyla, bitki hücreleri güneşten gelen enerjiyi insanlar ve hayvanlar tarafından besin yoluyla alınacak enerjiye çevirirler ve yine çok özel yollarla depolarlar. İşte bu şekilde fotosentez işlemi tamamlanmış olur. Gerçekte bütün bu işlemleri yapan, bitkinin tamamı değildir, yaprakları da değildir, hatta bitki hücresinin tamamı da değildir. Bu işlemleri bitki hücresinde yer alan ve bitkiye yeşil rengini veren "kloroplast" adı verilen organel gerçekleştirir. Kloroplastlar, milimetrenin binde biri kadar büyüklüktedir, bu yüzden yalnızca mikroskopla gözlemlenebilirler. Yine fotosentezde önemli bir rolü olan kloroplastın çeperi de, metrenin yüz milyonda biri kadar bir büyüklüktedir. Görüldüğü gibi rakamlar son derece küçüktür ve bütün işlemler bu mikroskobik ortamlarda gerçekleşir. Fotosentez olayındaki asıl hayret verici noktalardan biri de budur. SIR DOLU BİR FABRİKA: KLOROPLAST Kloroplastta fotosentezi gerçekleştirmek üzere hazırlanmış thylakoidler, iç zar ve dış zar, stromalar, enzimler, ribozom, RNA ve DNA gibi oluşumlar vardır. Bu oluşumlar hem yapısal hem de işlevsel olarak birbirlerine bağlıdırlar ve her birinin kendi bünyesinde gerçekleştirdiği son derece önemli işlemler vardır. Örneğin kloroplastın dış zarı, kloroplasta madde giriş-çıkışını kontrol eder. İç zar sistemi ise "thylakoid" olarak adlandırılan yapıları içermektedir. Disklere benzeyen thylakoid bölümünde pigment (klorofil) molekülleri ve fotosentez için gerekli olan bazı enzimler yer alır. Thylakoidler "grana" adı verilen kümeler meydana getirerek, güneş ışığının en fazla miktarda emilmesini sağlarlar. Bu da bitkinin daha fazla ışık alması ve daha fazla fotosentez yapabilmesi demektir. Bunlardan başka kloroplastlarda "stroma" adı verilen ve içinde DNA, RNA ve fotosentez için gerekli olan enzimleri barındıran bir de sıvı bulunur. Kloroplastlar sahip oldukları bu DNA ve ribozomlarla hem kendilerini çoğaltırlar, hem de bazı proteinlerin üretimini gerçekleştirirler. Fotosentezdeki başka bir önemli nokta da bütün bu işlemlerin çok kısa, hatta gözlemlenemeyecek kadar kısa bir süre içinde gerçekleşmesidir. Kloroplastların içinde bulunan binlerce "klorofil"in aynı anda ışığa tepki vermesi, saniyenin binde biri gibi inanılmayacak kadar kısa bir sürede gerçekleşir. Bilim adamları kloroplastların içinde gerçekleşen fotosentez olayını uzun bir kimyasal reaksiyon zinciri olarak tanımlarlarken, işte bu hız nedeniyle fotosentez zincirinin bazı halkalarında neler olduğunu anlayamamakta ve olanları hayranlıkla izlemektedirler. Anlaşılabilen en net nokta, fotosentezin iki aşamada meydana geldiğidir. Bu aşamalar "aydınlık evre" ve "karanlık evre" olarak adlandırılır. AYDINLIK EVRE Bitkilerin fotosentez işleminde kullanacakları tek enerji kaynağı olan güneş ışığı değişik renklerin birleşimidir ve bu renklerin enerji yükü birbirinden farklıdır. Güneş ışığındaki renklerin ayrıştırılması ile ortaya çıkan ve tayf adı verilen renk dizisinin bir ucunda kırmızı ve sarı tonları, öbür ucunda da mavi ve mor tonları bulunur. En çok enerji taşıyanlar tayfın iki ucundaki bu renklerdir. Bu enerji farkı bitkiler açısından çok önemlidir çünkü fotosentez yapabilmek için çok fazla enerjiye ihtiyaçları vardır. Bitkiler en çok enerji taşıyan bu renkleri hemen tanırlar ve fotosentez sırasında güneş ışınlarından tayfın iki ucundaki renkleri, daha doğrusu dalga boylarını soğururlar, yani emerler. Buna karşılık tayfın ortasında yer alan yeşil tonlardaki renklerin enerji yükü daha az olduğu için, yapraklar bu dalga boylarındaki ışınların pek azını soğurup büyük bölümünü yansıtırlar. Bunu da kloroplastların içinde bulunan klorofil pigmentleri sayesinde gerçekleştirirler. İşte yaprakların yeşil gözükmesinin nedeni de budur. Fotosentez işlemi bitkilerin yeşil görünmesine neden olan bu pigmentlerin güneş ışığını soğurmasından kaynaklanan hareketlenme ile başlar. Acaba klorofiller bu hareketlenme ile fotosentez işlemine nasıl başlamaktadırlar? Bu sorunun cevabının verilebilmesi için öncelikle kloroplastların içinde bulunan ve klorofilleri içinde barındıran Thylakoid'in yapısının incelenmesinde fayda vardır. "Klorofiller, "klorofil-a" ve "klorofil-b" olarak ikiye ayrılırlar. Bu iki çeşit klorofil güneş ışığını soğurduktan sonra elde ettikleri enerjiyi fotosentez işlemini başlatacak olan fotosistemler içinde toplarlar. Thaylakoid'in detaylı yapısının anlatıldığı resimde de görüldüğü gibi fotosistemler kısaca, thylakoid'in içinde yer alan bir grup klorofil olarak tanımlanabilir. Yeşil bitkilerin tamamına yakını bir fotosistem ile tek aşamalı fotosentez gerçekleştirirken, bitkilerin %3'ünde fotosentezin iki aşamalı olmasını sağlayacak iki farklı fotosistem bölgesi bulunur. "Fotosistem I", ve "Fotosistem II" olarak adlandırılan bu bölgelerde toplanan enerji daha sonra tek bir "klorofil-a" molekülüne transfer edilir. Böylece her iki fotosistemde de reaksiyon merkezleri oluşur. Işığın emilmesiyle elde edilen enerji, reaksiyon merkezlerindeki yüksek enerjili elektronların gönderilmesine, yani kaybedilmesine neden olur. Bu yüksek enerjili elektronlar daha sonraki aşamalarda suyun parçalanıp oksijenin elde edilmesi için kullanılır. Bu aşamada bir dizi elektron değiş tokuşu gerçekleşir. "Fotosistem I" tarafından verilen elektron, "Fotosistem II" den salınan elektron ile yer değiştirir. "Fotosistem II" tarafından bırakılan elektronlar da suyun bıraktığı elek-tronlarla yer değiştirir. Sonuç olarak su, oksijen, protonlar ve elektronlar olmak üzere ayrıştırılmış olur. Ortaya çıkan protonlar thylakoid'in iç kısmına taşınarak hidrojen taşıyıcı molekül olan NADP (nikotinamid adenin dinükliotid fosfat) ile birleşirler. Neticede NADPH molekülü ortaya çıkar. Suyun ayrışmasından sonra ortaya çıkan protonlardan bazıları ise thylakoid zarındaki enzim kompleksleri ile birleşerek ATP molekülünü (hücrenin işlemlerinde kullanacağı bir enerji paketçiği) meydana getirirler. Bütün bu işlemler sonucunda bitkilerin besin üretebilmesi için ihtiyaç duydukları enerji artık kullanılmaya hazır hale gelmiştir. Bir reaksiyonlar zinciri olarak özetlemeye çalıştığımız bu olaylar fotosentez işleminin sadece ilk yarısıdır. Bitkilerin besin üretebilmesi için enerji gereklidir. Bunun temin edilebilmesi için düzenlenmiş olan "özel yakıt üretim planı" sayesinde diğer işlemler de eksiksiz tamamlanır. KARANLIK EVRE Fotosentezin ikinci aşaması olan Karanlık Evre ya da Calvin Çevrimi olarak adlandırılan bu işlemler, kloroplastın "stroma" diye adlandırılan bölgelerinde gerçekleşir. Aydınlık evre sonucunda ortaya çıkan enerji yüklü ATP ve NADPH molekülleri, karanlık evrede kullanılan karbondioksiti, şeker ve nişasta gibi besin maddelerine dönüştürürler. Burada kısaca özetlenen bu reaksiyon zincirini kaba hatlarıyla anlayabilmek bilim adamlarının yüzyıllarını almıştır. Yeryüzünde başka hiçbir şekilde üretilemeyen karbonhidratlar ya da daha geniş anlamda organik maddeler milyonlarca yıldır bitkiler tarafından üretilmektedir. Üretilen bu maddeler diğer canlılar için en önemli besin kaynaklarındandır. Fotosentez reaksiyonları sırasında farklı özelliklere ve görevlere sahip enzimler ile diğer yapılar tam bir iş birliği içinde çalışırlar. Ne kadar gelişmiş bir teknik donanıma sahip olursa olsun dünya üzerindeki hiçbir laboratuvar, bitkilerin kapasitesiyle çalışamaz. Oysa bitkilerde bu işlemlerin tümü milimetrenin binde biri büyüklüğündeki bir organelde meydana gelmektedir. Şekilde görülen formülleri, sayısız çeşitlilikteki bitki hiç şaşırmadan, reaksiyon sırasını hiç bozmadan, fotosentezde kullanılan hammadde miktarlarında hiçbir karışıklık olmadan milyonlarca yıldır uygulamaktadır. Ayrıca fotosentez işlemi ile, hayvanların ve insanların enerji tüketimleri arasında da önemli bir bağlantı vardır. Aslında yukarıda anlatılan karmaşık işlemlerin özeti, bitkilerin fotosentez sonucu canlılar için mutlaka gerekli olan glukozu ve oksijeni meydana getirmeleridir. Bitkilerin ürettiği bu ürünler diğer canlılar tarafından besin olarak kullanılırlar. İşte bu besinler vasıtasıyla canlı hücrelerinde enerji üretilir ve bu enerji kullanılır. Bu sayede bütün canlılar güneşten gelen enerjiden faydalanmış olurlar. Canlılar fotosentez sonucu oluşan besinleri yaşamsal faaliyetlerini sürdürmek için kullanırlar. Bu faaliyetler sonucunda atık madde olarak atmosfere karbondioksit verirler. Ama bu karbondioksit hemen bitkiler tarafından yeniden fotosentez için kullanılır. Bu mükemmel çevirim böylelikle sürer gider. FOTOSENTEZ İÇİN GEREKLİ OLAN HER ŞEY GİBİ GÜNEŞ IŞIĞI DA ÖZEL OLARAK AYARLANMIŞTIR Bu kimyasal fabrikada her şey olup biterken, işlemler sırasında kullanılacak enerjinin özellikleri de ayrıca tespit edilmiştir. Fotosentez işlemi bu yönüyle incelendiğinde de, gerçekleşen işlemlerin ne kadar büyük bir hassasiyetle tasarlanmış olduğu görülecektir. Çünkü güneşten gelen ışığın enerjisinin özellikleri, tam olarak kloroplastın kimyasal tepkimeye girmesi için ihtiyaç duyduğu enerjiyi karşılamaktadır. Bu hassas dengenin tam anlaşılabilmesi için güneş ışığının fotosentez işlemindeki fonksiyonlarını ve önemini şöyle bir soruyla inceleyelim: Güneş'in ışığı fotosentez için özel olarak mı ayarlanmıştır? Yoksa bitkiler, gelen ışık ne olursa olsun, bu ışığı değerlendirip ona göre fotosentez yapabilecek bir esnekliğe mi sahiptirler? Bitkiler hücrelerindeki klorofil maddelerinin ışık enerjisine karşı duyarlı olmaları sayesinde fotosentez yapabilirler. Buradaki önemli nokta klorofil maddelerinin çok belirli bir dalga boyundaki ışınları kullanmalarıdır. Güneş tam da klorofilin kullandığı bu ışınları yayar. Yani güneş ışığı ile klorofil arasında tam anlamıyla bir uyum vardır Amerikalı astronom George Greenstein, The Symbiotic Universe adlı kitabında bu kusursuz uyum hakkında şunları yazmaktadır: Fotosentezi gerçekleştiren molekül, klorofildir... Fotosentez mekanizması, bir klorofil molekülünün Güneş ışığını absorbe etmesiyle başlar. Ama bunun gerçekleşebilmesi için, ışığın doğru renkte olması gerekir. Yanlış renkteki ışık, işe yaramayacaktır. Bu konuda örnek olarak televizyonu verebiliriz. Bir televizyonun, bir kanalın yayınını yakalayabilmesi için, doğru frekansa ayarlanmış olması gerekir. Kanalı başka bir frekansa ayarlayın, görüntü elde edemezsiniz. Aynı şey fotosentez için de geçerlidir. Güneş'i televizyon yayını yapan istasyon olarak kabul ederseniz, klorofil molekülünü de televizyona benzetebilirsiniz. Eğer bu molekül ve Güneş birbirlerine uyumlu olarak ayarlanmış olmasalar, fotosentez oluşmaz. Ve Güneş'e baktığımızda, ışınlarının renginin tam olması gerektiği gibi olduğunu görürüz. FOTOSENTEZİN SONUÇLARI Milimetrenin binde biri büyüklükte yani ancak elektron mikroskobuyla görülebilecek kadar küçük olan kloroplastlar sayesinde gerçekleştirilen fotosentezin sonuçları, yeryüzünde yaşayan tüm canlılar için çok önemlidir. Canlılar havadaki karbondioksitin ve havanın ısısının sürekli olarak artmasına neden olurlar. Her yıl insanların, hayvanların ve toprakta bulunan mikroorganizmaların yaptıkları solunum sonucunda yaklaşık 92 milyar ton ve bitkilerin solunumları sırasında da yaklaşık 37 milyar ton karbondioksit atmosfere karışır. Ayrıca fabrikalarda ve evlerde kaloriferler ya da soba kullanılarak tüketilen yakıtlar ile taşıtlarda kullanılan yakıtlardan atmosfere verilen karbondioksit miktarı da en az 18 milyar tonu bulmaktadır. Buna göre karalardaki karbondioksit dolaşımı sırasında atmosfere bir yılda toplam olarak yaklaşık 147 milyar ton karbondioksit verilmiş olur. Bu da bize doğadaki karbondioksit içeriğinin sürekli olarak artmakta olduğunu gösterir. Bu artış dengelenmediği takdirde ekolojik dengelerde bozulma meydana gelebilir. Örneğin atmosferdeki oksijen çok azalabilir, yeryüzünün ısısı artabilir, bunun sonucunda da buzullarda erime meydana gelebilir. Bundan dolayı da bazı bölgeler sular altında kalırken, diğer bölgelerde çölleşmeler meydana gelebilir. Bütün bunların bir sonucu olarak da yeryüzündeki canlıların yaşamı tehlikeye girebilir. Oysa durum böyle olmaz. Çünkü bitkilerin gerçekleştirdiği fotosentez işlemiyle oksijen sürekli olarak yeniden üretilir ve denge korunur. Yeryüzünün ısısı da sürekli değişmez. Çünkü yeşil bitkiler ısı dengesini de sağlarlar. Bir yıl içinde yeşil bitkiler tarafından temizleme amacıyla atmosferden alınan karbondioksit miktarı 129 milyar tonu bulur ki bu son derece önemli bir rakamdır. Atmosfere verilen karbondioksit miktarının da yaklaşık 147 milyar ton olduğunu söylemiştik. Karalardaki karbondioksit-oksijen dolaşımında görülen 18 milyar tonluk bu açık, okyanuslarda görülen farklı değerlerdeki karbondioksit-oksijen dolaşımıyla bir ölçüde azaltılabilmektedir. Yeryüzündeki canlı yaşamı için son derece hayati olan bu dengelerin devamlılığını sağlayan, bitkilerin yaptığı fotosentez işlemidir. Bitkiler fotosentez sayesinde atmosferdeki karbondioksidi ve ısıyı alarak besin üretirler, oksijen açığa çıkarırlar ve dengeyi sağlarlar. Atmosferdeki oksijen miktarının korunması için de başka bir doğal kaynak yoktur. Bu yüzden tüm canlı sistemlerdeki dengelerin korunması için bitkilerin varlığı şarttır. BİTKİLERDEKİ BESİNLER FOTOSENTEZ SONUCUNDA OLUŞUR Bu mükemmel sentezin hayati önem taşıyan bir diğer ürünü de canlıların besin kaynaklarıdır. Fotosentez sonucunda ortaya çıkan bu besin kaynakları "karbonhidratlar" olarak adlandırılır. Glukoz, nişasta, selüloz ve sakkaroz karbonhidratların en bilinenleri ve en hayati olanlarıdır. Fotosentez sonucunda üretilen bu maddeler hem bitkilerin kendileri, hem de diğer canlılar için çok önemlidir. Gerek hayvanlar gerekse insanlar, bitkilerin üretmiş olduğu bu besinleri tüketerek hayatlarını sürdürebilecek enerjiyi elde ederler. Hayvansal besinler de ancak bitkilerden elde edilen ürünler sayesinde var olabilmektedir. Buraya kadar bahsedilen olayların yaprakta değil de herhangi bir yerde gerçekleştiğini varsayarak düşünsek acaba aklınızda nasıl bir yer şekillenirdi? Havadan alınan karbondioksit ve su ile besin üretmeye yarayan aletlerin bulunduğu, üstelik de o sırada dışarıya verilmek üzere oksijen üretebilecek teknik özelliklere sahip makinaların var olduğu, bu arada ısı dengesini de ayarlayacak sistemlerin yer aldığı çok fonksiyonlu bir fabrika mı aklınıza gelirdi? Avuç içi kadar bir büyüklüğe sahip bir yerin aklınıza gelmeyeceği kesindir. Görüldüğü gibi ısıyı tutan, buharlaşmayı sağlayan, aynı zamanda da besin üreten ve su kaybını da engelleyen mükemmel mekanizmalara sahip olan yapraklar, tam bir tasarım harikasıdırlar. Bu saydığımız işlemlerin hepsi ayrı özellikte yapılarda değil, tek bir yaprakta (boyutu ne olursa olsun) hatta tek bir yaprağın tek bir hücresinde, üstelik de hepsi birarada olacak şekilde yürütülebilmektedir. Buraya kadar anlatılanlarda da görüldüğü gibi bitkilerin bütün fonksiyonları, asıl olarak canlılara fayda vermesi için nimet olarak yaratılmışlardır. Bu nimetlerin çoğu da insan için özel olarak tasarlanmıştır. Çevremize, yediklerimize bakarak düşünelim. Üzüm asmasının kupkuru sapına bakalım, incecik köklerine… En ufak bir çekme ile kolayca kopan bu kupkuru yapıdan elli altmış kilo üzüm çıkar. İnsana lezzet vermek için rengi, kokusu, tadı her şeyi özel olarak tasarlanmış sulu üzümler çıkar. Karpuzları düşünelim. Yine kuru topraktan çıkan bu sulu meyve insanın tam ihtiyaç duyacağı bir mevsimde, yani yazın gelişir. İlk ortaya çıktığı andan itibaren bir koku eksperi gibi hiç bozulma olmadan tutturulan o muhteşem kavun kokusunu ve o ünlü kavun lezzetini düşünelim. Diğer yandan ise, parfüm üretimi yapılan fabrikalarda bir kokunun ortaya çıkarılmasından o kokunun muhafazasına kadar gerçekleşen işlemleri düşünelim. Bu fabrikalarda elde edilen kaliteyi ve kavunun kokusundaki kaliteyi karşılaştıralım. İnsanlar koku üretimi yaparken sürekli kontrol yaparlar, meyvelerdeki kokunun tutturulması içinse herhangi bir kontrole ihtiyaç yoktur. İstisnasız dünyanın her yerinde kavunlar, karpuzlar, portakallar, limonlar, ananaslar, hindistan cevizleri hep aynı kokarlar, aynı eşsiz lezzete sahiptirler. Hiçbir zaman bir kavun karpuz gibi ya da bir mandalina çilek gibi kokmaz; hepsi aynı topraktan çıkmalarına rağmen kokuları birbiriyle karışmaz. Hepsi her zaman kendi orijinal kokusunu korur. Bir de bu meyvelerdeki yapıyı detaylı olarak inceleyelim. Karpuzların süngersi hücreleri çok yüksek miktarda su tutma kapasitesine sahiplerdir. Bu yüzden karpuzların çok büyük bir bölümü sudan oluşur. Ne var ki bu su, karpuzun herhangi bir yerinde toplanmaz, her tarafa eşit olacak şekilde dağılmıştır. Yer çekimi göz önüne alındığında, olması gereken, bu suyun karpuzun alt kısmında bir yerlerde toplanması, üstte ise etsi ve kuru bir yapının kalmasıdır. Oysa karpuzların hiçbirinde böyle bir şey olmaz. Su her zaman karpuzun içine eşit dağılır, üstelik şekeri, tadı ve kokusu da eşit olacak şekilde bu dağılım gerçekleşir.   Doğada meydana gelen ve canlılığın ışık ile iletişim gösteren en belirgin temel olaylarından biri "fotosentez" dir. Fotosentez ışık enerjisinin biyolojik olarak kimyasal enerjiye dönüşümü olayıdır. Enerji yönünden tüm canlı organizmalar kesinlikle fotosenteze bağımlıdır, çünkü gerekli besin maddelerinin ve hatta atmosferdeki oksijenin kökeni fotosentezdir. Canlı hücrelerin büyük bir çoğunluğu, basit bir algden, büyük ve karmaşık kara bitkilerine kadar fotosentez yaparlar. İnsan yaşadığı ortamda kendi gereksinmelerine göre bir çok değişiklikleri yapma yeteneğine sahip olmasına rağmen, tüm beslenme sorunu için tamamıyla diğer organizmalara bağlıdır. Bu besin piramidinin tabanını fotosentez yapan bitkiler oluşturur. Yediğimiz her şey, ya doğrudan doğruya bitkisel kökenli, ya da bu kökenden türemiş maddelerdir. Gerçekten fotosentez tek başına büyük bir olaydır. Her yıl dünyada 690 milyar ton karbon dioksit (CO2) ve 280 milyar ton su (H2 O) dan fotosentez yolu ile 500 milyar ton karbonhidrat üretilmekte ve 500 milyar ton oksijen atmosfere verilmektedir. Canlıların büyük bir çoğunluğu için oksijen, besin kadar önemlidir. Oksijen (O2) hayatsal olayların sürekliliği için gerekli olan, besinlerde depo edilmiş enerjiyi serbest hale getirir. Canlıların çoğu havadaki serbest oksijeni kullanır. Bir kısım organizmalar (bazı bir hücreliler, ilkel bitkiler, yassı ve yuvarlak parazit solucanlar) enerji elde etmek üzere çevrelerindeki eser miktarda oksijenden bile faydalanabilirler. Diğer bir kısım organizmalar ise serbest oksijen olmadan da enerji elde edebilirler (Anaerobik solunum). Fakat kompleks yapılı bitki ve hayvanlar, yaşamak için çok miktarda oksijen kullanmak zorundadırlar (Aerobik solunum). Öyleyse kompleks yapılı organizmaların canlılığının devamı ve yayılması oksijenin varlığına bağlıdır. Deney 1. Klorofil Elde Edilmesi Yeşil bitkilerin kloroplastlarında meydana gelen fotosentez de, havanın karbon dioksidi ve suyun varlığında karbonhidrat ve oksijen oluşturulmasıdır. Fotosentez olayını detaylı bir şekilde ortaya koymadan önce klorofil ile ilgili bazı deneyler gösterilecektir. Araç ve Gereçler: Isırgan otu (Urtica) yaprağı, kum, havan, kurutma kağıdı, tebeşir, benzen, alkol, su. Uygulama: Bir havan içine hücrelerin parçalanmasını kolaylaştırmak için kum ve alkol konulup ısırgan otunun yaprakları ilave edilerek iyice ezilir. Bunun sonucunda koyu yeşil boyalı bir eriyik elde edilir. Buna ham klorofil ekstresi adı verilir. Ham klorofil ekstresi hem klorofil, hem de diğer renk maddelerinden olan karotin ve ksantofil boyalı maddeleri de içermektedir. Bunları ayırmak için ekstre filitre kağıdından süzülür. Süzülen bu berrak ekstreden bir miktar alınarak bir deney tüpüne aktarılır. Tübün üzerine aynı miktarda benzen ile bir kaç damla su ilave ediler. Su ilave edilmesinin amacı alkol karışımının yoğunluğunu arttırıp, benzenin kolayca tübün üst kısmına çıkmasını sağlamaktır. Bir süre sonra tübün üst kısmında benzende eriyen klorofilin , alt kısmında ise alkolde kalan sarı renkli karotin ve ksantofil bulunur. Bu şekilde ayırmak, kaba bir yöntemdir. Bu ayrımı daha ayrıntılı bir biçimde gözleye bilmek için kağıt ve tebeşir yardımıyla basitçe yapılabilecek olan bazı uygulamaları örnek olarak verebiliriz. Bu uygulamada yukarıda adı geçen renkli maddeler molekül ağırlığı ve adsorbsiyon derecelerine göre ayrılırlar. Bir petri içine süzülmüş olan berrak klorofil ekstresinden bir miktar koyulur. İçerisine şerit şeklinde kesilerek hazırlanmış kurutma kağıdı ile tebeşir yerleştirilir. Bir süre sonra kağıdın ve tebeşirin üst kısımlarında sarı renkli karotin ve ksantofil, alt kısımda ise yeşil renkli klorofilin toplandığı görülür. Bu kademeli renk farkı adı geçen renk maddelerinin molekül ağırlıklarının ve adsorbsiyon derecelerinin farklı olmasında ileri gelir. Fotosentez Olayında Organik Madde Sentezlendiğinin Gösterilmesi Fotesentezde ışığın katalizörlüğü altında karbon dioksit ve suyun bitkiler tarafından birleştirilerek organik madde (glikoz) sentezlenmesidir. Bu maddeler ya olduğu gibi ya da uzun zincirler şeklinde paketlenerek nişasta şeklinde depolanırlar. Amacımız fotosentezin bir ürünü olan glikozun sentezlendiğini ortaya koymaktır. Araç ve Gereçler : Ebegümeci ve yaprağı iki renkli olan bir bitki yaprağı, siyah renkli kağıt, potasyum iyodür (KI), sıcak su. Uygulama : Yaprağı iki renkli olan bitkiyi alarak uzun bir müddet ışık altında tutunuz. Ebegümeci bitkisinin bir yaprağının yarısını siyah bir kağıt ile kapatarak diğer bitkiyle birlikte aynı sürede olmak şartıyla ışık altında bırakınız. Daha sonra bu bitkileri saplarından keserek kaynamakta olan suyun içerisinde hücrelerinin ölmesini ve çeperlerinin dağılmalarını sağlayınız. Bu iş için iki dakikalık bir süre yeterli olacaktır. Yapraklar yeşil rengini kaybedince potasyum iyodürle muamele ediniz. Işıkta kalmış yeşil renkli bölgelerin nişasta oluşumundan dolayı mavi bir renk aldığını, yeşil olmayan kısımların ise renk vermediğini göreceksiniz (Şekil 4. 3). Deney 3. Fotosentez İçin Karbondioksitin Varlığının Zorunlu Olduğunun Gösterilmesi Yeşil bir bitki oldukça yoğun olarak ışık altında bırakılsa bile, eğer ortamda karbon dioksit bulunmuyorsa bitki bir süre sonra sararmaya başladığı ve gelişiminin durduğu gözlenir. Bunu aşağıdaki gibi bir deneyle ispatlamak mümkündür. Araç ve Gereçler : Bir dal parçası, kavanoz, tüp, tıpa, potasyum hidroksit (KOH), su. Uygulama : Bir bitki dalı alınarak iki yaprağı içerisinde su ve potasyum hidroksit bulunduran bir tüple birlikte (tüpün ağzı açık durumda) geniş ağızlı bir şişe veya kavanoz içerisine bırakılır. Bir süre sonra dalın kavanoz içerisinde kalan kısmında yaprakların sararıp solduğu görülür. Bir müddet daha sonra ise yapraklar tamamen ölür. Buna neden olan faktör, büyük şişedeki karbon dioksitin potasyum hidroksit tarafından emilerek şişe içerisindeki yaprakların ışık ve suyu aldıkları halde karbon dioksit yetersizliğinden fotosentezi yapamamalarındandır. Böylece fotosentez için ortamda karbondioksite kesinlikle gereksinim duyulduğu ispatlanmış olur (Şekil 4. 4). Deney 4. Fotosentezi Etkileyen Faktörlerin Birlikte İncelenmesi Aynı canlı materyeli üzerinde, fotosentezi etkileyen faktörlerin birinin etkisini değiştirip (ışık, karbon dioksit, sıcaklık gibi) diğerlerininkinin sabit tutulması ile fotosentez hızında meydana gelen değişikliklerin incelenmesi ve bu faktörlerin etkilerinin karşılaştırılması şeklinde gösterilecektir. Araç ve Gereçler: Elodea bitkisi, beher, huni, ışık kaynağı, %4'lük potasyum bikarbonat (KHCO3), %1'lik KHCO3, termometre, ispirto ocağı, milimetrik kağıt. Uygulama: Bu deney için Elodea su bitkisi kullanılacaktır. Elodea bitkisi içi su dolu bir cam kaba alınır. Bitkinin üzeri çıkacak olan gaz kabarcıklarını toplayacak olan bir huniyle şekilde görüldüğü gibi kapatılır (Şekil 4. 5). Işık faktörünün etkisini ölçmek için önce normal ışıktaki kabarcık çıkışı tespit edilir. Bir lamba yardımıyla düzeneğe ışık verilir ve kabarcık çıkışı gözlenir. Fotosentez hızı ile aydınlatma şiddeti arasındaki ilişki grafikte gösterilir. Karbondioksit konsantrasyonunun etkisini inceleyebilmek için de başka bir kaba yine ortamı su ile hazırlanmış %4'lük KHCO3 çözeltisi konur. Yine bitki bu düzeneğin içine yerleştirilip bu konsantrasyondaki fotosentez hızı ölçülür. Aynı işlem %1'lik KHCO3 için tekrarlanır. KHCO3 konsantrasyonuna karşı kabarcık sayısındaki değişim grafiği çizilir. Sıcaklığın fotosentez üzerine etkisini ölçmek içinde aynı düzeneğin sıcaklığı ölçülür ve bu sıcaklıktaki kabarcık sayısı saptanır. Daha sonra sıcaklık ispirto ocağı yardımıyla arttırılır ve kabarcık sayısı belirlenir. Sıcaklık kabarcık çıkışı durana kadar arttırılır. Sıcaklık ile fotosentez ilişkisi bir grafikte gösterilir. Deney 5. Aerobik Solunum Bu deneyle karbonhidratların havadan alınan O2 ile CO2 ve H2 O ya kadar yıkılıp enerji açığa çıktığını göreceksiniz. Araç ve Gereçler: Çimlenmekte olan bezelye taneleri, balon joje, cam boru, beher, KOH, renkli bir sıvı. Uygulama: Bu deney için, CO2 tutma özelliğine sahip potasyum hidroksit (KOH) kristalleri pamuğa sarılarak çimlenmekte olan bezelye taneleri ile birlikte bir balon joje içine yerleştirilir. Daha sonra balon şekilde görüldüğü gibi bir ucu renkli sıvıya batırılmış kılcal boru ile birleştirilir. Bir süre sonra bezelyelerin solunum yapması sonucu O2 alınıp CO2 verilir. Dışarıya verilen bu CO2, KOH kristalleri tarafından tutulur ve azalan hacim kadar kılcal boruda sıvı yükselir. Deney 6. Anaerobik Solunum Havanın serbest oksijeni ile temas halinde olmayan bazı bitkiler, kendileri için gerekli olan enerjiyi, organik maddeleri enzimatik faaliyetlerle parçalayarak sağlarlar. Bu parçalanma sonucunda açığa çıkan gaz CO2 'tir. Araç ve Gereçler: Çimlenmekte olan nohut, deney tüpü, civa, beher. Uygulama: Çimlenmekte olan bir kaç nohut tanesini deney tüpünün içine yerleştirin. Sonra tüpü tamamıyla civa ile doldurun ve ters çevirerek yine civa dolu bir kabın içine batırın. Daha sonra cıva dolu kabın üzerine su ilave edin. Bir süre sonra tohumların anaerobik solunumu sonucu ortaya çıkan gaz tüpteki civayı aşağıya doğru ittiğini göreceksiniz (Şekil 4. 7). Bu da bize havadaki serbest oksijen yerine bitki dokularındaki bağlı oksijenin kullanıldığını gösterir. Deney 7. Fermantasyon Bazı organizmaların solunumu sonucunda substrat CO2 gibi çok basit bir ürüne kadar parçalanmaz. Solunum sonucunda daha kompleks bir madde açığa çıkar. Bu olaya fermantasyon denir. Araç ve Gereçler: %1 'lik glikoz çözeltisi, % 20 'lik Baryum hidroksit (Ba(OH)2), taze bira mayası, erlenmayer, cam boru, tıpa. Uygulama: Bir erlenin içine 200 cm3 %1 lik glikoz çözeltisi konulur. Daha sonra bu karışımın içine bir miktar taze bira mayası ilave edilir. Erlenin ağzı şekilde görüldüğü gibi cam boru takılmış tıpa ile kapatılır ve cam borunun diğer ucu yine tıpa ile kapatılmış % 20 'lik Ba(OH)2 çözeltisi içine batırılır. Ba(OH)2 içeren tüpte çökelmenin meydana gelmesi, olay sonucunda CO2 açığa çıktığını, alkol kokusu da fermentasyon sonucu alkolün meydana geldiğini gösterir Özet Doğada meydana gelen ve canlılığın ışık ile iletişim gösteren en belirgin temel olaylarından biri "fotosentez"dir. Fotosentez ışık enerjisinin biyolojik olarak kimyasal enerjiye dönüşümü olayıdır. Enerji yönünden tüm canlı organizmalar kesinlikle fotosenteze bağımlıdır, çünkü gerekli besin maddelerinin ve hatta atmosferdeki oksijenin kökeni fotosentezdir. Canlıların büyük bir çoğunluğu için oksijen, besin kadar önemlidir. Oksijen (O2) hayatsal olayların sürekliliği için gerekli olan, besinlerde depo edilmiş enerjiyi serbest hale getirir. Canlıların çoğu havadaki serbest oksijeni kullanır. Bir kısım organizmalar (bazı bir hücreliler, ilkel bitkiler, yassı ve yuvarlak parazit solucanlar) enerji elde etmek üzere çevrelerindeki eser miktarda oksijenden bile faydalanabilirler. Bu ünitede bitkilerde fotosentez olayını, fotosenteze etki eden faktörleri, oksijenli ve oksijensiz solunum olaylarını, fermantasyon olayının nasıl meydana geldiği bazı deneylerle gösterilmeye çalışılmıştır. Değerlendirme Soruları Aşağıdaki soruların yanıtlarını verilen seçenekler arasından bulunuz. 1. Fotosentez için aşağıdakilerden hangisi gerekli değildir? A. CO2 B. Işık C. Klorofil D. KOH E. H2O 2. Aşağıdaki bileşiklerden hangisi CO2 tutabilme özelliğine sahiptir? A. H2O B. KHCO3 C. BaCO3 D. NaOH E. KOH 3. Fermantasyon sonucu aşağıdaki maddelerden hangisi oluşur? A. Glikoz B. Karbonhidrat C. Alkol D. Oksijen E. Protein 4. Aerobik solunumda karbonhidratlar, aşağıdaki hangi maddenin yardımıyla en küçük yapı taşları ve enerjiye kadar parçalanırlar? A. O2 B. CO2 C. H2 O D. KOH E. NaOH 5. Aşagıdakilerden hangisi fotosentezin hızına etki etmez? A. CO2 B. Glikoz C. Sıcaklık D. Işık E. Klorofil Yararlanılan ve Başvurulabilecek Kaynaklar Ocakverdi, H., Konuk, M., (1989) Bitki Fizyolojisi Laboratuvar Kılavuzu, Selçuk Üniv. Eğitim Fak. Yay: 14, Konya. Önder, N. Yentür, S., (1991) Bitki Fizyolojisi Laboratuvar Kılavuzu, İstanbul. Üniv. Fen Fak.Yay. No: 220, İstanbul. Önder, N., (1985) Genel Bitki Fizyolojisi, İstanbul Üniv. Fen Fak. Yay. No: 189, İstanbul. Ayrıntılar ve şekiller için tıklayınız: http://www.aof.anadolu.edu.tr/kitap/IOLTP/2282/unite04.pdf

http://www.biyologlar.com/fotosentez

“Dinlerin evrimi” mi “Evrimin dini” mi?

Sık sık duyarsınız bu iki kelimeyi “Dinlerin Evrimi.” Öyle ki pekçok kaynakta neredeyse bilimsel bir gerçeklik gibi sunulur. Nedir bu “dinlerin evrimi” meselesi? 19.yüzyılıın sonundan itibaren darwinizm, büyük bir hızla kabul gördü ve biyolojiden başlayıp ekonomi, psikoloji, sosyoloji, antropoloji ve tarih gibi hemen her alanı yaygın bir biçimde etkiledi. Bu, “din” olgusuna da “dinlerin evrimi” olarak yansıdı. Böylelikle de insanlığın son derece kısa bir zamanını kapsayan yazılı tarihine ve eldeki kısıtlı arkeolojik bulgulara dayanarak, evrim fikrinin a priori kabul görüldüğü hakim materyalist bakışla “dinlerin evrimi” düşüncesi ortaya çıkmış oldu. Bu düşünceye göre insanlığın ilk dönemlerinde hiçbir dini inanç yoktu. İlk dinler ise ölülere tapınmayla başlamıştı. Bu konuda farklı görüşler de vardı, bunlardan bazılarına göre dinin kaynağı animizme (doğaya canlılık atfetme, onda ruh olduğuna inanma), bazılarına göre ise totemizme (sembol olarak seçilen bir insan, grup ya da eşyaya tapma) dayanıyordu. Bu evrim tarihi içinde de insanlık, inanç sistemleri olarak sırayla animizm, manizm, politeizm (çok tanrıcılık) aşamalarını geçmiş son olarak da monoteizme (tek tanrıcılık) demir atmıştı. Bu temelle ilişkili olarak, pozitivizmin fikir babası A. Comte’de insanlığın inanç tarihini kategorize ederken mitolojik çağ ve metafizik çağ olarak sınıflandırma yapmış, son aşama olarakta pozitivizmi öngörerek dinlerin bu yeni dönemde ortadan kalkacağını iddia etmişti. (Zaman, Comte’nin yanıldığını açıkça gösterdi, ama bu başka bir konu.) Dinlerin evrimi düşüncesini desteklemek için kullanılan bulgularla, biyolojik evrim için gösterilen bulguların kullanım mantığı arasında büyük bir benzerlik görüyoruz. Nasıl ki biyolojik evrimde canlıların yapıtaşlarındaki benzerlikler homoloji ve anoloji gibi kavramlarla “common descent”e (ortak ata) kanıt olarak gösteriliyorsa, dinlerin evrimi düşüncesinde de aradaki benzelikler evrimlerine kanıt olarak gösteriliyor. Özetle, tek tanrılı dinlerle önceki inanışların gerek bazı ritüelleri, gerek tarihsel hikayeleri, gerekse metafizik öğeleri arasındaki benzerliklerden hareketle, zaman içinde birbirlerinden evrimleştikleri öne sürülüyor. Peki bu sonuca varılmasını sağlayan nedir? Yani bu ortak noktalar birbirlerinden evrimleşmeye mi kanıttır yoksa İlahi mesajın sürekliliğine ve zamanla bozuldukça tekrarlandığına mı? Yoksa bu ortak noktalar her iki görüş için de bakılan yere göre değişen kanıt sunabilir mi? Tarih öncesi çağlara dair elimizde çok az bulgu olduğu gerçeğini de dikkate alarak şu söylenebilir; bu benzerlikler her iki düşünceyi de desteklemek için kullanılabilir. Elbetteki a priori kabullerle başlanarak. Hangi görüşü daha kuvvetli desteklediğini görmek için ise yetersiz de olsa elimizdeki bulgulara bakmalıyız. Dinlerin evrimi düşüncesi, “bilimsellik” bağlamında düşünürsek önkabullerden ve arkeolojik kanıtların bu önkabule uygun bir biçimde yorumlanmasından başka bir şey ifade etmiyor. Bu önkabul materyalizm elbette. Bu materyalist önkabulün olmadığı bir bakışla incelendiğinde ise yaklaşık bir yüzyıldır ele geçirilen antropolojik ve arkeolojik bulgular, tarih boyunca toplumlarda önce tek Tanrı inancının var olduğunu, ancak bunun zamanla bozulduğunu gösteriyor. Bazı dinler tarihi yorumcularına göre başlangıçta herşeyi yoktan var eden, herşeyi gören ve bilen, tüm alemlerin sahibi olan tek Yaratıcı’ya inanan toplumlar, zamanla Yaratıcı’nın sıfatlarını ayrı ayrı ilahlar olarak düşünme yanılgısına düşüyor ve birden fazla ilaha tapınmaya başlıyorlar. Birkaç alıntı ile eldeki bulguların ne ifade ettiğine bakalım. Stephen H. Langdon, The Scotsman adlı dergide şunları yazmış: Tüm deliller, kesinlikle başlangıçta bir “tek Tanrı” inancının bulunduğunu gösteriyor. Semitik kökenli halkların arkeolojik ve edebi kalıntıları da en eski zamanlarda bile bir “tek Tanrı” inancının var olduğunu gösteriyor. Yahudi dininin ve diğer Semitik kökenli dinlerin, totemistik, putlara dayanan bir kökeni olduğu teorisinin tamamen geçersiz olduğu bugün anlaşılmış durumda. Axel W. Persson da “Tarih Öncesi Yunan” isimli eserinde şöyle demiş: (1) İlk baştan beri var olan tek Tanrı inancı, daha sonra Yunan dinsel mitlerinde gördüğümüz sayısız önemli önemsiz tanrısal kişiliklere dönüşmüştür. Benim görüşüme göre bu birçok ilahın varlığı, tek ve bir olan bir Tanrı’yı tanımlayan değişik isimlerin zamanla değişik yorumlanmasına bağlıdır. Antropolog Sir Flinders Petrie de bu konuda şöyle diyor:(2) Eğer ruhlara tapmak tek bir İlah’a tapmaya uzanan bir evrim sürecinin ilk basamağı olsaydı, bu durumda çok tanrılılığın gittikçe tek tanrılılığa evrimleşmesinin kanıtlarını görmemiz gerekirdi… Bunun tam aksine tek görebildiğimiz, tek Tanrı inancının her zaman ilk basamak olduğudur…[….] Çok tanrı inancını ilk oluşumuna kadar izleyebildiğimiz her yerde, bunun tek Tanrı inancının bir çeşitlemesi olduğunu görüyoruz Alıntılar çoğaltılabilir. Yani bakışa göre değişir diyorum ama darwinist önkabulden sıyrılıp nesnel bir bakış yaptığımızda da “İlahi mesajın sürekliliği ve zamanla bozuldukça tekrarlandığı” yaklaşımının daha makul olduğu ve delillerle de desteklendiği görülüyor. Hele ki çıkışından 300 yıl sonra tanınamayacak hale getirilen Hristiyanlık örneği de elimizde iken bu bozulmanın mümkün olduğunu ve çeşitli öğretilerdeki sembolizmanın ifade ettiği anlamların benzerliği sebebiyle tek ilahi köken yaklaşımının çok daha makul olduğunu düşünüyorum. Tüm kadim medeniyetlerin ve toplulukların dini öğretilerinde ilahi bir öz vardır. Büyük İslam düşünürü Seyyid Hüseyin Nasr bunu “gelenek” olarak tanımlar. Bu, bizim bildiğimiz anlamda gelenek-görenek tanımlamasına giren adet, alışkanlık, düşünce ya da motiflrin kuşaktan kuşağa aktarımı değildir. Nasr bu “gelenek” ile, Vahy-i İlahi ile inen, kaynaklarında İlahi olanın özel bir tezahürü ile özdeşleşen ilkeler dizisini ve bu ilkelerin farklı zaman birimlerinde ve farklı koşullarda belli bir insan topluluğuna indirilmesini ve uygulanmasını kasteder. (3) Hulasa edersek; bu İlahi mesaj farklı zamanlarda farklı toplumlara farklı form ve sembolizma ile indirilmiş olabilir. Bir Hindunun dini ritueli, bir Brahmanın ahlakî yaklaşımı bu mesajın o toplum için sembolize edilmiş bir tezahürü olabilir. Bu konuda S.Hüseyin Nasr ve ünlü metafizikçi düşünürlerden Frithjof Schuon, Rene Guenon, A.K. Coomaraswamy gibi isimlerin eserlerine bakılabilir. Bu eserlerde İlahi mesajın insanlığın başlangıcından bu yana iletildiği zamana ve muhatap topluma göre nasıl bir sembolizmayı kullandığına, farklı farklı formlara büründüğüne ilişkin kıyaslamalara ve mesajın tekliğine ilişkin çok detaylı bilgiler var. (4) Bu yaklaşım her ne kadar bulgularla desteklense de nihayetinde a priori kabule dayanır; ve adı üstünde bu bir inançtır. Müslümanlar ya da diğer inanç sahipleri bunun bir “inanç” olduğunu kabul ederler. Bu teolojik olarak da kendi inanç sistemleri içinde tutarlı bir bakıştır. Fakat yukarıda da bahsettiğim nedenlerle dinlerin evrimi gibi bir düşünce de inançtır. Eldeki bulgular her ne kadar çoğunlukla aksini gösterse de, yine de bu düşünce lehine yorumlanabilir. Fakat bu yorum da -tıpkı İlahi köken yaklaşımında da olduğu gibi- önkabule dayanır, mevcut bilimsellik kriterlerine göre de bilimsel bir bakış değildir. O halde “dinlerin evrimi” gibi bir yaklaşımı, bilimsel gerçeklik gibi sunmaya çabalayan bazı materyalistlerin daha dikkatli konuşması gerekiyor. Notlar: (1) Tarihi Yalan:Kabataş Devri. Alıntı: Axel Persson, The Religion of Greece in Prehistoric Times, University of California Press (2) Age. Alıntı: Sir Flinders Petrie, The Religion of Ancient Egypt, Constable, London (3) İslam and The Plinght of Modern Man. S. Huseyn Nasr. (4) Bununla ilişkili bir yazım için bakınız: Kaynak: www.derindusunce.org

http://www.biyologlar.com/dinlerin-evrimi-mi-evrimin-dini-mi

Bir laboratuarda bulunması gerekli olan araç ve gereçlerin başlıcaları şunlardır

Saf su cihazıBuzdolabı –derin dondurucuMikroskopAyaklı lüpMumlu küvetParafin etüvleriSantrifüjlerTeraziHassas teraziPH metre Sıcak su banyosuIsıtma tablasıKarıştırıcıSterilizatör Ayrıca, mikrotom gibi araçlardan amaca uygun olanlar dışında beher, erlenmayer, balon, huni, petri kutusu, saat camı, büret, tüp, pipet, damlalık, lam, lamel, çeşitli boylarda cam kapaklı şişeler, boya kapları, cam baget, porselen havan v.b. gibi çeşitli cam eşyalarla enjektör, termometre, bistüri, spatula, pens, ince uçlu makas, ispirto ocağı, saplı iğne, toplu iğne, preparat kutuları, filtre kağıdı, pamuk, resim fırçası, tüp taşıyıcısı, jilet gibi çeşitli gereçler ve en çok kullanılan organik ve inorganik asitler, tuzlar, etil alkol, eter, aseton, ksilen, toluen v.b. kimyasal maddeler ve boyalar sayılabilir.

http://www.biyologlar.com/bir-laboratuarda-bulunmasi-gerekli-olan-arac-ve-gereclerin-baslicalari-sunlardir

Helmintlerde Tespit, Boyama ve Kalıcı Preparat Yapımı

Ahmet GÖKÇENHarran Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, Şanlıurfa, TürkiyeÖZET: Helmintlerin toplanma, gevşetilme, tespit, boyanma ve kalıcı preparat halinde saklama teknikleri parazitologlar için büyük önemarz eder. Parazitlerin, canlı olarak toplanmaları ve direkt tespit edilmeleri gerekir. Bu süreç, parazitlerin iç ve dış yapılarının uygun şekildekorunmalarını sağlar. Helmintlerin gevşetilmesi ve normal şekillerinin korunması için çeşitli metodlar kullanılabilir. Bu metotlarörneklerin uzun süre korunmasını sağlar. Boyama ve montaj teknikleri; örneğin türüne, büyüklüğüne ve gelişme dönemine göre değişir.Bu derlemede helmintlerin gevşetilmesi, tespiti, boyama ve kalıcı preparat haline getirilmeleri tartışılmıştır.Anahtar Sözcükler: Helmint, gevşetme, tespit, boyama, kalıcı preparat.Fixation, Staining and Preparation of Permanent Mounts of HelminthsSUMMARY: The techniques for the collection, relaxation, preservation and staining of helminths are very important for parasitologists.Parasites should be collected alive and fixed directly in the living condition. These procedures insure proper preservation of internal andexternal details of parasites. There are various methods for relaxing and preserving the normal morphology of helminths. These methodsare absolutely essential for permanent preservation of the specimens. Staining and mounting techniques vary depending upon size ofspecimens, species, and stage of development of the organisms. In this review, the preparation of permanent mounts, relaxation, fixationand staining methods of helminths has been discussed.Key Words: Helminth, relaxation, fixation, staining, permanent mountsGİRİŞHelmintlerin teşhisi değişik gelişme formlarından birinin veya yumurtalarının görülmesi ile yapılmaktadır. Büyük çoğunluğunsindirim sisteminde yerleştikleri için dışkı muayenesinin teşhiste ayrı bir önemi vardır. Dışkı muayeneleri, eğitim amacıyla öğrenci laboratuarlarında yapılabildiği gibi, hastalıkların teşhisi için hastanelerin parazitoloji laboratuarlarında da sık sık yapılmaktadır (5, 8, 9, 10).Helmintlerden kalıcı preparat hazırlanması, referans laboratuvarlarında rutin olarak yapılmaktadır. Özellikle helmint enfeksiyonlarının yaygın olduğu bölgelerde gerek doğru teşhis gereksebu alanda yeni çalışmaya başlayan teknik personel veakademisyenlerin eğitimi amacıyla koleksiyonlar oluşturulmaktadır.Çünkü incelenecek örneği her zaman ve her yerdebulmak mümkün değildir. Ayrıca öğrenci laboratuvarlarındamüfredat programına göre uygun örnekleri seçerek uygulamalıeğitim birimlerinde kullanılma kolaylığı sağlar (1).Kalıcı preparat yapmanın ön koşulu, kullanılacak helmintlerincanlı, morfolojik yapısının tam, sağlam ve konaktan elde edilmişolmasını zorunlu kılar. Yapılan koleksiyonun da kolaylıklaulaşılabilir, teşhis ve eğitim amacıyla kullanılabilir olmasıgerekir (1, 12).Gerekli laboratuar malzemeleri :1. Laboratuvar önlüğü: Çalışanların üzerlerinin kirlenmemesi, çeşitli boya ve kimyasal maddelerin elbiselerezarar vermemesi için,2. Doğal kıl ve tüylerden yapılmış değişik boyda yumuşak tüylü muhtelif fırçalar: Örneklerin temizlenmesiiçin kullanılır. Sentetik ve plastik fırçalar kullanılan bazı solüsyonlardan etkilenip bozulabilir.3. Diseksiyon seti: Sindirim sistemlerinin açılması ve büyük helmintlerin kesilip bölümlere ayrılması için kullanılır.4. Eldiven: Tek kullanımlık olanlar tercih edilir.5. Permanent kalemler: Preparatları ve saklama şişelerini işaretlemek için kullanılır.6. Boyama kapları: Kullanım amacına göre çeşitli büyüklüklerde olmalıdır.7. Plastik poşet ve torbalar: Atık malzemelerin toplanması için kullanılır.8. Kullanılacak tüm cam ve benzeri malzemelerin temiz ve kuru olması, kimyasal solüsyonların taze hazırlanmış olması, boya solüsyonlarının filtre edilmiş Makale türü/Article type: Derleme/ReviewGeliş tarihi/Submission date: 02 Kasım/02 November 2007Düzeltme tarihi/Revision date: 14 Şubat/14 February 2008Kabul tarihi/Accepted date: 06 Mart/06 March 2008Yazışma /Correspoding Author: Ahmet GökçenTel: (+90) (414) 312 84 56 Fax: (+90) (414) 314 41 58E-mail: agokcen@harran.edu.trGökçen A.178 olması ve içlerinde çökelti ve tortulaşma olmaması gerekir.9. Kaliteli ve uzun süre dayanıklı olan yapıştırıcı kullanılmalıdır. Tavsiye edilen en iyi yapıştırıcı Kanada balsamı ve Gum-damardır. Diğer yapıştırı-cılar kuruyunca veya belli süre sonra opaklaşır ya da kristalleşerek preparatın bozulmasına yol açabilir. Ayrıca hava kabarcıkları oluşturarak helmint örneğinin net görülmesine engel olabilirler (12).Örnek toplama ve preparat yapımında dikkat edilecek genel hususlar :Her hayvanda çeşitli parazit türleri bulunabilir. Ancak bir hayvandaher türden yeterli sayıda helmint olmayabilir. O zaman birkaçhayvandan toplanan türlerden preparatlar yapılabilir. Bazıhelmintler (Ascaridae’lerin çoğu, Anoplocephalidae’lerin bazılarıgibi) tek bir preparata sığmayacak kadar büyük olabilir. Böyledurumlarda morfolojik özelliklerine göre teşhise yardımcı olanbölümleri dikkate alınan helmintler, parçalar halinde ayrılarakkalıcı preparatlara monte edilebilir. Kayıt ve işaretleme işlemleridüzenli tutulmalı ve özellikle bölümlere ayrılan örneklerdekarışmaya fırsat verilmemelidir. Buna karşın nematodlarınçoğu ince bir kutikülaya sahip olduklarından boyama ve montajyapılamayabilir. Bunların tespiti, suyunun giderilmesi vemontajı çok zor olduğu için genellikle içine birkaç damla gliserinilave edilmiş %70’lik etil alkollü şişelerde saklanabilirler. Eğitimamacıyla kullanılacakları zaman bu şişelerden alınıp ya doğrudanya da laktofenolde şeffaflandırıldıktan sonra morfolojik özelliklerimikroskopta incelenebilir (12).Örnek toplama, gevşetme, tespit ve boyama işlemleri esnasındaaceleci olunmamalı, işlem aşamaları sırası atlanılmadanve belirtilen zaman süreçleri içerisinde tam olarak uygulanmalıdır.Örneğin alkol serilerinden tam geçirilmeyen ve bununsonucu tam dehidrasyonu sağlanmayan örnekler preparatlardabulanıklaşır ve boyanan materyalin tüm ayrıntıları net olarakgörülemeyebilir. Bazı helmint örnekleri çok küçük olduğu içingerek temizlerken, gerekse mikroskop altında çalışırken veyaörnekleri tespit ve boyama kaplarına naklederken örneklerzarar görüp teşhise yardımcı olan morfolojik özellikleri tahripolabilir. Bu gibi olumsuzluklara yol açmamak için nazik vekibar olunmalıdır (1, 11).Kalıcı preparat yapılacak helmintler, iç ve dış detaylarınınbozulmaması için canlı olarak toplanmalı ve derhal tespit edilmelidir.Parazit öldükten sonra vücudunda otolitik reaksiyonlarbaşlayacağından teşhis kriterleri olan bazı detaylar dadejenere olabilir. Konak hayvan ölünce ektopara-zitler konağıterk ederken endoparazitler belli bir süre sonra ölürler ve kısasüre içinde dejenere olmaya başlarlar. En iyi örnek, konakhayvan ölür ölmez ya da otopsi veya tüketim amacıyla kesilirkesilmez elde edilen canlı helmintlerdir. Cestod vetrematodlarda dejenerasyon ölümden birkaç dakika sonra başlarkennematodlarda bu süre birkaç saate kadar uzayabilir (10,12).Helmintlerin boyanarak kalıcı preparat haline getirilmeaşamaları :a. Helmintlerin konaklardan elde edilmesi,b. Helmintlerin temizlenmesi,c. Helmintlerin relaksatiyonu-gevşetilmesid. Helmintlerin fikzasyonu-tespitie. Helmintlerin boyanması ve kalıcı preparatlara monteedilmesi.a. Helmintlerin konaklardan elde edilmesi: İyi bir preparatyapımı için, örneklerin bütün ve canlı olarak elde edilmesigerekir. Örnekler yeni ölen veya otopsi için kesilen konaklardankısa sürede toplanmalıdır. Küçük hayvan-larda tüm sindirimsistemi özafagustan rectuma kadar bütün olarak açılır. Büyükhayvanlarda ise sindirim sistemi aralarına çift ligatür konulmuşbölümlere ayrılarak bir diseksiyon makası ile açılmalıdır. Mukozayayapışmış helmintleri çıkarmak için zorlamamalı, kendiliğindenayrılması için içerisine fizyolojik tuzlu su ilave edilmişbir küvete konularak, birkaç saat buzdolabında masere edilmeksuretiyle serbest kalmaları sağlanmalıdır. Cestodların skoleksleribağırsak lumanine yapışık olduğundan kıl fırça veya diseksiyoniğnesi ile çok dikkatli bir şekilde lumenden ayrılıp toplanmalarıgerekir. Çok küçük helmintleri toplamak için diseksiyonun mikroskobukullanılabilir.Canlı helmintlerin parçalanması, distorsiyonu ve iç organlarınınaçığa çıkarak zarar görmesini önlemek için; toplama,temizleme ve transfer esnasında küt makas, dişsiz pens, yumuşaktüylü fırça, puar ve pipet gibi malzemeler ile izotonik sıvılarkullanılmalıdır. Organın dokusu içerisinde bulunanhelmintleri toplamak için bu organları küçük parçalara ayırarakincelemek gerekir. Uzun süre önce ölmüş veya dondurulmuşhalde olan örnekler kalıcı preparat yapımı için uygundeğildir (9, 12).b. Helmintlerin temizlenmesi: Konak hayvanlardan dikkatlicealınıp petri kutularına nakledilen helmintler; dış yüzeyine yapışmışdışkı artıkları ve benzeri yabancı partiküllerden serumfizyolojik içinde yumuşak bir fırça yardımıyla yıkanarak temizlenir.Çok küçük örnekler stereomikroskop altında temizlenebilir.Temizlik esnasında bir kaba aşırı miktarda örnek konulmamalı vekaplar çalkalanmamalıdır (12).c. Canlı helmintlerin relaksatiyonu-gevşetilmesi:Relaksatiyon veya gevşetme, helmintlerin doğal görünümdekalmalarının yapay olarak sağlanmasını içeren bir süreçtir.Tam gevşetilmeyen helmintlerin, büzüşüp kıvrılarak bir yumakhalinde toplanmaları nedeniyle montaj esnasında teşhiseyarayan morfolojik özellikleri tahrip olabilir.Monogenea’lar narin yapılı trematodlar olup genellikle soğukkanlıhayvanların (Balık, kurbağa vb.) deri, solungaç ve burunboşluklarına çekmenleriyle tutunmuş olarak yaşarlar. Bunlarbalıkların 1/4000’lik formalin solüsyonunda 30 dakika kadarbekletilmeleri ile gevşemiş halde toplanırlar. KüçükHelmintlerde tesbit, boyama ve kalıcı preparat yapımı179trematodlar preparata yerleştirilir. Üzerine birkaç damla serumfizyolojik damlatılıp lamel kapatılır ve buzdolabında bir saatkadar bekletilerek gevşetilebilir. Çok küçük olanlarıdiseksiyon mikroskobu kullanılarak puar veya ince bir pipetyardımıyla alınıp AFA (Alkol-Formalin-Asetik asit) (*) solüsyonundasaklanırlar (3, 4, 13).Digenea’lar halk arasında kelebek olarak adlandırılan, genellikleince bağırsak, safra kesesi, safra kanalları, idrar kesesi gibi içorgan boşluklarında bulunan trematodlardır. Bunlar yerleştiğiorganların diseksiyonu ve içeriğin çeşme suyu altında yıkanmasıile toplanırlar. Tespit edilmeden su içinde uzun süre kalırlarsaosmotik şok sonucu yırtılmalara ve dejenerasyonlara maruzkalabilirler. Daha büyük trematodlar, ise serum fizyolojik içerisindebirkaç saat veya bir gece buzdolabında bekletilerek gevşetilebilirler.Bir lam boyutundan daha uzun olan örnekler birkaçkez katlanarak lam boyutuna getirilebildiği gibi deney tüpleriveya cam kavanozlar içinde ya da uzun cestodlarda olduğu gibiuygun yerlerinden kesilerek müstakil bölümler halinde gevşetilebilirler(1, 3, 4, 11, 13).Cestodlar, segmentli yapıda olup genellikle konakların sindirimsistemi lumeninde yapışma organelleri ile tutunmuş haldebulunurlar. Dış yüzeyine yapışan dışkı artıklarından bir fırçayardımıyla temizlendikten sonra, soğuk distile su, serum fizyolojikveya % 5-10’luk etil alkolden herhangi birisinde 5–15dakika bekletilerek gevşetilirler (4, 6, 9, 11).Nematodlar dışkı artıklarından temizlendikten sonra doğrudanglasiyal asetik asit içine atılıp 5–10 dakika bekletilir, daha sonrakıvrılanları uzatılarak düzeltilir ve hızlı bir şekilde % 70’lik etilalkole alınırlar. Bazı nematodlar bu esnada rupture olup parçalanabilir.Buna engel olmak için temizlenen nematodlar direktkaynama derecesindeki sıcak % 70’lik etil alkole atılıp düzeltilerekgevşetilir ve tespit edilirler. Tespitte kullanılan alkol içerisinebirkaç damla gliserin ilave edilmesi, nematodların hemyumuşak ve daha elastik kalmasını sağlar hem de alkol buharlaştığındakuruyup çatlamasını önler (6, 12).Acanthocephala’ların gevşetme ve tespiti nematodlarda olduğugibi yapılır. Ancak başlarında morfolojik teşhis kriterlerine esasolan dikencikler bulunduğu için daha fazla itina ister. Lumeneyapışmış halde bulunan proboscis kısmı çok dikkatli bir şekildekopartılmadan çıkarılmalı ve daha sonra doğrudan distile su içinealınıp 30–120 dakika kadar tutularak temizlenmelidir (1, 11).Sülükler, içerisine birkaç mentol kristali atılmış çeşme suyunaalınıp 15–60 dakika bekletilerek gevşetilirken bazen saatlercebeklemek gerekebilir. Diğer bir yöntem ise sodyum karbonatlısuda bekletme yöntemidir (1).d. Helmintlerin fikzasyonu-tespiti: Fikzasyon veya tespitdokuların canlı iken sahip olduğu özelliklerinin muhafazaedilmesini sağlayan bir süreçtir. Örneklerin uzun süre dayanıklıkalması için iyi bir şekilde tespit edilmesi gerekir. Tespitinamacı gevşetilmiş örneklerin gerçek boyutunda kalmalarınısağlamak ve bünyelerinde olabilecek metabolik ve dokusaldeğişiklikleri durdurmaktır (12).Tespit için kullanılan çeşitli metotlar vardır. En basit, kolay veucuz olanı % 5’lik sıcak formol ile tespittir. Bunun yanındaAFA fiksatifi, Gilson’un fisatifi (**) veya Shaudin’in fikzatifi(***) de kullanılabilir (1).Küçük Digenea’lar dışkı ve benzeri artıklardan temizlendiktensonra doğrudan AFA solüsyonu ile tespit edilirken, büyükolanları iki lam arasına konularak 48 saat süreyle tespit edilip% 70’lik etil alkolde uzun süre saklanabilirler (12).Cestodlar canlılık belirtileri tamamen kaybolmadan ilk 5–30dakika içinde tespit edilmelidirler. Küçük cestodlar doğrudanAFA solüsyonuna alınırken, büyük olanları morfolojik yapılarınagöre 3–4 cm uzunluğunda kesilerek, ezilip parçalanmayacakşekilde iki lam arasına sıkıştırılmalıdır. Daha sonra lamlarınyanlarına bir pipet yardımıyla tespit solüsyonu ilave edilerekcestod yüzeyleriyle teması sağlanır. Bundan sonra Digenea’lardaolduğu gibi 24–72 saat tespit solüsyonunda bekletildikten sonra %70’lik etil alkole alınarak uzun süre saklanabilirler (12).Nematodlar glasiyal asetik asitte hem tespit edilip hem desaklanabilirler. Bunun yanında direkt kaynama derecesindeki%70’lik sıcak etil alkole atılıp düzeltilerek gevşetilir ve tespitedilirler. Tespitte kullanılan alkol içerisine birkaç damla gliserinilave edilmesi, hem nematodların yumuşak ve daha elastikkalmasını sağlar hem de alkol buharlaştığında kuruyup çatlamasınıönler (1, 6, 12).Acanthocephala’lar temizlendikten sonra direkt AFA solüsyonunaalınarak tespit edilir. AFA solüsyonunda 3–7 gün tespitedildikten sonra %70’lik etil alkole alınıp uzun süre saklanabilir.İşlemler esnasında ve bu helmintleri naklederken çok dikkatliolunmalıdır. Aksi halde pens ile baş kısmından tutulursateşhiste yararlanılan baş kısmındaki dikencikler dejenere olabilir(12).Sülükler iki lam arasına sandviç gibi bağlanıp dış yüzeyindenAFA solüsyonu ile teması sağlanarak 15–30 dakikada tespit edilirler.Ya da bağlı şekilde AFA solüsyonunda 7 gün tespit edildiktensonra % 70’lik etil alkolde uzun süre saklanabilirler (1).e. Helmintlerin boyanması ve kalıcı preparata monteedilmesi: Monogenea’lar çift lamel arası gliserin jeli (****)ile preparat yapılıp lama yapıştırılmak suretiyle kalıcı preparathaline getirilirler. Şeffaf oldukları için iç organelleri kolaylıklagörülebilir ve boyanmadan kalıcı preparat yapılabilirler (12).Bunun için:1. Gevşetme ve tespiti yapılmış Monogenea’ya ait helmintbir pipet veya puar yardımıyla 22 x 22 mm veya daha büyükölçekli bir lamel üzerine yerleştirilir.2. Hava kabarcığı oluşturmadan üzerine bir damla gliserinjeli damlatılır.Gökçen A.1803. Üzerine yavaşça daha küçük bir lamel kapatılıp serin biryerde bir süre bekletilir, kenarlardan çıkan gliserin jelinfazla kısmı tıraşlanarak temizlenir.4. Bu şekilde hazırlanan örnek daha sonra bir lam üzerinemonte edilerek Kanada balsamı ile yapıştırılır. Lamamontaj esnasında küçük lamelli olan taraf alta yani lamatemas eden yüze gelmeli ve kenar boşlukları büyük lameltarafından korunmuş olmalıdır. Montaj işlemi biten preparat,37 ºC’lik etüvde bir süre kurutularak kullanıma hazırhale getirilebilir (1, 12).Digenea’ların boyanmasında Mayer’s hematoksilen, Semichon’sacetocarmine, Van Cleave’s acetocarmine veya Malzacher’s boyamasıgibi çeşitli boyama metotları kullanılabilir. Aşamaları-nınkarmaşık olmaması ve kolayca yapılabilmesi nedeniyle en çoktercih edilen Semichon’s acetocarmine (*****) boyama metodudur(10, 12).Bunun için:1. Etil alkolde saklanan örnekler direkt Semichon’s asetocarminboya solüsyonuna alınarak 2–4 saat boyanır.2. Boyanan örnekler %70’lik etil alkolde 15–30 dakikabekletilir.3. Boyanın sabitlenmesi için %70’lik asit alkolde trematodunbüyüklüğüne göre 15 saniye – 10 dakika arasında tutulur.4. Örnekler 15 saniye – 10 dakika arasında %70’lik bazikalkol ile muamele edilir.5. Önce %70’lik etil alkolde 5 dakika, sonra %95’lik etilalkolde 15–30 dakika ve daha sonra %96’lık absolüte etilalkolde her biri 15–30 dakika olmak üzere üç kez alkoldengeçirilir.6. Ksilen veya toluende her biri 10–20 dakika olmak üzereiki kez tutulur. Daha sonra iki lam arasına monte edilerekKanada balsamı veya Gum-damar ile yapıştırılır.Cestodların boyanması Digenea’lardaki gibi Semichon’sacetocarmine metoduyla yapılabilir. Bunun yanında BoraxCarmine (******) ile de boyanmaktadır. Büyük cestodlardateşhis kriterlerine esas olmak üzere morfolojik farklılık gösterenskoleks-baş bölgesi 2–3 cm aşağısındaki boyun bölümündenkesilir, 2–3 cm uzunluğunda birkaç genç halka ile birkaçolgun halka alınarak boyanıp ayrı ayrı preparatlara monteedilir. Metrelerce uzunluğundaki cestodun tamamını boyamayagerek yoktur. Tespit ve boyama esnasında çok dikkatliolmalı, birden fazla tür varsa farklı türlerin skoleks ve halkalarıbirbirine karıştırılmamalıdır (12).Borax Carmin ile boyama prosedürünün aşamaları şunlardır.1. Örnekler alkol serilerinden (%70, %80, %90 ve %96’lık)geçirilir.2. Hazırlanan Borax – Carmin solüsyonunda 15 dakikaboyanır.3. Beşer dakikalık sürelerle üç kez distile sudan geçirilir ve%70’lik etil alkol şişelerine alınır.4. Preparata monte edilerek kanada balsamı ile yapıştırılıp,37 °C’lik etüvde kurutulur.Nematodların bir kısmı toprakta serbest yaşarken, önemli birbölümü de insan ve hayvanların sindirim, kan ve lenf sistemlerindeparazit olarak yaşamaktadır (2, 3, 4, 11). Nematodların 2cm’den küçük olanları bütün halde bir preparata monte etmekiçin uygundur. Buna karşın daha büyük nematodlar morfolojikyapılarına göre teşhise yardımcı olacak bölümleri kasilerekayrı ayrı bölümler halinde monte edilmelidir. Ya da parafinlibloklarda histolojik kesitler alınarak preparatlara monte diliphematoksilen eosin ile boyanarak teşhis edilirler (12).Tespitten sonra değişik yoğunluktaki alkol serilerinden geçirilennematodlar ksilen veya toluende bekletildikten sonra boyanmadandirekt preparata monte edilebilirler. Eğer %70’liketil alkolde saklanacaklarsa içerisine %5’lik gliserol ilaveedilmesi gerekir (10, 12).Kalıcı preparat yapımında prosedür şu aşamalardan oluşur:1. Nematodlar eğer tespit edilmemişse, %70’lik etil alkolde30 dakika tespit edilir.2. Alkol serilerinden geçirilişi. %95’lik etil alkolde 30 dakika,%96’lık absolüte etil alkolde iki kez 30’ar dakika,Ksilen veya toluende önce 15, sonra 30 dakika bekletilmeli.3. Preparata montajı yapılıp üzerine lamel kapatılarak Kanadabalsamı ile yapıştırılır. Daha sonra 37 ºC’lik etüvdebirkaç hafta kurutularak kalıcı preparat haline getirilebilir.Acanthocephala’lar genellikle balık, kaplumbağa, su kuşlarınadiren insan ve evcil hayvanların ince bağırsaklarında lokalizeolurlar (4, 11, 13). Acanthocephala’lar boyalı veyanematodlarda olduğu gibi boyasız olarak mikroskopta incelenebilir.Boyama yapılacaksa; Van Cleave’s hematoxylin veyaMayer’s hematoxylin metodlarıyla ya da cestodlarda olduğugibi en çok önerilen Semichon’s acetocarmine metoduylaboyanarak kalıcı preparatları yapılabilir (10, 12).Sülükler genellikle göl, havuz, bataklık gibi durgun sularda veyayavaş akan dere, ırmak ve nehirlerde; ya balık, kaplumbağa gibikonaklara yapışmış halde ya da serbest halde bulunurlar (4). Büyüksülükler boyanmadan direkt incelenip % 70’lik etil alkolkonulmuş şişelerde boyanmadan saklanırken, küçük sülüklerDigenea’larda olduğu gibi gibi Semichon’s acetocarmine metoduylaboyanarak kalıcı preparatları yapılabilir (10, 12).Parazitlerin iç ve dış yapılarını uygun şekilde korumak içinlaboratuarlarda değişik metotlar uygulanmaktadır. Teşhis veeğitim amacıyla kullanılan ve söz konusu metotlarla elde edilenkoleksiyonlardan her zaman yararlanılabilir. Sonuç olarak,bu derlemede farklı kaynaklarda dağınık şekilde bulunanHelmintlerde tesbit, boyama ve kalıcı preparat yapımı181helmintlerdeki gevşetme, tespit, boyama ve kalıcı preparatamontaj metotlarının toplu olarak sunulması gereği vardır. Bununzaman ve emek kaybını önlemek için helmintoloji alanındayeni çalışmaya başlayanlara kolaylık sağlayacağı düşünülmektedir.Metinde geçen kimyasal bileşikler ve formülasyonları(*) AFA (Alkol-Formalin-Asetik asit) fikzatifi1. Ticari Formalin (HCHO) : 100 ml2. Etil alkol (C2H5OH, % 95’lik) : 250 ml3. Glasiyal asetik asit (CH3COOH) : 50 ml4. Gliserin (C3H5(OH)3) : 100 ml5. Distile su : 500 ml(**) Gilson’un fikzatifi1. Nitrik asit (HNO3, % 80’lik) : 15 ml2. Glasiyel asetik asit (CH3COOH) : 4 ml3. Civa klörür (HgCl2) : 20 gr4. Etil alkol (C2H5OH, % 60’lık) : 100 ml5. Distile su : 800 ml(***)Shaudin’in fikzatifi1. Civa klorür (HgCl2, Distile su ile doymuş halde) : 200 ml2. Etil alkol (C2H5OH, % 95’lik) : 100 ml3. Glasiyel asetik asit (CH3COOH) : 15 ml(****) Gliserin jeli bileşimi1. Jelatin : 10 gr2. Distile su : 60 ml3. Gliserin : 70 ml4. Fenol : 1grHazırlanışı: Kristal fenol suda çözülür ve jelâtin ilave edilir.Çözünüp homojen hale gelinceye kadar ısıtılır. Daha sonrageniş ağızlı bir cam şişeye katılıp soğutulur ve kullanılır.(*****) Semichon’s Acetocarmine (Stok solüsyonu)1. Glasiyal asetik asit (CH3COOH) : 250 ml2. Distile su : 250 ml3. Carmin : 5 gr4. Etil alkol (C2H5OH, % 70’lik) : 500 ml(******) Borax Carmine bileşimi1. Carmine : 3 gr2. Borax (Na2B4O7. 10H2O) : 4 gr3. Distile su : 100 ml4. Etil alkol (C2H5OH, % 70’lik): 100 mlHazırlanışı: Carmin ve borax distile su ile çözünene kadarkaynatılır, soğutulur ve etil alkol ilave edilerek 1–2 gün bekletildiktensonra süzgeç kâğıdından süzülerek kullanılır.KAYNAKLAR1. Anonim, 1961. Laboratory Procedures in Parasitology, TM 8–227–2. Headquarters, Washington, USA.2. Anderson RC, 1992. Nematode Parasites of Vertebrates, TheirDevelopment and Transmission, CAB Int, UK. p. 1–12.3. Dunn AM, 1978. Veterinary Helmintology, 2nd. ed., WilliamHeinemann, London. p. 295–304.4. Güralp N, 1981. Helmintoloji, Ank Ünv Vet Fak Yay No: 368Ders Kitabı: 266, İkinci baskı, Ank Ünv Basımevi, Ankara.5. Hendrix CM, 1997. Laboratory Procedures for VeterinaryTechnicians, 3rd. Ed., Mosby, Inc., USA.6. Kassai T, 1999. Veterinary Helminthology. 1st ed., Butterworth-Heinemann, Oxford. p. 181–204.7. Merdivenci A, 1967. Türkiye’nin Marmara Bölgesinde EvcilTavuk, Hindi, Ördek ve Kazlarda Görülen Trematod, Cestod veNematodlara Dair Araştırmalar, Kutulmuş Matbaası, İstanbul.8. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food (MAFF), 1971.Manuel of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques,HMSO, Technical Bulletin No:18, London.9. Pratt PW, 1997. Laboratory Precedures for VeterinaryTechnicians, 3rd. ed., Mosby Inc., Missouri.10. Sloss MW, Kemp RL, Zajak AM, 1994. Veterinary ClinicalParasitology 6th. ed., Iowa State University, Ames, Iowa.11. Soulsby EJL, 1986. Helminths, Arthropods and Protozoa ofDomesticated Animals, 7th. ed., Bailliere Tindall, London. p.763–777.12. Upton SJ, 2005. Animal Parasitology, Biology 625 LaboratoryManual, Kansas Satate University, USA.13. Urquhart GM, Armour J, Duncan JL, Dunn AM andJennings FW, 1988. Veterinary Parasitology. ELBS, LongmanUK. p. 269–279.Kaynak: Türkiye Parazitoloji Dergisi, 32 (2): 177 - 181, 2008PDF formatını buradan indirebilirsiniz.: www.tparazitolderg.org/pdf.php3?id=341

http://www.biyologlar.com/helmintlerde-tespit-boyama-ve-kalici-preparat-yapimi-1

Researchers use human stem cells to create light-sensitive retina in a dish

Researchers use human stem cells to create light-sensitive retina in a dish

Using a type of human stem cell, Johns Hopkins researchers say they have created a three-dimensional complement of human retinal tissue in the laboratory, which notably includes functioning photoreceptor cells capable of responding to light, the first step in the process of converting it into visual images.

http://www.biyologlar.com/researchers-use-human-stem-cells-to-create-light-sensitive-retina-in-a-dish

Besiyeri Hazırlanmasında Kullanılan Maddeler

Besiyeri bileşimine giren maddeler gelişme açısından; a) Gelişme için gerekli olanlar, b) inhibitörler olarak 2 gruba ayrılabilir. Gelişme için gerekli olan maddeler doğrudan mikroorganizmaların beslenme şekilleri ile ilgilidir ve bu maddeler besiyeri içinde bir anlamda zorunlu olarak bulunurlar. İnhibitörler ise gelişmesi istenmeyen mikroorganizmalar için gerektiğinde selektif besiyerlerine ilave edilirler. Besiyerlerine giren kimyasal maddeler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir.1. SuBesiyeri hazırlamada kullanılan suyun; distilasyon veya deiyonizasyon ile taze hazırlanmış olması, başta bakır olmak üzere toksik metallerden arı olması gerekir. İyon değiştirici reçineden geçirilerek elde edilen deiyonize (= demineralize) su kullanıldığında bu suyun içinde yüksek sayıda mikroorganizma bulunabileceği dikkate alınmalıdır. Destile (= Distile) su için en ideali cam sistemlerin kullanılmasıdır.Gerek deiyonize, gerek destile su eldesinde saf su sisteminin ve benzer şekilde saf suyun depolandığı kapların belirli aralıklarla temizlenmesi gerekir.Taze hazırlanmış saf suyun pH'sı 6,5-7,5 arasında olmalıdır. Depolanmış saf su atmosferik karbondioksitin absorbe edilmesi sonucu asit pH gösterir. Eğer saf suyun pH'sı 5,5'in altında ise bu su ısıtılarak CO2 uzaklaştırılır ve pH yeniden kontrol edilir. Eğer pH hala düşük ise NaOH ile saf su nötral pH 'ya getirilir ve saf su sistemi kontrol edilir. Besiyeri hazırlamada kullanılan su, asit özellik gösteriyor ise ve besiyeri bileşimde bikarbonat tamponlar varsa bunları etkileyerek hazırlanmış besiyerinde bir takım olumsuzluklara yol açabilir.2. Peptonlar"Pepton" deyimi ilk kez 1880 yılında Nageli tarafından kullanılmıştır. Nageli, kemoorganotrof mikroorganizmaların kısmen parçalanmış (hazmedilmiş = sindirilmiş = digested) protein içeren besiyerinde iyi geliştiklerini ilk açıklayan bakteriyologdur. Bugün pepton deyimi, proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel isimdir. Yaşayan tüm hücreler gibi mikroorganizmalar da azot, karbon, tuzlar ve diğer besin maddelerine gereksinirler. İstisnalar dışında mikroorganizmalar genel olarak proteini azot kaynağı olarak kullanamazlar ve azotlu bileşikleri daha kolay kullanabilecekleri protein hidrolizatlarına gerek duyarlar.Peptonlar sadece azot değil, aynı zamanda karbon kaynağı olarak da mikroorganizmalar tarafından kullanılırlar. Bunun yanında peptonların bileşiminde bulunan bazı aminoasitler ve vitaminler bazı mikroorganizmaları için gelişme faktörü olarak işlev görürler.Proteinler; kuvvetli asitler, kuvvetli alkaliler ile ya da enzimatik olarak temel bileşenleri olan peptit ve amino asitlere ayrışırlar. Bu amaçla en çok kullanılan proteolitik enzimler papain, pepsin ve pankreatin'dir.Peptonlar çeşitli ticari firmalar tarafından çeşitli hayvansal dokulardan, sütten ve soyadan farklı yöntemlerle elde edilirler ve farklı ticari isimler ile pazarlanır ve/veya dehidre besiyerleri içine ilave edilirler. Hammadde ve üretim yöntemi farklılığı doğal olarak peptonların bileşimlerinde farklılıklar oluşturur. Dolayısı ile farklı amaçlar için farklı peptonlar kullanılır.3. Ekstraktlar1. Maya EkstraktıMaya ekstraktı (maya özütü = yeast extract) otolize edilmiş (parçalanmış) bira mayasının (Saccharomyces cerevisiae) sulu ekstraksiyonu ile elde edilir. Özellikle yüksek B kompleksi vitamin konsantrasyonu nedeniyle çoğu mikroorganizmanın iyi bir şekilde gelişmesini sağlar. Bileşimindeki amino asitler, peptidler, vitaminler, karbohidratlar ve mineraller sayesinde pek çok mikrobiyolojik çalışmada kullanılır. Doğal karbohidratları nedeniyle fermentatif çalışmalarda kullanılmaz.2. Et EkstraktıEt ekstraktı (et özütü= meat extract = beef extract = lab lemco powder) genellikle yağı ve tendonları ayrılmış, ekstraksiyon öncesi hafifçe hidrolize edilmiş etten elde edilir. Karbohidrat içermez. Bu nedenle fermentasyon çalışmalarında kullanılabilir. Besiyerlerinde et peptonları yerini alabilir.3. Malt EkstraktıMalt ekstraktı (malt özütü = malt extract) biralık arpadan elde edilir. Başta maltoz olmak üzere çeşitli karbohidratların yüksek konsantrasyonuna bağlı olarak maya ve küflerin geliştirilmesi için kullanılır.4. Beyin ve Kalp EkstraktıBeyin ekstraktı (= brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) zor gelişen (= fastidious) patojen bakterilerin (streptokoklar, pneumokoklar, meningokoklar, gonokoklar vs) geliştirilmesi için besiyeri bileşimine katılır (Brain Heart Broth, Brain Hearth Infusion).5. Pirinç EkstraktıPirinç ekstraktı (rice extract), başta Candida türleri olmak üzere mayaların ayrımında kullanılan Rice Extract Agar 'ın bileşimine girer. Bu besiyerinde besin maddesi olarak sadece pirinç ekstraktı bulunur.4. Jelleştiriciler1. AgarBesiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştirici agar (= agar agar)'dır. Agar, bir poligalaktozid olup "agarophytes" olarak tanımlanan bazı kırmızı deniz yosunlarından (Gellidium, Eucheuma, Gracilaria, Acanthopeltis, Ahnfeltia, Pterocladia türleri) elde edilir. Bazı hidroksil grupları sülfürik asit ile esterifiye edilmiştir.Katılaştırma (= jelleştirme) özelliğini bileşimindeki D-galakton sağlar. Bileşiminde ayrıca inorganik tuzlar, çok az miktarda protein benzeri maddeler ve eser miktarda yağ vardır. Mikrobiyolojide kullanılan agarlar özel olarak saflaştırılırlar ve antimikrobiyel maddelerden arındırılırlar.Agarın bileşimindeki agaroz ve agaropektin adlı 2 polisakkarit agarın etkisini belirler. Agaroz, agarın yüksek jelleştirme özelliğinden sorumlu iken, agaropektin viskoz özellikler verir. Agardaki agaroz : agaropektin oranı hammaddelere göre değişmekle beraber agaroz oranı % 75'e kadar çıkabilir.Agar, besiyeri bileşimine sadece jelleştirici olarak katılır. Bir kaç istisna dışında mikroorganizmalar için agar, uzun ve dallanmış zincir yapısı nedeniyle mikroorganizmalar için besin maddesi değildir.Agar, 85 oC'da erir, 40 oC'da jelleşir. Gerek erime, gerek jelleşme sıcak-lığına ortamın pH'sı etkilidir. 5'in altındaki pH 'larda agar jelleşme özelliğini yitirir. Agarın jelleşme sıcaklığı literatürde 32-36 oC ve 32-39 oC olarak verilmektedir. Bununla beraber, petri kutularına döküm sırasında petri kutularının oda sıcaklığında (20 oC) olduğu ve dolayısıyla petri kutusu ile besiyeri arasında ısı değişimi olacağı dikkate alınarak döküm sıcaklığının 40 oC kadar olması gerekir.Agar, besiyerine amaca göre % 0,05-3 gibi geniş bir sınırda ilave edilebilir. Düşük agar konsantrasyonları (% 0,05-0,3) genellikle hareketliliğin belirlenmesi, mikroaerofillerin geliştirilmesi vb özel amaçlarla kullanılır. Standart kullanım konsantrasyonu %1-1,5'dur. Yüksek konsantrasyonlar ise yüksek asitli besiyerlerinde agarın jelleşme özelliğini göreceli olarak geri kazanması amacıyla kullanılır.2. JelatinMikrobiyolojinin gelişme yıllarında ilk kez Robert KOCH tarafından jelleştirici olarak kullanılan jelatin bu gün daha ziyade proteolitik aktivitenin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.Kollegen protein yapısında olup fermente olabilir karbohidratları içermez. Jelleştirici olarak besiyerine ilave edildiğinde jelatinin ısıya duyarlığı nedeni ile 115 oC 'da 10 dakika gibi düşük sterilizasyon normu kullanılmalıdır. Jelatin, 121 oC'da sterilizasyonda ise jelleşme özelliğini kayda değer ölçüde yitirir. Besiyeri bileşimine % 12-15 düzeyinde katılır. Yaklaşık 28 oC 'da eridiğinden jelatin kullanılan besiyerleri 28 oC 'ın altında inkübe edilmelidir.5. KarbohidratlarBazı besiyerlerinin bileşimine bakteriler için enerji ve karbon kaynağı olarak katılan karbohidratların bir başka kullanım şekli karbohidrat fermentasyonuna dayalı identifikasyon testleridir.Besiyeri bileşiminde karbon kaynağı olarak en çok kullanılan karbohidratlar glukoz, laktoz ve sakkarozdur. Bunlardan glukoz pek çok bakteri tarafından kullanılabildiği için daha çok genel besiyeri bileşimlerinde yer alır.Adonitol, arabinoz, sellobioz, sellüloz, dekstroz (= glukoz), dulsitol, galaktoz, inositol, inulin, laktoz, levuloz (= fruktoz), maltoz, mannitol, mannoz, melezitoz, mellibioz, nişasta, rafinoz, rhamnoz, sakkaroz (= sukroz), salisin, sorbitol, trehaloz, ksiloz çeşitli fermentasyon testlerinde kullanılmak üzere sıvı besiyerlerine katılabilmektedir.Glukoz, laktoz sakkaroz, mannitol gibi bazı karbohidratlar çeşitli katı besiyerlerine yine fermentasyonun izlenmesi ve buna göre koloninin ön identifikasyonunda yararlanmak amacı ile katılır.Koliform grup bakterilerin geliştirileceği besiyerlerinin hemen hepsinde C kaynağı olarak laktoz kullanılır. Koliform grubun geliştirilmesine yönelik olarak hazırlanmış besiyerlerinde laktozdan gaz oluşumu koliform grup için belirleyicidir.Nişasta, kullanımı (hidrolizi) bazı bakteriler için tipik olduğundan çeşitli özel besiyerlerinin bileşimine katılır.Karbohidratların genel olarak filitrasyon ile sterilize edilmesi önerilir. Bazı besiyerlerinin bileşimine katılan glukoz, laktoz, sakkaroz gibi bazı şekerler besiyeri ile birlikte otoklavda sterilize edilebilirler.6. TuzSodyum klorür, çoğu besiyerinin bileşimine izotonik bir ortam oluşturmak için katılır. Tuza dayanıklı bakterilerin selektif izolasyonu için yüksek konsantrasyonlarda özel besiyerlerinin bileşimine katılır.7. Tampon MaddelerMikroorganizmalar genel olarak nötr ve nötre yakın pH 'larda iyi gelişirler. Bazı mikroorganizmalar alkali pH 'ları yeğlerken (örneğin Rhizobium bakterileri) bazıları (örneğin mayalar, küfler, asidofilik bakteriler) asidik ortamları severler.Bir besiyerinde elden geldiğince çok sayıda mikroorganizma geliştirilmesi isteniyorsa pH nötre yakın değerde olmalı, tersine olarak geliştirilmesi istenen mikroorganizma yüksek asitliğe veya yüksek alkaliliğe dirençli (= rezistans) ise besiyeri pH'sı bu mikroorganizmanın gelişebileceği pH 'ya ayarlanmalıdır.Asitlik/alkalilik, besiyerlerinin selektivite kazandırılmasında çok kolay ve dolayısıyla çok yaygın olarak kullanılan bir faktördür. Örneğin maya ve küflerin, asidofilik bakterilerin geliştirileceği ortamlarda pH düşürülerek pek çok mikroorganizmanın gelişmesi kayda değer ölçüde önlenir/kısıtlanır.Metabolizmaya bağlı olarak besiyeri pH 'sında değişmeler meydana gelir. Bazı çalışmalarda inkübasyon sırasında pH 'nın değişmesi geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vereceği için istenmez. pH değişmesinin minimumda tutulması amacıyla besiyerine çeşitli tampon (buffer) maddeler ilave edilir. Tampon olarak en çok kullanılan maddeler, fosfatlar (K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, ß gliserofosfat), karbonatlar, asetatlar ve sitrat 'dır.8. İndikatörler1. pH İndikatörleriMikrobiyel metabolizma sonunda bazı besiyeri bileşenlerinden çeşitli asit veya alkali ürünler meydana gelir. PH 'daki değişme en kolay olarak pH indikatörleri ile belirlenir ve pH indikatörlerinin renk değişimine bağlı reaksiyonlar o besiyerinde gelişen mikroorganizmalar için önemli göstergelerdir.Aşağıda, besiyeri bileşiminde kullanılan çeşitli pH indikatörleri ve pH 'ya bağlı renkler verilmiştir.İndikatör Asit pH / renkAlkali pH / renkFenol blueFenol redBrom Cresol GreenBrom Cresol PurpleBrom Thymol BlueCresol RedLitmusMetil RedNeutral RedRosalic Asit 2. Redoks indikatörleriEn yaygın olarak kullanılan redoks indikatörü TTC (2,3,5 Triphenyl-tetrazolium chloride)'dir. Enterokokların selektif geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılır. Enterokoklar TTC 'yi indirgeyerek kırmızı renkli bir bileşiğe (formazon) dönüştürürler. Özel besiyerinde oluşan kırmızı renkli kolonilerin enterokok kolonileri olduğu bu şekilde anlaşılır.Resazurin, yaygın olarak kullanılan bir diğer redoks indikatörüdür.3. Diğer İndikatörlerMikrobiyel metabolizmaya bağlı olarak bazı kimyasalların çeşitli reaksiyonlar sonucu oluşturdukları ürünlerin belirlenmesi bu besiyerlerinde gelişen mikroorganizmaların ön identifikasyonunda kullanılır. Aşağıda bu tip reaksiyonlarda kullanılan indikatörlere örnekler verilmiştir.- MUG (4-Methylumbelliferyl-ß-Glucuronide): E. coli tanımında son yıllarda en yaygın olarak kullanılan bir bileşiktir. E. coli 'deki MUGase enzimi MUG 'u UV ile fluoresans veren bir bileşiğe parçalar. MUG hakkında aşağıda 7.1.1. bölümünde ayrıntılı bilgi verilmiştir.- Kan: Defibrine kan (çoğunlukla koyun kanı) hemoliz reaksiyonunun belirlenmesi için besiyeri bünyesine katılır.- Lesitin: Yumurta sarısı ve soya fasulyesinde bulunan lesitin, çeşitli bakterilerdeki lesitinaz enzim aktivitesi sonunda parçalanır ve lesitin katılmış katı besiyerinde koloni etrafında berrak zonlar görülür.- Jelatin ve kazein: Jelatin ve kazein proteolitik bakterilerin belirlenmesi amacıyla besiyeri bünyesine katılır. Proteolitik bakteri kolonileri etrafında proteoliz sonunda berrak zonlar oluşur.- Tributirin: Lipolitik aktivitenin belirlenmesi için kullanılır. Lipolitik bakteri kolonileri etrafında lipoliz sonunda berrak zonlar oluşur.9. İnhibitörlerSelektif besiyeri bileşimlerinde istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini engelleyen/baskılayan çeşitli inhibitör maddeler kullanılır.İnhibitör maddelerin etki şekilleri çok farklıdır. Etkileri, öncelikle konsantrasyonlarına bağlıdır.Bir yaklaşıma göre her maddenin yüksek konsantrasyonlarda inhibisyon etkisi vardır. Örneğin çoğu besiyerine ozmotik basınç sağlamak için katılan NaCl, yüksek konsantrasyonlarda pek çok mikroorganizmanın gelişimini engeller. Çoğu mikroorganizma için C kaynağı olarak kullanılan glukoz, % 50 konsantrasyonda ozmofilik/ozmotolerant mayaların gelişimine izin verirken, diğer mikroorganizmaların gelişimini inhibe eden bir etki yapar.Besiyerlerinde inhibitör olarak kullanılan maddeler genel ve selektif inhibitörler olarak kabaca 2'ye ayrılabilir. Genel inhibitörler daha geniş bir spektrumda istenmeyen mikroorganizma gelişimini engellerken, selektif inhibitörler belirli mikroorganizmaların gelişimini etkiler.İnhibisyon etki, yukarıda belirtildiği gibi öncelikle konsantrasyona bağlıdır. Bunun dışında mikroorganizma cinsi ve hatta türü inhibisyonda önemlidir. Belirli bir madde (örneğin tellurit) bazı bakteriler için inhibitör etki yaparken bazı bakteriler telluriti metalik telluriuma indirgerler, sonuçta gri-siyah renkli koloni oluşumu tipik bir morfolojik göstergedir.İnhibitör olarak kullanılan maddenin görevi, istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önlemek iken, kuşkusuz gelişmesi istenen mikroorganizma için inhibitör etki yapmamalıdır. Sadece belirli bir türün dışında tüm mikroorganizmaların gelişimini etkileyen inhibitör madde kullanımı oldukça nadirdir. Örneğin Malahit yeşili (Malachite Green) ve Cetrimide, Pseudomonas aeruginosa dışında, tüm refakatçi florayı inhibe eder.Besiyerinde tek bir inhibitör kullanımı yerine birden fazla inhibitör kullanmak ve/veya gelişmesi istenmeyen mikroorganizmayı kısıtlı besin maddesi bulundurmak, O/R potansiyelini değiştirmek, inkübasyon sıcaklığını ayarlamak vb yöntemlerle engellemek yaygın olarak uygulanan inhibisyon şekilleridir.İnhibitör olarak kullanılan tüm maddelerin hangi mikroorganizmalar için hangi konsantrasyonda ve hangi mekanizma ile inhibisyon etki sağladıklarını listelemek çok güçtür ve bu kitabın kapsamı dışındadır. Bununla beraber en çok kullanılan inhibitörler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir.- Boyalar: Metakrom sarısı (Metachrome Yellow) Proteus kolonilerinin yayılmasını; Eosin Y, metilen mavisi (Methylen Blue) gram pozitif bakterilerin gelişimini; malahit yeşili (Malachite green) Pseudomonas aeruginosa dışındaki refakatçi floranın gelişimini engeller/baskılar.- Sodyum Azid: Gram negatif bakterilerin gelişimini engeller.- Safra Tuzları (Bile salts, Ox bile): Gram pozitiflerin gelişimi engeller. - Antibiyotikler: Genellikle bakterileri engellemek için geniş spektrumlu olarak küf geliştirme besiyerlerinde veya refakatçi bakteriyel florayı inhibe etmek için dar spektrumlu olarak kullanılırlar.- Deoksiçolat (Deoxycholate): Gram pozitif bakterileri, kısmen koliformları ve zayıf olarak Shigella 'yı engeller.Bunların dışında selenit, tetratiyonat, bizmut, lauryl sülfat, yüksek konsantrasyonda asetat vb maddeler çeşitli besiyerlerinde inhibitör madde olarak kullanılırlar.

http://www.biyologlar.com/besiyeri-hazirlanmasinda-kullanilan-maddeler

MİKROBİYOLOJİ PREPARATLARIN HAZIRLAMASI VE İNCELENMESİ

İyi boyanmış bir  preparat usulune uygun olarak hazırlanan boya çözeltilerinin kullanılması ile mümkün olabilmektedir. İyi bir boya çözeltisi elde edebilmek için dikkat edilmesi gereken bir takım hususlar söz konusudur. 1-Toz boyayı havanda çok iyi ezmek gerekir. 2-Boya hazırlanınca renkli şişelerde ve karanlıkta saklanmalıdır. 3-Boyalar hazırlanınca en az 24 saat oda ısısında bekletilmelidir. 4-Filtreden süzülerek kullanılmalıdır. Preparatların hazırlanması: Preparatlar doğrudan hasta örneklerinden, kültürlerden ya da deney hayvanlarındaki patolojik lezyonlardan hazırlanırlar.Kültür katı veya sıvı olabilir; sıvı kültür ise tüp önce çalkalanmalı, sonra uygun temizlenmiş bir lam üzerine bakteri süspansiyonundan bir damla konulmalıdır. Katı besiyeri ise serum fizyolojik veya distile su kullanılabilir. Bakteri sıvıda homojen hale getirilir ve preparat kurumaya bırakılır. Etüvde kurutma yapılabilir. Direkt hastadan alınan örneklerde önce ekim yaptıktan sonra eğer materyal sıvı ise santrifüj edilir. Elde edilen çökeltiden preparat hazırlanır. Eğer örnek doku parçası ise preparat hazırlamak için anaerop enfeksiyon şüphesinde doku steril olarak kesilir, orta kısmından preparat hazırlanır. Aerop mikroorganizmalar için doku homojen hale getirilir. Bu steril petri kutusunda küçük küçük parçalara ayırma ile yapılabilir. Daha sonra preparat hazırlanır. Tesbit Yöntemleri: Preparatların tespit edilmesindeki amaç onların lama yapışmalarını sağlayarak tutturmaktır. Bu suretle üzerlerine uygulanacak sıvılarla lamdan ayrılmazlar. 1- Fiziksel tesbit: a)- Alevden geçirme b)- 18-24 saat oda ısısında bekletme 2- Kimyasal tesbit: Bu tespit yöntemi direkt dokudan hazırlanan preparatlarda ökaryotik hücre yapısının bozulmasını önlemek için yapılır. a)- Alkol eter karışımı b)- Metanol ile 3-5 dakika tesbit c)-Aseton: Özellikle floresan mikroskopisi için hazırlanan preparatlar asetonda 5 dakika tutularak tesbit edilirler. d)- Absolu alkol ile 8-10 dakika da tesbit yapılabilir.Ayrıca  alkol+aseton karışımı ve başka kimyasal maddelerle tesbit işlemleri yapılabilir.

http://www.biyologlar.com/mikrobiyoloji-preparatlarin-hazirlamasi-ve-incelenmesi

Sürüngen preparasyonu nasıl yapılır

SÜRÜNGENLER Sürüngenler (Reptilia), amfibilerle kuşlar arasında yer alan bir omurgalı grubudur. Kara hayatına uyum sağlamışlardır. Derileri kuru ve derilerinde salgı bezi yok denecek kadar azdır. Derilerinin üzeri keratin tabakası ile örtülüdür. Keratin tabaka vücudun değişik yerlerinde pul ve plaklar halinde yapılar oluşturur. Bu tabaka zaman zaman atılarak yenilenir. Sürüngenlerin bir kısmı 4 bacaklı, bir kısmı da bacaksızdır. Bacaklı olanlarda bile vücut yere değecek kadar alçaktır. Sürüngenlerin büyük bir kısmı karada, bazıları da suda yaşarlar. Ancak suda yaşayanlar da akciğerleri ile solunum yaparlar. Sürüngenlerde genellikle çiftleşme organı bulunur. (Tuatara hariç) Bu nedenle de döllenme içte gerçekleşir. Çoğu yumurta bırakır. Yumurtalar dayanıklı elastiki kabuklu yahut kuş yumurtası gibi kolayca kırılabılir tiptedir. Bazı sürüngen türleri canli doğurur, (ancak memelilerde olduğu gibi yavru anasına bir bağ ile bağlı değildir) gelişmelerinde de bir larva devresi bulunmaz. Yumurtadan çıkan yavrular minyatür erginlere benzerler. Sürüngenler genellikle diğer hayvanları avlayarak beslenirlerse de, bazı kara kaplumbağaları ile bazı kertenkele türlerinin esas besinlerini bitkisel maddeler teşkil eder. Derileri kuru olup,keratin pullar ve plakalarla örtülüdür.Derilerinde kuşlarda olduğu gibi çok az salgı bezi bulunur.Bunlarda kurbağalarda olduğu gibi dış kulak bulunmaz.beş parmaklı iki çift ekstremiteye sahiptirler.Bununla beraber,bazı kertenkele ve yılanlarda ön ve arka ekstremiteler kaybolmuştur.Bu yüzden bu hayvanlar yerde sürünerek hareket ederler.Sürüngenler iç organları kaburgalar tarafından korunan ilk omurgalılardır.Bunların akciğerleri ve kalpleri kurbağalardan daha gelişmiş olarak bulunur.Sürüngenlerin en önemli özelliği,kurbağalardan farklı olarak iç döllenme yapmaları ve buna uygun üreme organlarının gelişmesidir.   Sürüngenlerin yumurtası,kuşların yumurtası gibi vitellus bakımından çok zengin ve derimsi kabukludur.Yumurta içerisinde gelişen embriyoda amnion,karion,allantois ve vitellus yapıları bulunur.Bu yapılar memelilerin embriyo gelişiminde de görülür. Sürüngenler de kurbağa ve balıklarda olduğu gibi değişken sıcaklı hayvanlardır. Pental Sodyum (20 kat sulandırılmış) enjekte edilerek bayıltıldıkdan sonra dissekte edilmiş, önce göğüs ve karın boşluğundaki organlar stereomikroskop altında yüzeysel olarak incelenmiştir. Daha sonra akciğer, karaciğer ve diğer iç organlarla birlikte ince ve kalın bağırsak içinde fizyolojik su bulunan mumlu petri kutularında açılarak stereomikroskopta kontrol edilmiş, . ag – anterior genials alias perisai dagu depan f – perisai frontal in – perisai internasal l – perisai loreal la – perisai supralabial atau labial atas la' – perisai infralabial atau labial bawah m – perisai mental n – perisai nasal p – perisai parietal pf – perisai prefrontal pg – posterior genials atau perisai dagu belakang pro – perisai preokular pso – perisai presubokular pto – perisai post-okular r – perisai rostral so – perisai supraokular t – perisai temporal anterior dan posterior v – perisai ventral yang pertama (terdepan) REPTİLLER İLE AMFİBİALAR ARASINDA ÇOK FAZLA PREPARASYON FARKI YOKTUR. Bu laboratuvar çalışmamıza kadar incelediğimiz hayvan örnekleri omurgasız hayvanlar grubuna aittiler. Bu çalışmamızda ise Omurgalı hayvanlardan bir örnek inceleyeceğiz. Vertebrata'nın (omurgalılar) Amphibia (kurbağalar) klasisinin Anura (kuyruksuz kurbağalar) takımına mensup Rana ridibunda (su kurbağası) su içinde, su kenarlarında nemli yerlerde yaşar. Amfıbiler, suda yaşayan balıklar ile kara omurgalıları arasında orta bir yer işgal ederler. Tamamen karada ya da tamamen suda yaşayan formları olduğu gibi, hem karada hem de suda yaşayanları vardır. Bu ara durum ve kara hayatına geçiş ile ilgili organ sistemlerindeki değişiklikler kurbağada açıkça görülür. Kurbağanın vücudu baş ve gövde olmak üzere iki kısımdan meydana gelir. Başla gövde arasında bir sınır, farklılaşmış bir boyun bölgesi yoktur. Vücut pulsuz olup, çıplak, yumuşak ve kaygan bir deri ile örtülüdür. Deride mukus salan çok sayıda bez bulunur. Ergin hayvanda kuyruk tamamen kaybolmuştur. Gövdede iki çift ekstremite vardır. Başın önünde geniş bir ağız bulunur. Üst çenenin hemen ön tarafında bir çift dış burun deliği ve onların arkasında iki büyük göz vardır. Hareketli göz kapaklan üst, alt ve alt göz kapağının devamı gibi duran gözü yan yanya örten yan göz kapağından ibarettir. Ancak bu üçüncü göz kapağının kendi başına hareket yeteneği yoktur. Gözlerin arkasında orta kulağı örten 3-4 mm çapında yuvarlak iki kulak zan bulunur. Kurbağalarda dış kulak yoktur. Erkek kurbağalarda kulak zarının gerisinde ince bir zardan yapılmış bir çift dış ses kesesi bulunur. Erkek kurbağaların gövdeleri dişilere göre biraz daha ince uzundur. Dişilerde ise gelişmiş ovaryumlar nedeniyle gövdenin eni boyuna göre daha gelişmiştir. Bütün tetrapodlarda karada yürümeye elverişli (balıkların pektoral ve pelvik yüzgeçlerine karşılık) dört ekstremite vardır. Kurbağaların ön ekstremiteleri kısa olup, dört parmaklıdır. Birinci parmak körelmiştir. Erkek bireylerde ön ekstremitede çiftleşme mevsiminde ikinci parmağın yan tarafında büyük siyah bir şişkinlik (nasır) ortaya çıkar. Uzun olan arka ekstremiteler beş parmaklıdır. Birinci parmak en kısa, dördüncü ise en uzundur. Parmaklar arasında yüzme derisi gerilidir. Vücudun son ucunda iki arka ekstremite arasında kloak açıklığı vardır (Şekil 1). Şekil 1. Bir erkek kurbağanın dış görünüşü 1. dış burun deli ği 2. ağız 3. ön ayak 4. nasır (a) 5. yüzme perdesi 6. arka ayak 7. dış ses kesesi (a) 8. orta kulak zarı 9. göz Ağız içinde üst çenede oldukça küçük, sivri ve çok sayıda diş bulunur. Ayrıca damakta vomer dişleri vardır. Ön tarafta bulunan oval iki açıklık iç burun delikleridir. Alt çenede göze ilk çarpan yapı dildir. Dil çeneye ön taraftan tespit edilmiş olup, serbest kalan ucu çatallıdır. Dilin uzama ve kasılma yeteneği çok fazladır. Alt çenede diş yoktur. Yutağa (farinks) östaki borusu açılır. Burada bulunan glottis (küçük dil), besinlerin akciğerlere girmesine engelolur (Şekil 2). Şekil 2. Kurbağada ağızın iç yapısı ı. vomer dişleri 2. iç burun deliği 3. üst çene dişleri 4. göz çukurları 5. östaki borusu açıklıgı 6. farinks açıklıgı 7. ses kesesi açıklıgı (erkekte) 8. glottis (küçük dil) 9. dil 10. dil bağlantısı Kurbağada pleuroperitonal ( göğüs-kann ) boşlukları içinde ilk göze çarpan organ, kahve renkli ve yaprak şeklindeki loplardan yapılmış olan karaciğerlerdir. Karaciğer sağ, orta ve sol lop olmak üzere üç parçadan oluşmuştur. Orta lop sağ ve sol loptan birbirine bağlayan küçük bir parçadır ve bu yan loplar tarafından örtülmüştür. Orta lobun sol lop ile birleştiği yerde yeşil renkli yuvarlak bir safra kesesi vardır. Sol lobun altında da büyükçe bir mide yer alır. Midenin ön ucu çok kısa bir yemek borusu ile birleşir. Midenin sivri olan arka ucu ise bağırsağa açılır. Bu kısım midenin pilor bölgesidir. incebağırsak uzun ve kıvrıntılı bir boru halindedir. Mideden sonra gelen ilk kısım on iki parmak bağırsağı (duedenum) dır. İnce bağırsağın son kısmı sonbağırsak (rektum) dır. İncebağırsaktan daha geniş ve çok daha kısa olan bu kısım kloaka (dışkılık) açılır. Mide ile duedenum arasında pankreas yer alır. Kalp tam göğüs kemiğinin altındadır. Perikard boşluğu içine yerleşmiş durumdadır. Perikard boşluğu perikard zarı ile sınırlanır. Kalp iki kulakçık ve bir karıncıktan meydana gelir. Sağ kulakçığa anteriör ve posteriör vena cava (ön ve arka toplardamarlar)ların açıldığı sinüs venosus bağlanmıştır. Ventrikulustan ise truncus arteriosus 'tan ayrılan aort yaylan çıkar. Balıklara göre bu yaylarda bir azalma görülür. Yalnızca III. IV. ve VI. yaylar kalmış olup, III. den başa giden carotid 'ler, IV. den systemik yaylar (sağ ve sol aorta), VI.dan ise pulmonar arterler (akciğer atardamarları) meydana gelmiştir. Kirlenen kan pulmonar arterler ile temizlenmek üzere akciğerlere gider ve burada temizlendikten sonra tekrar kalbe döner. Böylece esas vücut dolaşımından başka bir de kalp ile akciğerler arasında küçük dolaşım meydana gelmiştir. Kurbağaların solunum organları gayet kısa bir soluk borusu ile bir çift akciğerden meydana gelir. Akciğerler gevşek bir dokudan yapılmıştır. Kirli kahve renkli iki kese şeklindedir. Sönük oldukları zaman ancak bir santimetre boyunda ve üçgen şeklindedirler. Kurbağalarda ayrıca kuvvetli bir deri solunumu vardır. Kurbağaların boşaltım organları böbrekleridir. Vücudun dorsal duvarına yakın, bir çift olarak bulunurlar. Koyu kırmızı renkli, uzunca oval yapılı, 1.5-2 cm uzunluğunda ve mezonefroz tipindedirIer. Bunların ventral yüzlerinde altın sarısı renginde ve şerit şeklinde böbrek üstü bezleri bulunur. Karın boşluğunun kuyruk ucunda ise beyaz renkli, ince duvarlı, büyük bir kese şeklinde idrar kesesi vardır. Bu kese kısa bir boyun bölgesi ile kloakın ventral duvarına açılır. Erkek kurbağalarda boşaltım organı ile üreme organları arasında sıkı bir ilişki vardır. Spermler ile boşaltım maddeleri müşterek bir kanaldan (üreter ya da wolf kanalı) dışarı atılırlar. Testisler san-beyaz renkli, yuvarlağımsı ve bir çift olarak böbreklere yakın bulunurlar. Dişilerde de bir çift ovaryum bulunur. Yumurta hücreleri ayrı bir kanalla (ovidukt) dışarı atılırlar. Bu yumurta kanalının kloaka açılan son kısım kısa bir şekilde genişlemiştir. Üreme mevsiminde içinde yumurta birikmiş durumdadır (Şekil 3). Şekil 3. Diseksiyonu yapılmış bir kurbağada içorganların görünüşü 1. alt çene 2. dil sağ atrium 4. ventrikulus 5. testis 6. böbreküstü bezi 7. böbrek 8. idrar torbası 9. sonbağırsak 10. yüzme perdesi 11. mezenter 12. incebağırsak 13. pankreas 14. mide 15. dalak 16. karaciğer 17. safra kesesi 18. akciğer 19. glottis 20. yutak 21. üst çene Kurbağaların sinir sistemleri, merkezi sinir sistemi beyin ve omurilik ile çevre sinir sistemi sinirlerden meydana gelir. Kurbağada beyin, ön, orta ve arka olmak üzere üç kısımdan meydana gelir. Ön beyinde koku alma siniri (olfaktorius sinirler)nin çıktığı iki bulbus olfaktorius lobu, iki beyin yarım küresi (cerebrum) ile diencephalon bulunur. Diensefalonun üzerinde epifiz bezi yer alır. orta beyinde ise görme sinirlerinin çıktığı optik loplar yer alır. Arka beyinde de cerebellum ve medulla oblangata yer alır, bundan sonra da omurilik uzanır (Şekil 4). Şekil 4 . Kurbağada beyin yapısı ı. olfaktorius siniri 2. olfaktorius lobu 3. cerebrum 4. göz sİniri 5. optik lop 6. kranial sinirler 7. Cerebelluın 8. krania! sinirler 9. Medulla oblangata 10. omurilik İzlenecek Yol Ø Kurbağanın iç organlarını incelemeye geçmeden önce, içinde kloroform ya da etere batırılmış pamuk bulunan bayıltma kabında kurbağayı bayıltırız. Bayılmış ve hareketsiz duruma gelmiş kurbağayı küvet üzerine alarak dıştan inceleyiniz. Dıştan görünen organ ve yapıları çizerek gösteriniz. Ø Üst çenenin alt çene ile birleştiği yerden kasları hafifçe keserek ağzı açarız. İç burun deliklerinden bir iğne sokarak dış burun deliklerine kadar uzandıklarını tespit ediniz. Dili bir pensle kaldırarak tespit edildiği yeri görünüz. Dişler, göz şişkinlikleri, farinks, glottis ve östaki borusu açıklıklarını görerek ağzın içten görünüşünün şeklini çiziniz. Ø Beyin ve omurilik hariç, kurbağanın tüm sistemleri ventral taraftan disseke edilebilir. Bu sistemleri ortaya çıkarabilmek için kurbağanın vücut boşluğunun açılması gerekir. Deri ile vücut çeperi arasında geniş lenf boşlukları olduğundan bu açılış iki safhada yapılmalıdır. Birincisi derinin kesilmesi, ikincisi ise vücut çeperinin kesilmesidir. * Bu işlemi yapmak için kurbağayı küvet üzerine sırt üstü yatırınız. Dört bacağından da toplu iğne ile küvete tespit ediniz. Bu sırada kurbağada ayılma belirtileri görürseniz, kloroformlu ya da eterli pamuğu başının üzerine koyarak iyice bayılmasını sağlayınız. Ø Arka üyelerin birleştiği yerden başlayarak göğüs kemiği hizasına kadar sadece deriyi düz bir çizgi şeklinde kesiniz. Göğüs kemiği hizasında kesitinizi iki yan tarafa doğru uzatınız. Açtığınız deriyi iki yan tarafa yatırıp iğneleyiniz. Bu durumda ventral vücut duvarını yapan kaslar ortaya çıkar. Göğüs kemiği hizasından aşağıya kadar tam orta istikamette uzanan büyük bir kan daman ile bu damarın iki yan tarafında göğüs kemiği karşısından başlayarak aşağıya giden ve tekrar yukarıya dönerek deriye yayılan bir çift kan damarı göze çarpar. Ortadaki damar vena abdominalis (karın bölgesi toplardamarı), iki yan taraftakiler vena cutenea magna dır. Ø Vena abdominalisin sağ tarafından kas tabakasını göğüs kemiği hizasına kadar kesiniz. Bundan sonra göğüs kemiği kaidesinden sağ ve sol tarafa doğru vena cutenea magnaya kadar küçük birer kesim yapınız. Bu şekilde ayırdığınız kas tabakasını sağa ve sola yatırıp iğneleyiniz. Ø Bu şekilde açılan pleuroperitonal boşluk içinde ilk göze çarpan organ karaciğerdir. Karaciğerin loplarını ayırt ediniz. Orta lobu görmek için sağ ve sol lopları yukarı kaldırarak bu parçayı ortaya çıkarınız. Bunun sol lop ile birleştiği yerde yeşil renkli, yuvarlak safra kesesi vardır. Sol lobun ön dış parçasını da kaldırarak büyükçe olan mideyi ortaya çıkarınız. Yemek borusunu ancak bütün iç organların incelenmesi bittikten sonra görebilirsiniz. Sindirim sistemine ait diğer parçaları on iki parmak bağırsağı. İncebağırsak, pankreas ve rektumu bulup inceleyiniz. Ø Kalbi iyi görebilmek için göğüs kemiğini kesiniz. Kurbağa henüz ölmemişse kalbin hareketini görebilirsiniz. Kalp tam göğüs kemiğinin altındadır. Perikard zarını sıyırarak kalbi açığa çıkarınız. Alt tarafta üçgen şeklinde ve daha açık renkte görünen kısım ventrikulustur. Daha koyu renkli iki siyah çıkıntı ise sağ ve sol atriumdur. Ventrikulus ile sağ atriumun dış taraftan sınırladığı bölgede toplu iğne başı kadar bir şişkinlik vardır. Bullıus cordİs adını alan bu bölgeden kalın bir kan damarı truncus arterİosus çıkar. Yüreği küt uçlu bir pensle yukarı doğru kaldırıp ventral tarafına bakınız. Üçgen şeklinde, ince çeperli bir bölge sinüs venosus tur. Buraya ön taraftan büyük bir damar girer. Ø Akciğerler ilk bakışta karaciğer loplarının altında olduklarından görülmezler. Karaciğer loplarını kaldırıp akciğerleri meydana çıkararak sünger görünümündeki bu yapıları inceleyiniz. Ø İç organları vücut duvarına bağlayan mezenterleri inceleyiniz. Sindirim sistemi organlarını ortaya çıkararak görebildiğiniz tüm iç organları gösteren bir şekil çizip isimlendiriniz. Ø Sindirim sistemine ait organları karın boşluğunun dışına çıkarınız. Kurbağa dişi ise bağırsakları çıkarmadan önce onların yan taraflarına taşmış ovaryumlar böbrekleri görmeyi engeller. Bunun için bir tarafın ovaryum ve yumurta kanalını kesip çıkarınız. Yedinci ile sekizinci omur hizasından arkaya doğru uzanan böbrekler birbirine çok yakın olarak dururlar. Üzerlerinde böbreküstü bezleri görülür. Böbreklerden geniş, beyaz iki kanal (üreter) kloaka doğru uzanır. Bu kanallar boşaltım maddelerini, erkeklerde ise aynı zamanda spermleri taşırlar. Ø İdrar kesesini bulunuz. Bunun üreterden ayrı olarak kloaka açıldığını görünüz. İdrar kesesi bacakların birleştiği yerde, kloakın hemen önündedir. Eğer patlamamışsa kolayca farkedilir. Patlamış durumda ise aynı bölgede bir zar halinde görebilirsiniz. Ø İçorgan1arın incelenmesi bitince beyinin diseksiyonu için hayvanın başının dorsali size dönük olacak şekilde çeviriniz. Ø Başın dorsalini kaplayan deriyi bistüri ile yüzünüz. Bunun için hayvanın kafasını sol elin baş ve işaret parmakları arasında tutunuz. Sağ elin 3.4.5. parmaklarını kurbağanın sırtına yaslayıp, bistüri bıçağı hayvanın kafatasına teğet tutmaya çalışarak dikkatli bir şekilde kesim yapınız. Bu şekilde gevşettiğiniz cranİuın (kafatası)'un tavanını yukarı doğru kaldırınız. Kurbağada taze beyin dokusu çok yumuşaktır. Bu nedenle beyini zedelememek için bistürinin kesim sırasında devamlı olarak kafatasına teğet tutulması gerekir. Kranium açıldıktan sonra ilk göze çarpan kısım optik loplardır. Diseksiyon makasının bir ucunu kraniumun bir kenanndan içeri doğru sokarak makası her defasında çok az ileri iterek bir seri küçük kesimler yapınız. Bu şekilde kafatasının yan kenarlarını keserek kafatası tavanının geri kalan kısmını temizleyiniz. Bistüri yardımıyla bu açıklığı genişleterek beyinin dorsalinin tamamının ortaya çıkmasını sağlayınız. Beyinin son kısmı meddulla oblangatayı görebilmek için kafatasının hemen arkasındaki ilk bir kaç omuru her iki yandan neural yaylannı kesip, omurların dorsal kısımlarını uzaklaştırınız. Bu durumda beyinin tamamı ve omuriliğin başlangıcı ortaya çıkmış olur. Dorsalden beynin görüntüsünü kısımlarını belirterek çiziniz. Ø Omurilikten çıkan sinirleri incelemek için tüm iç organları çıkarılmış, alt çene ve ağzın ventral kısmı kesilmiş ve iyice temizlenmiş hayvanda, omurilikten çıkan parlak beyaz renkli 10 çift sinirin ventral uzantılarının omurlar arasından çıkışını görmek mümkündür. Kaynak: biyoloji.ogu.edu.tr/gbII/rana.mht

http://www.biyologlar.com/surungen-preparasyonu-nasil-yapilir

Fosiller Nasıl Oluşur

Fosiller Nasıl Oluşur

Canlılar öldükten sonra organik-yumuşak kısımları diğer hayvanlar tarafından tüketilir veya bakteriler tarafından tahrip edilir.

http://www.biyologlar.com/fosiller-nasil-olusur

Oncogene controls stem cells in early embryonic development

Oncogene controls stem cells in early embryonic development

After a gestation period of around ten months, fawns are born in early summer - when the weather is warm and food is plentiful for the mother. Six months would actually be enough for the embryo's development, but then offspring from mating in the later portion of summer would be born in winter. Therefore, nature prolongs the gestation period by a hormone-regulated pause in the development of the early embryos. Many animal species use this process, called diapause, to adjust their reproduction to environmental conditions. In their research on embryonic stem cells, Andreas Trumpp and colleagues have now discovered the factor that controls this developmental pause. Trumpp is head of a research department at the DKFZ and of Heidelberg Institute for Stem Cell Technology and Experimental Medicine (HI-STEM), which is based at the DKFZ and supported by the Dietmar Hopp Foundation. It is known in many types of cancer that the more MYC they produce, the more aggressively the tumors grow. The scientists had noticed that MYC is also active in embryonic stem cells. In order to explore the role that the gene plays in these cells, the investigators obtained embryonic stem cells from mice whose MYC genes (c-MYC and N-MYC) they could selectively deactivate. The resulting embryonic MYC-depleted stem cells strongly reduced the activity of genes that play a role in cell division, cellular growth and metabolism. However, the dormant cells stayed alive and retained their identity as stem cells: they continued producing the important "stem cell factors" that enable them to differentiate into the more than 200 cell types of the body. Using a chemical substance that inhibits MYC, the scientists were able to show that this biochemical dormancy is reversible. When they stopped giving the inhibitor, the cells immediately resumed RNA, protein and DNA synthesis and were able to proliferate infinitely. Inhibiting MYC activity arrests embryonic development "The biochemical dormancy of MYC-depleted stem cells reminded us strongly of the process of diapause, which has remained completely elusive so far," says Roberta Scognamiglio, who is the first author of the study. "In this process, too, embryos in the early development state, called blastocysts, enter a dormant state without growth and almost without metabolism prior to nidation in the uterus." In order to find out whether these two phenomena have the same cause, the researchers compared the activity of all genes in MYC-depleted embryonic stem cells with those in diapaused mouse blastocysts. In both cases, the groups of genes that were inactive besides MYC primarily controlled protein synthesis and cell growth. The stem cell factors, however, continued to be produced unchanged. When the researchers treated normal blastocysts in the Petri dish with the MYC inhibitor, they fell into a diapause-like state. These dormant embryos were subsequently transferred into surrogate mother mice and grew to become normal young animals. "To induce diapause or to put embryonic stem cells into a dormant state, it is therefore sufficient to deactivate the MYC oncogene," Trumpp summarizes. "This does not affect the potential of stem cells. This is a very special property of stem cells, because all other cell types die after MYC inhibition." Trumpp thinks that MYC can also have a disastrous effect on cancer stem cells, particularly on dormant metastasis stem cells. When they migrate through the bloodstream to distant organs, they may come under the influence of signaling molecules that form, for example, in inflammatory processes. These might stimulate their MYC production and thus cause them to grow into metastases. "We now try blocking MYC as a strategy to control these dangerous sleepers," the stem cell researcher says. Source: German Cancer Research Center (Deutsches Krebsforschungszentrum, DKFZ) http://www.biologynews.net

http://www.biyologlar.com/oncogene-controls-stem-cells-in-early-embryonic-development

Mikrobiyal Biyoteknoloji Bölüm 4

MİKROBİYAL FİTAZLAR Tahıl ve baklagil tohumlarının olgunlaşması sırasında fitik asitin (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihidrojen fosfat) önemli bir miktarı birikmekte olup (Honke ve ark. 1998) bu tohumların çoğunda ve yan ürünlerinde %1-2 fitik asit bulunmaktadır (Reddy ve ark. 1982). Fitik asit; tahıl, baklagil ve yağlı tohumlarda fosforun ana depo formudur. Kimyasal olarak tam tarifi myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hekza-dihidrojen fosfat’tır (IUPAC-IUB 1977). Moleküler formülü ise C6H18O24P6’dır. Fitik asitin tuzları fitat olarak tanımlanır. Fitat, fitik asitin potasyum-magnezyum ve kalsiyum tuzlarının karışımıdır (Vohra ve Satyanarayana 2003) Fitaz (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase), fitik asiti (myo-inositol hekzafosfat), inorganik monofosfat, myo-inositol fosfat ve serbest myo-inositol’e hidrolize eden enzimdir (Kerovuo 2000). Bitkilerde, hayvansal dokularda ve çeşitli mikroorganizmalarda fitaz aktivitesinin olduğu bildirilmiştir (Miksch ve ark. 2002). Fitatı parçalayan enzimler IUPAC-IUB (International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry) tarafından iki sınıfa ayrılmıştır: Fitatın D3 pozisyonundaki ortofosfatı uzaklaştıran 3-fitaz (myo-inositol-hekzakisfosfat 3-fosfohidrolaz, EC 3.1.3.8) ve myo-inositol halkasındaki L-6 (D-4) pozisyonundaki defosforilasyonu sağlayan 6-fitaz (myo-inositol-hekzakisfosfat 6-fosfohidrolaz, EC 3.1.3.26). Mikrobiyal fitazlar genellikle 3-fitaz sınıfında yer alırken bitkisel kökenli fitazlar 6-fitaz sınıfında yer almaktadır (Konietzny ve Greiner 2002). Fitaz parçalayan enzimlerle yem hammaddelerinde ve insanlar için hazırlanan gıdalardaki fitat içeriğini azaltmak amacıyla özellikle son yıllarda birçok çalışma yürütülmektedir. Fitatı parçalayan enzimler bitkisel materyalin besleyici değerini artırmak amacı ile tavsiye edilmektedir. Son yıllarda fitaz enzimlerinin özellikle entansif hayvan yetiştiriciliği yapılan alanlarda hayvan gübresiyle ortaya çıkan fosfor kirliliğini azaltmak amacıyla kullanımını da gündeme getirmiştir. Yapılan bir çok çalışmada fitatı parçalayan enzimlerin fitatdan fosfor kullanımını artırmakta olduğu ve çevrede ortofosfat birikimini önemli derecede azalttığı bildirilmiştir (Cromwell ve ark. 1995, Simons ve ark. 1990). Ayrıca bunların yanı sıra myo-inositol fosfatların hazırlanması, kağıt endüstrisi ve toprak iyileştirme alanlarında da fitaz enzimi kullanılmaktadır. Ayrıca son yıllarda biyoteknoloji alanındaki gelişmeler sonucunda heterolog mikrobiyal ekspresyon sistemleriyle büyük miktarlarda ve düşük maliyetli fitaz üretimi de mümkün olabilmektedir. Fitaz enzimi bitkilerde, mikroorganizmalarda ve bazı hayvansal dokularda bulunmasına rağmen yapılan son araştırmalar mikrobiyal fitazların biyoteknolojik uygulamalar için en ümit verici olduğunu göstermiştir (Pandey ve ark. 2001, Vohra ve Satyanarayana 2003). Bakteri, maya ve funguslardan fitaz enzimleri karakterize edilmiş olup, günümüzde ticari olarak üretimde toprak fungusu olan Aspergillus üzerinde durulmaktadır. Ancak substrat spesifitesi, proteolisise karşı direnç göstermesi ve katalitik aktivitesi gibi özelliklerinden dolayı bakteriyel fitazlar, fungal enzimlere alternatif oluşturabilmektedir (Konietzyn ve Greiner 2004). Bakteriyel fitazların ortalama olarak moleküler ağırlığı (40-55 kDa) glukolizasyon farkı olduğu için fungal fitazlardan (80-120 kDa) daha küçüktür (Choi ve ark. 2001, Golovan ve ark. 2000, Han ve Lei 1999, Kerovuo ve ark. 1998, Rodriguez ve ark. 2000a, Van Hartingveldt ve ark.1993). İzole edilen fitazların çoğunun pH optimumu 4.5-6.0 arasında yer almaktadır. Ancak Bacillus sp.’ye ait nötral veya alkali fitazlar da bulunmaktadır (Choi ve ark. 2001, Kim ve ark. 1998). A. niger fitazının (phyA) pH optimumu ise asidik sınırlarda olup 2.5 ve 5.5’dir. Bu iki sınır arasında aktivitede azalma meydana gelmektedir. Mikrobiyal fitazların çoğunun sıcaklık optimumu ise 45-60°C arasında yer almaktadır. Ancak Pasamontes ve ark. (1997a,b) A. fumigatus’a ait sıcaklığa dirençli fitazın 100°C’ye kadar olan sıcaklıklarda 20 dakikalık inkübasyonlarda sadece %10’luk kayıpla aktivitesini koruduğunu bildirmişlerdir. E. coli ve Citrobacter braakii fitazı, ticari olarak kullanılan Aspergillus niger fitazına kıyasla pepsin ve pankreatine daha dirençlidir (Kim ve ark. 2003; Rodriquez ve ark. 1999). Ayrıca C. braakii fitazı tripsine de dirençlidir (Rodriquez ve ark. 1999). E. coli fitazı, Bacillus fitazı ile karşılaştırıldığında, pankreatine benzer hassasiyetlik gösterirken pepsine karşı daha hassastır (Simon ve Igbasan 2002). E. coli ve C. braakii fitazları yem katkısı olarak uygun özelliklere sahiptirler. E. coli fitazı asidik koşullar altında yüksek bir pH stabilitesine sahip olup pH 2.0’de birkaç saat sonunda bile önemli bir aktivite kaybı göstermemektedir (Greiner ve ark. 1993). Fitaz Enziminin Uygulama Alanları 1-) Yem katkısı: Fitat, tohumların çimlenmesi sırasında enerji ve fosfor kaynağı olarak görev alsa da bağlı fosfor tek mideli hayvanlarca çok az miktarda kullanılabilmektedir. Bu nedenle inorganik fosfor yenilenemez ve pahalı bir mineral olup kanatlı, domuz ve balık rasyonlarında fosfor kaynağı olarak ilave edilmektedir (Lei ve Porres 2003). Fitat ve fitata bağlı fosfor tüm kanatlı rasyonlarında bulunmakta ve fitat fosforunun da kısmen kullanıldığı bilinmekteydi (Lowe ve ark. 1939). İlk olarak Warden ve Schaible (1962), broylerde, ekzogen olarak verilen fitazın, fitat fosforunun kullanımını ve kemikteki mineralizasyonu artırdığını bildirmişlerdir. Ancak bundan yaklaşık 30 yıl sonra, yem katkısı olarak, fitata bağlı fosforu serbest bırakacak ve fosfor atığını azaltacak Aspergillus niger fitazının ticari olarak kullanımı başlamıştır. Günümüzde tek mideli hayvanlarda yem katkısı olarak fitaz kullanımı oldukça yaygınlaşmış olup hatta nişasta tabiatında olmayan polisakkaritleri parçalayan enzimlerden daha fazla kullanılmaktadır (Bedford 2003). Geçtiğimiz 10 yıl içerisinde kanatlı ve domuz rasyonlarında mikrobiyal fitaz kullanımı ile bu konudaki bilimsel çalışmalar ve deneyimler artmakta ve yem katkısı yeni fitaz enzimleri araştırılmakta ve kullanılmaktadır. Bazı kanatlı yem maddelerindeki toplam fosfor, fitat fosforu ve toplam fosfordaki fitat fosfor oranları Çizelge 2’de verilmiştir. Ruminantlar ise, rumendeki mikrobiyal flora tarafından üretilen fitaz enzimi ile fitatı parçalayabilmektedirler (Yanke ve ark. 1998). Fitatın parçalanması ile açığa çıkan fosfor hem mikrobiyal flora hem de konakçı ruminant tarafından kullanılmaktadır. Birçok farklı kaynaktan elde edilen mikrobiyal fitaz ürünleri günümüzde ticari olarak kullanılmaktadır. Bunlar arasında yem katkısı olarak en yaygın olarak kullanılanları A. niger (3-fitaz), Peniophora lycii (6-fitaz) ve Escherichia coli (6-fitaz) fitazlarıdır. Kanatlı rasyonlarına fitaz, granül veya sıvı formda veya yüksek peletleme sıcaklığındaki (>80ºC) enzim denatürasyonu probleminden kaçınmak için peletleme sonrasında uygulanabilmektedir (Selle ve Ravindran 2006). Bitkisel fosfor kaynaklarındaki kullanılmayan fitat fosforu zaman içerisinde birikmekte ve entansif olarak hayvan yetiştirciliği yapılan alanlarda çevre kirliliğine neden olmaktadır. Topraktaki aşırı fosfor deniz ve göllere akmakta ve burada yaşayan canlılarda birikerek insanlarda da nerotoksik etki oluşturmaktadır (Lei ve Porres 2003). Su ürünleri üretiminde, soya küspesi ve diğer bitki kökenli küspeler kullanılarak birçok çalışma yürütülmüştür (Mwachireya ve ark. 1999). Pahalı protein kaynakları yerine daha düşük fiyatlı bitkisel protein kaynakları kullanıldığında masraflarda önemli derecelerde azalmaların olabildiği bildirilmektedir. Balık üretim masraflarının %70’ini yem giderleri oluşturmaktadır (Rumsey 1993). Kanatlı ve domuzlarda olduğu gibi balıklarda yem maddeleri içerisindeki fitin fosforundan yararlanacak sindirim enzimine sahip olmadığından suda fosfor birikimi meydana gelmektedir. Bu nedenle fitaz su ürünleri üretmede, hem düşük fiyatlı bitkisel kökenli maddelerin kullanımını artırmak hem de suda fosforu kabul edilebilir seviyede tutabilmek amaçları ile kullanılmaktadır. Balık beslemesinde, yüksek seviyelerde bitkisel kökenli maddeler içeren yemlerde fitaz enziminin kullanılması ile ilgili birçok çalışma yürütülmektedir (Robinson ve ark. 1996, Mwachireya ve ark. 1999). 2-) Gıda sanayi: Fitik asit tuzları olarak tanımlanan fitatlar, bitki tohumları ve danelerde fosfat ve inositolün başlıca depo formudur. Fitat bitki tohumlarının olgunlaşması sırasında oluşur ve olgun tohumlarda toplam fosfatın %60-90’nını oluşturur (Loewus 2002). Fitat bu nedenle bitkisel kökenli gıdaların başlıca bileşenidir. Bazı bitkisel kökenli gıdalardaki kuru maddedeki fitat miktarı Çizelge 3’de verilmiştir. Diyetlerdeki bitki kökenli gıdaların miktarına ve gıdaların işlenme derecelerine bağlı olarak günlük fitat tüketimi en fazla 4500 mg’a kadar yükselmelidir. Ortalama olarak vejetaryen diyetlerinde ve gelişmekte olan ülkelerde kırsal kesimlerde günlük fitat tüketimi yaklaşık 2000-2600 mg olup bu değer karışık diyetlerde 150-1400 mg’dır (Reddy 2002). Diyetlerde fitatın varlığı ile ilgilenilmesinin nedeni mineral alımındaki negatif etkisidir. Bu mineraller çinko, demir, kalsiyum, magnezyum, manganez ve bakırdır (Konietzny ve Greiner 2003, Lopez ve ark. 2002). Fizyolojik pH değerlerinde çözünmez mineral-fitat komplekslerinin oluşumu düşük mineral emiliminin temel nedeni olarak bildirilmektedir. Çünkü bu kompleksler aslında insan sindirim sisteminde absorbe olmamaktadır. Ayrıca sindirim sisteminin üst kısmında sınırlı miktarda mikrobiyal popülasyonun olması ve içsel fitatı hidrolize edici enzimlerin olmaması nedenleri ile ince bağırsakta, fitat çok sınırlı miktarda hidroliz olabilmektedir (Iqbal ve ark. 1994). Fitat, asidik ve alkali pH’da proteinlerle kompleks oluşturmaktadır (Cheryan 1980). Bu interaksiyon proteinin yapısında değişiklikler meydana getirmekte ve bunun sonucunda enzimatik aktivitede, proteinin çözünürlüğünde ve proteolitik parçalanmada azalmalar meydana gelebilmektedir. Fitaz enzimi yem katkısı olarak kullanılmasının yanı sıra gıda sanayinde de büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak şimdiye kadar marketlerde fitaz enzimi kullanılmış gıdalar bulunmamaktaydı. Bu alandaki çalışmalar, gıda işlemede teknik geliştirmenin yanı sıra bitki kökenli gıdaların besleyici değerlerinin artırılması üzerine yoğunlaşmıştır. Fitat içeriği yüksek diyetler mineral maddelerin absorbsiyonunu oldukça azaltmakta (Konietzny ve Greiner 2003, Lopez ve ark. 2002) ve gıdaların işlenmeleri sırasında fitatın defosforilasyonu, sadece kısmen fosforile olmuş myo-inositol fosfat esterlerinin oluşmasına neden olmaktadır (Sandberg ve ark. 1999, Sandström ve Sandberg 1992, Han ve ark. 1994). Myo-inositol fosfat esterleri insanlar için önemli fizyolojik özelliklere sahiptir (Shears 1998). Bu nedenle fitaz enziminin gıda üretimi sırasında kullanılması ile fonksiyonel gıdaların üretilmesi mümkün olacak (Greiner ve ark. 2002) ve böylelikle fitaz enzimi ile biyokimyasal olarak aktif myo-inositol fosfat esterleri oluşacak ve insanlarda mineral maddelerin emilmesi de sağlanmış olacaktır. Gıda sanayinde gıdaların işlenmesi sırasında fitaz ilavesi ekmek yapımı (Haros ve ark. 2001), bitkisel protein izolatlarının üretimi (Fredrikson ve ark. 2001, Wang ve ark. 1999) ve tahıl kepeklerini parçalamada kullanılmaktadır (Kvist ve ark. 2005). Gıda işleme ve hazırlama sırasında, fitat genel olarak, bitkilerde ve mikroorganizmalarda doğal olarak bulunan fitazlarla tamamen hidrolize olmamaktadır. Özellikle demir olmak üzere minerallerin yararlanımını artırmak için fitat çok düşük düzeylere indirilmelidir (Hurrell 2003). Myo-İnositol fosfatların hazırlanması: Günümüzde, transmembran sinyalizasyonunda ve intraselülar kaynaklardan kalsiyumun hareketini sağlamada görev alan inositol fosfat ve fosfolipidlere olan ilginin artması, çeşitli inositol fosfatların hazırlanmasını gündeme getirmiştir (Billington 1993). S.cerevisiae fitazı kullanılarak fitik asitin enzimatik hidrolizi ile D-myo-inositol 1,2,6-trifosfat, D-myo-inositol 1,2,5-trifosfat, L-myo-inositol 1,3,4-trifosfat ve myo-inositol 1,2,3-trifosfatların hazırlandığı bildirilmiştir (Siren 1986a). Ayrıca E. coli fitazı kullanılarak inositol 1,2,3,4,5-pentakisfosfat, inositol 2,4,5-trifosfat ve inositol 2,5-bifosfat da hazırlanmaktadır (Greiner ve Konietzny 1996). İnositol fosfat türevleri enzim stabilizatörü (Siren 1986b), enzim inhibitörü, biyokimyasal ve metabolik araştırmalarda enzim substratı ve ilaç olarak da kullanılmaktadır (Laumen ve Ghisalba 1994). İnositol fosfat karışımları eklem iltihabı ve astım gibi solunum hastalıklarına karşı kullanıldığı ve spesifik inositol trifosfatların ağrı kesici olarak önerildiği de bildirilmiştir (Siren 1998). İnositol veya inositol fosfatların endüstriyel üretiminde, fitik asitten myo-inositol fosfat türevleri, serbest myo-inositoller ve inorganik fosfat eldesinde fitaz enzimi kullanımı önerilmektedir (Brocades 1991). Bu enzimatik hidrolizin avantajı fitaz enziminin spesifitesi ve reaksiyon koşullarına uygun olmasıdır. 3-) Kağıt endüstrisi: Kağıt endüstrisinde bitki fitik asitinin uzaklaştırılması oldukça önemlidir. Günümüzde termostabil fitazlar, kağıt hamuru ve kağıt yapma aşamalarında fitik asiti parçalamak amacıyla kullanılan biyolojik maddelerdir. Fitik asitin enzimatik olarak parçalanması sonucunda kanserojen veya toksik maddeler içeren ürünler oluşmaz. Bu nedenle kağıt endüstrisinde fitaz enzimlerinin kullanımı, daha temiz bir teknolojinin kullanılmış olması ve dolayısıyla çevreyi koruma açısından önem taşımaktadır (Liu ve ark. 1998). 4-) Toprak iyileştirme: Bazı alanlarda toprakta, fitik asit ve türevleri toplam organik fosforun %50’sini oluşturabilmektedir (Dalal 1978). Findenegg ve Nelemans (1993), mısır bitkisi için topraktaki fitik asitten fosforun kullanılabilmesinde fitazın etkisini araştırmışlardır. Toprağa fitaz ilave edildiğinde fitinin parçalanma oranının artmasına bağlı olarak büyümeyi uyardığını bildirmişlerdir. Bu çalışma bitkilerin köklerinde fitaz geninin ekspresyonu ile transgenik bitkilerle topraktaki fosforun kullanılabileceği düşüncesini ortaya çıkarmıştır (Day 1996). 5-) Biyoteknoloji : Geçtiğimiz 20 yıl içerisinde fitaz enzimi, besleme, çevre koruma ve biyoteknoloji alanlarındaki bilim adamlarının dikkatini çekmektedir. Fitazlar özellikle biyoteknolojik uygulamalarda (özellikle yem ve gıdalardaki fitat içeriğini azaltmada) büyük bir önem taşımaktadır (Lei ve Stahl 2001, Vohra ve Satyanarayana 2003). ANTİBİYOTİKLER Ticari olarak üretilen mikrobiyal ürünlerin içerisinde en önemlisi antibiyotiklerdir. Antibiyotikler mikroorganizmalar tarafından üretilen, diğer mikroorganizmaları öldüren veya büyümesini inhibe eden kimyasal maddelerdir. Antibiyotikler tipik sekonder metabolitlerdir. Ticari olarak faydalı antibiyotiklerin birçoğu filamentöz funguslar ile Bacteria’nın aktinomiset grubu tarafından üretilmektedir. Endüstriyel fermentasyonla büyük ölçekte üretilen en önemli antibiyotikler Çizelge1’de gösterilmiştir. Çizelge 1. Ticari olarak üretilen bazı antibiyotikler. Antibiyotik Üreten mikroorganizma* Basitrasin Sefalosporin Kloramfenikol Siklohekzimid Sikloserin Eritromisin Griseofulvin Kanamisin Linkomisin Neomisin Nistatin Penisilin Polimikzin B Streptomisin Tetrasiklin Bacillus licheniformis (EOB) Cephalosporium sp.(F) Kimyasal sentez (daha önce Streptomyces venezuela’ (A)dan mikrobiyal yolla üretilmekteydi) Streptomyces griseus (A) Streptomyces orchidaeus (A) Streptomyces erythreus (A) Penicillium griseofulvin (F) Streptomyces kanamyceticus (A) Streptomyces lincolnensis (A) Streptomyces fradiae (A) Streptomyces noursei (A) Penicillium chrysogenum (F) Bacillus polymyxa (EOB) Streptomyces griseus (A) Streptomyces rimosus (A) *EOB, endospor oluşturan bakteri; F, fungus; A, aktinomiset Günümüzde 8000’in üzerinde antibiyotik maddesi bilinmektedir ve her yıl yüzlercesi keşfedilmektedir. Daha fazla antibiyotik keşfedilmesi beklenmektedir mi, buna gerek var mıdır diye bazı sorular akla geldiğinde bunun cevabı evettir. Bu nedenle Streptomyces, Bacillus, Penicillium gibi birkaç genusa ait mikroorganizmaların çoğu antibiyotik üretip üretmedikleri açısından sürekli olarak incelenmektedir. Antibiyotikler konusunda araştırma yapan birçok araştırıcı, diğer mikroorganizma gruplarının da incelenmesi sonucunda birçok yeni antibiyotiğin keşfedileceğine inandıklarını belirtmektedir. Son yıllarda büyük ilerleme gösteren genetik mühendisliği tekniklerinin yeni antibiyotiklerin yapılmasına izin vereceği ve yeni ilaçlar için kompüter modellemesinin klasik eleme (screening) metotlarının er geç yerini alacağı düşünülmektedir. Fakat günümüzde bunlar henüz çok yaygın bir kullanıma sahip olmadığı için yeni antibiyotikler klasik yol olan “screening” yoluyla keşfedilmektedir. Screening yaklaşımında, çok sayıda muhtemelen antibiyotik üreticisi olan mikroorganizma izolatı doğadan saf kültürler halinde izole edilmektedir (Şekil 1-a) daha sonra bu izolatlar Staphylococcus aureus gibi bir test bakterisinin büyümesini inhibe eden diffüzlenebilen maddeler üretip üretmedikleri açısından test edilmektedir. Şekil 1-a’daki fotoğrafta görülen kolonilerin çoğu Streptomyces türlerine aittir ve antibiyotik üreten bazı kolonilerin etrafında indikatör organizmanın (Staphylococcus aureus) büyüyemediği inhibisyon zonları görülmektedir. Bu amaçla kullanılan test bakterileri çok çeşitli ve genellikle bakteriyal patojenlere yakın veya onları temsil eden türler olup çeşitli literatürlerde tip kültür numaralarıyla belirtilmektedir. Antibiyotik üretimi için yeni mikrobiyal izolatların test edilmesinde, “karşıt-çizgi metodu” (Şekil 1-b) yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde Streptomyces gibi potansiyel üretici olduğu bilinen bir tür petrinin üçte birlik kısmını kaplayacak şekilde bir köşesine ekilir ve petri uygun sıcaklıkta inkübe edilir. İyi bir büyüme elde edildikten sonra sıvı besi yerinde geliştirilmiş olan test bakterileri Streptomyces hücre kütlesine dikey olacak şekilde çizilerek inkübasyona bırakılır. Şekil 1-b’deki fotoğrafta da görüldüğü gibi bazı test bakterilerinin Streptomyces hücre kütlesine yakın kısımlarda büyüyemediği görülmektedir. Bu Streptomyces’in test bakterilerinin büyümesini inhibe eden bir antibiyotik ürettiğini göstermektedir. Fotoğrafta (Şekil 1-b) görülen test organizmaları (soldan sağa): Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Mycobacterium smegmatis’tir. Bu şekilde ekim yapılan izolatlardan antibiyotik üretimi belirlenenler daha sonra daha ileri denemelere alınarak antibiyotiğin yeni olup olmadığı bakımından test edilirler. Çoğu screening (eleme) programlarında elde edilen izolatların çoğu bilinen antibiyotikleri üretmektedir. Bu nedenle endüstriyel mikrobiyologların bilinen antibiyotik üreticilerini çok hızlı belirlemesi gerekmektedir böylece çalışmalarında hem zamanın hem de kaynakların boşa gitmesi önlenecektir. Bir organizmanın yeni bir antibiyotik ürettiği keşfedildiğinde bu antibiyotik yapısal analizler için yeterli miktarlarda üretilmelidir ve daha sonra enfekte olmuş hayvanlarda terapötik aktivite ve toksisite için test edilmelidir. Burada yeni antibiyotiğin selektif toksisiteye sahip olup olmadığı ortaya çıkmaktadır. Maalesef yeni bulunan antibiyotiklerin bir çoğu hayvan testlerini geçemezken sadece birkaç tanesi geçebilmektedir. Bu nedenle her yıl yüzlerce yeni antibiyotik bulunmasına karşılık bunların sadece birkaç tanesinin medikal kullanım için yararlı olduğu kanıtlanabilmekte ve ticari olarak üretilmektedir. VİTAMİNLER VE İLİŞKİLİ BİYOFAKTÖRLER Dengesiz beslenme ve besin işleme alışkanlıkları, gıda kıtlığı, açlıktan dolayı hayvan ve bitki orijinli vitaminlerden başka ekstra vitaminlere ihtiyaç duyulmaktadır. Vitaminlerin kullanım alanları gıda/yem sektörü, sağlık ve tıbbi alanlardır. Ekstra vitaminler günümüzde kimyasal veya biyoteknolojik olarak fermentasyon ya da biyodönüşüm prosesleriyle hazırlanmaktadır. Vitaminler ve diğer biyofaktörlerin çoğu kimyasal olarak veya ekstraksiyon işlemi ile üretilirken bazıları da hem kimyasal hem de mikrobiyal proseslerle üretilmektedir. Bunun yanı sıra vitamin B12 ve B13 gibi vitaminler ise sadece mikrobiyolojik yolla üretilmektedir. Aşırı miktarlarda vitamin üreten mikrobiyal suşların doğadan taranması ve bulunması veya bunların genetik mühendisliği yoluyla yapımı zordur, bunun yerine geliştirilmiş fermentasyon prosesleri ve immobilize biyokatalist biyodönüşümleri önem kazanmıştır. ENZİMLER Bütün organizmalar hücresel faaliyetlerini sürdürebilmek için küçük miktarlarda çok çeşitli enzimleri üretmektedir. Günümüze kadar tanımlanmış olan 3000’den fazla enzimin büyük bir çoğunluğu mezofilik organizmalardan izole edilmektedir. Buna karşılık bazı enzimler bazı organizmalar tarafından çok yüksek miktarlarda üretilmekte ve hücre içinde tutulmayarak hücre dışına salgılanmaktadır. Ekstraselüler enzimler olarak isimlendirilen bu enzimler selüloz, protein, nişasta, vb. gibi suda çözünmeyen polimerleri parçalama yeteneğindedir. Bu ekstraselüler enzimlerin bazıları gıda, tekstil ve ilaç endüstrilerinde kullanılmaktadır ve mikrobiyal sentez yoluyla büyük miktarlarda üretilmektedir. Son yıllarda enzim terminolojisinde ortaya çıkan yeni bir terim olan “ekstremozimler” ise ekstrem çevrelerde yaşayan prokaryotlardan elde edilen enzimleri ifade etmektedir. Ekstremozimler, ekstrem olarak yüksek sıcaklık, düşük sıcaklık, çok yüksek tuz, çok yüksek asit veya alkalin pH’larda yaşayan ve “ekstremofiller” olarak isimlendirilen mikroorganizmalar tarafından üretilmektedir. Bu enzimleri yüksek miktarlarda üreten mikrobiyal kaynakları doğadan izole etmek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır ve yeni mikrobiyal kaynakların araştırılması sürekli olarak devam eden bir iştir. Burada biyoçeşitlilik önemli bir konu olup farklı ve yabancı çevrelerden (ekstrem çevreler) izole edilen mikroorganizmalar önemli enzim kaynakları olarak düşünülmektedir. Ülkemiz en önemli ekstrem çevreler olan sıcak su kaynakları (kaplıcalar) açısından çok zengindir. Ayrıca soda gölleri, tuz gölleri, vb. ekstrem çevrelere de sahip olduğumuz göz önüne alınırsa, buralardaki biyoçeşitliliğin bir an önce belirlenerek ortaya konması ülkemiz açısından çok önemli bir konudur. Lipazlar bakteri, maya ve küfleri içeren mikrobiyal flora tarafından bol miktarda üretilmektedir. Lipazlar gıda endüstrisinde, biyomedikal uygulamalarda, biyosensörler ve pestisidlerin yapımında, deterjan ve deri sanayiinde, çevre yönetiminde, kozmetik ve parfüm sanayiinde uygulama alanları bulmaktadır. Endüstriyel olarak en yaygın kullanılan lipaz üreticisi mikroorganizmalar Candida spp., Pseudomonas spp., Rhizopus spp.’dir. Son yıllarda biyoteknoloji alanında lipazların kullanımında eksponansiyel bir artış gözlenmektedir. Bu nedenle lipazların aşırı üretimini sağlamak amacıyla yönlü mutasyonlar yardımıyla suş geliştirme çalışmalarına ağırlık verilmiştir. Endüstriyel olarak en fazla üretilen enzimlerden biri olan proteazlar ise ekmekçilikte, deterjan ve temizleme sanayiinde, biyomedikal uygulamalarda, gıda sanayiinde etlerin olgunlaştırılmasında, tabaklama sanayiinde, atık arıtımı ve kimyasal endüstride kullanılmaktadır. Son yıllarda alkalofilik mikroorganizmaların ürettiği ve aşırı alkali ortamlarda aktivite gösteren alkalin proteazlar endüstriyel olarak çok önem kazanmıştır.Şu anda alkalin proteazların ticari üretimi Bacillus licheniformis ve diğer alkalofilik Bacillus spp.’den yapılmaktadır. Bu enzimlerin üretimi için öncelikle ümit verici organizmaların seçilmesine olanak sağlayan farklı izolasyon yöntemlerinin belirlenmesi daha sonra endüstriyel suş geliştirilmesi için mutasyon ve/veya rekombinant DNA teknolojisinin kullanımı üzerinde yoğun çalışmalar sürdürülmektedir. α-amilaz, β-amilaz ve glukoamilaz gibi mikrobiyal amilazlar, enzimler arasında en önemlileri olup günümüzde biyoteknolojide oldukça büyük önem kazanmışlardır. Mikrobiyal amilazlar uygun preparasyonlarda hazırlandıktan sonra ilaç sanayiinde analitik kimya alanında, nişastanın sakkarofikasyonu, tekstil ve gıda sanayiinde, bira sanayii ve damıtma endüstrilerinde geniş bir uygulama alanına sahiptir. Hayvanlar ve bitkilerde de bulunmasına karşılık amilazlar en yaygın olarak mikroorganizmalarda bulunmaktadır. Amilazların ticari üretiminde birçok bakteri ve fungus türleri kullanılmaktadır. α-amilazın ticari üretiminde Bacillus türleri çok önemlidir. Ticari amilaz üreticisi suşların geliştirilmesinde gen klonlama yöntemleri kullanılmaktadır. Gen klonlmanın en temel amaçları; termostabil enzimlerin ifade edilmesi, yüksek enzim verimliliği ve iki enzimin aynı organizmada ifade edilmesinin sağlanmasıdır. AMİNOASİTLER Organizmaların primer metabolitleri arasında en önemlileri amino asitlerdir. 1950’lerin sonlarına doğru Corynebacterium glutamicum’un bazı suşlarının doğal olarak önemli miktarlarda L- glutamat sentezlediğinin bulunmasının ardından amino asit üreticisi mikroorganizmaların taranması ve ıslah edilmesi çalışmaları büyük hız kazanmıştır. O zamandan beri amino asit salgılama yeteneğinde olan bir çok organizma belirlenmiş ve bu konu endüstriyel mikrobiyolojinin önemli bir konusu olmuştur. Dünya çapında 1.5x106 ton amino asit üretimi gerçekleşmektedir. Amino asitler tıpta, gıda endüstrisinde katkı maddesi olarak, kimya endüstrisinde başlatıcı maddeler olarak kullanılmaktadır. En önemli ticari amino asit lezzet arttırıcı olarak monosodyum glutamat (MSG) formunda kullanılan Glutamik asittir. Diğer iki önemli amino asit diyet içecekler ve yiyeceklerde tatlandırıcı olarak kullanılan Aspartam’ın bileşenleri olan Aspartik asit ve Fenil alanindir. Bundan başka lisin, glutamin , arjinin, triptofan, treonin, izolösin ve histidin amino asitleri de ticari olarak mikrobiyolojik yolla üretilmektedir.Mikrobiyolojik üretim için Corynebacterium ve Brevibacterium türleri ile Escherichia coli en bilinen ticari türlerdir. Corynebacterium ve Brevibacterium türlerinde metabolizma nispeten basit olduğu için regülasyon sistemlerinin kolaylıkla değiştirilmesiyle, Enterobacteriaceae üyelerinde ise karmaşık rekombinant DNA tekniklerinin kullanımıyla verimli amino asit üreticileri elde edilebilmektedir. Kaynak: Doç. Dr. Rengin ELTEM /Ege Üniversitesi /Mühendislik Fakültesi Biyomühendislik Bölümü POLİMER ÜRETİMİ Modern biyoteknolojiyi komodite amaçlı ürünlerin üretiminde de kullanmak mümkündür. En çarpıcı örneklerden biri, mikroorganizmaları uygun ortamlarda besleyip polimer ürettirmektir. Birçok mikroorganizma besin kısıtlaması koşullarında, tepkisel olarak hücre içinde polimer biriktirir. (Şekil 3’de hücre içindeki beyaz dairesel şekilli olanlar). Bunlar bilimsel adıyla “polialkalonatlar”, “mikrobiyal poliesterler” dir. Polibuturat ve poli(buturat-valarat) teknolojik olarak üretilen mikrobiyal poliesterlerdir. Bunların işlenmesi biraz zor, komodite plastiklere göre biraz pahalı, ancak doğada parçalanabilen türden, dolayısıyla çevre dostu polimerlerdir. Bunlardan üretilen şampuan, parfüm, vb. şişeleri piyasaya sunulmuş durumdadır. Buradaki ilginç gelişme yine genetik modifiye mikroorganizmaların kullanımıdır. Bunlarda hücre içinde polimer birikimi kuru ağırlıkta %99’lara kadar çıkarılmıştır, dolayısıyla verim çok yüksektir. Bu yöntemle üretilen polimerlerin molekül ağırlıkları sentetik yollarla çıkılması çok yüksek değerlerdedir (20 milyon hatta daha fazla). Mikroorganizmalar ile polimer üretimi teknolojisini bitkilere de uygulamak mümkündür. Özellikle mısır’ın çok da değerli olmayan koçanında ve kabuğunda polimerler biriktirilebilir. Faj Yerdeğiştirme “phage display” Teknolojisi Alternatif yöntemlerden biri de genetik modifiye mikroorganizmaları kullanmaktır. Yaygın olarak E.Coli’nin kullanıldığı “faj yerdeğiştirme” (“phage display”) tekniği böyle bir yaklaşımdır. Burada, istenilen üretim bilgisini taşıyan DNA, B lenfositlerinden izole edilir ve bakteriye yerleştirilir. Daha sonra bakteri, filament fajlar (bir çeşit virüs) ile enfekte edilir. Fajlar, bakteri içinde, genellikle çok sayıda antibadi fragmanını da taşıyacak şekilde çoğalır. İstenilen fragmanı taşıyan fajlar, bir biyoafinite sistemi ile ayrılır ve bunlarla yine bakteriyi enfekte edilerek üretimi gerçekleştirilir. Elde edilen monoklonal antibadi fragmanları saflaştırılıp ya doğrudan yada bir antibadi gövdesine takılarak kullanılabilir. Bu teknikte kullanılan reaktörler, hibridoma teknolojisinde kullanılanlardan çok daha düşük fiyatlı ve iyi tanımlanmış klasik fermentörlerdir, dolayısıyla üretim ucuz ve kolaydır. Kaynak: www.biyomedtek.com/bmt-konular-no3.htm Hazırlayanlar: Enver Ersoy ANDEDEN&Ahmet TEZER

http://www.biyologlar.com/mikrobiyal-biyoteknoloji-bolum-4

Mantarların Boyanması

Laktofenol Pamuk Mavisi Boyama Yöntemi: (Laktik asit, kistal fenol, gliserin, saf su, pamuk mavisi): Özellikle küf tarzında üreyen mantarlardaki hif ve sporlarını incelemek amacıyla kullanılmaktadır. Pratik olarak temiz bir lam üzerine bir damla lakto fenol pamuk mavisi eriyiğinden konur. Selofan bandın yapışkan tarafı petri kutusunda üretilmiş olan mantar kolonisi üzerine temas ettirildikten sonra lamın üzerindeki lakto fenol pamuk mavisi üzerine bastırılarak, yapışkan kısmın lamın yüzeyine yapışması sağlanır. Sonra mikroskopta incelenir.Çini mürekkebi ile boyama: Özellikle kapsüllü mantarlardan Cryptococcus neoformans’ın tanısı amacıyla kullanılır.Gram Boyama: Daha çok maya formlarını gözlemek amacıyla kullanılır ve bütün mantarlar  gram pozitif boyanırlar.NaOH veya KOH preparatları ile mantar incelemesi: % 10-20 arası genel olarak  %15 oranında kullanılır. Kitin tabakasının çözülmesi ve hiflerin ortaya çıkması sağlanır. Direkt örneklerin incelenmesi amacıyla yapılır.Peryodik Asit Shift (PAS) Boyama Yöntemi: Genel olarak doku içindeki mantarların gösterilmesi amacıyla kullanılmaktadır. Mantarların polisakkaritleri boya içindeki periodat etkisiyle polialdehit oluşturmak üzere oksitlenir. Bu son ürün yine boya çözeltisi içinde bulunan bir madde ile kırmızı renkte boyanır. Bakteri DNA’sını boyamak için en fazla Fulgen Metodu kullanılır.Kuduzdaki Negri cisimciğini gözlemek için Seller Metodu kullanılır.

http://www.biyologlar.com/mantarlarin-boyanmasi

Biyolojik Mücadele

BİYOLOJİK MÜCADELE NEDİR? Zararlı böceklerin yaptığı zararları durdurmak veya azaltmak için onların doğal düşmanlarını doğada artıracak şekilde yapılan işlemlere denilmektedir. Zararlı böceklerin doğada mevcut doğal düşmanların yardımıyla ekonomik zarar düzeyinin altında tutulması işlemine biyolojik mücadele denmektedir. Biyolojik mücadelede hedef ilaçlı mücadelede olduğu gibi, zararlıları tümüyle yok etmek değildir. Biyolojik mücadelede, zararlı yoğunluğu ekonomik zarar düzeyinin altında tutulmakta, böylece söz konusu zararlıların doğal düşmanlarının doğada sürekliliğinin sağlanması hedef alınmaktadır. Doğal düşmanları üç grupta toplayabiliriz: 1) Predatör Böcekler Hayatı boyunca serbest olarak yaşayan, avını yiyerek veya vücut sıvısını emerek öldüren, çoğunlukla avından büyük boyda olan ve gelişmesini tamamlayabilmesi için birden fazla ava ihtiyacı olan organizmalardır. 2) Parazit Böcekler Yumurtasını konukçusunun içine veya üzerine bırakarak gelişmesini tamamlayıp, konukçusunu öldüren ve ergin oluncaya kadar, yalnız bir tek konukçuya ihtiyaç gösteren organizmalardır. 3) Entomopatojenler Konukçularını hastalandırarak öldüren mikroorganizmalardır. Biyolojik mücadele programlarının hazırlanabileceği bölgelerdeki kültür bitkilerindeki tüm zararlıların ve bu zararlıların doğal düşmanlarının saptanması gerekmektedir. Söz konusu doğal düşmanların birbirleriyle ilgilerinin çok iyi bilinmesi gerekir. Ayrıca bu doğal düşmanların konukçularına hangi şartlarda ne oranda etkili olduklarının da ortaya konması gerekir. Aslında biyolojik mücadele dışardan bakıldığında kimyasal ilaçlar ile yapılan mücadeleye nazaran çevreye zarar vermeyen, etkili ve kesin bir çözüm gibi görünmektedir. Fakat bahsettiğimiz konu dışarıdan görüldüğü kadar basit ve kolay bir konu değildir. Kaş yapayım derken göz çıkarma ihtimalini her an bünyesinde barındırır. Nasıl? Bir zararlıya karşı kullanacağınız predatörü iyi araştırmadan, araştırsanız dahi bir dizi deneme aşamasından geçirmeden doğaya, mücadelenin yapılacağı ortama saldığınızda sizi şu sonuçlar bekliyor olabilir: -Ortama saldığınız predatör sadece sizin zararlınızla değil de başka türlerlede besleniyor olabilir ki bu çok mühim bir durum olabilir. İlk başta zararlınıza karşı başarılı bir mücadele verirken karşısına çıkan iştah kabartıcı ve sizin için önemli, yararlı olan başka bir türe yönelerek bulunduğunuz ortamın ekolojik dengesini temelden sarsabilir. -Üreme kapasitesi çok fazla olup, yeni ortama da hızlı bir şekilde uyum sağlayıp çevresinde rekabete girdiği yerli türleri saf dışı bırakarak baskın tür haline gelebilir. Bu da ekolojiye ciddi bir darbe vurabilir. Bunun gibi ufak iki örnek bile göz önünde tutulduğunda biyolojik mücadelenin dışarıdan göründüğü gibi rahat bir şekilde başvurulabilecek bir çözüm yolu olmadığı görülebilir. Biraz da şuan Doç. Dr. Selçuk HAZIR'ın yürütücülüğünde devam ettirdiğimiz projeden bahsedeyim. Bu projede entomopatojen nematodları kullanmaktayız çeşitli tarım zararlılarına karşı. Bu zararlılardan bir kaçı; Tenebrio molitor: Un kurdu, depolanmış ürünlere zarar verir. Cossus cossus: Ağaç gövdelerinde ciddi zararlara yol açarlar. Polyphylla fullo: Manas (Kadı Lokması), bitki kökleri ve yumruları ile beslenirler. Ciddi zararlar ortaya çıkartabilirler. Nematodlar bu zararlılar ile karşılaştıklarında trake açıklığı, anüs, ağız gibi larvaların vücut boşluklarından içeriye sızıyorlar ve kendi bünyelerinde bulunan bakterileri larvaların iç kısımlarına ulaştırmış oluyorlar. Bu kısımda nematodların içindeki bakteriler dışarı çıkarak salgıladıkları enzimlerle larvaları içten çürütüyorlar. Nematodlar ölü larvanın içinde üreyerek çok gelişmiş reseptörleri sayesinde yakında bir su birikintisi(petride) algıladıklarında kadavra içinden çıkıp suya geçiyorlar. Şuan itibariyle yaptığımız deneylerde Aydın'daki topraklardan izole edilen 11 adet nematod kullandık ve bunlardan birkaçı larvalar üzerinde çok başarılı oldu. Kullandığımız nematodlar arasında Heterorhabditis bacteriophora, Steinernema weiseri ve Steinernema feltiae türleri var. Ve son bir not: Uluslararası katılımlı “Entomopatojenler ve Mikrobiyal Mücadele” sempozyumunun ikincisi Adnan Menderes Üniversitesi tarafından 24-27 Eylül 2009 tarihinde Muğla’nın Ortaca ilçesine bağlı Sarıgerme beldesinde yer alan JOY PEGASOS TROPICAL otelinde Doç. Dr. Selçuk HAZIR başkanlığında gerçekleştirilecektir. Gerekli bilgiler aşağıdaki linkten ulaşabilirsiniz:

http://www.biyologlar.com/biyolojik-mucadele-2

LABORATUVAR KULLANMA TALİMATI VE ÖĞRENCİLERİN DİKKAT ETMESİ GEREKEN KURALLAR

Laboratuarlarda yapacağınız çalışmalarda kendinizin ve arkadaşlarınızı tehlikelerden korumak için aşağıdaki prensiplere uygun olarak hareket ediniz. 1. Daima öğretmen tarafından verilen ve laboratuar kitabında yazılı olan direktiflere göre çalış, katiyen verilmemiş deneyleri sınıfın emniyeti açısından yapmaya kalkışma.2. Eğer bütün sınıfın faydalanabileceği bir çözeltiyi kullanıyorsan senin için gerekli olan miktarı aldıktan sonra gerisini arkadaşlarının da kullanabilecekleri uygun bir yere bırak. Herkesin sınıf içinde koşuşup aramak suretiyle karışıklık çıkarmasına meydan verme.3. Şişe veya kavanozdan madde alırken etiketi daima iki kere oku. Emniyet ve deneyin hatasız yapılabilmesi için bu önemli hususu aklından çıkarma.4. Kimyasal maddeleri çok temiz olmalarına dikkat et. Kullanmak için aldığın çözeltiyi kullanımdan sonra fazla olarak kalırsa kesinlikle şişeyi boşaltma öğretmeninin vereceği direktife göre hareket et. 5. Kimyasal maddelerin katiyen eline alma, metal maşa, spatül, cam veya plastik kaşık kullan.6. Çözeltiyi aldığın şişenin kapağını derhal üzerine yerleştir. Aynı şekilde diğer kimyasal maddelerinde kapaklarının açık kalmamasına dikkat et.7. Hiçbir zaman dereceli ölçü silindiri ve diğer ölçü kaplarını ısıtma.8. Kolayca yanabilen maddelerle çalışırken açık aleve yakın tutma. Çünkü bu gibi yanıcı maddelerin görünmeyen buharları çalışma masasının ötesindeki ocaklara kadar ulaşıp yangına sebep olabilir. 9. Kibrit çöpü, pamuk, süzgeç kağıdı vb. katı maddeleri kesinlikle lavabolara atma 10. Kullanılmış kapları temizle her ne suretle olursa olsun onları kirli bırakma. Ve içindeki maddelerin kuruyup yapışmasına imkan verme. Eğer temizlenecek madde renkli ise veya temizlenmesi zor ise bunu çözebilecek bir çözücü maddeyi öğretmenine sorarak al ve vereceği talimata göre kullan. Temizleme işlemi bittikten sonra kapları yerine yerleştir, deney masasını temizle diğer malzemeleri usulüne uygun olarak yerleştir.11. Tehlikeli deneyler için koruyucu gözlük ya da maske kullanmayı ihmal etme. Bu tür koruyucu maddelerin hangi deneylerde kullanılacağı öğretmeniniz tarafında size belirtilecektir.12. Değişik asitlerle çalışırken son derece dikkati daima asidi su üzerine boşaltarak seyreltme işlemini yap, asitleri lavaboya boşaltırken eğer değişik iki asit ise iyice seyrelttikten sonra boşalt ayrıca boşalttığın kabı ve lavaboyu bol su ile yıkamayı ihmal etme.13. Çalışma masasına kitap ve defter bırakma ancak müsvette kağıt ile bir kalem bulundur.14. Laboratuar çalışmasından önce yapacağın deneyi iyice oku, ilgili kısımları not tut, eğer deney esnasında bir zorlukla karşılaşırsan mutlaka öğretmenine sor.15. Güç kaynağı, voltmetre, Ampermetre, termometre ve kronometre gibi araçların kullanımdan önce ne şekilde kullanılacağı hususunda öğretmeninin yapacağı açıklamalarını dinle.16. Temiz olduğuna kanaat getirirseniz bile laboratuarda bulunan beherglas, erlenmayer, balon gibi kaplarla kesinlikle su içme.17. Laboratuarlarda her ne suretle olursa olsun hiçbir maddenin tadına bakmayın.18. Beklenmedik durumların ortaya çıkması halinde veya bir değişikliğin gözlenmesi durumunda öğretmenize mutlaka haber veriniz.19. Kendi başınıza dolaplardan malzemeyi almayınız. Öğretmenin müsaadesi dışında kullanmayınız.20. İşin bittikten sonra muslukları, elektrik düğmelerini ve tüpgaz musluklarını mutlaka kapatınız.21. Laboratuarlarda ciddi olarak çalışmak mecburiyetindesiniz. Bu nedenle arkadaşlarınızla kesinlikle el hareketleri ve benzeri şakalarda bulunmayınız.22. Sıvıların pipetle emilmesi doğru değildir. Ağıza kimyasal çözeltilerin kaçması tehlikeli olduğundan bu duruma meydan vermeyiniz.23. Piset, hortum vb. araçlarla arkadaşlarınızla su veya herhangi bir madde sıçratmayınız.24. Gerektiği kadar malzeme kullanınız. Fakat asla lüzumundan fazla malzemeyi kullanmayınız.25. Bilhassa köpüklenip taşabilme durumlarına karşı dikkatli olunuz. Öğretmenlerinizin tavsiyelerine uyunuz.26. Balon, erlenmayer, beher ve şişelerin basınca karşı dayanma direnci az olduğundan sıcakken kapak veya mantar ile kapatmayınız. Böyle durumlarda kabın bütün kaidesi soğutma esnasında çatlayıp kırılabilir.27. Su üzerinde gaz toplama ile sonuçlanan bir çok denemelerde geri emmeler alabileceğinden dikkatli ol ve içinde gaz çıkışı ile reaksiyonunun devam ettiği cam balonun çıkış borusundan ayrılmadıkça ısıtma işlemine son verme.28. Elinizde cam boruların kırılması bükülmesi gibi medenemelere kesinlikle girişmeyiniz.29. Maddelerin üzerinde yazılı olan etiketleri kesinlikle koparmayınız. Kopma ihtimali olan varsa öğretmeninize mutlaka haber veriniz.30. Metalik yapılı olan ders araçlarını nemli bırakmayınız. Bu durum onların paslanıp çürümelerine neden olabilir.31. Ders bitiminden hemen sonra laboratuarın genel temizliğini yapınız.32. Temizlik işleminden sonra gerekli havalandırma işlemini gerçekleştirerek kapı ve camları usulüne uygun olarak kapatınız.  Laboratuvarda Çalışma Prensipleri 01. İdari bölüm, fiziksel, kimyasal ve mikrobiyoloji analiz laboratuvar bölümleri ayrı  birimler halinde planlanmalıdır. Laboratuvarlar yapılan analizin özelliğine uygun bir şekilde planlanmalı ve çalışmalıdır. 03. Personel için yeteri kadar soyunma dolabı bulundurulmalı, kadın ve erkek personel için soyunma odaları ve sosyal alan düşünülmelidir. Laboratuvara çanta, palto, hırka, mont ve gereksiz malzeme getirilmemelidir. 04. Laboratuvarlar özel çevre koşulları gerektiren analizlerde bu koşulları kontrol etmeye yarayan alet ­ ekipmanlarla donatılmış olarak ayrı bölümler halinde planlanmalıdır. 05. Laboratuvarlar toz, nem, buhar, titreşim, elektromanyetik etkenler ve zararlı canlılar gibi olumsuz etmenlerden korunmalıdır. Çalışma alanları 20ºC sıcaklıkta sabit tutulmalıdır. 06. Analiz yapılan bölümler, çalışan personelin rahatça hareket etmesine olanak sağlayacak genişlikte planlanmalıdır. 07. Boru sistemleri, radyatörler, aydınlatma sistem ve bağlantıları ile diğer servis noktaları kolay temizlenecek biçimde tasarlanmalı, duvarlar, taban ve tavanlarkolay temizlenir ve gerektiğinde dezenfekte edilir özellikte olmalıdır. 08. Aydınlatma, ısıtma ve havalandırma sistemleri yapılacak analizleri doğrudan veya dolaylı olarak etkilemeyecek nitelikte olmalıdır. 09. Laboratuvarda ilk yardım için gerekli ilaç ve malzeme bulunan bir dolap ve ilk yardım talimatı bulunmalıdır. 10. Laboratuvarda yangına karşı gerekli önlemler alınmalı, bu konuda mutlaka itfaiyeden uygunluk belgesi alınmalıdır. 11. Laboratuvar binasının çevresinde kirliliğe yol açacak çöp, atık yığınları, su birikintisi ve zararlı canlıların yerleşmesine uygun ortamlar bulunmamalıdır. 12. Personelin iş güvenliği için uygun giysi ve donanım kullanması sağlanmalıdır. Laboratuvarda mutlaka laboratuvar önlüğü ile çalışılmalıdır. Laboratuvar önlüğü tercihan yanmayan kumaştan, normal uzunlukta ve uygun bedende olmalıdır. 13.Uzun saçlar toplanmalı, ya topuz yapılmalı veya yanmaz bone içine alınmalıdır. Ayakkabılar laboratuvarda çalışmaya uygun olmalı, burnu açık ayakkabı giyilmemelidir. Tuvaletler laboratuvar bölümlerine açılmamalıdır. 14. Laboratuvarda herhangi birşey yenilip içilmemeli (özellikle sigara), çalışırken eller yüze sürülmemeli, ağıza herhangi birşey alınmamalıdır. 15. Laboratuvarın her bölümünde temizlik, sanitasyon dezenfeksiyon işlemleri yazılı talimatlara göre periyodik olarak yapılmalı, kayıtları tutulmalıdır. 16. Çalışan personelin periyodik sağlık kontrolleri yapılmalı, bulaşıcı bir hastalığı olan veya taşıyıcı olduğu belirlenen personel çalıştırılmamalıdır. 17. Kullanıldıktan sonra her bir eşya, alet veya cihaz belli ve yöntemine uygun biçimde temizlenerek yerlerine kaldırılmalıdır. 18. Laboratuvarların giriş ­ çıkışı denetlenmeli ve analiz yapılan bölümlere çalışanlar dışında kişilerin girmeleri engellenmelidir. 19. Laboratuvarın faaliyet gösterdiği konulara göre ortaya çıkan atıklar doğrudan alıcı ortama verilmemeli, tekniğine ve mevzuata uygun bir biçimde etkisiz hale getirilmelidir. 20. Atılacak katı maddeler çöp kutusuna atılmalıdır. İşi bitmiş, içinde sıvı bulunan beher, erlenmayer, tüp gibi temizlenecek cam kaplar da lavaboya konulmalı, masa üzerinde bırakılmamalıdır. 21. Su, gaz muslukları ve elektrik düğmeleri, çalışılmadığı hallerde kapatılmalıdır. Malzemeler kendi malınızmış gibi kullanılmalıdır. 22. Çalışmalarda dikkat ve itina ön planda tutulmalıdır. 23. Laboratuvarda başkalarının da çalıştığı düşünülerek gürültü yapılmamalıdır. Asla şaka yapılmamalıdır. 24. Laboratuvarda meydana gelen her türlü olay, laboratuvarı yönetenlere anında haber verilmelidir. 25. Laboratuvarı yönetenlerin izni olmadan hiçbir madde ve malzeme laboratuvardan dışarı çıkarılmamalıdır. 26. Katı haldeki maddeler şişelerden daima temiz bir spatül veya kaşıkla alınmalıdır. Aynı kaşık temizlenmeden başka bir madde içine sokulmamalıdır. Şişe kapakları hiçbir zaman alt tarafları ile masa üzerine konulmamalıdır. Aksi taktirde, kapak yabancı maddelerle kirleneceği için tekrar şişeye yerleştirilince bu yabancı maddeler şişe içindeki saf madde veya çözelti ile temas edip, onu bozabilir. 27. Cam kapaklı şişeler açılmazlarsa, böyle hallerde şişe kapağına bir tahta parçası ile hafifçe vurularak gevşetilir. Bu fayda etmediği taktirde camın genişlemesi için küçük bir alevle şişe döndürülerek boğazı dikkatlice ısıtılır veya şişe bir müddet su içinde batırılmış vaziyette bırakılır. Kapaklı ve tıpa ile kapatılmış kaplardaki madde kesinlikle ısıtılmamalı, üzerinde ateşe dayanıklı işareti taşımayan kaplarda ısıtma ve kaynatma yapılmamalıdır. 28. Şişelerden sıvı akıtılırken etiket tarafı yukarı gelecek şekilde tutulmalıdır. Aksi halde şişenin ağzından akan damlalar etiketi ve üzerindeki yazıyı bozar. Şişenin ağzında kalan son damlaların da şişenin kendi kapağı ile silinmesi en uygun şekildir. 29. Kimyasal maddeler gelişigüzel birbirine karıştırılmamalıdır, çok büyük tehlike yaratabilir. 30. Bazı kimyasal maddeler birbiriyle reaksiyona girerek yangına veya şiddetli patlamalara yol açarlar ya da toksik ürünler oluştururlar. Böyle maddelere geçimsiz kimyasal maddeler denir. Bunlar her zaman ayrı ayrı yerlerde muhafaza edilmelidir. Bu maddeler aşağıda verilmiştir: 31. Çözelti konulan şişelerin etiketlenmesi gerek görünüş ve gerekse yanlışlıklara meydan verilmemesi için gereklidir. Kağıt etiket kullanılıyorsa yazıların ıslanınca akmaması için çini mürekkep kullanılması iyi sonuç verir. Etiketlerin arkası nemlendirilirken ağıza ve dile sürülmemelidir. 32. Kimyasal maddeler risk gruplarına ve saklama koşullarına göre, havalandırma sistemli ayrı oda, dolap veya depolarda bulundurulmalıdır. Kimyasal maddelerin bulunduğu yer kilitli olmalı, anahtarı depo sorumlusu ve sorumlusunda olmalıdır. 33. Laboratuvarda zaman çok önemlidir. Yapılacak işler başlangıçta planlanırsa zamandan tasarruf edilebilir. Örneğin, suyu uçurma gibi bazı işler pek az dikkat ister ve bu zaman süresince başka bir analiz de yapılabilir. 34. Organik çözücüler lavaboya dökülmemelidir. Tartım veya titrasyon sonuçları küçük kağıtlara yazılmamalıdır. Bu kağıtlar kaybolabilir ve analizin tekrarlanması zorunluluğu ortaya çıkabilir. 35. Laboratuvarda çalışmalar için özel bir defter tutulmalıdır. Yapılan çalışma ve gözlemler mutlaka kaydedilmelidir. 36. Ecza dolabında neler bulunduğu, yangın söndürme cihazının nasıl çalıştığı bilinmelidir. Bu konuda eğitim yapılmalıdır. 37. Uçucu sıvılar lavaboya dökülmemelidir. 38. Şişelerin kapak veya tıpaları değiştirilmemelidir. Çözelti şişelere doldurulurken dörtte bir kadar kısım genişleme payı olarak bırakılır. 39. Etiketsiz bir şişeye veya kaba, kimyasal madde konulmaz. Ayrıca boş kaba kimyasal bir madde koyunca hemen etiketi yapıştırılmalıdır, bütün şişeler etiketli olmalıdır. Üzerinde etiketi olmayan şişelerdeki kimyasal maddeler, deneylerde kesinlikle kullanılmamalıdır. 40. Cam kesme ve mantara geçirme durumlarında ellerin kesilmemesi için özel eldiven veya bez kullanılmalıdır. Ucu sivri, kırık cam tüplerine, borulara lastik tıpa geçirilmemelidir. Böyle uçlar; havagazı ocağı, zımpara veya eğe ile düzgün hale getirilmelidir. 41. Lastik tıpalara geçirilecek cam boruların uçları su ile ıslatılmalı veya  gliserin, vazelin ile yağlanmalıdır. Cam borular lastik tıpaya direkt bastırılarak değil de döndürülerek sokulmalıdır. 42. Tüp içinde bulunan bir sıvı ısıtılacağı zaman tüp, üst kısımdan aşağıya doğru yavaş yavaş ısıtılmalı ve tüp çok hafif şekilde devamlı sallanmalıdır. Tüpün ağzı kendinize veya yanınızda çalışan kişiye doğru tutulmamalı ve asla üzerine eğilip yukarıdan aşağıya doğru bakılmamalıdır. Yüze sıçrayabilir. 43. Zehirli ve yakıcı çözeltiler, pipetten ağız yolu ile çekilmemelidir. Bu işlem için vakum ya da puar kullanılmalıdır. 44. Genel olarak toksik olmadığı bilinen kimyasal maddeler bile, ağıza alınıp tadına bakılmamalıdır. 45. Benzin, eter ve karbonsülfür gibi çok uçucu maddeler ne kadar uzakta olursa olsun açık alev bulunan laboratuvarda kullanılmamalıdır. Eter buharları 5 metre ve hatta daha uzaktaki alevden yanabilir ve o yanan buharlar ateşi taşıyabilir. 46. Sülfürik asit, nitrik asit, hidroklorik asit, hidroflorik asit gibi asitlerle bromür, hidrojen sülfür, hidrojen siyanür, klorür gibi zehirli gazlar içeren maddeler ile çeker ocakta çalışılmalıdır. 47. Tüm asitler ve alkaliler sulandırılırken daima suyun üzerine ve yavaş yavaş dökülmeli, asla tersi yapılmamalıdır. 48. Civa herhangi bir şekilde dökülürse vakum kaynağı ya da köpük tipi sentetik süngerlerle toplanmalıdır. Eğer toplanmayacak kadar eser miktarda ise üzerine toz kükürt serpilmeli ve bu yolla sülfür haline getirilerek zararsız hale sokulmalıdır. 49. Termometre kırıklarının civalı kısımları yada civa artıkları asla çöpe yada lavaboya atılmamalı, toprağa gömülmelidir. 50. Elektrikle uğraşırken eller ve basılan yer kuru olmalı, metal olmamalı, elektrik fişleri kordondan çekilerek çıkarılmamalıdır. Gerektiğinde bazı işlemleri hemen yapabilmek için gerektiği kadar elektrik bilgisi edinilmeli, büyük onarımlar mutlaka ehliyetli teknisyenlere yaptırılmalıdır. 51. Laboratuvarda, özellikle kilitlenmiş bir yerde yalnız çalışılmamalıdır. Her türlü olasılıklara karşı, tek başına çalışan kişi yapacağı işleri bir başkasına önceden anlatmalı ve sürekli haber vermelidir. 52. Kimyasallar taşınırken iki el kullanılmalı, bir el kapaktan sıkıca tutarken, diğeri ile şişenin altından kavranmalıdır. Desikatör taşınırken mutlaka kapak ve ana kısım birlikte tutulmalıdır. Desikatör kapakları arasıra vazelin ile yağlanmalıdır. 53. Laboratuvar terkedilirken bulaşıklar yıkanmalı, tüm kimyasallar güvenlik altına alınmalı, gaz muslukları ana musluktan kapatılmalıdır. 54. Gözler, hassas terazide tartma gibi işlemler dışında daima korunmalıdır. Emniyet gözlükleri takmak yararlıdır. Gazlardan dolayı gözlerin herhangi bir tahrişinde buna engel olmak için sık sık gözleri soğuk su ile yıkamak veya bol su akıtmak gereklidir. 55. Asit, baz gibi aşındırıcı ­ yakıcı maddeler deriye damladığı veya sıçradığı hallerde derhal bol miktarda su ile yıkanmalıdır. 56. İçinde kültür bulunan tüp, petri kutusu gibi malzeme açık olarak masa üzerine bırakılmamalı, tüpler önlük cebinde taşınmamalı, masa üzerine gelişigüzel konulmamalıdır. Tüpler tüplükte tutulmalıdır. 57. Çalışırken laboratuvar kapı ve pencereleri kapalı tutulmalı, mikroorganizma veya sporlarını etrafa yayacak gereksiz ve ani hareketlerden sakınılmalıdır. 58. Kültürlerin yere veya masaya dökülmesi veya kültür kaplarının kırılması halinde durum hemen laboratuvar yöneticisine bildirilmeli ve dökülen kültürün üzeri anında uygun bir dezenfektan çözeltisi ile kaplanarak (örneğin %10'luk hipoklorit çözeltisi) 15 ­ 30 dakika bekletilmeli ve daha sonra temizlenmelidir. 59. Öze uçları her kullanımdan önce ve sonra Bunzen beki alevinde usulüne uygun şekilde yakılarak sterilize edilmelidir. 60. Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılacak pipetler, önce ağız kısımlarına pamuk yerleştirilerek sterilize edilmeli ve bu şekilde kullanılmalıdır. 61. Kültürün yutulmaması için  tüm önlemler alınmalı kültür yutulursa, anında laboratuvar yöneticisine haber verilmelidir. 61. Mikrobiyolojik çalışmalarda steril olduğundan kuşku duyulan malzeme kullanılmamalıdır. 62. Pipetleme yapılırken kesinlikle üflenmemelidir. 63. Etil alkol gibi yanıcı, tutuşucu maddeler Bunzen beki alevi çevresinden uzak tutulmalıdır. 64. Ellerde kesik, yara ve benzeri durumlar varsa bunların üzeri ancak su geçirmez bir bantla kapatıldıktan sonra çalışılmalı, aksi takdirde çalışılmamalı ve son durum sorumluya iletilmelidir. 65. Mikroskobun objektif ve oküler kısmı her kullanımdan önce ve sonra ince mercek kağıdı ile veya bir tülbent yardımıyla dikkatlice merceğe zarar vermeden temizlenmelidir. 66. Çalışma bittikten sonra kirli malzemeler kendilerine ait kaplara konulmalıdır. Örneğin; kullanılmış pipetler, lam ve lamel hemen, içinde dezenfektan çözeltisi bulunan özel kaplara aktarılmalıdır. 67. Laboratuvardan çıkmadan önce mikroskop lambaları kapatılmalıdır. Gereksiz ışıklar söndürülmelidir. 68. Laboratuvar terkedilirken bulaşıklar yıkanmalı, tüm kimyasallar güvenlik altına alınmalı, gaz muslukları ana musluktan kapatılmalıdır. 69. Çalışma bittikten sonra eller sabunlu su ve gerektiğinde antiseptik bir sıvı ile yıkanmalıdır. 70. Kültür ve benzeri materyal laboratuvardan dışarı çıkarılmamalıdır. 71. Tüm deney sonuçları için gizlilik esasına uyulmalıdır. 72. En yakın sağlık kuruluşunun ve cankurtaran telefonları görülen yere asılmalıdır. 73. Laboratuvarda tek başına çalışılmamalıdır.

http://www.biyologlar.com/laboratuvar-kullanma-talimati-ve-ogrencilerin-dikkat-etmesi-gereken-kurallar

Ürease Testi

Bu test, mikroorganizmaların üreyi hidrolize eden ürease enzimini saptamak amacıyla yapılır. Ürease hidrolizasyon testi bakterilerin cins ve türlerini tayinde işe yarar. Üre, karbonik asit’in bir diamid’idir. Bütün amidler de kolayca hidrolize olurlar. Ürenin hidrolizasyonu da spesifik bir enzim olan ürease tarafından katalize edilir. Reaksiyonun sonunda 2 molekül amonyak ve karbondioksid meydana gelir.Ürease aktivitesi için optimal pH 7.0 dir. Besiyerinde amonyak meydana gelmesi pH nın yükselmesine neden olur. Amonyağın meydana geldiği de indikatör boya ve Nessler ayıracı ile ortaya konur. Ürease testi için bazı yöntemler (Christensen, Stuart, vs.) geliştirilmiştir. Bunların seçimi araştırıcıya bağlıdır. Aşağıda Christensen Metodu bildirilmiştir.Materyal1) Christensen'in üreli agarı (tüp veya petri kutusunda) veya üreli broth2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri 3) Kontrol mikroorganizmalar. P. vulgaris (+) ve E. coli (-)MetotPetri kutusu üzerine fazla miktarda mikroorganizma ekildikten sonra 37°C de 1-5 gün bırakılır. Her gün kontrol edilen kültürlerde (kırmızı rengin meydana gelmesi pozitif reaksiyon) renk değişmelerine dikkat edilir. Bazı durumlarda renk değişikliği 5-6 saat içinde meydana gelebilir.DeğerlendirmeKültürde kırmızı rengin meydana gelmesi (amonyak oluşumu nedeniyle pH'nın yükselmesi sonu indikatörün renginin ortaya çıkması) pozitif reaksiyon olarak ve hiçbir değişikliğin olmaması de negatif olarak değerlendirilir.

http://www.biyologlar.com/urease-testi-1

Oksidase Testi

Bu test, mikroorganizmalar tarafından sentezlenen ve intrasellüler olan oksidase enziminin (sitokrom C oksidase) varlığını ortaya koymada kullanılır. Deneyden aynı zamanda cinslerin (Moraxella (+), Neisseria (+), Yersinia (-), Acinetobacter (-), ve türlerin (B. ovis (-), B.neotomae (-) ve B. abortus ( + ) ayırımında yararlanılır. Oksidase reaksiyonu, bakterilerde (aerobik olanlarda) sitokrom oksidase sisteminin bulunduğunu ifade eder. Bu sistem reaksiyonda son hidrojen alıcısı olarak oksijenin kullanımını sağlayarak moleküler oksijeni hidrojen perokside redükte eder. Anaerobik mikroorganizmalarda oksidase sistemi yoktur. Oksidase testi bakterilerde sitokrom C 'nin varlığını ortaya koyarYukarıda da görüldüğü gibi (2. basamak) okside olmuş sitokrom C, ayıraçta bulunan p-amino dimetilanilini okside ederek, renkli bileşik oluşturur (kırmızı - mavi renk).Materyal1) Petri kutusunda veya tüplerde katı besi yeri (sıvı besi yeri de kullanılabilir).2) Mikroorganizmanın saf ve taze kültürleri .3) Kontrol pozitif (P.aeruginosa) ve negatif (E. coli ) suşlarının kültürleri 4)Ayıraç ( %0.5, tetrametil-p-fenilendiamin )MetotMikroorganizmalar katı besi yerine ekildikten sonra 37 °C de 1-5 gün inkubasyona bırakılır. Üremiş koloniler üzerine ayıraç damlatılır.Değerlendirme Üzerine ayıraç damlatılan kolonilerin 1-2 dakika içinde kırmızı mavi renk almaları pozitif oksidase testi olarak kabul edilir. Hiç bir renk değişikliğinin olmaması negatif olarak değerlendirilir. Kolonilerin siyah renk alması öldüklerini ifade eder.Dikkat edilecek noktalar1) Ayıraç sadece kolonilerin üzerine damlatılır. Bütün plate veya tüpe yayılmaz.2) Ayıraçlar taze hazırlanmalıdır. Gerektiğinde buzdolabı sıcaklığında muhafaza edilebilirler.3) Gerektiğinde test filtre kağıt şeritlerinde de yapılabilir. Ayıraca emdirilmiş kağıt şeritler üzerine mikroorganizma kolonileri konur. Kısa bir süre içinde (10-15 saniye ) kırmızı rengin oluşumu pozitif olarak dikkate alınır.4) Besi yerlerinde glikoz ve nitrat bulunmamalıdır. Triptikase soy agar (TSA), nutrient agar (NA) uygundur.5) Koloni alınırken platin öze veya cam çubuk kullanılmalıdır.6) Oksidase ayıracı, serbest oksijen tarafından kolayca okside olur ve duyarlılığını kaybeder. Bunu azaltmak için %0.1 askorbik asit katılabilir.

http://www.biyologlar.com/oksidase-testi-1

Eukaryotes: A new timetable of evolution

Eukaryotes: A new timetable of evolution

Contaminated samples have evidently created some confusion in the timetable of life. On the basis of ultra-clean analyses, an international team, including scientists from the Max Planck Institute for Biogeochemistry, has disproved supposed evidence that eukaryotes originated 2.5 to 2.8 billion years ago. In contrast to prokaryotes such as bacteria, eukaryotes have a nucleus. Some researchers thought they had discovered molecular remnants of living organisms in rock samples up to 2.8 billion years old. However, as the current study shows, these molecular traces were introduced by contamination. The oldest evidence for the existence of eukaryotes is now provided by microfossils that are ca. 1.5 billion years old. Amoeba are more closely related to humans than to bacteria, at least in the tree of life. Like mammals, they belong to the realm of the eukaryotes, while bacteria are prokaryotes. The first eukaryotes are thus indeed the primeval ancestors of all higher life forms including humans. To this extent, evolution made a big leap towards complex life forms when eukaryotic cells appeared. The so-called symbiogenesis, which caused two or more single-celled bacteria to merge into a new organism with a nucleus and organelles, was the essential prerequisite that allowed most living creatures that surround us today to evolve. To understand how higher life forms developed, evolutionary biologists want to know when and under what conditions the first eukaryotes entered the scene. An international team, in which researchers from Christian Hallmann's Group at the Max Planck Institute for Biogeochemistry were involved, is now supplying crucial arguments to the scientific debate surrounding these questions. A gap between fossils and chemical traces The oldest microfossils that are widely acknowledged as the remains of eukaryotes were found in ca. 1.5 billion-year-old rocks in northern Australia. Researchers have analyzed these fossils morphologically in micropaleontogical studies and identified them as the remains of microalgae. In alternative attempts to trace the origin of higher life forms, scientists analyzed certain lipid molecules (steroids) contained in the cell walls of eukaryotic organisms. Not only can they serve as highly specific markers for certain groups of organisms, they can also survive in sediments for extremely long periods of time given the right conditions. "By analyzing such molecules, so-called biomarkers, we can reconstruct early life on Earth on a molecular level", says Christian Hallmann, Leader of the Max Planck Research Group 'Organic Paleobiogeochemistry'. Since 2012 Hallmann's team has been working on increasing our understanding of how environmental conditions developed and the diversity of life appeared in the period from when the Earth was created until animal life first appeared (i.e. during the Precambrian). "Our understanding of this period, which is of great evolutionary interest, is benefiting enormously from this molecular approach", Hallmann explains. The paleontologist and his staff have now analyzed rock samples up to 2.7 billion years old for traces of molecules. Steroid molecules can be preserved as steranes in old sediments, in other words the petrified beds of prehistoric seas and lakes. And since during the last 15 years an increasing number of scientists had repeatedly identified such molecular traces in samples of sediments from 2.5 to 2.8 billion years old, they concluded that eukaryotic algae already existed in this period, i.e. during the Late Archean. Thus, a gap of more than a billion years appeared between the earliest deposits of these biomarkers and the oldest fossilized microalgae. Ultra-clean sampling aimed at clarifying the question of contamination In addition, the discovery of a large variety of steroids pointed to a seemingly-modern pattern representing various algae species. "At first there was speculation that it might suggest that algae had split into different species at a very early date", says Christian Hallmann. "But suspicion mounted that the samples in these studies might have become contaminated in spite of extensive precautionary measures." The problem was that the Archean sample material either had not been taken under special conditions or had been stored for several years under conditions that were not ideal. "The question of contamination gradually split our fellow scientists into two conflicting camps", Hallmann continues. Working with Katherine French from the Massachusetts Institute of Technology (MIT), Hallmann therefore developed a method for taking ultra-clean samples from the oldest rocks that had been classified as containing steroids. Together with Roger Buick from the University of Washington, the scientists drilled and collected rock samples over the course of several weeks in the remote Australian outback during the "Agouron Institute Drilling Projects (AIDP)" in 2012, and in the process took unprecedented precautionary measures to prevent contamination. Not even a picogram of eukaryotic steroids French, Hallmann and other colleagues split open these drill cores and analyzed them in several independent laboratories - with astonishingly uniform results. "My biggest fear was having to discover in the laboratory that the samples had become contaminated despite our excessive endeavours", Hallmann continues. "Then the whole effort would have been useless." However, the samples were extremely clean - so clean in fact that the highly sensitive mass spectrometers in the various labs were unable to detect even picogram quantities of indigenous eukaryotic steroids. The suspicion that earlier samples might have been contaminated was confirmed. At the same time, the researchers found relatively large amounts of so-called diamondoids and polyaromatic hydrocarbons in the rock. Hallmann calls this the 'exhaust signature' as these molecules also occur in the exhaust gases of combustion engines and they point to organic material that has been modified at high temperatures. "The entire organic material in these samples was modified by pressure and temperature during the course of billions of years, and no biomarker molecules could have survived. We are thus unable to draw any conclusions on the original biological signature of the material", says Hallmann. At any rate, the steroid molecules, which were supposedly 2.7 billion years old, can no longer serve as evidence that eukaryotes originated much earlier than indicated by the fossil record. The microfossils, which are about 1.5 billion years old, must therefore currently be deemed the oldest evidence of eukaryotic life on Earth - an insight that is expected to have major consequences, not only in the geosciences. Biomarkers remain an important tool in Precambrian paleontology French and Hallmann's results not only help to clarify when eukaryotes originated, they also aid in the solution of a further puzzle: since all eukaryotes require oxygen, the development of oxygen-producing (oxygenic) photosynthesis must have preceded the evolutionary transition to the eukaryotes. The consequences of this biochemical innovation, known as the "great oxidation event", changed the entire planet as the atmosphere became gradually enriched with oxygen. This event is clearly dated to between 2.5 and 2.4 billion years ago. Until now, it had been hard to explain how the eukaryotes could have originated several 100 million years earlier given that they were inherently dependent on access to molecular oxygen. "Using a well-designed technique and a large-scale international collaborative process, we were able to answer one of the major questions in molecular geobiology", says Hallmann. In spite of these new insights, biomarkers in old rocks remain an important tool for paleontological investigations of the Precambrian, not least because sedimentary steroids and other biomarkers can be much more specific than microfossils. In contrast to the studied Archean rocks, late-Precambrian sedimentary basins on Earth contain a wide variety of rocks whose organic material is relatively well preserved and can be examined for biomarkers. "With the gained knowledge that eukaryotes appeared later, we can now work on the true early evolution of algae in a new context and with greatly enhanced prospects of achieving success". Source: Max-Planck-Gesellschaft http://www.biologynews.net

http://www.biyologlar.com/eukaryotes-a-new-timetable-of-evolution

Nişasta Hidrolizasyon Testi

Bu test, bir homopolisakkarid olan nişastanın, bazı mikroorganizmalarca sentezlenen ekstrasellüler amilase enzimi tarafından hidrolizasyonunu ortaya koymak amacı ile yapılır. Ayrıca bu test bakteri cins ve türlerinin belirlenmesinde de yardımcı olur. Nişastanın glikoz'a kadar olan ayrışma aşamaları yanda gösterilmiştir. Materyal1) Petri kutularında hazırlanmış nişastalı agar besi yerleri2) Denenecek mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri3) Kontrol mikroorganizmalar [(E. coli (-) ve B. subtilis (+)]4) Lugol solusyonu veya % 95 etanol5) Test, agar üzerinde olduğu gibi, sıvı kültürler (nişastalı buyyon) içinde de yapılabilir.MetotNişasta hidrolizasyon aktivitesi ölçülecek mikroorganizmadan nişastalı agar üzerine çizgi tarzında ekimler yapılır ve 37°C de 2-5 gün inkube edilirler.Diğer bir besi yeri de iki kısma ayrılarak her bir yarımına kontrol mikroorganizmalar ekilir.Değerlendirme1) İnkubasyon süresinin sonunda agarların üzeri lugol solusyonu ile kaplanır. Pozitif reaksiyonlarda, koloni etrafında renksiz bir halka oluşur (alfa-amilase enziminin nişastayı hidrolizasyonu sonu). Negatif durumlarda besi yeri mavi renkte görülür. Koloni etrafındaki oluşan pembe-esmer bölge şüpheli reaksiyonu ifade eder. Reaksiyon 5 dakika içinde okunmalıdır.2) Petri kutuları üzerine lugol solusyonu yerine 8-10 ml % 95 etanol'de konulabilir. Nişastanın hidrolizasyonu halinde koloni etrafında açık alan meydana gelir (pozitif amilase). Negatif durumlarda bu alan süt beyazı görünümündedir. Reaksiyon 30 dakika içinde okunur. Her iki yöntemde de lugol ve etanol döküldükten sonra değerlendirme yapılır.Dikkat edilecek noktalar: 1) Nişastalı katı veya sıvı besi yerleri çok fazla ısıtılmamalıdır.2) Besi yerleri nötr (pH 7.2) olmalıdır.3) Nişastalı besi yerleri taze oldukları zaman daha belirgin ve çabuk sonuç verirler. Eski besi yerleri ise opaklaşır ve yanlış değerlendirmelere yol açar.4) Besi yerlerinde, alfa -amilase aktivitesi için klorid iyonları bulunması gereklidir. Bu nedenle klorid iyonlarının en az 0.01 M konsentrasyonunda olması gereklidir.5) Besi yerlerinin buzdolabında bulunması ve muhafazası opaklaşmaya yol açar.6) Testte kullanılan lugol solusyonu 1/5 sulandırılarak kullanılır. Saf lugol yanlış negatif sonuçlara yol açar.7) Lugol solusyonu besi yeri üzerinde 5 dakika (etanol 30 dakika) tutulduktan sonra dökülür ve değerlendirme yapılır.

http://www.biyologlar.com/nisasta-hidrolizasyon-testi-1

DONDURMA YÖNTEMİ

Bu yöntem zaman geçirmeden hemen sonuç alınması gereken durumlarda örneğin hastanelerde teşhis amacı ile tümör olduğundan şüphe edilen dokularda acele kesit alınmasında ve dokudaki yağ enzim ve bazı radyo izotopların kayba uğramadan araştırılması istendiğinde kullanılır. Dondurma yönteminin uygulanması sırasında basit dondurma mikrotomu kullanılır. Dondurma ya sıvı karbondioksit ile yada freon 12 gazı ile yapılır. Bu yöntemin bir kusuru dondurma ve   kesme işlevi sırasında çok azda olsa biçim değişikliklerinin oluşumudur. Kesilecek materyalin dondurulması ve kesit alınması Tabla büyüklüğünü aşmayan bir filtre kağıdı kesilip su ile ıslatılır ve tabla üzerine konularak hafifçe dondurulur kesilecek doku, bisturi ile istenen büyüklükte  küp yada dikdörtgen biçiminde yontulup tabla üzerine konulur, fanus kapatılır ve dondurulma işlemine başlanır. Kısa aralarla CO2 verilip dondurma işlemi gerçekleştirilir. Parça iyice donduktan sonra yüzeyini düzleştirmek için birkaç kalın kesit alınır, düzgün yüzey elde edildikten sonra dokudan 15-20 mikron kalınlığında kesitler alınır. Teşhis amacı ile  30 mikron kalınlığındaki kesitler uygundur.Biyolojik amaçlar için 15-20 mikronluk kesitler alınır. Eğer kesitler bıçak altında parçalanıp dağılıyorsa parça iyi donmamış demektir ve birkaç saniye için CO2 verilmesi gerekir. Eğer kesitler yuvarlanıyorsa kısa bir an CO2 verilmesi yeterlidir. Hafifçe kıvrılarak gelen kesitler en uygun olanlarıdır. Kesitler ince bir resim fırçası yardımı ile tek tek alınıp küçük bir petri kutusundaki saf su içinde biriktirilirler. Kesitlerin boyanması parafin kesitler gibi yapılır. Dondurma kesiti temiz bir lam üzerine alınır ve suyun fazlası kesite fazla yaklaşılmadan  üçgen biçimindeki filtre kağıdı ile alınır. Kesitin her tarafı örtülene kadar  boyadan bir kaç damla damlatılır. 1-2  dakika tutulduktan sonra kesitler yine lam üzerinde saf su ile çalkalanır. Böylece boyanın fazlası kesitten çıkarılmış olur. Bu türlü boyanmış dondurma kesitleri reçineli bir ortamda kapatılamaz. O nedenle kesitler gliserin jelle kapatılır.

http://www.biyologlar.com/dondurma-yontemi

Fosiller Nasıl Oluşur

Canlılar öldükten sonra organik-yumuşak kısımları diğer hayvanlar tarafından tüketilir veya bakteriler tarafından tahrip edilir. Eğer ortam bakterilerin yaşamasına uygun oksijene sahip değilse ve ortam fosilleşmeye uygun taşlaşma süreci koşulları taşıyorsa, canlıdan arta kalan kemik, kabuk ve diş gibi sert ve dayanıklı kısımlar fosilleşerek günümüze ulaşabilir. Ayrıca hayvanların; kusmuk pelletleri, dışkı pelletleri (koprolit), yumurtaları ve izleri de fosil olarak korunabilir. 1. Karbonlaşma: Bitki fosilleri deniz, göl ya da bataklık gibi ortamlarda gömülerek fosilleşebilir. Kömürleşme denen karbonlaşma olayıyla bitkiler kısmen veya tamamen değişerek kömür haline gelebilirler. 2. Petrifikasyon: Organizma kalıntılarının kristalizasyonla mineralojik bileşimlerinin değişmesidir. En iyi bilinen petrifikasyon tipi silisçe zengin suların bitki hücreleri içine girerek ağaç dokusunun damarlarının yüzeyi ve damarları arasındaki boşluklara silis depolanmasıdır. Buna silisleşmiş ağaçlar örnek olarak verilebilir. Ayrıca hayvan kabukları veya kemikleri, içlerindeki boşluk veya gözeneklerin kalsit, silis ve demirce zengin sularla dolarak kristalleşmesiyle demirleşmiş, piritleşmiş, silisleşmiş veya kalsitleşmiş hale dönüşebilirler. 3. Yer Değiştirme: Yer değiştirme çamur içinde gömülü olan organizma kalıntılarının sülfid (pirit) veya fosfat (apatit) mineralleriyle yer değiştirmesi sonucu oluşur. Bu süreçte mineraller, organizmanın anatomisinin detaylarını gösteren yumuşak dokularla yer değiştirebilir. Örneğin Almanya'da bazı şeyller içinde Devoniyen'de yaşamış bir trilobitin antenleri ve sefalopodların tentakülleri, piritleşmiş fosiller olarak bulunmuştur. 4. Yeniden Kristalleşme: Yeniden kristalleşme olayı hayvanın kabuğunun mikroskobik ölçüde detaylarını bozar. Buna karşılık kabuğun dış şeklinde bir değişiklik olmaz. Hayvan kabuklarının bir çoğu kalsiyum karbonat bileşimli aragonit mineralinden yapılmıştır. Milyonlarca yıl boyunca fosilleşme sırasında kalsiyum karbonat yeniden kristalleşerek daha duyarlı bir mineral olan kalsit haline dönüşür. 5. Yumuşak Dokuların Korunması Yoluyla Fosilleşme: Bazen olağanüstü koşullar altında, organizmaya ait deri, tüy, doku gibi bazı parçalar bozulmadan fosilleşebilir. Örneğin Sibirya'da buz kütlelerin içinde binlerce yıl boyunca bozulmadan kalmış bütün mamut fosilleri bulunmuştur. Hatta bu mamutların midelerindeki yiyecekler bile olduğu gibi korunmuştur.Olağanüstü koşullar sıcak ve kurak iklimlerde de oluşabilir. Mumyalaşma adı verilen bu süreçte yumuşak dokular, bakterilerce çürütülmeye fırsat kalmadan kısa sürede kurur. Paleontologlar Çin'de bu şekilde derileri ve tüyleriyle korunmuş dinozor fosilleri bulmuşlardır. 6. Organik Kapanlar: Bir organizmanın amber, doğal asfalt veya çürümüş organik madde içinde hapsolarak korunması sonucu oluşan fosilleşme şeklidir. Bunlardan amber, ağaç reçineleridir. Ağaçtan akan reçine bu sırada böcek, örümcek veya küçük kertenkeleleri yakalayabilir. Hemen katılaşarak sertleşen bu madde içindeki hayvan hiç bozulmadan ve tüm detayıyla milyonlarca yıl boyunca kalabilir. Doğal asfalt, petrol kalıntısıdır. Asfalt suyla örtüldüğü zaman, susamış hayvanlar sudan içmek için geldiklerinde içine düşebilirler. Böylece yapışkan zeminden kurtulamayan hayvan yine hiç bozulmadan korunur. Bu tip ortamda fosilleşmiş hayvanlara Amerika'da Kaliforniya'da rastlanmıştır. Bir başka ortam bataklıklardır. Her ne kadar asidik ortam organik malzemeyi bozsa da, daha sağlam olan kemikler bozulmadan kalabilir. Danimarka'da 2000 yıl öncesinden kalma bataklıklarda insan kalıntıları bulunmuştur. 7. Boşluk ve Kalıplar: Asidik koşullar kayaç içinde korunmuş fosil hayvan kalıntılarını bulundukları yerde yavaşça eritir. Bu etki kaya içinde bir kalıp bırakır. Bu süreç genellikle kolay çözülen kalsitik kabuklarda daha fazla görülür. Kabuğun dış kısmının etkilenmesiyle dış kalıp oluşur. Bazen kabuk çözülmeden önce içi çökelle dolarak iç kalıplar meydana gelir. 8. İzler (Omurgalı ve Omurgasız Hayvanlar): Hayvanlar çamur gibi yumuşak bir zeminde yürüdükleri zaman bıraktıkları çeşitli ayak, kuyruk veya gövde vb. izleri sertleşerek korunabilir. Bu izlere ait boşluklar farklı bir çökelle dolduğu zaman kalıp haline gelir. Buna dinozorların ve insanların ayak izleri örnek olarak gösterilebilir. Paleontologlar, dinozorların ayak izlerini yorumlayarak onların yürüme ve hareket etme özelliklerini ortaya koyabilirler. 9. Fosil Benzeri Yapılar: Bazen mineraller, kayaçlar içinde büyüyerek fosil benzeri şekiller oluşturabilirler. Bunlara yalancı fosiller denilir. Örneğin dendrit kristalleri sıklıkla fosil sanılmaktadır. Bunun dışında, bazen mumyalaşmış veya travertenle kaplanmış güncel hayvan veya bitkilere de rastlanabilir. Bu kalıntılar da gerçek fosil değildir. Zaman içinde fosilleşmeye aday örneklerdir.

http://www.biyologlar.com/fosiller-nasil-olusur-1

BAZI ÖZEL HİSTOLOJİK PREPATATLARIN YAPIMI

1-KAN PREPARATI: Omurgalı kanı iki türlü incelenir. a-Canlı olarak b-Tespit edilmiş ve boyanmış olarak a.Canlı olarak preparat hazırlanması: Doğrudan doğruya parmaktan lama alınan kan incelenir veya % 0.9’luk fizyolojik su içine kan damlatılıp , incelenir. Eritrositler birbirinden ayrıldığı için iyi görülür. Ayrıca 300 mg Ruj.nötr 100 cm3 saf suda eritilir. Bir damla lam üzerine konur sonra diğer bir lamın kısa kenarı ile bu sıvı lam üzerine yayılır ve kurutulur. Sonra bir damla kan konur ve lamel kapatılır. Bir süre sonra kan hücrelerinin bu boyayı alarak çeşitli renklerde oldukları görülür. Eritrositler bu boyayı almazlar. Sıcak kanlı hayvanların lökösitlerin ameboid hareketlerini görmek için lam hafifçe ısıtılır. Soğuk kanlılarda oda sıcaklığında bu hareketi görebiliriz. b- Tesbit edilmiş ve boyanmış olarak: Alkolde temizlenen parmak ucundan sterilize iğne ile çıkarılan kan temiz bir lam üzerine konur. Başka bir lamın kısa kenarı ile iyice yayılır. Biraz kuruması beklenir, sonra metil alkol içinde 3 dakika bekletilir. Daha sonra lam üzerine saf su damlatılır. Biraz bekletilir, suyu akıtıldıktan sonra bir kap içindeki Giemza boyasına konur (10 cc distile su+1 cc Giemsa ). 30 dakika bekledikten sonra çeşme suyunda yıkanır, kurutulur, incelenir. 2-MİTOZ BÖLÜNME PREPARATI Kuru soğan ya da arpacık soğanı kökleri su içine gelecek şekilde suyun içine konur. Üç hacim absolü alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içine uzayan köklerin uç kısımları kesilerek biriktirilir. Bu karışımdan çıkan kökler 3 N HCl içinde 2-3 dakika bırakılır ( 24 cc HCl alınır. 100 cc ye distile su ile tamamlanır. 100 cc % 50’ lik asetik asit içine 1 gr orcein konur. Asitten çıkarılan kökler boya içinde 1.5 saat bekletilir. Lam üzerine 1 kök konur. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit damlatılır. Üzerine lamel kapatılır. Gazlı bez yardımıyla üstten bastırılarak yayılır ve mikroskopta incelenir. 3-MAYOZ BÖLÜNME PREPARATI 1-Çekirge testisleri çıkarılır. 2-3 hacim alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içersinde 24 saat buzdolabında fikse edilir. 3-Saklamak için % 70 ‘lik alkol kullanılır. 4-Boya 1 gr orcein 100 ml % 50 ‘lik Asetik asit içinde çözülür 30 ‘ dakika 5-% 45 ‘lik asetik asit damlatılıp ezilir. 6-Mikroskopta incelenir. 4-DÜZ KAS PREPARATI ( KURBAĞA MESANESİNDEN ) Araç ve Gereçler Kurbağa Şişe mantarı Lam, lamel, makas, pens, küvet Bouin, etil alkol, eter veya kloroform Bouin Çözeltisi 9 gr pikrik asit 75 cc distile suda çözülür ( %74’ lük ) % 40’ lık formol...........25 cc Glasiyal asetik asit.......5 cc Bouin taze hazırlanır. Asetik asit buharlaştığından çözeltinin yapısı bozulabilir. İyi saklanırsa uzun süre kullanılabilir. Mesaneyi iyi fikse ettiği gibi sertleştirerek kolay boyanır hale getirir. Hemalum % 1’ lik suda hazırlanmış olarak kullanılır. Eozinin ise % 70’ lik etil alkolde hazırlanmış % 1 ‘ lik çözeltisi kullanılır. Kurbağa bayıltılır. Mesanesi kesilerek alınır. Parafinde kaynatılmış veye doyurulmuş, ortası delik mantarın delik kısmı üstüne iğne ile gerilir. Bouin çözeltisine aktarılır. Mesane alt yüzeyde olmalı ve Bouin ile temas etmelidir. 1-2 saat sonra mesane sarı renk alır ve sertleşir. % 70’ lik alkole aktarılır. Objenin rengi giderilinceye kadar alkol değiştirilir. Sonra hemen hematoksilen ile istenilen mor renk alınıncaya kadar boyanır. Eozin ile 15 dakika boyanır. % 70-90-100’lük etil alkollerde 10’ ar dakika dehidre edilir. Ksilolde 5 dakika tutulur. Pensle çıkarılan materyel filtre kağıdı üzerine alınır. Mesane küçük parçalara ayrılarak lam üzerine alınır. Entellan damlatılarak lamel kapatılır. Kurutulur ve incelenir. 5-ÇİZGİLİ KAS PREPARATI (Çekirgeden): Çekirgenin abdomeni açılır. 2 kas demeti görülür. Steromikroskop altında kas çıkarılır. % 0.6’ lık fizyolojik sıvıya konur (NaCl ile hazırlanmış ). Buradan 1 hacim asetik asit+3 hacim % 96’ lık etil alkol içeren tespit çözeltisine aktarılır. Burada demet halindeki kaslar iğne veya pensle küçük parçalara ayrılır. 1 kas lifi lama alınır. Üzerine 1-2 damla asetocarmin damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Üzerine lamel kapatılır ve hafifçe bastırılır. Sonra lamelin bir tarafından asetocarmin çekilip diğer taraftan % 96’ lık alkol eklenir. Bu işlem 2 defa tekrarlanır. Lameli yavaşça kaldırıp 1 damla kanada balzamı veya entellan damlatılır ve lamel kapatılır. Bu işlemlerin lamel kapatılarak yapılmasının nedeni kas üzerinde baskı yapmaktır. Baskı olmadığı zaman kas büzülür. 6-KEMİK PREPARATI Araç ve Gereçler % 5- % 7.5’ lik Nitrik asit ( 100 cc % 65’lik nitrik asit+1200 cc distile su) % 5’ lik sodyum sülfat Etil alkol Kreozot (karanfil yağı ) Uzun kemik (3-5 cm boyunda ) Preparasyon 2 teknikle yapılabilir. 1-Yumuşatma: Gerekli maddeler bulunduğu takdirde daha kolay ve uygun bir tekniktir. 2-İnceltme: Daha çok el becerisine dayanır. a-Kemiğin yumuşatılarak preparat hazırlanması: Uzun kemik parçasının üzerindeki yağ, kas kısımları bistüri ile temizlenir. Kemiğin anorganik yapısını eritmek için % 5 veya 7.5 lik seyreltilmiş nitrik asit içine konur., 24-48 saat bırakılır. Sık sık çalkalanır. 5 saatte bir çözelti tazelenir. Kemikler jiletle kesilecek kadar yumuşayınca çıkarılır.. 24-48 saat kadar % 5’lik sodyum sülfat içinde bırakılır. Sonra asitin giderrilmesi için çeşme suyunda 1-2 gün yıkanır. Keskin jiletle yumuşamış ve yıkanmış kemikten çok ince kesitler alınarak % 50 ve % 70’ lik alkol bulunan petri kaplarında 10-60 dakika bekletilir. Kreozot içine alınarak 15-20 dakika şeffaflandırılır. Temiz bir lam üzerine alınan kemik kesiti üzerine entallan damlatılarak lamelle kapatılır. Kesitler düzgün ve yeterli incelikte alınmışsa Havers kanalları ve konsantrik lameller izlenir. Boyuna alınan kesitlerle de Volkman ve Havers kanalları ve lameller izlenir. Mikroskopta inceleme yaparken diyafram kısılırsa daha iyi görüntü alınır. b-Kemiğin inceltilmesi ile preparat yapımı: Uzun kemiklerden kemik testeresi ile enine parçalar kesilir. Bunlar döner zımpara taşlarında ( elektrikli veya kolla dönen ) mümkün olduğu kadar inceltilir. Daha sonra kesilen bir tahta üzerine koyarak ince dişli demir eğici ile çalışarak inceltmeye devam edilir. Bu arada kesitler incelendikce daire şeklindeki kesitten kopmalar olur. Kopan parçalar ponza taşında tekrar inceltmeye devam edilir. Ponza taşı üzerinde düzgün bir yüzey elde edilir. Bu yüzey üzerine su damlatılır. Ve kesitler parmak ucu ile taş üzerine sürtülerek daha da inceltilir. Parmak ucunda tutulan kesitlerden parmağın izleri görünüyor ise kemik parçaları yeteri kadar incelmiş demektir. İnceliği uygun görülen kesitler 5-10 ‘kadar HNO3 de bekletilir. Sonra damıtık suda birkaç değiştirme ile iyice yıkanır. Filtre kağıdından suları süzülür. Dikdörtgen veya kare şeklinde kesilerek lama yerleştirip lamel kapatılır. Kesiler saydam olduğu için kanada balzamının ksilol ile seyreltilerek kullanılması tercih edilir. 7-KIKIRDAK PREPERATI Kurbağanın ön ve arka ekstremitelerinin eklem yerlerindeki kıkırdak kullanılır. Hayvan eter veya kloroformla bayılttıktan sonra ekstremitlerinden biri eklem yerinden kesilir. Kasları kemikten ayrılır. Temizlenmiş olan kemik fizyolojik suya konur (%0.8 NaCl). Keskin bir jiletle uzun kemiklerin uçlarındaki mavimsi renkli kıkırdaktan ince kesitler alınıp, fizyolojik suda lamel altında incelenir. Kıkırdak ara maddesi bu bölgede homojendir. Kapsülde genellikle bir kıkırdak hücresi bulunur. Ara maddeleri açık gri kapsül beyaz renkli , plazma ve nukleus mavimtrak görünür. Bunu boyamak için Karmin- Asetik Bunu boyamak için Karmin -Asetik asit kullanılır. Bu boya fiksatiftir. Onun için kesit lam üzerine konan 1-2 damla asetokarmin içinde 1-2 dakika bekletilir, lamel kapatılır. Bu arada materyal tespit edildiği için hücreler büzülür. Nukleus kırmızı, plazma pembe boyanır. Kapsül ve ara madde az boyanır veya hic boyanmaz. Preparatın devamlı olması için : Boyanan kesit % 96 lık alkolde 5 dakika tutulur. Sonra kreozt veya karanfil yağı içine konur. En fazla yarım saatte bu kesiler şeffaflaşır. Temiz bir lama bir damla Kanada balzamı veya entellan damlatılır. Kesit bunun üzerine yerleştirilir ve lamel kapatılır. b- Kıkırdak pikrik asit içermeyen herhangibir fiksatif içinde tespit edilir. Sonra iyice yıkanır. Aşağıda formülü verilen Von Wijre boyasında 24 saat boyanır. %70’ lik etil alkol.......................100 cc HCL.............................................0.1 cc Toluidin mavisi ........................ 0.1 gr Boyadan sonra % 70 alkol içinde (0.001 HCL li) hiç boyası çıkmayıncaya kadar kalacak, % 70-80 -90-100 alkol serilerinde dehidrasyon yapılarak şeffaflaştırıcı (kreozot) içine aktarılır. Lam üzerine alınınca 1 damla Kanada balzamı veya entellan eklenerek lamel kapatılır. 8- KURBAĞA DERİSİ Kurbağanın sırt derisi kesilerek delikli bir mantar üzerine gerilir. Bouin de 3-4 saat tesbit edilir. İğneleri çıkartılarak ufak parçalara bölünür. Sarı rengi giderilinceye kadar % 70 alkolde yıkanır. % 80’lik etil alkolde 1 saat % 90’lik etil alkolde 1 saat % 100’ lık etil alkolde 1 saat Ksilol + %30’luk alkolde 15-30' Ksilolde 30 dakika Ksilol+parafinde 30 dakika Etüvdeki parafinde 24 saat Bloklanır. Daha sonra mikrotomda 12 mm’lik kesitler alınır. Kesitler bir gün bekletilir. Ksilolde 5-10 dakika Alkol serilerinde (% 100-96-80-80 ) beşer dakika Hematoksilen Akarsuda 15 dakika boyama Eosin (Eosin su ile yapıldıysa akarsudan sonra . %80’ e kadar alkol serilerinden geçirilir sonra eosinle boyanır ). % 96 - %100’ lik alkol 1-2 dakika Ksilol 2-3 dakika Kanada balzamı ve lamel kapatılması 9-DEV KROMOZOMLARIN PREPARATI: Bu teknikte absolü metil alkol sadece tespit ve lamel kapatma sırasında çözücü olarak kullanılır. Ringer çözeltisi içine alınan ganglion veya tükrük bezi temiz bir lam üzerine alınır. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit eklenerek 3-4 dakika tespit edilir. Fazla tutulursa parçalanır. Lamel kapatılır. Fiksatifin fazlası emdirilir. Kullanılan lam daha önceden albümin veya başka bir yapıştırıcı sürülmüş ve kurutulmuş olmalıdır. Lam ve lamel içinde alkol bulunan bir kaba aktarılır. 12 saat ya da daha fazla bekletilir. Lamel kendiliğinden düşmemişse ince bir iğne yardımı ile lamel alınır. Üzerine tükrük bezi yapışmış lam alkolde doyurulmuş amonyum ferri sülfat bulunan kaba taşınır. 12 saat bekledikten sonra biraz hematoksilen kristali boyaya aktarılır. Alkol banyosundan sonra 5-10 dakika alkolde doyurulmuş lityum karbonat çözeltisinde bekletilir. Kırmızı bir boyama yapılacaksa 1-3 saniye alkolik eozinde ( 100 cc % 90’ lık alkol+ 0.5 gr eosin ) bekletilir. Entellan damlatılarak lamel kapatılır.

http://www.biyologlar.com/bazi-ozel-histolojik-prepatatlarin-yapimi

Katalase Testi

Bu test, bazı mikroorganizmalarca sentezlenen katalase enzimini (hidrojenperosid oksidoredüktase) saptamak amacıyla yapılır ve identifikasyonda kullanılır. Bu enzim ekseri sitokrom ihtiva eden aerobik bakterilerde ve bazı fakültatiflerde bulunur. Katalase bir hemeprotein olup prostetik grubunda, her molekülde, 4 atomlu ve 3 değerli demir (Fe+++) bulunur. Enzim, hidrojen peroksid'i (H2O2) su (H2O) ve oksijene (O2) ayrıştırır. Hidrojen peroksidin ayrışmasında, bir molekülü substrate donor olarak görev yapar. Substrat ve suda donorun hidrojeni yardımı ile redükte olur ve böylece, substrat redükte, donor da okside olur.Bakterilerde hidrojen peroksidin ayrışmasında başlıca iki enzim etkili olabilmektedir. Bunlardan biri, katalase ve diğeri de peroksidase'dir. Hidrojen peroksidin dışında diğer bazı substratlar da katalase enzimi tarafından kullanılabilirler. Bunlar arasında, alkoller (etanol), hidratlanmış formaldehid (H2C(OH2), nötröz asidi (HNO2) ve formik asit (HCOOH) vardır. Katalase enzimi, hidrojenperoksidi, metilalkol'u (CH3OH) ve etlalkol'u (C2H5OH) okside etmek için kullanılabilir.Materyal1) Taze hazırlanmış hidrojen peroksid solusyonları (% 3 ve % 30) 2) Muayenesi istenen mikroorganizmaların taze (18-24 saatlik) sıvı veya katı besiyerindeki kültürleri3) Bilinen ve kontrol olarak kullanılacak, pozitif (S. aureus) ve negatif (S. faecalis) taze kültürleri.Metot1) Katı besi yerinde (kanlı agar hariç) üremiş olan mikroorganizma kolonilerinden platin öze (veya cam baget) yardımı ile yeterli miktarda alınarak temiz ve yağsız bir lamın üzerine konulur. Sonra buna % 30 luk hidrojen peroksidden bir damla damlatılır veya2) Sıvı besiyerinde (5 ml) üremiş kültür üzerine % 3 lük hidrojen peroksid'den 3-4 damla ilave edilir.DeğerlendirmeHidrojenperoksid katılmasından sonra kabarcıkların görülmesi veya çıkması pozitif reakiyon olarak değerlendirilir. Şüpheli durumlarda mikroskop altında muayene yapılabilir. Reaksiyon en iyi pH 7.0 da meydana gelir ve oda sıcaklığında yapılır. Sonuçlar, negatif (-), zayıf (+), orta (++) ve kuvvetli (+++) pozitif olarak derecelendirilir.Dikkat edilecek hususlar1) Mikroorganizmaları üretmede kullanılan katı besi yerinde kan bulunmamalıdır. Bunun yerine, eğer zorunlu ise, çikolata agar denenebilir.2) Lam üzerinde uygulanan yöntemde, aerosol infeksiyonlara veya deri-göz konjonktivasına etkenin sıçraması sonu hastalanmalara rastlanabilir. Bu yönden dikkatli bulunulmalıdır.3) Hidrojenperodsid dayanıksızdır. Bu nedenle taze hazırlanmalı ve kullanılıncaya kadar buz dolabı sıcaklığında muhafaza edilmelidir.4) Testte kontrol mikroorganizmalar bulundurulmalıdır (S. aureus ve S. faecalis).5) Muayene edilecek kültürler 18-24 saatlik olmalıdır. Eski kültürler yalancı negatif reaksiyon verebilirler.6) Hidrojenperoksid (% 30) deri için zararlı bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, % 70'lik alkol daima hazırda bulundurmalı ve gerekitği zaman deriye sürülmelidir.7) Test oda sıcaklığında yapılmalıdır. Asit ortamlar, katalase aktivitesini önlediğinden, nötr pH 7.0 tercih edilmelidir.8) Yalancı pozitif reaksiyonlar, kirli malzeme kullanılmadığında görülebilir. Bu nedenle bütün cam malzemenin kimyasal yönden temiz olması gereklidir.9) Eğer, anaerobik koşullarda üretilmiş kültürlerin yoklaması söz konusu ise, bu takdirde, kültürler teste tabi tutulmadan önce 30 dakika açık havada bulundurulmalıdırlar.02.15. Kazein Hidrolizasyon TestiBu test, sütün proteinini oluşturan ve kolloidal karakterde bulunan kazeinin, bakterilerce sentezlenen, proteolitik ve ekstrasellüler bir enzim olan protease tarafından hidrolize edilebilme durumunu saptamak için kullanılır. Mikroorganizmaların türlerinin identifikasyonunda işe yarar.Materyal 1) İçinde % 10 yağsız süt bulunan agar (sütlü agar)2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri3) Kontrol pozitif (B. subtilis) ve negatif (E. coli) mikroorganizma kültürleri4) Ekilmemiş besi yeri 5) Gerektiğinde sütlü sıvı besi yeri de kullanılabilir.MetotSütlü agar besi yerine çizgi tarzında mikroorganizmalar ekilir ve petri kutusu 37°C de 2-14 gün kadar inkubasyona bırakılır. Petri kutuları her gün, kontrollerle karşılaştırılarak, muayene edilirler.DeğerlendirmeSüre sonunda koloniler etrafında oluşan açık alan, sütteki kazeinin hidrolize olduğunu ifade eder (pozitif reaksiyon). Negatif durumlarda koloni etrafında hafif opaklaşma görülür. Dikkat edilecek noktalar1) Sonucu iyi değerlendirmek için Petri kutuları siyah bir zemin üzerine konulur. 2) Sütte bulunan laktozu fermente eden mikroorganizmalar asit oluşturmaları nedeniyle süt proteininde değişmeler meydana getirebilir ve açılmalara yol açabilir. Bunu anlamak için, petri kutusuna % 1 HCl veya % 1 Cıva klorür solusyonundan konur. Eğer açılan sahaların rengi kaybolursa, kazein hidrolize olmamıştır.

http://www.biyologlar.com/katalase-testi-1

Fosfatase Testi

Bu test, özellikle, stafilokokların (koagulase pozitif) sentezledikleri fosfatase enzimini belirlemek amacıyla yapılır.Reaksiyon, ortamda indikatör olarak bulunan fenolftalein difosfat'ı fosfatase enzimi yardımıyla ayrıştırarak serbest fenolftalein meydana getirir. Bu da alkali ile birleşince parlak pembe-kırmızı renk oluşur. Materyal1) İçinde, % 0.5 fenolftalein disfofat bulunan agar besi yeri (pH 7.3)2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri3) Kontrol pozitif (S. aureus) ve negatif (S. epidermidis) suşlarının kültürü4) Ayıraç (% 40 NaOH solusyonu veya yoğun amonyum hidroksid, NH4OH)5) Ekilmemiş tüp (kontrol tüp)MetotMikroorganizma kültürlerinden fenolftalein fosfatlı agara ekim yapılır ve 37 °C de 1-2 gün inkube edilir. Bu sürenin sonunda, koloniler amonyak buharına tutulurlar (petri kutusunun kapağına 1 ml NH4OH konur ve kültür ters olarak kapatılır). Eğer sıvı besiyeri kullanılmışsa, tüplere sodyum hidrositten bir damla damlatılır. DeğerlendirmeKolonilerde veya tüpte kırmızı rengin meydana gelmesi pozitif reaksiyonu gösterir. Negatif durumda renk değişikliği olmaz. Dikkat edilecek noktalarAlkali ilavesi çok az veya çok fazla olmamalıdır. Yanlış sonuç verebilir.02.08. Glukonat Oksidasyon TestiBu test, mikroorganizmaların glukonat (glukonik acid) okside edebilme yeteneğini ölçmede kullanılır. Glukonat'ın ayrışması sonu besi yerinde oluşan 2 ketoglukonat, ayrıçla ortaya konulur. Bu deneyden mikroorganizma cinslerini [E. coli (-), Enterobacter (+), Klebsiella (+) ve P. aeruginosa (+)] identifikasyonunda yararlanılır.Materyal1) İçinde glukonat (potasyum glukonat, potasyum glukonik asit) bulunan sıvı besi yeri (5 ml tüplerde),2) Muayene edilecek mikroorganizmalar saf ve taze sıvı kültürleri,3) Kontrol pozitif (Klebsiella aerogenes) ve negatif (E. coli) kültürleri,4) Benedict'in ayıracı.MetotMikroorganizmalardan yeteri miktarda glukonatlı besi yerlerine ekilir ve 37 °C de 2-3 gün inkübe edilirler. Bu sürenin sonunda kültürlere Benedict ayıracından 1 ml konur ve iyice karıştırılırlar. Sonra 100 °C de su banyosunda 10 dakika bekletildikten sonra okunur.DeğerlendirmeTüplerde kahverengi - esmer renkte bir presipitasyonun meydana gelmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir. Negatif olgularda ayıracın renginde (mavi) bir değişiklik olamaz. Meydana gelen presipitat genellikle renksiz bir görünümdedir.

http://www.biyologlar.com/fosfatase-testi-1

Deoksiribonuklease (Dnase) ve Termonuklease Testleri

Bu test, mikroorganizmaların ısıya dayanıklı olan deoksiribonuklease (DNase) enzimini sentezleyebilme yeteneklerini ölçmede kullanılır. Enzim, hücre çekirdeklerinde bulunan deoksiribonukleik asidi (DNA) depolimerize ederek ayrıştırır. Ayrıca, S. aureus 'ların DNase'lerinin ısı karşısında termonuklease stabilitesini ölçmede de yararlanılır.DNase aktivitesi, özellikle, koagulaz negatif reaksiyon veren S. aureus 'ların patojenitelerini tayinde yardımcı olur. Bu yönden, S. aureus (+) ve S. epidermidis (-) dir. Ayrıca, birbirlerine yakın pigment vermeyen genuslardan Klebsiella – Enterobacter – Serratia 'ları ayırmada da kullanılır (Serratia spp. (+) Klebsiella ve Enterobacter (-) dir.Termonuklease testinde, ısı karşısında, S. aureus tarafından sentezlenen DNase varlığı ortaya konur ve S. epidermidis ve diğer mikrokokların oluşturduklarından farkı ortaya konur. Nuklease enzimleri başlıca iki karakter taşır.1) Endonuklease'ler internal pozisyonda bulunan fosfodiester bağlarını ayrıştırır.2) Ekzonuklease'ler ise DNA molekülü terminusunda bulunan nukleotid'leri hidrolize eder. DNase, DNA'yı depolimerize ettiği gibi, aynı zamanda polimerizasyonu da katalize eden bir enzimdir. DNase'ler birçok mikroorganizmanın ekstraksiyonundan elde edilebilir. Ekstrasellüler karakterde olanlar, S. aureus, grup A streptokok, C. diphteriae, S. marcescens, P. aeruginosa, Bacillus spp. ve Vibrio spp. 'den izole edildiği bildirilmiştir. Stafilokokkal DNase'ler hem S. aureus ve hem de S. epidermidis 'den elde edilmiştir. Bunlardan S. aureus 'unki ısıya dayanıklıdır (100 °C 15 dakika). Serratia DNase'leri nonspesifik fosfodiesterase'lerdir.S. aureus ile Serratia marcescens DNase'leri arasındaki farklar aşağıda gösterilmiştir. Özellikleri S. aureus S. marcescensAktivasyon için gerekli iyon Ca++Mg++ veya Mn++pH sınırları 8.6 - 9.07.0 - 10.0Isıya dayanıklılık (44°C ve yukarı)termostabiltermolabilMateryalKültür filtratlarında bulunan ekstrasellüler DNaseyi ölçmede aşağıdaki materyal kullanılır.1) İçinde, son konsantrasyonu 2 mg/ml kadar olan DNA ile toluidin mavisi (% 1) bulunan agar plakları (Toluidin mavisi DNA agar)2) Teste tabi tutulacak mikroorganizmaların (stafilokok suşları) saf ve taze sıvı kültürleri3) Kontrol mikroorganizmalar pozitif (S. aureus) ve negatif (S. epidermidis) suşlar.4) Hidroklorik asit (1 N HCl). Metotİncelenecek mikroorganizma kültürlerinden, petri kutusunda ki Toluidin mavisi DNA agar üzerine ortasına (bir noktaya) veya çizgi tarzında ekim yapılır. Petri kutusu 37 °C'de 2-3 gün inkube edilir. Bu sürenin sonunda, ekimin yapıldığı yerlerde üremenin etrafında parlak pembe bir açıklık meydana gelir. Eğer, besiyerinde Toluidin mavisi yoksa o zaman HCl (1 N, solusyonu agar üzerine yayılır.Değerlendirme1) Toluidin mavisi DNA agar üzerinde üreme etrafında parlak pembe açık sahanın oluşması DNase pozitif olarak değerlendirilir. Negatif olgularda bir değişiklik görülmez.Toluidin mavisi içermeyen DNA agar üzerine HCl (1 N) ince bir tabaka halinde yayılır. Pozitif durumlarda üreme etrafında açık bir alan meydana gelir. Buna karşın negatif kültürlerde, üreme etrafında opak bir renk vardır.2) Termonuklease ölçmek için ise, kültürler su banyosunda ısıtılır (kaynayan suda 15 dakika) ve soğutulur.Toluidin mavisi DNA agar üzerinde açılan 5 mm çapındaki çukurlara ısıtılmış (kontrol) kültürlerden konulur. Petri kutuları 37°C de 2-4 saat inkube edilirler. Bu sürenin sonunda, etrafında parlak pembe renk oluşan çukurlardaki filtratlarda ısıya dayanıklı (termostabil) DNase (termonuklease) bulunmaktadır (pozitif reaksiyon). Pembe renk göstermeyenler ise negatif olarak kabul edilir (S. marcecens). Isıtılmış IsıtılmamışS. aureus ++Serratia marcescens +-Dikkat Edilecek Noktalar1) Kültürler taze olmalı ve yeterli bir üreme meydana gelmelidir.2) Deneme çift olarak düzenlenmeli ve hem DNase ve hem de termonuklease akitvite ölçülmelidir.3) DNase'lerin çoğu aktiviteleri için besiyerlerinde divalan katyonlara gereksinimleri vardır.4) Negatif durumlarda, gerektiğinde inkubasyon süreleri uzatılabilir.

http://www.biyologlar.com/deoksiribonuklease-dnase-ve-termonuklease-testleri-1

mikrobiyoloji ödevi

Mikrobiyoloji lab.da ekim yapılmadan önce hangi hazırlıklar yapılır. ekim nasıl yapılır. etken teshisi nasıl yapılır. antibiyogram nasıl yapılır... -MİKROORGANİZMALARIN EKİM YÖNTEMLERİ Bu deneyde saf kültür elde etmek amaçlanmıştır.Dökme plak yöntemi,yayma plak yöntemi ve sürme ekim yöntemleriyle izolasyon sağlanır.Plate Count Agar ve Malt Extract Agar besiyerlerine yayma plak yöntemi kullanılarak kıyma örneğinin uygun dilüsyonları ekilecektir.Violet Red Bile Glucose Agar besiyerine dökme plak yöntemi uygulanarak ekim yapılacaktır.Nutrient Agar besiyerine de sürme ekim yapılacaktır.İnkübasyon sonunda, NA besiyerinde gelişen bakterilere endospor boyama yapılacaktır.MEA besiyerinde gelişen küflere de küf boyama yapılacaktır. NA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak yapılan endospor boyama sonucunda mikroskopta Lactobaciller gözlenmiştir. MEA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak yapılan küf boyama sonucunda Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir. Üzerinde veya içinde mikroorganizma üretilmiş (ya da üremiş) besiyerlerine kültür denir.Saf kültür, besiyerinde yalnızca tek bir mikroorganizma türü üretilmiş kültürlerdir.Saf kültür elde etmenin bazı aşamaları vardır.Öncelikle örnek alnır.Bu örneğin istenen dilüsyonları hazırlanır.Sonra örnek uygun araçlarla (pipet,öze) besiyerine aktarılır.İnokülasyon işlemi gerçekleştirilir.İnkübasyondan sonra, kültür hazırdır. Dökme plak yöntemi,yayma plak yöntemi ve sürme ekim yöntemleriyle izolasyon sağlanır. Sporlu bakterileri görüntülemek için endospor boyama yapılır.Bazı bakteriler (Bacillus ve Clostridium cinsi) yüksek sıcaklık,düşük su aktivitesi gibi dış ortam koşullarına dayanıklı sporlar oluştururlar.Bakteri hücresinin içinde oluşan bu spora endospor denir.Sporların soğuk,sıcak,UV,düşük su aktivitesi gibi fiziksel etkenlere pek çok boya maddesine ve kimyasal maddelere karşı vejetatif hücrelerden daha dayanıklı olması kimyasal ve fiziksel yapılarının farklılığından ileri gelir.Gram boyamada kullanılan boyalar spor çeperine nüfuz edemediklerinden gram boyama yöntemiyle sporlar boyanamaz.Sporların görünmesi için en yaygın yöntem Schaffer-Fulton yöntemidir.Preparat hazırlandıktan sonra malachite yeşili boyası uygulanır,boyanın spor çeperine nüfus edebilmesi için preparat bir süre ısıtılır.Boya yıkanıp,safranin karşıt boyası ile boyanır.Mikroskopta sporlar yeşil,hücre pembe-kırmızı görülür (Temiz, 2000). Küf boyamada küflerin misel ve spor yapılarının mikroskopta görüntülenmesi için yapılır.Lama önce boya çözeltisi konur,üzerine bir miktar agarla birlikte alınan küf miselleri yerleştirilir,lamel kapatılarak mikroskopta incelenir. Gıda sanayiinde boyama yöntemlerinden yararlanarak mikroorganizmaların morfolojik özellikleri belirlenir.Böylece hangi tip mikroorganizma oldukları anlaşılır.Buna göre,mikroorganizma gelişimini önleyici tedbirler alınır. MATERYAL VE METOT Dilüsyon hazırlanması Materyal -Kıyma örneği -Fizyolojik Tuz Çözeltisi -Mekanik çalkalayıcı -Pipet -Deney tüpleri -Pens Uygulama Gıda maddesinden(kıyma) steril pens ve bistüri yardımıyla steril petri kutusuna 10±0.4g tartılır. Kıyma ve bir erlen içerisinde önceden otoklavda steril edilmiş 90 ml fizyolojik tuz çözeltisi,mekanik çalkalayıcıya konur.Mekanik çalkalayıcı cihazında 5 dak,250 devirde homojenize edilir.Böylece örnek 1:10 oranında seyreltilmiş olur (Şekil 1). Homojenizasyonu tamamlanmış gıda maddesinden steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak içerisinde 9 ml dilüsyon sıvısı bulunan tüpe ilave edilir.Böylece örnek 1:100 oranıda seyreltilmiş olur. 10-2 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:1000 oranında seyreltilmiş olur. 10-3 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:10000 oranında seyreltilmiş olur. 10-4 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:100000 oranında seyreltilmiş olur. Böylelikle,kıyma örneğinin 10-2 , 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları ekim için hazırdır. Yayma Plak Yöntemi ile Ekim Yapılması Materyal -Kıyma örneği dilüsyonları -Katı besiyerleri (PCA ve MEA) -Pipet -Drigalski -Bunzen Beki -Tüp karıştırıcı -İnkübatör Uygulama Yayma plak yöntemiyle, PCA besiyerine kıyma örneğinin 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları ekilir.PCA besiyeri genel amaçlı bir besiyeridir. 10-5 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 10-5 dilüsyonundan alınarak, içerisinde PCA katı besiyeri bulunan petri kutusuna 0.1 ml ekilir.Petri kutusunun üzerine 10-6 yazılır.Sonra 10-4 dilüsyonundan aynı şekilde bir diğer petri kutusuna ekim yapılır.Petri kutusu üzerine 10-5 yazılır.Daha sonra, 10-3 dilüsyonundan ekim yapılır.Petri kutusuna 10-4 yazılır. Drigalski adı verilen steril bir cam baget vasıtasıyla ekilen kısım (inokulum) petri yüzeyine yayılır.Ancak drigalski kullanımından önce alkole daldırılıp,bunzen beki alevinden geçirilmelidir.Böyle bir yol izlendiğinde, drigalski ekim öncesinde besiyerinin boş kısmına değdirilerek soğutulmalıdır. PCA besiyerlerini içeren petri kutuları ters çevrilerek inkübatöre konur.PCA için 35-37 °C de 48 saat yeterlidir. Yayma plak yöntemiyle, MEA besiyerine kıyma örneğinin 10-1 ve 10-2 dilüsyonları ekilir.MEA maya ve küflerin teşhisi,izolasyonu ve sayımlarında yararlanılan bir besiyeridir. 10-2 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 10-2 dilüsyonundan alınarak içerisinde MEA katı besiyeri bulunan petri kutusuna 0.1 ml ekilir.Petri kutusunun üzerine 10-3 yazılır.Sonra 10-1 dilüsyonundan aynı şekilde bir diğer petri kutusuna ekim yapılır.Petri kutusu üzerine 10-2 yazılır. Drigalski adı verilen steril bir cam baget vasıtasıyla ekilen kısım (inokulum) petri yüzeyine yayılır. MEA besiyeri düz bir şekilde inkübatöre konur.MEA maya ve küfler için genel bir besiyeridir.Mayalar için, 25 °C de 3 gün,küfler için 25 °C de 2 gün inkübe edilir. Dökme Plak Yöntemi Materyal -Kıyma örneği dilüsyonları -Katı besiyeri (VRBGA) -Pipet -Tüp karıştırıcı -Bunzen Beki -İnkübatör Uygulama Dökme plak (pour plate) yönteminde,steril,boş petri kutusuna önce ekim yapılıp,üzerine yaklaşık 45° C ye kadar soğutulmuş besi yeri dökülür. Kıyma örneğinin 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları VRBGA besiyeri için ekilecektir. VRBGA koliform ve Enterobacteriacea tanımlaması için kullanılan bir besiyeridir. Ekim işlemine en son dilüsyondan başlanır.10-5 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 1 ml alınarak petri kutusuna ilave edilir.Petri kutusu üzerine dilüsyon ile aynı seyreltme oranı yazılmalıdır. 10-3 ve 10-4 dilüsyonlardan da benzer şekilde ekim yapılarak, işlem tamamlanır (Şekil 2). Yaklaşık 45 °C ye soğultulmuş VRBGA besiyeri petri kutusuna ilave edilir.Petri kutusu inokulum ile besiyeri karışımının sağlanması için sekiz çizerek yavaşça karıştırılır. Karıştırma sırasında petri kutusu kapağına bulaşma olmamasına ve agarın petri kutusundan taşmamasına dikkat edilmelidir. Petri kutuları ters çevrilerek inkübatöre konur.VRBGA besiyeri için, 37 °C de 24-48 saat inkübe edilir. NA Besiyerine Sürme Ekim Yapılması Materyal -Öze -Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü -Tüp karıştırıcı Uygulama Sürme ekim yöntemi öze kullanılarak gerçekleştirilir.Bu yöntem tek koloni düşürme tekniği olarak da anılmaktadır. Sıvı besiyerinden Öze ile Ekim Sıvı besiyerini (kıyma örneği) içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılır.Böylece, sıvı besiyerindeki mikroorganizmaların bulundukları sıvı içinde homojen dağılımı sağlanır. Öze sağ elde kalem gibi tutularak uç kısmı Bunzen beki alevinin mavi kısmına daldırılır ve öze dike yakın bir konuma getirilir.10-15 saniye özenin soğuması için beklenir. Sol elde bulunan tüpün ağzındaki pamuk tıkaç,öze tutulan elin parmaklarıyla tüp hafifçe ekseni etrafında çevrilerek açılır. Tüpün ağız kısmı alevden geçirilir ve tüp hafif eğilerek öze ucu sıvı besiyerine daldırılır.Bir öze dolusu örnek alınır. Steril agarlı besiyerini (NA) içeren petri kutusu sol elin ayası içine alınır. İşaret parmağı destek vazifesi görürken,baş parmak aracılığıyla kapak aralanır.Öze bu aralıktan içeri sokularak,öze ucunun örnek alınan kısmı agar yüzeyinin seçilecek bir bölgesine temas ettirilir.Örnek bu bölgede hafifçe ezilerek birkaç mm çapında yayılır.Öze ile bu yayılma alanından başlayarak sürme işlemine geçilir Katı Besiyerinden Öze ile Ekim Öze sağ elde kalem gibi tutularak uç kısmı Bunzen beki alevinin mavi kısmına daldırılır ve öze dike yakın bir konuma getirilir. PCA besiyerini içeren petri kutusunun kapağı alevin yanında aralanır ve öze bu aralıktan içeri sokularak,besiyerinin boş bir alanında soğutulur. Steril özenin ucu PCA besiyerindeki üreme bölgesine veya koloniye hafifçe temas ettirilerek ya da sürülerek örnek alınır. Steril agarlı besiyerini (NA) içeren petri kutusu sol elin ayası içine alınır. İşaret parmağı destek vazifesi görürken,baş parmak aracılığıyla kapak aralanır.Öze bu aralıktan içeri sokularak,öze ucunun örnek alınan kısmı agar yüzeyinin seçilecek bir bölgesine temas ettirilir.Örnek bu bölgede hafifçe ezilerek birkaç mm çapında yayılır.Öze ile bu yayılma alanından başlayarak sürme işlemine geçilir (Temiz, 2000). Endospor Boyama Materyal -Lam -Öze -Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü -Boya çözeltileri; Malachite yeşili,safranin -% 95′ lik etil alkol -Kurutma kağıdı -İmmersiyon yağı -Mikroskop(100X obj.) Malachite Yeşili Malachite green 5g Distile su 100ml Safranin Safranin 0.5g Distile su 100ml Uygulama Preparat hazırlanması Lam steril bir pensle tutulup alkole daldırılır,sonra aleve tutulur.Mikroorganizmalar uzaklaştırılmış olur. Lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır. Öze bek alevinde sterilize edilir,soğuması için beklenir. Steril öze ile katı besiyerinden (NA, 10-3 katı besiyerinden ) bir miktar kültür alınır. Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır. Preparatın kuruması için bir süre beklenir. Bir steril pensle bir ucundan tutulan lam bunzen alevinden 20 kez geçirilir.Böylece mikroorganizma lam üzerine tespit (fiksasyon) edilmiş olur. Boyama Preparatın üzeri kurutma kağıdı ile kaplanır,üzerine malachite yeşili çözeltisi dökülür. Preparat hafif alev üzerinde 5 dakika ısıtılır.Ancak preparat kurutulmamalıdır.Gerekirse üzerine boya ilave edilmelidir. Preparat musluk suyu ile 10 saniye yıkanır. Karşıt boyama için safraninle 15 saniye boyanır. Su ile yıkanır,kurutma kağıdıyla kurutulur. İmmersiyon yağı damlatılarak (100X) objektifle incelenir. Küf Boyama Materyal -Lam -Öze -Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü -Boya çözeltileri; laktofenol -% 95′ lik etil alkol -Kurutma kağıdı -İmmersiyon yağı -Mikroskop(100X obj.) -Lamel Küf Boyama İçin Laktofenol Çözeltisi Laktik asit 20g (16ml) Gliserol 40g (31ml) Fenol kristalleri 20g Anili blue 0.05g Distile su 20 ml Uygulama Lam üzerine 1 damla laktofenol damlatılır. Öze alevde kor haline getirilir,agarın (MEA,10-3) kenarında soğutulur.Ucu yuvarlak ve yumuşak öze yerine sert,düz öze kullanılmalıdır. Öze yardımıyla koloninin kenarından,bir parça agar ile birlikte kültür alınır.Bunun nedeni; küfün asıl yapısının agara nüfus etmiş olmasıdır. Boya çözeltisinin üzerine konur. Üzerine 1 damla alkol damlatılır. Kültürün üzeri arada hava kalmayacak şekilde kapatılır.Eğer hava kabarcığı varsa bir özenin sapıyla lamel üzerine hafifçe bastırılarak bu kabarcık giderilmeye çalışılır. Önce (10x) objektif,sonra (40x) objektif ve en son yağ damlatılarak (100x) objektifle incelenir. Pratik Yol Lam üzerine 1 damla laktofenol damlatılır. Bir bantla küf agardan alınır. Lamın üzerine yapıştırılır. Mikroskopta incelenir. BULGULAR VE TARTIŞMA Violet Red Bile Glucose Agar besiyeri ile yapılan dökme plak yöntemiyle ekim sonucunda koliform bakteriler yerine küf gelişimi gözlenmiştir.Bu küfler havadan besiyerine bulaşmıştır. Malt Extract Agar besiyerine yapılan yayma plak yöntemiyle ekim sonucunda maya ve küf gelişimi gözlenmiştir.Ancak, koloniler çok yoğun olduğu için sayım yapılamamıştır. Plate Count Agar besiyerine yapılan yayma plak yöntemiyle ekim sonuçları: M.o. sayısı (cfu-g)=petrideki Mo sayısıxseyreltme faktörü*/petri kutusuna ekilen miktar(ml) Seyreltme faktörü=1/seyreltme oranı PCA (10-5 ) deki koloni sayısı=8 PCA (10-5 ) deki koloni sayısı=10 PCA (10-4 ) deki koloni sayısı=9 PCA (10-4 ) deki koloni sayısı=19 Koloni sayıları 25 koloniden az olduğu için sayım yapılamaz. Nutrient Agar besiyerlerine sıvı besiyerinden ve katı besiyerinden yapılan öze ile ekim işlemleri sonucunda besiyerlerinde bakteri,maya ve küf gelişimi gözlenmiştir. NA 10-3 katı besiyerinden bir miktar kültür alınarak yapılan endospor boyama sonucunda mikroskopta (100x objektif) uzun çubuk şeklinde sporlu bakteriler (Lactobaciller) gözlenmiştir.Bakterilerin sporları yeşil,vejetatif hücreleri ise pembe-kırmızı renkte görünmektedir(Şekil 4). MEA 10-3 katı besiyerinden bir miktar kültür alınarak yapılan küf boyama sonuçları, önce (10x) objektif, sonra (40x) objektif ve en son yağ damlatılarak (100x) objektifle incelenmiştir.Sonuçta Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir (Şekil 5). SONUÇLAR Dilüsyon yöntemiyle, kıymadaki canlı mikroorganizma sayısı belirlenmiştir. Örneğin uygun seri dilüsyonları hazırlanarak uygun agarlı besiyerlerine ekimleri gerçekleştirilmiştir.Yayma plak yöntemiyle Plate Count Agar ve Malt Extract Agar;dökme plak yöntemiyle de Violet Red Bile Glucose Agar besiyerlerine ekimler yapılmıştır.İnkübasyon sonucunda koloniler sayılmıştır.Nutrient Agar besiyerlerine, sıvı besiyerinden öze ile ve katı besiyerinden (PCA) öze ile sürme ekim yapılmıştır.Yapılan izolasyon sonucundan kısmen izole koloniler elde edilmiştir. NA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak endospor boyama yapılmıştır.Mikroskopta Lactobaciller gözlenmiştir. MEA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak küf boyama yapılmış ve Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir. REFERANSLAR HARRIGAN, W.F.1998.”Laboratory Methods in Food Microbiology.”3rd ed.Academic Press,New York. TEMİZ,AYHAN.2000.”Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri”.3rd ed.Hatiboğlu Yayınevi,Ankara. DART,R.K.1996.”Microbiology For Analytical Chemist”.3rd ed.Redwood Books Ltd,Cambridge. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİNDE GÜVENİLİR SONUÇLARIN ALINMASI İÇİN STANDART YÖNTEMLERİN UYGULANMASI Antibiyogram test için pratikte en yaygın kullanılanı “Disk Diffüzyon” (Kirby-Bauer) yöntemidir. Belirli bir miktar antibiyotik emdirilmiş kağıt diskler, test mikroorganizmasından hazırlanan standart süspansiyonun yayıldığı agar plakları yüzeyine yerleştirilir. Böylece diskteki antibiyotik agarın içerisine gittikçe azalan miktarlarda yayılır ve bakteriye etkili olduğu düzeylerde üremeyi engeller. Bunun sonu-cunda disk çevresinde bakterilerin üremediği dairesel bir inhibisyon alanı oluşur (inhibisyon zonu). İnhibisyon zonunun çapı, bakterinin duyarlılığı ile direkt olarak ilişkilidir. Her antibakteriyel için standart değerler vardır. Disk etrafında inhibisyonun görülmemesi, bakterinin o antibakteriyele karşı dirençli olduğunu gösterir. Bu alanın çapı ölçülerek duyarlı (S), orta duyarlı (I) ve dirençli (R) olacak şekilde duyarlılık dereceleri belirlenir. KIRBY-BAUER DİSK DİFFÜZYON YÖNTEMİ İLE ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ 1- KOLONİ SEÇİMİ: Hastalık etkeni olarak izole edilen ve tanımlanan, 18–24 saatlik üremiş olan bakteri kolonilerinden 3-4 tanesi seçilir. Steril koton bir sıvab kullanılması tercih edilir. 2- İNOKULUM SÜSPANSİYONUNUN HAZIRLANMASI: 5 ml’lik tüp içindeki Mueller-Hinton Broth veya Tryptone Soya Broth’a, agardan alınan 3-4 bakteri kolonisi süspanse edilir. Sıvab tüpün dibine daldırılır,karıştırılır ve bu şekilde alınan kolonilerin Broth’a iyice süspanse olması sağlanır. Sıvab tüpün iç cidarlarına bastırılarak çıkarılır. 2 A- Direkt koloni süspansiyonu yöntemi • Tüm Stafilokoklar • Zor beğenen, önceden Broth içinde üremesi bilinemeyen Streptokoklar 2 B- Log Faz Büyüme yöntemi • Bütün organizmalar için bu yöntem kullanılır • 35° C’de 2-8 saat inkube edilir • Eğer bulanıklık bu saatler içinde yeterliyse bir üst basamağa geçilir • Eğer bulanıklık bu saatler içinde yeterli değilse inkubasyona devam edilir 3- İNOKULUMUN STANDARDİZASYONU: Test süspansiyonunun bulanıklılığı, 2-8 saat üreme sonunda, 0.5 McFarland Standardı ile eşleştirilerek (1.5 x 108 CFU/ml tekabül eden) standardize edilir. Gözle bulanıklık ayarlaması yapılırken hem standardın hem de süspansiyonun çok iyi karıştırıldığına dikkat edilmelidir. 0.5 McFarland Standardının hazırlanması: 0.05 ml % 1.175 Barium Chloride dihydrate (BaCl2. 2 H2O) ile 9.95 ml % 1 sulfuric acid (H2SO4) karıştırılır. Tüplere 5-6 ml olacak şekilde bölünerek buzdolabında saklanır. a- Her iki yöntemde de Süspansiyon çok yoğunsa; • Kullanılan Broth’la veya fizyolojik tuzlu su ile tamamlanır, vortex ile karıştırılır b- Direkt koloni Süspansiyon yönteminde süspansiyon açık renk ise; • Seçilen kolonilerden ilave edilebilir, vortex ile karıştırılır. c- Log Faz yönteminde süspansiyon açık renk ise; • Süspansiyon tekrar inkube edilir, kullanmadan önce vortex ile karıştırılır. 4- PETRİLERE İNOKULUM YAPILMASI: Steril bir koton sıvab süspansiyonun içerisine daldırılır, karıştırılır. Sıvab tüpün iç kenarına bastırılarak çıkarılır. Agar’ın bir tarafından başlanarak tüm yüzeye yayılır. 60 döndürülerek aynı işlem tekrarlanır. Tekrar 60 döndürülerek aynı sıvab ile aynı işlem yapılır. Dördüncü defa sıvab agar’ın petri kenarlarındaki yüzeyine çepeçevre sürülerek işlem tamam-lanır. Agar’ın yüzeyinin kuruması için oda ısısında 10-15 dakika beklenir. 5- ANTİMİKROBİYAL DİSKLERİN YERLEŞTİRİLMESİ Antibiyotik diskleri oda ısısına getirilir. Aynı gruptaki antibiyotiklerin etki mekanizmaları aynıdır. Mümkün olduğu kadar çok sayıda farklı grup antibiyotik diski ile test yapılmalıdır. 150 mm çapı olan petrilere 12 disk, 100 mm olan petrilere 8 diskten fazla yerleştirilmemelidir. Diskler arasında 20 mm mesafe olacak şekilde diskler steril bir pens ile agarın yüzeyine yerleştirilir. Hafifçe üzerlerine pens ile bastırılarak disklerin agarla temasının tam olması sağlanır. Firmalar tarafından örnek olarak verilen antibiyotik diskleri bu metod ve aynı besi yerleri kullanılarak referens suşlarla valide edilerek spesifize edilmişlerdir. 6- MUELLER-HİNTON BESİ YERİNİN İNKUBASYONU 35° C’de 16 – 18 saat inkube edilir. Aerob olanlar, oksijenli (O2) ortamda, anaerob olanlar ise, jarda % 3-10 karbon dioksit (CO2) veya desikatörde oksijensiz ortam (mum yakarak) sağlamak suretiyle, etüvde üretilirler. Jarda yapıldığı taktirde 90-100 mm çaplı petriler tercih edilmelidir. 7- ZONLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ Siyah bir zemin üzerinde disklerde dahil olmak üzere zon çapı cetvel ile ölçülür. Disklerle birlikte verilen zon çapları, ölçüm sonrası her bir disk için ayrı ayrı değerlendirilmelidir. 8- SONUÇ Zon Çapının Tanımlanması: a- Duyarlı (Susceptible, S) Enfeksiyonun önerilen dozda o ilaç ile başarılı bir şekilde tedavi edilebileceğini gösterir. b- Orta derecede Duyarlı (İntermediate, I) İlacın normalden yüksek dozlarının kullanıldığında klinik olarak etkili olacağını gösterir. c- Dirençli (Resistant, R) Tedavide güvenilir bir etkinlik yoktur. Antibiyotik duyarlılık testlerinin sonuçlarının tekrarlanabilir olması, yani aynı koşullarda tekrarlandığında sonuçların aynı veya birbirine yakın olması gerekir. Testlerin uygun koşullarda yapılıp yapılmadığı, kalite kontrol suşları ile (referens suşlar) denetlenir. Bu suşlarla beklenen sonuçlar elde edilemezse antibiyotik duyarlılık testlerinin tekrarlanması gerekir. En son olarak: DOĞRU UYGULANAN VE YORUMU DOĞRU YAPILAN ANTİBİYOGRAM SONUÇLARI KLİNİKTE ANTİBİYOTİK TEDA-VİSİNİN AKILCI OLARAK PLANLANMASINA IŞIK TUTACAKTIR. EKLER: 1- Tryptone Soya Broth (TSB) Casein pepton (pancreatic) 17.0 g Soymeal pepton (pancreatic) 3.0 g D (+) –Glucose 2.5 g NaCl 5.0 g K2HPO4 2.5 g Distilled Water 1000.0 ml Distile su içinde kaynatılarak çözülür. 121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Oda ısısına soğutulur. pH 7.3 ± 0.2 Steril olarak, steril tüplere 5 – 6 ml olacak şekilde taksim edilir. Buzdolabında saklanır. 2- MUELLER-HINTON BROTH Meat infusion 2.0 g/L Casein hydrolysate 17.7 g/L Starh 1.5 g/L Distilled Water 1000 ml Distile su içinde kaynatılarak çözülür. 121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Oda ısısına soğutulur. pH 7.3 ± 0.2 Steril olarak, steril tüplere 5 – 6 ml olacak şekilde taksim edilir. Buzdolabında saklanır. 3- MUELLER-HINTON AGAR Meat infusion 2.0 g/L Casein hydrolysate 17.7 g/L Starh 1.5 g/L Agar-agar 17.0 g/L Distilled Water 1000 ml Distile su içinde kaynatılarak çözülür. pH 7.3 ± 0.2 (oda ısısında) 121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Otoklav sonrası 45-50 derece’de soğutulup, gerekli ise % 5-10 defibrine kan ilave edilir ve steril petri kutularına yaklaşık 12.5 ml olacak şekilde dökülür. Oda ısısına soğutulur. Buzdolabında saklanır. YARARLANILAN KAYNAKLAR 1- Aksoy, A. Murat ( 2006-2007 ): Bakterilerin İzolasyon ve İdantifikasyon Yöntemleri, Labotatuvar Uygulama Kılavuzu. 2- Türk İnfeksiyon Web Sitesi 3- Gür, Y : Antibiyotik Kullanımında Genel Prensipler. 4- Antimicrobial Susceptibility Testing By CLSI (NCCLS) Reference Disk Diffusion Method (Kirby-Bauer).  

http://www.biyologlar.com/mikrobiyoloji-odevi

Saf Kültür İzolasyonu Mikrobiyoloji

İncelenecek örnekten, petri kutusundaki uygun agarlı bir besiyerine tek koloni düşürme tekniği ya da yayma tekniği kullanılarak ekim yapılır. Petri kutuları uygun sıcaklık ve sürede inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası petri kutularında oluşan, birbirine temas etmeyen ve izole edilmek istenen mikroorganizmanın özelliklerine uygun olan koloni öze, kürdan veya aşı iğnesi yardımı ile sıvı bir besiyerine aktarılır. İnkübasyonun ardından izolatın saf olup olmadığını incelemek amacıyla saflık kontrolü yapılır. Saflık kontrolü için petri kutusundaki agarlı besiyerine sürme yapılarak inkübasyon sonrası burada oluşacak koloninin şekil, büyüklük, yapı, renk gibi özellikleri incelenir. Farklı özelliğe sahip koloni varlığı gözlendiğinde, bu durum kültürün karışık olması anlamına gelir ve tekrar tek koloni alınarak saflık kontrolüne kadar işlemler tekrarlanır. Besiyerinde aynı tip koloni gözlense bile tek koloni alınarak reizolasyon işlemi yapılması da genel olarak önerilmektedir.

http://www.biyologlar.com/saf-kultur-izolasyonu-mikrobiyoloji

S.mansoni live worm pair

S.mansoni live worm pair

  A short movie of an S.mansoni wormpair. This movies shows the worms under a microscope, the female is protected by her mate, sheltering between his folds, much like a banana. On the right side you can clearly see the suckers of the male worm, these suckers are used to move around the vessels, or some cases the petridish.

http://www.biyologlar.com/s-mansoni-live-worm-pair

Scientists uncover the way a common cell enzyme alerts the body to invading bacteria

Biomedical investigators at Cedars-Sinai have identified an enzyme found in all human cells that alerts the body to invading bacteria and jump-starts the immune system.

http://www.biyologlar.com/scientists-uncover-the-way-a-common-cell-enzyme-alerts-the-body-to-invading-bacteria

New clues found to how 'cruise-ship' virus gets inside cells

New clues found to how 'cruise-ship' virus gets inside cells

Researchers at Washington University School of Medicine in St. Louis have identified the protein that norovirus -- shown here in a colored transmission electron micrograph -- uses to invade cells

http://www.biyologlar.com/new-clues-found-to-how-cruise-ship-virus-gets-inside-cells

Şişme Deneyi

Jel halindeki kolloid cisimlerin katı hallerini değiştirmeden su alarak hacimlerini ve ağırlıklarını arttırmaları olayına şişme denir. Her sıvı emme olayı şişme değildir, şişmede amaç hacim artışıdır. a) Şişmenin anlamı : Küp şeklinde tahta parçaları ve tebeşir parçaları alınarak ağırlık ve hacimleri saptanır. Değerler tabloya yazılır. Daha sonra parçalar suya atılır ve 30 dakika sonra tekrar ağırlık ve hacimleri ölçülür. Tebeşir parçalarının ağırlıkları ................, ancak hacimleri ..................... Çünkü tebeşir porlu bir yapıya sahiptir ve suya konulunca porların arasındaki hava çıkar, yerine su girerek .................. ......... neden olur. Yani tebeşirde şişme olayı ........................, sadece sıvı emmiştir. Tahta parçalarının ağırlıkları ve hacimleri ............... çünkü tahta parçası kuru iken miseller sıkı sıkıya bir arada tutulur, suya konunca su molekülleri miseller arasına girerek miselleri birbirinden ayırır ve böylece hacim .......................... (Burada şişme teğetsel yöndedir). Dolayısıyla tahta parçasının hem ağırlığının hem de hacminin ............................ olması tahta parçasında şişme olayının olduğunu kanıtlar. b) Şişmenin basıncı: Filtre kâğıdıyla kaplanmış bir cam huninin içine yarıya kadar yumuşak alçı hamuru dökülür ve içine kuru bezelye taneleri konduktan sonra tekrar alçı hamuruyla kapatılıp katılaşmaya bırakılır. Alçı sıvasının Özellikleri: Karışım Suyu .................1 kg alçıya 0,6,0-0,65 lt su. Donma Sonu....................150-180 dakika Kullanım Süresi................60 dakika Konik şekilde donan alçı huniden çıkarılarak bir petri kabına konur ve alçıdaki ........................ alan tohumlar .......................... alçıyı parçalarlar. Bu da bize şişen cismin artan hacimle beraber bir ......................... yarattığını gösterir. c) Şişmenin kantitatif ölçümü: Kuru bir bitki parçasına geçirilen tek halkalardan biri çengelle tutturulur. Tahtanın ucundaki diğer halka küçük bir makaradan geçen ve uç kısmında ağırlık bulunan bir ipliğe bağlanır. Sistemdeki küçük dairenin merkezine tutturulan bir gösterge, üzerinde milimetrik bir kâğıt bulunan büyük bir daireye düşülür ve kâğıda değdiği nokta başlangıç olarak işaretlenir. Şişmesi izlenecek olan parça suya batırılır ve şişme laboratuar süresince milimetrik kâğıttaki göstergenin hareketinden izlenir. Şişme derecesi 15 dakikada bir ibrenin cetvel üzerindeki hareketinden okunarak tabloya kaydedilir ve sonuçlara göre 24 saat sonunda bir grafik çizilir. d) Ölü dokularda şişme ile ilgili hareketler : I - Anizotrop şişme : Açılmış olan çam (Pinus sp.) kozalakları alınarak sıcak su içerisine bırakılır. Bir süre sonra kozalaklar ...........Çünkü kozalak pulunun iç ve dış yüzeyi değişik şişme özelliği gösterir. Helichrysum'un (saman çiçeği) çiçek involukrumları kuru iken açıktır, sıcak suya batırıldığında su emerek hacimlerini .................. ve içeri doğru ......................... Pisum (bezelye) legümenleri alınarak sıcak suya konursa kıvrık olan legümenin ................................. görülür. II - Ölü dokulardaki hareketlerin kağıt modellerle taklidi : Bir saman kâğıdı tabakasından lif yönleri enine ve boyuna olan 2 şerit kesilerek soğuk suda ıslatılır. Fazla suyu bir bezle alınarak zamkla bunlar birbirine yapıştırılır ve alevde kurutulursa enine lifler fazla şiştiği için kuruyunca ............ve ..... ...... .............. görülür. Ayrıca lif yönleri çapraz olan kağıt tabakalarından 2 şerit kesilerek yukarıdaki işlemlere tabi tutulur ve bunların uzama yönleri birbirine zıt olduğundan kuruyunca ........................ bir yapı kazanırlar.

http://www.biyologlar.com/sisme-deneyi

Klorofil ve Karotenoidler Deneyi

Bir havan içine hücrelerin parçalanmasını kolaylaştırmak için kum ve alkol konup Urtica sp. (ya da koyu yeşil yapraklı başka bir bitki taflan) yaprakları da ilave edilip iyice ezilir. Koyu yeşil renkte boyalı bir eriyik elde edilir, buna ham klorofil eldesi adı verilir. Bu ham extre fluoresans özelliği gösterir, beyaz ışığa tutulursa ............ ................. renkte görülür. Ham klorofil extresi hem klorofil hem de karotin ve ksantofil boyalı maddelerini içermektedir. Bunları ayırmak için extre filtre kâğıdından süzülür, süzülen bu berrak yeşil extreden bir miktar deney tüpüne alınıp üzerine aynı miktar benzen ve bir kaç damla su ilave edilerek çalkalanır. Su karıştırılmasının yararı alkol karışımının yoğunluğunu arttırıp benzenin kolayca tüpün üstünde toplanmasını sağlamaktır. Bir süre sonra tüpün üst kısmında benzende eriyen ..................., alt kısmında ise alkolde kalan ............ renkli ................. ve .................... bulunur. Kağıt Kromotografisi İle Boyalı Maddelerin Ayrılması : Bu yöntemde klorofil, karotin ve ksantofil gibi boyalı maddeler molekül ağırlıkları ve absorpsiyon derecelerine göre ayrılır. Bir petriye berrak klorofil extresinden bir miktar konur ve içine genişçe bir şerit halinde filtre kağıdı ve tebeşir batırılır. Kağıdın ve tebeşirin üst kısmında sarı renkli .................. ve .................., alt kısmında ise yeşil renkli .............. toplandığı görülür. Bu kademeli renk farkı klorofilin ve karotenoidlerin gerek molekül ağırlıklarının gerekse absorpsiyon derecelerinin farklı olmasından ileri gelir. Karotenoidlerin absorpsiyon derecesi klorofile oranla ................................................... olduğundan üst kısımlara hareket eder. Elektro Kromotografi İle Madde Ayrılması : Aşağıdaki düzeneği kurun. Anot(-) ve katot(+) bağlı olan havuzlara 300ml (3gr NaCl+5 g NaHCO3). Lam arasına giren şerit halindeki kurutma kâğıda üzerine farklı renkli tükenmez kalemler işaret bırakın. Deney sonunda farklı renkli tükenmez kalemlerin hangi maddelerden oluştuğu yazın(her bant bir madde kabul edin) ………………Renk ………………………alt üniteden oluşmuştur. Örneğin kâğıt üzerinde çözücü 9 cm kadar ilerlemiştir. Bu noktadan sonra sırasıyla sarı-turuncu renkteki Karaten (orijin noktasından 7.7 cm uzakta), mavi-yeşil renkteki Klorofil a (orijinden 4.5cm uzakta), açık yeşil renkteki Klorofil b (orijinden 2.3 cm uzakta) ve son olarak sarı renkteki Ksantofil (orijinden 0.6cm uzaklıkta) belirmiştir. Rf sabiti bir pigmentin plaka üzerinde aldığı yolun çözücünün aldığı yola oranıdır. Bu oran her pigment için farklı ve sabit olduğu için pigmentler için karakteristiktir. Kâğıt tabaka kromatografisinde bir pigmentin ilerlediği yola göre onun hangi pigment olduğunu sayısal değerlerle bulabiliriz. Rf= Maddenin ilerlediği yol . Çözücünün ilerlediği yol Örneğin: Karotenin Rf değeri:7.7 cm =0.85 9 cm Klorofil a’nın Rf değeri: 4.5cm. =0.5 9cm Klorofil b’nin Rf değeri: 2.3 cm =0.25 9cm Ksantofil’in Rf değeri: 0.6 cm =0.06

http://www.biyologlar.com/klorofil-ve-karotenoidler-deneyi

Karotin Varlığının Saptanması

Havuçtan jiletle küçük ve ince parçalar alınıp bir tüp içine konur, üzerine bir miktar petrol eteri ilave edilerek iyice çalkalanır ve turuncu renk oluşur. Sonra petrol eterinde eriyen karotin çözeltisi bir petriye dökülerek petrol eterinin uçması beklenir. Petrol eteri uçtuktan sonra geriye turuncu renkli .......................... kristalleri kalır. İğne yapılı bu kristaller üzerine konsantre H2SO4 döküldüğü zaman karakteristik ................................. renk meydana gelir. Dikkat Bu laboratuarda kullanılan Hekzen tehlikeli bir çözücüdür Solunum yoluyla alınmaması gerekir. BENZEN kullanmayın kanserojendir. Alkol buharı baş ağrısı yapabilir.

http://www.biyologlar.com/karotin-varliginin-saptanmasi

Koliform grubu bakterıler ve bunlar hakkında bilgi

Koliform bakteriler gıda ve suların sıhhi durumunu gösteren göstergeç bakterilerdir. Tanım olarak çubuksu, Gram-negatif olup 35-37 °C'de laktoz fermante ederek asit ve gaz üretirler. Koliformlar sıcak kanlı hayvanların dışkılarında bolca bulunurlar, ama sulak ortamlarda, toprakta ve bitkilerde de bulunurlar. Coğu zaman kloliformalar kendileri hastalığa neden olmazlar ama kolay kültürlenirler, ve varlıkları dışkı kaynaklı zararlı patojenlerin de mevcut olabileceğine işaret eder. Dışkıya ait (fekal) patojenlere bakteriler, virüsler, protozoalar ve parazitler dahildir. Koliform bakterileri oluşturan cinsler arasında şunlar sayılabilir:[1] Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Serratia ve Yersinia. Escherichia coli (E. coli) bakterisinin diğer koliformlardan ayırdedici özelliği 44 °C'da laktoz fermantasyonu yapabilmesi, bazı özel kültür ortamlarında büyüyebilmesi ve bu ortamlarda oluşturduğu renktir. Genel koliform grubundan farklı olarak E. coli hemen tamamen dışkı kaynaklıdır ve onun varlığı dışkı kirlenmesinin açık bir belirtisidir. Koliform grup bakteriler, Enterobacteriaceae familyası içinde yer alan, fakültatif anaerob, gram negatif, spor oluşturmayan, 35 oC' de 48 saat içinde laktozdan gaz ve asit oluşturan, çubuk şeklindeki bakterilerdir. Bu grupta yer alan ve gıda mikrobiyolojisi açısından önemli olan mikroorganizmalar; Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae 'dir. Koliform grup mikroorganizmalara pek çok gıda hammaddesinde rastlanmaktadır. Bunların başında; taze sebzeler, taze yumurta, çiğ süt, kanatlı etleri ve koliform bakımından sayıca zengin sulardan alınan kabuklu ve diğer su ürünleri gelmektedir. Gıdalarda koliform mikroorganizmaların bulunması; kötü sanitasyon koşullarının, yetersiz veya yanlış pastörizasyon uygulamalarının, pişirme ve pastörizasyon sonrası tekrar bulaşma olduğunun bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. Koliform grubu mikroorganizmaların hepsi dışkı kökenli değildir. Bu grupta bulunan bakterilerden normal florası insanların ve sıcak kanlı hayvanların alt sindirim sistemleri olanlar "fekal koliform" olarak tanımlanmakta ve bunlar fekal kontaminasyonun bir göstergesi olarak kabul edilmektedirler. Koliform grup içinde fekal koliform olarak tanımlanan bakterilerin büyük çoğunluğunun E. coli olduğu bilinmektedir. Grubun diğer üyeleri toprak ve bitki kökenli olabilmektedirler. Herhangi bir örnekte E. coli 'ye ve/veya fekal koliform bakterilere rastlanması oraya doğrudan ya da dolaylı olarak dışkı bulaştığının ve yine bağırsak kökenli Salmonella ve Shigella gibi primer patojenlerin de olabileceğinin bir göstergesidir. Bu nedenle hiçbir gıda maddesinde, içme ve kullanma sularında, denizlerde ve göllerde E. coli ve fekal koliform bulunmasına izin verilmezken, bazı gıdalarda belirli sayıda koliform bakteri bulunmasına izin verilebilmektedir. E. coli fekal kontaminasyonun bir göstergesi olması yanında genetik yapısı en iyi bilinen canlı olma özelliğine de sahiptir. Suşlarının birçoğu zararsız olan bu bakterinin bazı patojenik tipleri, insan ve hayvanlarda sonucu ölüme kadar giden ishallere, yara enfeksiyonlarına,menenjit, septisemi, artheriosklerosis, hemolitik üremik sendrom, çeşitli immünolojik hastalıklar vb. gibi hastalıklara sebep olabilmektedir. 02. Analiz Yöntemleri Bir gıda maddesinde ya da herhangi bir materyalde E. coli aranma ve sayılması için kullanılan tüm standart yöntemler koliform grup aranmasına yöneliktir. Bu yöntemler en muhtemel sayı (EMS) yöntemi, katı besiyeri kullanılan yöntemler, membran filtrasyon yöntemi ve hızlı sayım yöntemleri olarak gruplandırılmaktadır. 02.01. En Muhtemel Sayı Yöntemi Genel olarak koliform grup/fekal koliform grup bakteriler / E. coli sayılmasında EMS yöntemi kullanılmakta ve yöntem üç aşamada uygulanmaktadır. Bu aşamalar sırasıyla: - Koliform grup bakterilerin muhtemel sayısını belirlemek, - Koliformların kesin sayısını onaylamak ve aynı anda farklı bir besiyerinde fekal koliformların sayısını belirlemek, - E. coli sayısını belirlemektir. Türk Standartları Enstitüsü (TSE) ve Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO)' nün koliform grup mikroorganizma aramak için kullanılan standart analiz yöntemlerine göre örnek hazırlanıp dilüsyonları yapıldıktan sonra ardışık 5 dilüsyondan 3 'er adet Lauril Sülfat Triptoz Broth (LST) besiyerine 1'er ml ekim yapılmakta ve 37 oC 'de 24 (gerekirse 48) saat inkübasyondan sonra pozitif sonuç veren tüpler muhtemel koliform olarak değerlendirilmektedir. Bu yönteme göre, muhtemel koliformların sayısını doğrulamak için de Brilliant Green Bile Broth (BGBB ) besiyerine ekim yapılmakta ve 37 oC 'de 24 (gerekirse 48) saat inkübasyondan sonra pozitif sonuç veren tüpler koliform grup olarak doğrulanmaktadır. TS 6063/ISO 7251 'e göre E. coli aranmasında analize koliform grupta olduğu gibi örneğin hazırlanıp dilüsyonlarının yapılmasından sonra, ardışık 5 dilüsyondan 3'er adet LST besiyerine 1 'er ml ekim yapılmakta ve tüpler 37 oC 'de 24 (gerekirse 48) saat inkübasyona bırakılmaktadır. Burada pozitif sonuç veren tüplerden, su banyosunda 44,5 oC 'de tutulan E. coli (EC) Broth besiyerlerine ekim yapılmakta ve gaz oluşumu için yine 44,5 oC 'de 24 (gerekirse 48) saat inkübe edilmektedir. Bu sürenin sonunda gaz oluşumu görülen tüpler fekal koliform olarak değerlendirilmektedir. Testin devamında EC Broth besiyerinde pozitif sonuç veren tüplerden 44,5 oC 'deki Tripton Water (TW) besiyerine ekim yapılmakta ve aynı derecede 48 saat inkübasyona bırakıldıktan sonra indol testi yapılmaktadır. Bu testin sonunda indol pozitif reaksiyon veren tüpler E. coli, negatif reaksiyon verenler ise E. coli dışındaki diğer fekal koliformlar olarak değerlendirilmektedir. Amerikan Resmi Analitik Kimyacılar Birliği (AOAC) 'nin koliform grup/E. coli aranması için önerdiği yöntem EMS yöntemidir. AOAC 'ye göre örnek hazırlanıp dilüsyonları yapıldıktan sonra, ardışık 3 dilüsyondan 3 'er adet LST besiyerine 1 'er ml ekim yapılmakta, 35 oC 'de 48 saat süren inkübasyondan sonra pozitif sonuç veren tüpler muhtemel koliform grup olarak değerlendirilmektedir. İkinci aşamada pozitif sonuç veren bu tüplerden BGBB ve EC Broth besiyerlerine ekim yapılıp, 35 oC 'de 48 saat inkübe edildikten sonra, BGBB tüplerinden alınan pozitif sonuçlar koliform grup olarak doğrulanmakta, 44,5 oC 'de 48 saate kadar inkübeedilen EC Broth tüplerinden alınan pozitif sonuçlar ise fekal koliform olarak kabul edilmekte ve sayılmaktadır. Son olarak EC Broth besiyerinde gaz pozitif tüplerden Eosin Metilen Blue Agar (EMB ) besiyerine sürme yapılarak, ayrıca gram boyama ve IMVEC testleri uygulanarak E. coli doğrulanmaktadır. Amerikan Halk Sağlığı Kuruluşu (American Public Health Association; APHA) tarafından özellikle suların mikrobiyolojik analizinde kullanılmak üzere önerilen Amerikan Standartları metoduna göre koliform grup/fekal koliform/E. coli aranmasında %0,5 Laktoz Broth (LB ) kullanılmaktadır. Bu yönteme göre; her biri 20 ml LB besiyeri içeren 15 adet tüpe, 5 X 10 ml, 5 X 1 ml ve 5 X 0,1 ml olacak şekilde ekim yapılmakta ve tüpler 35 oC 'de 24-48 saat inkübasyona bırakılmaktadır. İnkübasyon sonunda gaz oluşturan tüpler muhtemel koliform olarak kabul edilmektedir. Daha sonra gaz oluşturan bu tüplerden EMB agara sürme yapılmakta ve 35 oC 'de 24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. Eğer bu besiyerinde tipik E. coli kolonileri oluşmuş ise tamamlama testi yapılmakta, oluşmamış ise teste burada son verilmektedir. Tamamlama testinde EMB agardan birkaç değişik koloni alınarak LB fermentasyon besiyerine ve yatık Nutrient Agar (NA) besiyerine ekim yapılarak her iki besiyeri de 35 oC' de 24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. İnkübasyon sonunda LB besiyerinde gaz oluşmuş ve NA' dan alınan kolonilerde gram negatif sporsuz çubuk bakteriler tespit edilmiş ise su örneğinde koliform grup mikroorganizma olduğu kabul edilmektedir. Aynı kuruluş fekal koliform testi için EC Broth besiyerinde 44±0,2 oC 'de 48 saat inkübasyon sonunda gaz oluşumu görülen tüplerin fekal koliform olarak değerlendirilmesini önermektedir. Koliform grup mikroorganizma aranmasında kullanılan diğer bazı sıvı besiyerleri; LMX Broth, MOSSEL Broth, MacConkey Broth ve EE Broth' dur. 02.02. Katı Besiyeri Yöntemi Pek çok kuruluş tarafından koliform grup ve E. coli aranmasında standart yöntem olarak EMS yöntemi gösterilirken, özellikle izolasyon amaçlı sayım çalışmalarında katı besiyeri kullanılmaktadır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan besiyeri Violet Bile Red (VRB ) Agardır. Bu besiyerinde sayım yapılırken yayma, dökme ve çift tabaka dökme plak yöntemleri uygulanmaktadır. VRB Agar besiyerine alternatif olarak Petrifilm VRB yöntemi de kullanılabilmektedir. Bu yönteme göre VRB Laktoz Agar besiyeri kullanılması önerilmektedir. Besiyeri bileşiminde katılaştırıcı ajan olarak agar yerine soğuk suda çözülebilen bir madde kullanılmaktadır. Bileşenler kurutularak üzeri plastik film ile kaplanmış halde kullanıma hazır olarak satılmaktadır. Yönteme göre seyreltiden veya direkt örnekten 1 ml alınarak besiyeri üzerine ilave edilir. Plastik film üzerine basınç uygulanarak örneğin 20 cm2 alana yayılması sağlanır. 32±1 oC 'da 24±2 saat inkübasyondan sonra, etrafında bir veya daha fazla gaz kabarcığı görünen koloniler koliform olarak sayılır. Burada ister koliform olsun ister başka bir tür kolonilerin kırmızı renkli olacağı unutulmamalıdır. E. coli sayımında katı besiyeri olarak Triptik Soy Agar (TSA) besiyeri de kullanılmaktadır. Dökme plak yöntemi ile hazırlanan petri kutuları 35 oC 'de 2 saat inkübasyondan sonra besiyerinin üzeri ikinci tabaka olarak VRB Agar ile kaplanmakta ve inkübasyona 44,5 o C 'de 24 saat devam edilmektedir. Bu yöntemle, hasar görmüş E. coli hücrelerinin sayımında daha iyi sonuçlar alınmaktadır. Koliform bakteri izolasyonunda kullanılan diğer bazı katı besiyerleri; Enriched Lauryl Sulphate Aniline Blue Agar, Fecal Coliform Agar, Pepton Tergitol Glucuronide Agar, Deoxycholate Agar, Endo Agar, EMB Agar, Brillant Green Agar, XLD Agar' dır. 02.03. Membran Filtrasyon Yöntemi Hidrofobik Grid Membran Filtre (HGMF) tekniği, özellikle su ve diğer sıvı gıdaların analizinde kullanılmaktadır. Bu teknikte örnek önce bir membran filtreden geçirilerek mikroorganizmalar filtre üzerinde tutulmaktadır. Daha sonra bu filtreler uygun bir besiyeri üzerine, arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilmekte ve oluşan koloni sayısından materyaldeki mikroorganizma sayısı hesaplanmaktadır. Filtreler üzerinde bulunan birbirini dik kesen hidrofobik hatlar, oluşan kolonilerin dağılmasını önlemekte ve böylece sayım yapılmasını kolaylaştırmaktadır. HGMF tekniği ile E. coli sayımı AOAC tarafından standart analiz yöntemi olarak kabul edilmiştir. Membran filtrasyon tekniğinin bazı üstünlükleri bulunmaktadır. Bunlardan en önemlileri; örnekte az sayıda mikroorganizmanın bulunması durumunda bile belirleme imkânı vermesi ve inkübasyondan sonra filtrelerin kurutularak saklanabilmesidir. HGMF ile fekal koliform sayılmasında filtre, TSA besiyerine yerleştirilmekte ve kuru gıdalar için 25 oC 'de 4-5 saat, diğer gıdalar için 35 oC 'da 4-5 saat olmak üzere, hasar görmüş ve stres altındaki mikroorganizmaların tekrar aktivite kazanmalarını sağlamak amacı ile bir ön inkübasyon uygulanmaktadır. Filtreler buradan m-FC Agar besiyerine alınmakta ve 44,5 oC 'da 24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. İnkübasyon sonunda bir veya daha çok mavi renkli koloni gelişimi görülen alanlar belirlenmekte ve değerlendirme koliform sayımında olduğu gibi yapılmaktadır. HGMF tekniğinde amaca uygun olan her tür besiyeri kullanılabilmektedir. Bunlardan bazıları; m-T7 (membran Tegritol-7) Agar, Tamponlanmış Tripton Bile Agar, MI Agar, m-ENDO Agar, m-TEC (membran Thermotolerant E. coli) Agar, m-Coli Blue 24 Agar besiyerleri ve ticari olarak hazırlanmış (Sartorius) ve besiyeri emdirilmiş steril pedlerdir. 02.04. Koliform Grup ve E. coli İdentifikasyonu Uluslararası standart kontrol örgütleri tarafından E. coli 'nin doğrulama testleri olarak IMVEC testleri gösterilmektedir (I: İndol testi, M: Metil red testi, V: Voges-Proskauer testi, E: Eijkman testi veya 44,5±0,2 oC 'de gelişme testi, C: Sitrat testi). IMVEC testlerine ilaveten HOMoC testleri de yapılmaktadır (H: Hidrojen sülfür oluşum testi, O: Ornitin dekarboksilaz testi, Mo: Hareketlilik testi, C: Sitrat testi). Ayrıca; glikozdan gaz oluşumu, laktoz, mannit, sorbitol fermentasyon testleri, lisin dekarboksilasyonu, H2S oluşumu testleri koliform grup bakterilerin identifikasyonu için önerilen diğer bazı testlerdir. Bu testlerde koliform grup bakteriler ve E. coli 'nin test sonuçları çizelge 1 'de verilmiştir. 02.05. MUG ve Diğer Hızlı Analiz Yöntemleri AOAC tarafından bildirilen E. coli hızlı tayin yönteminde örnekten dilüsyonlar hazırlandıktan sonra ardışık 3 dilüsyondan 3'er adet LST Broth besiyerine inokülasyon yapılıp, tüpler kapalı su banyosunda 44,0±0,2 oC' de 24 saat inkübasyona bırakılmakta ve pozitif sonuç veren tüpler muhtemel E. coli olarak değerlendirilmektedir. Daha sonra bu kültürlerden EMB Agar besiyerine sürme yapılarak E. coli 'nin varlığı doğrulanmaktadır. Bu yönteme göre analiz süresi toplam 48 saattir. İlk kez 1982 yılında ortaya konulan MUG tekniği, son yıllarda E. coli sayımına yeni bir yaklaşım getirmiştir. Bu tekniğin prensibi; doğrudan besiyerinin ilave edilen ya da selektif katkı olarak ilave edilen 4-methyleumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) adlı bileşiğin E. coli 'de yapısal bir enzim olarak olarak bulunan β-D-glucuronidase (MUGase, β-GUR) enzimi tarafından 4-methyleumbelliferone adlı florojenik bir ürüne dönüşmesi ve bu ürünün de 366 nm uzun dalga boylu ultraviyole ışık altında floresan ışıma vermesi esasına dayanmaktadır. MUG, katı ve sıvı besiyerlerinin bileşimine kolaylıkla ilave edilebildiği için, EMS yöntemi, katı besiyerleri ve membran filtrasyon yöntemi ile yapılan koliform grup/E. coli analizlerinde kullanılmaktadır. β-D-glucuronidase pozitif olan bakteriler içinde indol pozitif olan tek bakteri E. coli 'dir. Bu nedenle E. coli dışında bazı β-D-glucuronidase pozitif Citrobacter, Enterobacter, Salmonella, Shigella suşlarının neden olduğu sahte pozitif reaksiyonlar indol testi ile belirlenebilmektedir. Ayrıca bazı E. coli suşları yoğun üremeye bağlı olarak aşırı miktarda asit oluşturmakta ve bu da floresan ışımayı maskelemektedir. Bu gibi durumlarda besiyerine 1 ml, 1 N NaOH ilavesi ile floresan reaksiyon kesinleştirilebilmektedir. Koliform grup/E. coli analizlerinde en fazla kullanılan MUG' lu besiyerleri LST Broth ile VRB Agar' dır. Bu besiyerlerinde inkübasyondan sonra UV ile floresan pozitif sonuç alındıktan sonra, doğrudan sıvı besiyerinde gelişen kültürün üzerine veya katı besiyerinde gelişen koloni üzerine Kovac's indol ayıracı damlatılarak indol testi yapılmakta ve böylece 16-18 saat gibi kısa bir sürede, floresan ve indol pozitif reaksiyon verenler E. coli olarak belirlenebilmektedir. Sıvı besiyerlerinde MUG kullanılan yöntemlerde, istenirse fekal koliform bakterilerin analizi de yapılabilmektedir. Ancak fekal koliform grubun %90'dan fazlasının E. coli olduğu düşünülürse buna ancak özel durumlarda gerek olacağı düşünülmektedir. Standart yöntemle 6 gün süren koliform grup/E. coli aranması ve sayılması MUG sistemi kullanıldığında 24-48 saatte yapılabilmektedir. Hatta sıvı besiyerlerinde 16-18 saatte gelişme olduğu düşünülürse analiz süresi oldukça kısalmaktadır. MUG sistemi kullanıldığında dikkat edilmesi gereken en önemli nokta kendiliğinden floresan veren cam tüplerdir. Analiz sonucu negatif olsa dahi bu tür tüplerde pozitifmiş gibi görünmekte ve bu da sahte pozitif sonuçların alınmasına neden olmaktadır. Bunu önlemek için besiyeri tüplere dağıtılmadan önce tüpler UV lamba ile kontrol edilmeli ve böyle tüpler kullanılmamalıdır. MUG içeren katı besiyerlerinde koliform grup / E. coli aranması ve sayılmasında yaygın olarak kullanılan besiyerinden birisi VRB Agar' dır. VRB+MUG Agar besiyerinde standart dökme ve yayma yöntemleri kullanılmaktadır. Eğer ekim yayma yöntemi ile yapılıyor ise çift tabaka ekim yapılmalıdır. Bu besiyerinde 35-37 oC 'de 16-18 saat inkübasyon sonunda oluşan tipik koloniler koliform grup, floresan veren koloniler ise E. coli olarak değerlendirilmektedir. Burada yine E. coli olan kolonilerin IMVEC testleri ile veya hızlı identifikasyon kitleri ile doğrulanması gerekmektedir. MUG yöntemi kromojenik substratlarla beraber kullanıldığında daha etkin ve çabuk sonuçlar alınmaktadır. Koliform grubu bakteriler için karakteristik olan β-D-galactosidase enzimi kromojenik bir substrat olan Salmon-GAL ile, E. coli için karakteristik olan β-D-glucuronidase enzimi ise yine kromojenik bir substrat olan X-glucuronide ile belirlenir. Kromojenik substratlar kullanılarak koliform grup ve E. coli aranması için geliştirilmiş besiyerlerinden birisi de Lauryl Sulphate-MUG-X-GAL (LMX) Brothdur. Bu besiyerinin bileşiminde 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto pyranoside (X-GAL) adı verilen kromojenik bir substrat ve MUG bulunmaktadır. Bu besiyerinde koliformlar ürediğinde kromojenik substrat parçalanmakta ve mavi-yeşil renk oluşmakta, E. coli ürediğinde ise MUGase varlığına bağlı olarak floresans ışıma oluşmaktadır. Bu sisteme göre hazırlanmış Readycult Koliform (Merck) arama kitleri de bulunmaktadır. Koliform grup/E. coli analizlerinde kullanılan enzimlerin adaptif değil yapısal nitelikte olması gerekmektedir. Enzimatik yönteme dayalı olarak geliştirilen Chromojenic E. coli/Koliform Medium (Oxoid) adlı besiyerinde, gıda ve diğer çevresel örneklerde bulunan E. coli ve koliformların ön tanısı 18 saatte yapılabilmektedir. Bu yöntem, besiyerinde bulunan iki kromojenik substrattan birinin, %97'si E. coli tarafından üretilen glukoronidaz enzimi tarafından parçalanarak mor koloniler oluşumuna neden olması; diğerinin ise yine büyük çoğunluğu koliform grup tarafından üretilen galaktosidaz enzimi tarafından parçalanarak kırmızı/pembe renkli koloniler oluşumuna neden olması prensibine dayanmaktadır. Besiyerinde oluşan bu mor ve pembe kolonilerin dışında saman sarısı koloniler de oluşmakta ancak bunlar renklerinden dolayı diğerlerinden kolaylıkla ayırt edilebilmektedir. Serolojik yöntemlerle koliform grup mikroorganizma aranmasında ilk akla gelen teknik Floresan Antikor (FA) Tekniğidir. Bu teknikte örnekten izole edilen mikroorganizmalar floresan bir madde ile işaretli antiserumla kaplanmış bir filtre üzerinde tutulmakta ve filtrenin floresan mikroskobu altında incelenerek belirlenmesi esasına dayanmaktadır. Bu yöntem daha çok su analizlerinde kullanılmaktadır. Koliform grup/E. coli aranmasında elektro kimyasal yöntemler de kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin esası gelişmekte olan bakteri kültüründe oluşan moleküler hidrojenin ölçülmesi, bakteri kültürünün ortama uyum sağlarken oluşan direncin ölçülmesi ve elektrot yüzeyi ile ilişki kurulduğunda bakteri yüzeyleri ile arada oluşan elektron transferinin ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Çiğ süt, yoğurt, dondurma ve pastörize krema gibi süt ürünlerinde koliform grup mikroorganizma aranmasında kullanılmak üzere geliştirilmiş BactometerTM mikrobiyel analiz cihazi impedans-kondüktans prensibine göre çalışmaktadır. Bu yönteme göre önce standart miktarda test örneği alınarak aletin inkübatör kısmına yerleştirilerek 35 oC' da 3 saat ön zenginleştirmeye bırakılır. Bu aşamada Coliform Medium (CM) besiyeri kullanılmaktadır. Ön zenginleştirme aşamasından sonra 1,5 ml örnek alınarak aletin inkübasyon kuyucuklarına yerleştirilip yine aynı derecede inkübasyona bırakılır. Kuyucuk içindeki test karışımı renginin menekşeden sarıya dönmesi koliform grup pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmektedir. Analiz cihazı bilgisayar donanımlı olduğu için sonuçlar direkt bilgisayara kaydedilebilmekte veya yazdırılabilmektedir. E. coli sayımında kullanılan hızlı yöntemlerden bir tanesi de BioSys (BioSys, Inc., Ann Arbor Mich.) optik ölçüm sistemidir. Yöntemin prensibi mikroorganizma gelişimi sonucu meydana gelen pH ve redoks değişimlerinin optik okuyucu yardımı ile ölçülmesi esasına dayanır. pH 'da meydana gelen değişiklikler besiyerinde bulunan brom cresol purple indikatörü yardımıyla tespit edilir. Burada indikatörün renginin değişmesi ile besiyerinden geçen ışık şiddetinde meydana gelen değişimler tespit edilmektedir. Bu yönteme göre önce uygun bir seyreltme çözeltisi içinde homojenize edilen örnekten 4,5 ml alınarak BioSys tüplerine aktarılır. BioSys tüplerinde %2 dekstroz ilave edilmiş çift kuvvetli Coliform Medium (bioMerieux Vitek Inc.) besiyeri bulunmakta olup ayrıca tüplerin dip kısmında agar içeren bir bölme bulunmaktadır. İnokülasyondan sonra tüpler aletin inkübasyon kısmına yerleştirilerek (42 oC) inkübasyon süresi boyunca sonuçlar optik okuyucuya kaydedilir. Bactometer ve BioSys analiz sistemleri ile E. coli sayımı 1-11 saatte gerçekleştirilebilmektedir.

http://www.biyologlar.com/koliform-grubu-bakteriler-ve-bunlar-hakkinda-bilgi

Mutasyon Oranı

Kültürlerde oluşan spontan mutasyonlar az çok sabit bir durum gösterebilir. Mutasyon oranı her generasyonda, her bir hücreye isabet eden mutasyon miktarı ile ölçülür. Mutasyonlar genellikle, replikasyon sırasında ve yeni sentezlenen iplikçiklerde meydana gelirler. Parental DNA'da mutasyon çok azdır. Mutasyon oranı (MO) aşağıdaki şekilde hesaplanır. Ms MO = ¾¾¾¾¾ N1-No MO: Mutasyon oranı Ms: Mutasyon sayısı N0: Başlangıçtaki mikrop sayısı N1: Bir generasyon sonra mikrop sayısı Yukarıdaki formül yanı sıra, mutasyon sıklığını hesaplamada Poisson dağılımı formülünden de fazlaca yararlanılır. P(x)= ( mx/X!) e¾m e: Doğal logaritma (2.178) m: Her petrideki (tüpteki) ortalama mutant sayısı Bu formüle göre; 1- Hiç mutant ihtiva etmeyen tüp sayısı m=o), P(0)= e-m veya P(0) = -m 'dir. 2- Bir mutant ihtiva eden tüp sayısı (m = 1) P(1) = e-1 veya P(1) = 1/e = 0.37'dir.

http://www.biyologlar.com/mutasyon-orani

EMB (EOZİN METİLEN BLUE) BESİ YERİ

Besiyerinin içerdiği boyalar gram olumlu, bir kisim gram olumsuz bakterilerin üremelerini inhibe eder. Özellikle Enterobakteriaceae ve benzeri bakterilerin ayirt edilmesinde kullanilan ayirtici bir besiyeridir. Laktoz veya sukroz üzerine etki eden bakteriler asit oluştururlar. Boyalar bu ortamda presipite olurlar. Sonuç olarak E.coli gibi tipik laktozu fermante eden bakteriler madeni parlaklik veren yeşil, siyah koloniler yaparlar. Salmonella, Shigella, Proteus gibi şekeri fermante etmeyenler saydam, renksiz koloniler oluştururlar. Besiyeri içerisinde; Pepton 10 gr. Laktoz 5 gr. Sukroz 5 gr. K2HPO4 2 gr. Agar 13.5 gr. Eozin Y 0.4 gr. Metilen blue 0.065 gr. Saf su 1000 ml. Maddeler kariştirilir. Kaynatilarak eritilir. 121°C de 15 dk. otoklavlanir. pH 7.1 e ayarlanir. Plaklara dökülür.   Aşağıda görüldüğü gibi bu besiyerinde protein, buffer, boyalar, agar ve iki karbonhidrat bulunmaktadır. Eozin Y ve metilen mavisi birçok gram pozitif bakteriler için inhibitördür. Grarn negatif basillere karşı ise ya daha az toksik veya etkisizdir. Gram negatif basillerin ayırdedilmesi, laktoz fermentasyonu yoluyladır. Tipik olarak laktoz fermentasyonu yapan Gram negatif basiller için alternatif karbonhidrat kaynağı olarak ortama sükroz eklenir. Çünki Gram negatif basiller bazen laktozu fermente etmez veya yavaş fermente etmektedir. Bu besiyerine ekilen bakterilerin renkli koloni teşkil etmeleri iki faktöre bağlıdır. Bunlardan birincisi laktoza tesir eden bakterinin kafi düşüklükte pH teşkili i1e her koloninin boya bileşiğini alması, ikincisi ise bakteri kolonileri tarafından alınan boya bileşiğini yapmak üzere eozin (bir asid boya) ile metilen mavisinin (bir bazik boya) reaksiyona girmesidir. Laktoza tesirsiz bakteri kolonileri renksizdir. Şeftaf görünür. Laktoza tesir eden (E. coli gibi) bakteri kolonileri koyu renklidir. EMB agar da E. coli için tipik olan koloniler merkezi koyu renkte yeşilimsi, parlak metalik renkte kolonilerdir. Laktoz ve sükroz fermentasyonu yapan bakteri kolonilorindeki bu koyu pigmentasyon, boya çökeltisi olup muhtemelen "methylene blue-eozinat"tır. Karbonhidratları fermentasyona uğratan bakteri kolonileri etrafında düşük pH (asid reaksiyon) meydana gelmesinin sonucu boya çökeltileri meydana gelmektedir. Bu boya çökeltileri şüphesiz koloni içine absorbe olmuştur. Fermentasyon yapmayanlar, muhtemelen proteinlerin oksidatif deaminasyonu nedeniyle yüzeyde pH'ı artırırlar. Böylece metilen mavisi eozin kompleksi çözülür ve renksiz kolonilere sebep olurlar. Pepton 10 gr Laktoz 5 gr Sükroz 5 gr Dipotasyum fosfat 2 gr Eozin Y 0.4 gr Metilen mavisi 0.065 gr Agar 13.5 gr Distile su 1000 ml   Levine EMB Agar In vitro (canlı hücre dışında) yapılan standart mikrobiyolojik analizlerde E. coli ve diğer Enterobacter türlerinin izolasyon ve ayrımı ile Candida albicans 'ın hızlı tanımlanması için selektif katı besiyeri olarak kullanılır. Bileşim Peptone 10,0 g/L; Lactose 10,0 g/L; K2HPO4 2,0 g/L; Eosin yellowish 0,4 g/L; Methylene blue 0,065 g/L; Agar-agar 13,5 g/L Etki şekli Bileşimdeki boyalar, pek çok Gram pozitif bakterinin gelişimini baskılar. Koagülaz pozitif stafilokoklar karakteristik renksiz ve toplu iğne başı büyüklüğünde koloni oluşturarak gelişirler ve bunlara koagülaz testi uygulanabilir. Koliform grup bakteri analizinde yayma ya da sürme ile inoküle edilen Petri kutuları aerobik olarak 35 oC'da 1-2 gün inkübe edilirken, Candida analizi %10 CO2 atmosferinde yapılır.

http://www.biyologlar.com/emb-eozin-metilen-blue-besi-yeri

Eşeyli Üreme (Seks), Evrimi Nasıl Yönlendiriyor?

Aşırı süslü özellikler ve sadece bir cinsiyette görülen ilginç davranışlar evrim kuramına aykırı mı? Mücadeleyi kazanan veya en güzel görünüşü sergileyen erkeklerin daha fazla eşi olacağı doğru mu? Erkekler arası rekabet ve dişilerin eş tercihi nasıl evrimleşti? Eşeyli üreme de nereden çıktı? Erkek ve dişinin farklı çiftleşme stratejileri. Neden hep dişi seçiyor? Dişi aslında neyi seçiyor ve nasıl seçiyor? Ne olacak bu erkeğin hali?! Okuyacağınız makale, Jerry A. Coyne’ın “Why evolution is true?” (Evrim neden doğru?) adlı kitabının (Oxford University Press, 2009) “How sex drives evolution?” adlı bölümünün çevirisidir. Arabaşlıkları biz koyduk. Bütün görüntüsüyle, vücudunun arkasında tam bir zaferle yelpaze gibi açılan üzerinde bir sürü gözbebeği bulunan parlak mavi-yeşil kuyruğuyla erkek bir tavus kuşundan daha göz kamaştırıcı çok az hayvan vardır doğada. Darwinizmi her yönden çiğniyormuş gibi görünür, onu güzel yapan bütün özellikleri aynı zamanda hayatta kalması açısından uyumsuzdur. O uzun kuyruk uçuş sırasında aerodinamik sorunlar yaratır, tavus kuşunun uçabilmek uğruna verdiği mücadeleye tanık olanlar bunu bilir. Bu, kuşların geceleri ağaçlardaki tüneklerine çıkmalarını ve yırtıcılardan kaçmalarını zorlaştırır; özellikle de nemli bir kuyruğun sürüklenmek zorunda kaldığı muson yağmurları sırasında. Parıldayan renkler de, özellikle kısa kuyruklu ve ölü yeşilimsi bir kahverengi ile kendilerini kamufle eden dişilerle karşılaştırıldığında yırtıcıları kendisine daha fazla çeker. Ve çok fazla metabolik enerji her yıl yeniden büyümesi gereken bu kuyruğa harcanır. Darwin’i şaşırtan görüntü ve davranışlar Tavus kuşunun tüyleri sadece amaçsız görünmekle kalmaz, aynı zamanda bir engeldir. Bu nasıl bir adaptasyon olabilir? Ve bu tüylere sahip bireyler daha fazla gen aktarabiliyorsa, tahmin edileceği gibi giysi doğal seçilimle evriliyorsa, neden dişiler de aynı şekilde göz kamaştırıcı olmuyor? Darwin, 1860’da Amerikalı bir biyolog olan Asa Gray’e yazdığı bir mektubunda bu sorulardan yakınıyordu: “Gözle ilgili düşüncenin beni dondurduğu anı hatırlarım, fakat bu şikâyet halinin üstesinden geldim ve şimdi yapıya dair önemsiz şeyler beni rahatsız hissettiriyor. Tavus kuşunun kuyruğundaki bir tüyün manzarası ise her ona baktığımda beni hasta ediyor!” Tavus kuşunun kuyruğu gibi muammalar çoktur. Soyu tükenmiş İrlanda elkini ele alalım (aslında ne İrlandalı ne de elk olduğu için bir isim hatası. Bu zamana kadar tanımlanmış en büyük geyiktir ve Avrasya civarında yaşamıştır). Bu türün erkekleri sadece on bin yıl kadar önce yok olmuş ve bir uçtan diğer uca 12 fitten (1 fit yaklaşık 0,3 m, 12 fit = 3,6 m) geniş olan büyük bir çift boynuzun sahibidir! Birlikte 90 pound (1 pound yaklaşık 453,6 gram, 90 pound = 40,8 kg) ağırlığında olan bu boynuzlar önemsiz 5 pound ağırlığındaki bir kafatasının üzerinde durur. Neden olacağı gerilimi bir düşünün. Bütün gün kafanızın üstünde genç bir insanı taşıyarak yürümek gibidir. Ve tavus kuşunun kuyruğu gibi bu boynuzlar da her yıl oyuklarından yeniden doğmak zorundadır. Aşırı süslü özelliklerin yanında, sadece bir cinsiyette görülen ilginç davranışlar da vardır. Orta Amerika’nın erkek tungara kurbağaları şişirebildikleri ses keselerini her gece uzun bir serenat yapmak için kullanır. Bu şarkılar dişilerin dikkatini çeker; fakat şarkı söylemeyen dişilerdense söyleyen erkeklerle beslenen yarasa ve kan emici sineklerin de dikkatini çeker. Avustralya’da erkek çardak kuşları çubuklardan, türüne göre tüneller, mantarlar veya tentelere benzeyen büyük ve biçimsiz “çardaklar” inşa eder. Bunlar dekoratif şeylerle süslenmiştir: çiçekler, yılan kabukları, kabuksuz meyveler, tohum zarfları ve eğer insanlara yakınsa teneke kutular, cam parçaları ve folyo ile. Bu çardakların yapılması saatler hatta bazen günler alır (bazıları enine 10 fit, uzunluğuna 5 fit boyutlarında olabilir), fakat yine de yuva olarak kullanılmazlar. Neden erkekler bütün bu zorluklara katlanır? Eşeysel dimorfizm Biz Darwin gibi, bu özelliklerin hayatta kalma olasılığını azalttığını sadece tahmin etmek zorunda değiliz. Dönemimizdeki bilim insanları bunların nelere mal olabileceğini göstermiştir. Kırmızı gerdanlı çardak kuşu erkeği parlak siyahtır, derin bir boyun ve kafa yaması ile gösteriş yapar ve gayet uzun kuyruk tüyleriyle yüklüdür, bu tüyler neredeyse boyunun iki katı uzunluğundadır. Erkek çardak kuşunu arkasında çırpınan kuyruğuyla havada mücadele ederek uçarken gören biri bu kuyruğun ne işe yaradığını anlamakta zorlanır. İsveç Göteborg Üniversitesi’nden Sarah Pryke ve Steffan Andersson Güney Afrika’da bir grup erkek yakaladılar ve birinci grubun kuyruklarını bir inç kadar ikinci grubun ise dört inç kadar kısalttılar. Üreme mevsiminden sonra yeniden yakaladıklarında, kısa kuyruklu olanlara oranla uzun kuyruklu erkeklerin daha fazla kilo kaybetmiş olduğunu gördüler. Açıkçası, bu uzamış kuyruklar büyük handikaptır. Canlı renkler de öyledir ve bu da gerdanlıklı kertenkelelerde yapılan daha zekice bir deneyle gösterilmiştir. Amerika’nın batısında yaşayan bir fit uzunluğundaki bu kertenkelenin erkek ve dişileri birbirinden çok farklı görünür. Erkek turkuaz renkli vücudu, sarı kafası, siyah boyun halkası ve siyah-beyaz benekleri ile gösteriş yapar; dişilerin rengi ise gri-kahverengi arasıdır ve az beneklidirler. Oklahoma Devlet Üniversitesi’nden Jerry Husak ve arkadaşları, erkeklerin parlak renginin yırtıcıları daha çok çektiği hipotezini sınamak için çöle erkek ve dişi kertenkelelere benzeyen boyanmış kilden modeller yerleştirdiler. Yumuşak kil bu modelleri gerçek hayvanlarla karıştıran herhangi bir yırtıcının bıraktığı ısırık izlerini saklıyordu. Sadece bir hafta sonra kırk parlak erkek modelden otuz beşinde çoğunlukla yılan ve kuş ısırıkları görüldü; kırk ölü renkli dişi modelden ise hiçbiri ısırılmamıştı. Bir türün erkek ve dişileri arasında görülen bu farklı özellikler, örneğin kuyruk, renk ve şarkı, “eşeysel dimorfizm” olarak adlandırılır, bu terim Yunanca “iki form” anlamına gelir. Biyologlar, erkeklerin eşeysel dimorfik özelliklerinin, zamanı ve enerjiyi boşa harcadığı ve hayatta kalma oranını düşürdüğü için evrim teorisini ihlal ettiğini gösterdiler. Renkli erkek lepistesler, daha sade olan dişilerden daha sıklıkla yem olmaktadır. Bir Akdeniz kuşu olan siyah kuyrukkakan erkeği, iki haftadan fazla bir süre çakılların arasında kendi ağırlığının elli kat fazlasını biriktirerek farklı bölgelerde büyük taş yığınları kurar. Çalı tavuğu erkeği, çayırda kabarıp sönerek ve iki büyük ses kesesinden yüksek sesler çıkartarak süslü görüntüler sergiler. (1) Bu muziplikler bir kuş için büyük enerji tüketimi anlamına gelir: bir günlük görüntü, kalori açısından bir muz dilimine denk enerji yakar. Eğer bu özellikler için seçilim söz konusuysa -karmaşıklıkları göz önünde bulundurulduğunda olmalıdır da- bunun nasıl gerçekleştiğini açıklamamız gerekir. Darwin’in anahtarı: eşeysel seçilim Darwin’den önce eşeysel dimorfizm bir sırdı. Bugün de olduğu gibi yaratılışçılar, doğaüstü bir tasarımcının, hayatta kalmayı tehlikeye sokan bu vasıfları neden sadece bir cinsiyette yarattığını açıklayamıyorlardı. Doğanın çeşitliliğini en güzel şekilde açıklayan Darwin de bu yararsız özelliklerin nasıl evrildiğini anlayamamaktan dolayı kaygılıydı. Sonunda bunun açıklanması için gerekli anahtarı keşfetti: Eğer bir türün erkekleri ile dişileri arasında özellik farkları varsa, ayrıntılı davranışlar, yapılar ve süsler neredeyse sadece erkeklerle sınırlıdır. Artık bu masraflı özelliklerin nasıl evrildiğini tahmin edebilirsiniz. Seçilimin değerinin gerçek anlamda hayatta kalma olmadığını, başarılı üreme olduğunu hatırlayın. Süslü bir kuyruk ve baştan çıkarıcı bir şarkı hayatta kalmanıza yardım etmez, fakat döl bırakabilme şansınızı artırır, bu da söz konusu göz alıcı özelliklerin ve davranışların ortaya çıkmasına neden olan şeydir. Darwin bu takasın ilk farkına varan kişidir ve eşeysel dimorfik vasıflardan sorumlu seçilim türüne eşeysel seçilim adını vermiştir. Eşeysel seçilim, basitçe, bir bireyin eş bulması olasılığını artıran seçilimdir. Yani doğal seçilimin bir alt kümesidir, fakat çalıştığı biricik yol açısından ve ürettiği uyumlu olmayan adaptasyonlardan dolayı kendine has bir bölümde anlatılması gerekir. Eşeysel olarak seçilmiş özellikler, erkeğin azalan yaşama şansını üremesinde bir artış ile dengelemekten fazlasını yapıyorsa evrim geçirir. Whydah ispinozları uzun kuyruklarıyla yırtıcılardan çok iyi kaçamazlar, fakat dişileri eş olarak uzun kuyruklu olanları tercih eder. Daha uzun boynuzlu geyikler hayatta kalmak için metabolik bir sorumlulukla savaşırlar, fakat belki de karşılaşmaları sıklıkla kazanmaları daha fazla döl bırakabilmelerini sağlar. Eşeyli seçilim iki şekilde olur. Birincisi, dev boynuzlu İrlanda elkleri örneğinde görüldüğü gibi, dişilere giden yolda erkekler arasında doğrudan rekabettir. Whydah ispinozlarının uzun kuyruğunun türemesine neden olan diğeri ise, olası erkekler arasında seçim yaparken görülen dişi titizliğidir. Erkek erkeğe rekabet (veya Darwin’in hırçın terminolojisinde “Mücadele Yasası”) anlaması en kolay olanıdır. Darwin’in söylediği gibi “neredeyse bütün hayvanların erkekleri arasında dişinin mülkiyeti için bir mücadele vardır.” Bir türün erkekleri doğrudan savaştığında, geyiğin boynuz çarpıştırması, geyik böceğinin boynuzunu saplaması, sap gözlü sineğin kafasını toslaması veya iri fil ayıbalığının kanlı savaşlarında olduğu gibi, rakiplerini defederek dişilerine kavuşurlar. Seçilim, hayatta kalma oranını düşürmeyi dengelemekten daha büyük oranda eş bulma şansını artıran bu gibi zaferleri sağlayan özellikleri destekler. Canlı renkler, süsler, çardaklar ve çiftleşme görüntüleri ise ikinci eşeysel seçilim türüyle yani eş tercihiyle şekillenir. Öyle görünüyor ki, dişilerin gözünde bütün erkekler aynı değildir. Bazı erkek özelliklerini ve davranışlarını diğerlerinden daha etkileyici bulurlar, bu sayede popülasyonda bu özellikleri üreten genler birikir. Bu senaryoda erkekler arası bir rekabet elemanı da vardır, fakat bu dolaylıdır: kazanan erkekler en yüksek sese, en parlak renklere, en cazip feromonlara, en seksi görünüşlere ve daha birçok şeye sahiptir. Erkek-erkeğe rekabetin tersine burada kazanan, dişi tarafından belirlenir. Erkekler arasında doğrudan rekabet Mücadeleyi kazanan, çok süslü olan veya en güzel görünüşü sergileyen erkeklerin daha fazla eşi olacağı doğru mudur? Eğer öyle değilse eşeysel seçilim teorisi hepten çöker. Aslında kanıtlar hem güçlü hem tutarlı bir şekilde teoriyi destekler. Mücadelelerle başlayalım. Kuzey Amerika’nın Pasifik kıyısındaki kuzeyli fil ayıbalığı, boyutları açısından sıra dışı bir eşeysel dimorfizm gösterir. Dişiler yaklaşık 10 fit uzunluğunda ve 1500 pound ağırlığındayken erkeklerin uzunluğu neredeyse iki katıdır ve ağırlıkları da 6000 pounda kadar varabilir ki bu bir Volkswagen’den büyük ve iki katından daha ağır demektir. Bunlar poligamiktir de, yani çiftleşme dönemi boyunca erkekler birden fazla dişi ile eşleşir. Erkeklerin yaklaşık üçte biri eşleştikleri dişilerden oluşan haremlerini savunurlar (bir erkeğin 100 kadar eşi olabilir!), geri kalan erkekler ise bekârlıktan yana kara talihlerini yaşar. Çiftleşme piyangosunun kime vuracağı dişiler daha sahile çıkmadan önce erkekler arasındaki vahşi savaşla belirlenir. Bu savaşlar kocaman vücutlarını birbirine vuran büyük boğalarınki gibi kanlı olur, dişleriyle derin boyun yaraları açarlar ve en büyük erkeklerin en üste yerleştiği bir baskınlık hiyerarşisi ortaya çıkar. Dişiler vardığında baskın erkekler onları haremlerine doğru sürükler ve yaklaşan rakiplerini kovar. Verili bir yıl içerisinde çoğu bebek sadece birkaç büyük erkek tarafından yapılmış olur. Bu, erkeklerin rekabetidir; saf ve basit, ödül de üremedir. Bu çiftleşme sistemi ele alındığında eşeysel seçilimin büyük ve cani erkeklerin evrimini teşvik ettiğini görmek kolaydır: büyük erkekler genlerini yeni jenerasyona aktarabilir, küçükler yapamaz (dövüşmek zorunda olmayan dişiler, tahminen optimum üreme ağırlıklarına yakındır). Vücut büyüklüğündeki eşeysel dimorfizm, biz de dahil birçok türde erkeklerin dişilere ulaşmak için giriştiği rekabetten kaynaklanıyor olabilir. Erkek kuşlar çoğunlukla, sahip oldukları arazi üzerinde şiddetle rekabet ederler. Birçok türde, erkekler dişilerini sadece, yuva yapmak için uygun, güzel yeşillikleri olan bir toprak parçasını kontrol altında tutarak etkiler. Erkekler bu parçaya sahip olduklarında, görsel ve ses öğeleriyle veya alanlarına tecavüz eden erkeklere doğrudan saldırarak onu savunurlar. Bize zevk veren kuş şarkılarının pek çoğu aslında diğer erkeklere uzak durmalarını söyleyen tehditlerdir. Kuzey Amerika’nın kırmızı kanatlı karatavuğu genellikle açık habitatlardaki tatlı su bataklığı gibi bölgeleri savunur. Fil ayıbalıkları gibi bunlar da poligamiktir, bazı erkekler kendi bölgelerinde barınan neredeyse elli kadar dişiyle eşleşebilir. Diğer pek çok erkek ise “oltacı” diye adlandırılır ve eşleşmeden yaşarlar. Oltacılar ele geçirilmiş bölgelerdeki erkekleri oyalayıp uzak tutarak dişilerle sinsice eşleşmek için sürekli buraları işgal etmeye çalışırlar. Erkekler zamanlarının dörtte birini tetikte durup kendi bölgelerini korumaya çalışmakla geçirirler. Kırmızı kanat erkekleri doğrudan devriye gezmenin yanı sıra karmaşık şarkılar söyleyerek ve omuzlarında parlak kırmızı bir apoletle soylarına has süslerini tehdit gösterisine çevirerek savunma yaparlar (Dişiler kahverengidir, bazen küçük iz gibi bir apoletleri olur). Apoletler dişileri etkilemek için değildir, gerçekte bölgeyi ele geçirmek için düelloya gelen diğer erkekleri tehdit etmek için kullanılır. Araştırmacılar, siyaha boyayarak apoletlerini yok ettikleri erkeklerin yüzde 70 oranında bölgelerini kaybettiğini gördüler; fakat apoletleri şeffaf bir çözücü ile boyanan erkeklerin sadece yüzde 10’u kaybetmişti. Apoletler belki de zorla girenleri uzak tutmak için, o bölgede yaşandığını gösteren bir işarettir. Şarkı da önemlidir. Şarkı söyleme yeteneğini geçici olarak kaybetmiş, susturulmuş erkekler de bölgelerini kaybediyordu. Kısacası karatavuklarda şarkı ve tüyler bir erkeğin daha fazla eş edinmesine yardımcı olur. Yukarıda anlatılan çalışmalarda ve diğer başka birçok çalışmada araştırmacılar, daha ayrıntılı özelliklere sahip erkeklerin dölde daha büyük bir netice elde etmesinde, eşeyli seçilimin rol oynadığını gösterdiler. Bu sonuç basit görünmektedir, fakat meraklı biyologların yüzlerce saatlik sabırlı saha çalışmaları sonucunda ortaya çıkmıştır. Parıltılı bir laboratuarda DNA’nın dizi analizini yapmak daha ihtişamlı görünebilir ama bir bilim insanının seçilimin doğada nasıl işlediğini göstermesinin tek yolu sahada kirlenmekten geçer. Çiftleşme sonrası rekabet örnekleri Eşeysel seçilim sadece eşeye etkimekle bitmez: erkekler çiftleşmeden sonra da rekabete devam eder. Birçok türde dişiler kısa bir süre içerisinde birden fazla erkekle çiftleşebilir. Bir erkek bir dişiyi dölledikten sonra, aynı dişiyi diğer erkeklerin döllemesini ve babalık hakkını elinden almasını nasıl engelleyebilir? Bu çiftleşme sonrası rekabet eşeysel seçilim tarafından inşa edilmiş en merak uyandırıcı özelliklerden bazılarını ortaya çıkarmıştır. Bazen erkek çiftleşmeden sonra etrafta başıboş gezer, dişisini bu şekilde diğer taliplerden korur. Birbirine yapışmış bir çift yusufçuk görürseniz bilin ki erkek dişiyi dölledikten sonra fiziksel olarak diğer erkeklere kapatarak korumaya alıyordur. Bir Orta Amerika kırkayağı en olağanüstü şekilde eşini korumaya geçer: bir dişiyi dölledikten sonra, onu birkaç gün boyunca taşır ve bu şekilde yumurtalarına herhangi bir rakibin sahip çıkmasını engeller. Bazen bu engelleme kimyasallar yoluyla yapılır. Bazı yılanların ve kemirgenlerin menisi çiftleşmeden sonra dişinin üreme yolunu geçici olarak tıkayan kimyasallar içerir, yani diğer erkeklere karşı barikat kurar. Benim de çalıştığım sirke sineği grubunda ise erkek dişiye bir anti-afrodizyak enjekte eder, semenindeki bu kimyasal birkaç gün boyunca dişiyi yeniden çiftleşmeye isteksiz hale getirir. Erkekler babalıklarını korumak için çok çeşitli savunma silahları kullanırlar. Fakat çok daha sinsi de olabilirler, birçoğu ilk çiftleşen erkeğin spermlerinden kurtulabilecek ve yerine kendilerininkini koyabilecek hücum silahı taşır. Bunlar arasında en zekice araçlardan biri bazı kızböceklerinin “penis kepçesi”dir. Erkek önceden çiftleşmiş bir dişiyle çiftleştiğinde, penisi üzerinde arka tarafa bakan iğnelerini kullanarak daha önceden çiftleşen erkeğin spermlerini dışarı atar. Ancak dişi spermlerden arındırıldıktan sonra kendi spermlerinin transferine başlar. Drosophila’da (Drosophila melanogaster sirke sineğinin tür ismidir), kendi laboratuarımda erkek menisinin daha önceden çiftleşen erkeğin spermlerini pasifleştiren bir madde bulduk. Dişilerin eş tercihi Eşeysel seçilimin ikinci formu olan eş tercihine gelelim. Erkek-erkeğe rekabetle karşılaştırıldığında bu sürecin nasıl işlediğine dair çok daha az bilgimiz var. Çünkü boynuzların ve diğer silahların önemi, renkler, tüyler ve görünüşün öneminden çok daha açıktır. Eş tercihinin nasıl evrimleştiğini ortaya çıkarmak için Darwin’i bu kadar sinirlendiren belalı tavus kuşu kuyruğuyla başlayalım. Tavus kuşundaki eş tercihi üzerine çalışmaların çoğu, İngiltere Bedfordshire’daki Whipsnade Parkı’nda serbest-değişen bir popülasyonu çalışan Marion Petrie ve arkadaşları tarafından gerçekleştirildi. Bu türün erkekleri toplu halde görünebilecekleri ve bu sayede dişiye karşılaştırma olanağı sağlayan bölgelerde, leklerde (Lek, erkek hayvanların kur yapmak ve kendisini göstermek için toplanması hali) toplanır. Bütün erkekler leklere katılmaz, ancak bir dişi kazanabilecek olanlar katılır. On tane kur yapan erkek üzerinde yapılan gözlemsel bir çalışmada erkeklerin kuyruk tüylerindeki göz beneği sayıları ve başarılı oldukları çiftleşme sayıları arasında bir bağıntı bulundu: 160 göz beneği olan en ayrıntılı erkek, bütün eşleşmelerin yüzde 36’sını topladı. Bu, dişilerin daha ayrıntılı kuyrukları tercih ettiğini tahmin ettirir, fakat kanıtlamaz. Erkeğin kur yapmasında bazı diğer yönlerinin de –örneğin görünüşündeki zindelik- dişi tarafından seçiliyor olması muhtemeldir ve bu, tüylerle bağıntılı görünmektedir. Bunu hariç tutmak gerekirse, bazı deneysel düzenlemeler yapılabilir: tavus kuşunun kuyruğundaki benek sayısını değiştirin ve bunun eş bulma yeteneğini etkileyip etkilemediğine bakın. Dikkate değer bu tip bir deney Darwin’in rakibi Alfred Russel Wallace tarafından 1869’da düzenlendi. Bu iki bilim adamı birçok konuda, özellikle de doğal seçilimde birbirini onaylamış olsa da konu eşeysel seçilime geldiğinde ayrıştılar. Erkek-erkeğe rekabet iki adam için de sorun değildi, fakat Wallace dişi tercihi olasılığını uygun görmüyordu. Yine de bu konuda açık ufuklu davrandı ve bunun nasıl deneneceğini önerirken kendi zamanının ötesine geçti: “Süslü olanın kendisi tarafından oynanması gereken bölüm çok küçüktür, hatta süslünün az da olsa üstünlüğünün genellikle eşin tercihini belirleyeceği kanıtlansa bile. Nitekim kanıtlanmadı. Yine de bu, deneye imkân veren bir sorundur ve ben de bazı Zooloji Toplulukları veya araca sahip herhangi bir insanın bu çalışmaları denemesini öneririm. Her biri dişi kuşlara erişebildiği bilinen, aynı yaşta bir düzine erkek kuş seçilmelidir, örneğin evcil kümes hayvanları, yaygın sülünler veya altın sülünler. Bunların yarısının bir veya iki kuyruk tüyü kesilmeli veya boyun tüyleri doğadaki çeşitliliği taklit eden bir fark oluşturmaya yetecek fakat kuşu biçimsizleştirmeyecek şekilde biraz kısaltılmalıdır ve sonra dişi kuşların bu eksikliği fark edip etmediği ve daha az süslü erkekleri eşit bir şekilde reddedip etmedikleri gözlemlenmeli. Bu deneyler, dikkatlice planlanır ve birkaç sezon için mantıklı bir şekilde çeşitlendirilirse, bu ilgi çekici soruya dair en değerli açıklamaları sağlayacaktır.” Aslında bir yüzyıl sonrasına kadar bu tip deneyler yapılmadı. Fakat şimdi sonuçları elimizde ve buna göre dişi tercihi yaygın. Bir deneylerinde Marion Petrie ve Tim Halliday, bir grup tavus kuşundaki her erkeğin kuyruğundan yirmi göz bebeğini kestiler ve yakalanan fakat tüyleri kesilmeyen bir kontrol grubuyla çiftleşme başarılarını karşılaştırdılar. Tabii sonraki üreme mevsiminde süsleri alınmış erkeklerin her biri kontrol erkeklerinden ortalama 2,5 daha az çiftleşme gerçekleştirebildi. Bu deney, dişilerin süsleri azaltılmamış erkekleri tercih ettiğini gösterir. Fakat ideal olan, deneyin bir de tersinden tekrarlanmasıdır: kuyrukları daha ayrıntılı hale getirin ve bunun çiftleşme başarısını artırıp artırmadığına bakın. Böyle bir deneyi tavus kuşlarında yapmak zor olsa da, İsveçli biyolog Malte Andersson tarafından Afrika’da yerel uzun kuyruklu Whydah ispinozları üzerinde denendi. Bu eşeysel dimorfik türlerde erkeklerin kuyruğu yaklaşık 20 inç (1 inç yaklaşık 2,5 cm, 20 inç = 50 cm), dişilerin ise 3 inç uzunluğundadır. Andersson uzun erkek kuyruklarının bir parçasını alıp bunları normal kuyruklara yapıştırarak aşırı derecede kısa kuyruklu (6 inç), normal “kontrol” kuyruklu (bir parça kesilmiş ve sonra geri yapıştırılmıştır) ve uzun kuyruklu (30 inç) erkekler üretti. Tahmin edileceği gibi, kısa kuyruklu erkekler normallerle karşılaştırıldığında bölgesinde barınan daha az dişiyi elde edebilmiştir. Fakat suni bir şekilde kuyrukları uzatılmış olan erkekler çiftleşmede çok büyük bir artış elde etmiş, neredeyse normal erkeklerin iki katı kadar dişiyi etkilemişlerdir. Buradan bir soru ortaya çıkar. Eğer 30 inç uzunluğunda kuyruğu olan erkekler daha fazla dişi tarafından tercih ediliyorsa, neden Whydah ispinozları ilk başta bu uzunlukta bir kuyruğa evrilmedi. Cevabı bilmiyoruz, fakat bu uzunlukta kuyruğun eş bulma yeteneğini artırmasından daha büyük oranda ömrü kısaltıyor olması muhtemeldir. Yirmi inç belki de ömrü boyunca verebileceği ortalama üreme sayısının en yüksek olduğu uzunluktur. Peki, erkek çalı tavukları yeşilliklerdeki çetin maskaralıklarından ne kazanıyor? Burada da yanıt: eş. Tavus kuşları gibi, erkek çalı tavuğu da denetlemeye çıkmış dişilere toplu halde göründükleri lekler yapar. Sadece günde 800 kere “kasılarak yürüyen” en kuvvetli erkeğin dişileri kazanabildiği gösterilmiştir; geri kalan çoğunluk ise çiftleşemeden yürümeye devam eder. Eşeysel seçilim diğer yandan çardak kuşlarının mimari başarılarını da açıklar. Türden türe değişen çardak dekorasyonlarının pek çok çeşidinin çiftleşme başarısıyla bağlantılı olduğu birçok çalışmada gösterilmiştir. Örneğin saten çardak kuşları çardaklarına daha fazla mavi tüy koyduklarında daha fazla çiftleşebilir. Benekli çardak kuşlarında en büyük başarı yeşil solanum meyveleri (yabani domatesle akraba bir tür) gösterildiğinde elde edilmektedir. Cambridge Üniversitesi’nden Joah Madden benekli çardak kuşlarının çardaklarından dekorasyonları çaldı ve erkeklere altmış objelik bir seçenek sundu. Tabii bunlar çardaklarını yine en çok solanum meyveleri ile dekore ettiler, bu meyveleri çardağın göze çarpan yerlerine koydular. Kuşlar üzerine eğiliyorum çünkü biyologlar eşey tercihinin en kolay bu grupta çalışılabildiğini görmüşler. Kuşlar gün içerisinde aktiftir ve gözlemlenmesi kolaydır, fakat diğer hayvanlarda eşey tercihinin çalışıldığı pek çok örnek de vardır. Dişi tungara kurbağaları en karmaşık sesleri çıkaran erkeklerle çiftleşmeyi tercih eder. Dişi lepistesler daha uzun kuyruğu ve daha renkli benekleri olan erkekleri sever. Dişi örümcekler ve balıklar genellikle daha büyük olan erkeği seçer. Malte Andersson Eşeysel Seçilim adlı kapsamlı kitabında, 186 türde 232 deneyin erkek özelliklerinin büyük bir kısmının çiftleşme başarısıyla bağlantılı olduğunu ve bu deneylerin büyük çoğunluğunun dişi tercihi gösterdiğini anlatmaktadır. Kısacası dişi tercihinin birçok eşeysel dimorfizmin evrimini yönlendirdiğinden şüphemiz yok. Yani Darwin haklıydı. Fakat biz iki önemli soruyu atladık: erkekler kur yapmak veya onlar için savaşmak zorundayken neden dişiler seçme işlemini yapmak zorunda kalıyor? Ve neden her zaman dişiler seçiyor? Bu sorulara yanıt verebilmek için organizmaların neden eşeyli olmayı benimsediklerini anlamamız gerekir. Neden eşeyli üreme? Eşeyin neden evrimleştiği evrimde hâlâ en muammalı sorudur. Genlerinin sadece yarısına sahip yumurta veya spermler oluşturarak eşeyli üreyen herhangi bir birey eşeysiz üreyen diğer bir bireye göre yeni jenerasyona yüzde 50 oranında genetik harcama yapar. Şu şekilde düşünelim. İnsanlarda, normal formu eşeyli üremeye yarayan, mutant formu ise dişilerin döllenme gerekmeden yumurta üretmesini sağlayan partenogenez ile üremesine yardımcı olan bir gen hayal edin (Bazı hayvanlar gerçekten bu şekilde ürer: yaprak bitleri, balık ve kertenkelelerde görülmektedir). İlk mutant kadının sadece kızları olacaktır ve bu kızlar da kendi kendilerine başka kızlar doğurabilecektir. Mutant olmayanlarda ise eşeyli üreyen kadınlar erkeklerle çiftleşecektir ve yarısı erkek yarısı dişi olan döller verecektir. Dişi havuzu sadece kız çocuğu üreten mutantlarla dolacağı için popülasyondaki kadın oranı çabucak yüzde 50’nin üzerine çıkacaktır. Sonunda bütün dişiler eşeysiz üreyen annelerden doğmuş olacaktır. Erkekler gereksiz hale gelecek ve ortadan kaybolacaktır: hiçbir mutant kadın onlarla çiftleşme ihtiyacı duymaz ve bütün dişiler sadece daha fazla dişi doğuracaklar. Partenogenez için gereken gen eşeyli üreme için gereken geni yenmiş olur. “Eşeysiz” genin kendisini, her jenerasyonda, “eşeyli” genin yaptığının iki katı kadar üreteceği teorik olarak gösterilebilir. Biyologlar bu duruma “eşeyin iki katı masrafı” derler. Sonuçta, doğal seçilim etkisinde partenogenez için olan genler çok hızlı bir şekilde yayılır ve eşeyli üremeyi eler. Fakat bu gerçekleşmedi. Dünya’daki türlerin büyük çoğunluğu eşeyli ürer ve üremenin bu türü bir milyar yıldır sürüyor. (2) Peki eşeyin masraflı olması neden partenogenezle yer değiştirmesine neden olmadı? Eşeyin, masrafından daha ağır evrimsel bir avantajı olmalı. Henüz o avantajın ne olduğunu ortaya çıkaramamış olsak da, teorilerde bir noksanlık hissedilmemektedir. Asıl anahtar, eşeyli üreme sırasında genlerin rasgele karışması ve bu sayede dölde yeni gen kombinasyonları ortaya çıkarmasıdır. Bir bireyde birçok elverişli geni bir araya getirirsek eşey, çevrenin sürekli değişen manzarasıyla baş edebilmek için evrimi hızlanmaya zorlar, parazitlerin evrimleşen savunma mekanizmalarımıza karşı durabilmek için acımasız bir şekilde evrim geçirmesi buna örnektir. Veya belki de eşey, tamamen avantajsız bir bireyde, bir araya getirmek suretiyle türdeki bütün kötü genleri yok edebilir. Bilim insanları hâlâ, eşeyi, iki kat masraflı olmasına karşın daha önemli hale getiren bir avantajı olup olmadığını sorguluyor. Eşey evrildiğinde ister istemez bunu eşeyli üreme de takip edecektir, bunun için iki şeyi daha açıklamamız gerekir. İlki; döl oluşturmak için çiftleşmek ve genlerini bir araya getirmek zorunda olan neden sadece iki cinsiyet var (neden üç veya daha fazla değil)? Ve ikincisi; neden iki eşeyin farklı sayı ve büyüklükte gametleri (erkekler pek çok küçük sperm oluşturur, dişiler ise daha az ama daha büyük yumurtalar) var? Eşey sayısına dair soru bizi oyalamaması gereken karmaşık teorik bir sorundur; fakat teorinin, iki eşeyin, üç veya daha fazla eşeyli çiftleşme sistemlerinin evrimsel olarak yerini alacağını gösterdiğini aklımızdan çıkarmayalım. İki eşey en sağlam ve kararlı stratejidir. İki eşeyin gametlerinin neden farklı sayı ve boyutlarda olduğu teorisi de aynı şekilde karmaşıktır. Bu durum muhtemelen iki eşeyin de aynı büyüklükte gametler ürettiği daha önceki eşeyli üreyen türlerden evrilmiştir. Teorisyenler doğal seçilimin, bu atasal durumun bir eşeyin (“erkek” diye adlandırdığımız) çok sayıda küçük gametler (sperm veya polen) oluşturması ve diğerinin (“dişi”) ise daha az ama büyük gametler (yumurta) oluşturması durumuna geçişini elverişli kıldığını inandırıcı bir şekilde gösterdiler. Erkek ve dişinin farklı çiftleşme stratejileri Eşeysel seçilimin aşamasını belirleyen gamet boyutundaki asimetri, aynı zamanda iki eşeyin farklı çiftleşme stratejileri evrimleştirmesine de neden olmuştur. Erkekleri ele alalım. Bir erkek çok miktarda sperm üretebilir ve büyük olasılıkla çok miktarda dölün babası olur; bu etkileyebileceği dişi sayısıyla ve spermlerinin rekabet yeteneği ile sınırlıdır. Dişiler için ise durum farklıdır. Yumurtalar masraflıdır, sayıca sınırlıdır ve eğer bir dişi kısa bir süre içerisinde pek çok kez çiftleşirse bu onun döl sayısını artırmada çok az etkili olur. Bu fark çok açık bir şekilde, bir insan dişisi ile erkeğinin ebeveyni olduğu kayıtlı çocuk sayısına bakarak görülebilir. Bir kadının hayatı boyunca üretebileceği maksimum çocuk sayısını tahmin etmeye kalkarsanız muhtemelen 15 civarında dersiniz. Bir daha düşünün. Guinness Rekorlar Kitabı’ndaki resmi rakam 69’dur, on sekizinci yüzyılda yaşayan bir Rus köylüsünün rekorudur. 1725 ile 1745 arasındaki 27 hamilelikten 16 ikiz, 7 üçüz ve 4 adet dördüz doğmuştur (Muhtemelen fizyolojik veya genetik olarak çoklu doğuma yatkınlığı vardı). Birileri bu çalışan kadın için ağlar, fakat bu rekor bir erkek tarafından, Marokko İmparatoru Mulai İsmail (1646-1727) tarafından, kırılmıştır. İsmail Guinness’te “en az 342 kız ve 525 erkeğin babası” olarak ve “1721’de 700 erkek toruna sahip” olarak kaydedilmiştir. Bu uç örneklerde bile erkekler dişileri 10 katından fazla geçmektedir. Erkekler ve dişiler arasındaki evrimsel fark, farklı yatırımdan gelir. Erkekler için çiftleşmek ucuzdur; dişiler için masraflıdır. Erkekler için bir çiftleşme sadece az miktarda sperme mal olur, dişiler için çok daha fazlasını ifade eder: büyük, besin dolu yumurtaların üretimi ve çoğunlukla çok miktarda enerji ve zaman kaybı. Memeli türlerinin yüzde 90’dan fazlasında, bir erkeğin döle yaptığı tek yatırım spermidir, dişi ise bütün bakımı üstlenir. Dişi ve erkeklerin olası eş ve döl sayıları arasındaki bu asimetri eş seçme zamanı geldiğinde çelişen ilgilere neden olur. Erkeklerin, standardın altında bir dişi (diyelim ki zayıf veya hasta biri) seçtiklerinde kaybedecekleri şey azdır, çünkü kolaylıkla tekrar ve defalarca eşleşebilirler. Bu durumda seçilim bir erkeği gelişigüzel yapan, neredeyse her dişiyle durmaksızın eşleşmeye çalışan genlerini öne çıkarır. Dişiler farklıdır. Yumurtalarına ve döllerine çok yatırım yaptıkları için en iyi taktikleri gelişigüzel olmak değil titiz olmaktır. Dişiler sınırlı sayıda yumurtalarını dölleyecek en iyi baba olanağını seçmek için her fırsatı hesaba katmalıdır. Bu nedenle potansiyel erkekleri çok yakından incelerler. Genellikle bunun anlamı, erkeklerin dişiler için rekabet etmesi gerektiğidir. Erkekler gelişigüzel, dişiler nazlıdır. Bir erkeğin hayatı, sürekli eş için hemcinsleriyle yarışan yıkıcı bir anlaşmazlık ile geçer. Standart erkekler eşleşemezken, iyi erkekler, hem daha etkileyici hem de daha vahşi olanlar, çoğunlukla çok sayıda eşi güvenceye alacaktır (tahminen daha fazla dişi tarafından da tercih edilecektir). Diğer yandan, neredeyse her dişi sonunda bir eş bulacaktır. Her erkek onlar için rekabet ettiğinden, dişilerin eşleşme başarısının dağılımı daha dengeli olacaktır. Biyologlar bu farkı, eşleşme başarısındaki varyansın erkekler için dişiler için olduğundan daha yüksek olması gerektiğini söyleyerek açıklarlar. Peki, öyle midir? Evet, genellikle böyle bir fark görürüz. Örneğin kırmızı geyik erkekleri arasında, hayatları boyunca kaç döl bıraktıklarına dair çeşitlilik dişilerinkinin 3 kat fazlasıdır. Uyumsuzluk fil ayıbalıkları için çok daha büyüktür, çünkü bunlardaki dişilerin yarısından fazlasıyla karşılaştırılırsa, bütün erkeklerin yüzde 10’u üreme sezonları boyunca hiç döl bırakamaz. (3) Erkek ve dişilerin olası döl sayıları arasındaki fark erkek-erkeğe rekabetin ve dişi tercihinin evrimleşmesine neden olmuştur. Erkekler sınırlı sayıdaki yumurtaları döllemek için rekabet etmek zorundadır. Buna “muharebe yasası” diyoruz: erkekler arasında genlerini gelecek jenerasyonlara aktarmak için doğrudan rekabet. Bu nedenledir ki erkekler renklidir veya “beni seç, beni seç!” demenin bir yolu olan görüntüleri, çiftleşme şarkıları, çardakları vardır. Ve sonunda yine de erkeklerde uzun kuyrukların, daha vahşi görüntülerin ve daha yüksek sesli şarkıların evrimini sürükleyen dişinin tercihleridir. Anlattığım senaryo bir genellemedir ve bazı istisnalar vardır. Bazı türler monogamiktir, erkek de dişi de yavruların bakımını üstlenir. Erkekler, daha fazla eş aramak için döllerini bıraktıklarından daha fazla döle çocukların bakımına yardım ederek sahip oluyorsa, evrim monogamiyi elverişli kılar. Örneğin birçok kuşta, iki tam-zamanlı ebeveyne ihtiyaç duyulur: biri yem aramaya gittiğinde diğeri yumurtaları sıcak tutar. Fakat monogamik türler vahşi doğada tahmin edildiği kadar da çok değildir. Örneğin bütün memeli türlerinin sadece yüzde 2’si bu tür eşleşme sistemine sahiptir. ‘Yalancı’ monogami örnekleri Eşeysel dimorfizmi birçok “sosyal monogamik” türde de görürüz. Bunlarda erkekler ve dişiler çift oluşturur ve yavruları birlikte yetiştirirler. Erkekler dişiler için rekabet etmiyorsa neden parlak renkler ve süsler evrimleştirmiş olabilir? Aslında bu çelişki de eşeysel seçilim teorisini destekler. Bu durumlarda, öyle görünüyor ki, dış görünüş aldatıcıdır. Türler sosyal yönden monogamiktir, fakat gerçek monogamik değildir. Chicago’daki okul arkadaşım Stephen Pruett-Jones’un çalıştığı Avustralyalı görkemli çalıkuşu bu türlerden biridir. Bu tür ilk bakışta monogaminin kusursuz örneği zannedilir. Erkek ve dişiler bütün erişkin yaşamlarını genellikle sosyal olarak birbirine bağlı geçirirler, arazilerini birlikte korur ve yavrularına birlikte bakarlar. Yine de tüylerinde eşeysel dimorfizm gösterirler: erkekler muhteşem yanardöner mavi ve siyahlıdır, dişiler ise ölü grimsi kahve renklidir. Neden? Çünkü “zina” yaygındır. Çiftleşme zamanı geldiğinde, dişiler kendi “sosyal eşleri”nden çok diğer erkeklerle eşleşir (Bu DNA babalık testi ile kanıtlanmıştır). Erkekler de aktif bir şekilde “ekstra çift” eşleşmeler arayarak ve dişilere asılarak aynı oyunu oynarlar, fakat üreme kapasitesi açısından dişilerden çok daha farklıdırlar. Bu zina dolu eşleşmelerle birlikte eşeysel seçilim cinsiyetler arasındaki renk farklılıklarının evrimleşmesini sağlamıştır. Söz konusu çalıkuşu bu davranışı gösteren tek tür değildir. Bütün kuş türlerinin yüzde 90’ı sosyal monogamik olsa da bu türlerin dörtte üçündeki erkekler ve dişiler kendi sosyal partnerleri haricinde bireylerle de eşleşir. Eşeysel seçilim teorisi test edilebilir tahminlerde bulunur. Eğer sadece bir eşeyin parlak tüyleri, boynuzları varsa, güçlü çiftleşme görüntüleri sergiliyorsa veya dişileri cezbetmek için göz kamaştırıcı yapılar inşa ediyorsa bahse girebilirsiniz ki bunlar çiftleşmek için diğer üyelerle rekabet eden eşeylerdendir. Gösteriş veya davranışta daha az eşeysel dimorfizm gösteren türler daha monogamik olmalıdır: eğer erkekler ve dişiler çift oluşturur ve eşlerinden ayrılmazsa eşeysel bir rekabet yoktur ve tabii ki eşeysel seçilim de yoktur. Aslında biyologlar eşleşme sistemi ile eşeysel dimorfizm arasında güçlü bir bağıntı görür. Boyutta, renk veya davranıştaki olağandışı dimorfizmler cennet kuşları veya fil ayıbalıkları gibi erkeklerin dişiler için rekabet ettiği ve sadece birkaç erkeğin eşlerin çoğuna sahip olduğu türlerde görülür. Erkeklerle dişilerin benzer görüldüğü türler, örneğin kazlar, penguenler, güvercin ve papağanlar, gerçek monogamik olma eğilimindedir, yani hayvanlardaki sadakatin örneğini teşkil ederler. Sadece eşeysel seçilim düşüncesi tarafından öngörüldüğü fakat herhangi bir yaratılışçı alternatif tarafından öngörülemediği için bu bağıntı evrim teorisinin bir başka zaferidir. Evrim yoksa neden renk ile çiftleşme sistemleri arasında bir bağıntı olsun ki? Aslında bir tavus kuşu tüyü gördüğünde hasta olması gerekenler yaratılışçılardır, evrimciler değil. (4) Az da olsa bazen roller değişir Şimdiye kadar eşeysel seçilimde önüne gelenle çiftleşen eşeyi erkek, titiz olanı ise dişi olarak tanımladık. Fakat bazen, ender de olsa, tersi doğrudur. Ve bu davranışlar eşeyler arasında değiş tokuş edildiğinde dimorfizmin yönü de değişir. Bu dönüşü en cazip balıklarda, denizatında ve yakın akrabası olan yılaniğnesinde görürüz. Bazı türlerde dişilerdense erkekler hamile kalır. Bu nasıl olabilir? Dişi yumurtayı üretse bile, bir erkek onları dölledikten sonra karnında veya kuyruğundaki özelleşmiş bir kuluçka kesesine yerleştirir ve çatlayana kadar taşır. Erkekler bir seferde sadece bir kuluçka taşır ve “gebelik” dönemleri bir dişinin taze bir parti yumurta üretmesinden uzun sürer. Dolayısıyla erkekler çocuk yetiştirmeye dişilerden daha fazla yatırım yapar. Döllenmemiş yumurta taşıyan dişi sayısı erkeklerin onları kabul edebileceğinden fazla olduğu için de dişiler nadir bulunan “hamile olmayan” erkekler için rekabet etmek zorundadır. Burada, üreme stratejisindeki erkek-dişi farkı tersine dönmüştür. Ve eşeysel seçilim teorisine göre tahmin edebileceğiniz gibi, parlak renkler ve süslerle dekore edilmiş olanlar bu kez dişilerdir, erkekler ise daha sönüktür. Avrupa ve Kuzey Amerika’da yaşayan zarif üç sahil kuşu türü olan deniz çulluklarında bu durum geçerlidir. Bunlar birkaç poliandri (bir dişi ve çok erkek) çiftleşme sistemi örneğinden biridir. Erkek deniz çullukları çocuk bakımından tamamen sorumludur, yuvayı kurar ve dişi diğer erkeklerle çiftleşmek için gittiğinde kuluçkayı besler. Yani erkeğin döle yaptığı yatırım dişininkinden daha büyüktür ve dişiler çocuklarına bakacak erkekler için rekabet eder. Ve tabii ki her üç türde de dişilerin renkleri erkeklerden çok daha parlaktır. Denizatları, yılaniğneleri ve deniz çullukları genel yasaya uymayan istisnalardır. Eşeysel dimorfizmin evrimsel açıklaması doğruysa, “ters” dekorasyonlar da beklediğimiz gibidir; fakat türler özel olarak yaratılmışsa aynı sonucu bekleyemeyiz. Dişi neyi seçiyor, nasıl seçiyor? Dişilerin seçici taraf olduğu “normal” eş seçimine dönelim. Bir erkeği seçerken gerçekten ne arıyorlar? Bu soru evrim biyolojisinde ünlü bir tartışmayı canlandırmıştır. Daha önce de gördüğümüz gibi Alfred Russel Wallace bile dişilerin seçici olduğu konusunda şüpheliydi (ve sonuçta hatalıydı). Teorisi dişilerin yırtıcılardan saklanmaya ihtiyacı olduğu için erkeklerden daha az renkli olduğu, erkeklerin parlak renklerinin ve süslerinin ise fizyolojilerinin yan ürünü olduğuydu. Fakat erkeklerin neden saklanmak zorunda olmadığına dair hiçbir açıklama yapmadı. Darwin’in teorisi ise biraz daha iyiydi. Erkek seslerinin, renklerinin ve süslerinin dişi tercihi ile evrildiğini güçlü bir şekilde hissetmişti. Dişiler neye dayanarak seçim yapıyordu? Yanıtı şaşırtıcıydı: saf estetik. Darwin dişilerin, aslen cazip görmüyorlarsa bu özenli şarkılar veya uzun kuyruklar gibi şeyleri seçmeleri için bir neden bulamıyordu. Eşeysel seçilim konusunda çığır açan çalışması İnsanın Türeyişi ve Eşeye Bağlı Seçilim (1871), dişi hayvanların erkeklerin türlü özellikleri karşısında nasıl “büyülendiklerini” ve nasıl “kur yapıldığını” anlatan ilginç antropomorfik açıklamalarla doludur. Wallace’ın da not ettiği gibi, hâlâ bir sorun vardı. Hayvanlar, özellikle de arı ve sinekler gibi basit olanlar, bizim gibi bir estetik duygusuna sahip miydi? Darwin bunun üzerine bahse girdi: “Avustralya’nın çardak kuşlarında olduğu gibi, kuşların parlak ve güzel objeleri takdir ettiğine dair bazı pozitif kanıtlarımız olsa da, şarkının gücünü kesinlikle takdir ediyor da olsalar, yine de birçok dişi kuşun ve memelinin, eşeysel seçilime dayandığını söylediğimiz süsleri takdir etmek gibi başarılı bir tat alma duyusuna sahip olmasının hayrete şayan olduğunu kabul ediyorum. Ve bu özellikle de sürüngenler, balık ve böcekler için çok daha hayret vericidir. Fakat aşağı canlıların aklına dair çok az şey biliyoruz.” Bütün yanıtları bilmese de bu Darwin’in doğruya Wallace’tan daha yakın olduğunu gösterir. Evet, dişiler seçim yapar ve bu seçimler eşeysel dimorfizmi açıklıyor gibi görünmektedir. Fakat dişi tercihinin basitçe estetiğe dayandırılması bir anlam ifade etmiyor. Yeni Gine cennet kuşları gibi yakın akraba türlerin erkekleri çok çeşitli tüylere ve eşleşme davranışına sahiptir. Bir türe güzel gelen şey onun en yakın akrabalarına güzel gelen şeyden çok mu farklıdır? Aslında, artık dişi tercihlerinin kendi başlarına uyumsal olduğuna dair çok kanıtımız var. Bazı erkeklerin seçilmesi dişilerin genlerini yaymasına yardım eder. Tercihler Darwin’in öne sürdüğü gibi her zaman rasgele ve doğuştan gelen tat almayla ilgili değildir, birçok durumda muhtemelen seçilimle evrimleşmiştir. Bir dişi belirli bir erkeği seçerek ne kazanır? Bunun iki yanıtı vardır. Dişi, yavru bakımı boyunca daha fazla ve sağlıklı yavrular üretmesine yardım edecek erkeği seçerek doğrudan yarar sağlayabilir. Veya diğer erkeklerden daha iyi genlere (sonraki jenerasyonda döllerine avantaj sağlayacak olan genler) sahip olan erkeği seçerek dolaylı yoldan yarar sağlayabilir. Her iki yoldan da dişi tercihlerinin evrimi doğal seçilim tarafından elverişli kılınacaktır. Doğrudan yararları ele alalım. Bir dişiye daha iyi bölgeleri sahiplenen bir erkekle çiftleşmesini söyleyen bir gen, döllerinin daha iyi beslenmesine veya daha güzel yuvalar edinmesine yardımcı olur. İyi bölgelerde yetiştirilmemiş gençlere oranla daha iyi yaşayacak ve üreyeceklerdir. Bu şu anlama gelir; genç popülasyonu kendinden önceki jenerasyonun sahip olduğundan daha yüksek oranda “tercih geni”ne sahip dişiler içerecektir. Jenerasyonlar geçtikçe ve evrim devam ettikçe her dişi sonunda tercih genine sahip olacaktır. Hatta daha iyi bölgelerin tercihini artıran başka mutasyonlar varsa bunların da frekansı artacaktır. Zamanla daha iyi bölgelere sahip erkeklerin tercih edilmesi çok daha güçlü olmaya doğru evrilecektir. Ve bu bölgeler için daha güçlü rekabet eden erkeklerin seçilmesiyle sonuçlanacaktır. Dişi tercihi arazi için erkekler arası rekabetle birlikte evrimleşir. Seçici dişilere dolaylı yarar sağlayan genler de yayılacaktır. Kendisini bir hastalığa karşı diğerlerinden daha dirençli yapan gene sahip bir erkek hayal edin. Bu tür bir erkekle çiftleşen dişi hastalığa karşı daha dirençli döller üretecektir. Bu erkeği seçmek ona evrimsel bir yarar sağlar. Şimdi de bu daha sağlıklı erkekleri dişinin eş olarak belirlemesine yardımcı olan bir gen hayal edin. Eğer dişi böyle bir erkekle çiftleşirse, bu çiftleşme iki geni de (hem hastalığa karşı direnç geni hem de hastalığa karşı dayanıklıları tercih etme geni) içeren kız ve erkek çocukları meydana getirecektir. Her jenerasyonda, daha iyi üreyen ve hastalığa karşı en dirençli bireyler, aynı zamanda dişilere en dirençli erkekleri seçmesini söyleyen geni de taşıyacaktır. Bu direnç genlerinin doğal seçilimle yayılması gibi, dişi tercihi için olan genler de bunların sırtında ilerleyecektir. Bu yolla hem dişi tercihi hem de hastalığa karşı direnç bir tür içerisinde artacaktır. Bu iki senaryo da dişilerin neden bazı erkekleri tercih ettiğini açıklar, fakat parlak renkler veya özenli tüyler gibi erkeklerin belirli özelliklerini neden tercih ettiğini açıklamaz. Bu muhtemelen, belirli özellikler dişiye o erkeğin daha büyük doğrudan veya dolaylı yararlar saplayacağını söylediği için gerçekleşmektedir. Dişi tercihine dair bazı örneklere bakalım. Kuzey Amerika’nın ev ispinozu renkleri açısından eşeysel dimorfiktir: dişiler kahverengiyken erkeklerin kafasında ve göğsünde parlak renkler vardır. Erkekler bölgelerini savunmaz ama yavru bakımını üstlenir. Michigan Üniversitesi’nden Geoff Hill yerel bir tür içinde erkeklerin renklerinin açık sarıdan portakala veya parlak kırmızıya kadar değişkenlik gösterdiğini buldu. Rengin üreme başarısını etkileyip etkilemediğini görmek amacıyla saç boyası kullanarak erkekleri daha parlak veya soluk yaptı. Ve tabii ki parlak olanlar soluk renklilerden daha başarılı bir şekilde eş buldu. Ve üzerinde oynanmamış erkekler açısından, dişiler solgun renkli erkeklerin yuvasını parlak olanlarınkine oranla daha fazla terk etti. Dişi ispinozlar neden daha parlak erkekleri tercih ediyor? Hill, aynı popülasyonda parlak erkeklerin yavrularını solgunlardan daha fazla beslediğini gösterdi. Yani dişiler daha parlak erkekleri seçmekle, döllerinin daha iyi beslenmesi şeklinde doğrudan bir yarar sağlıyordu (Daha solgun erkeklerle eşleşen dişiler yavruları yeteri kadar beslenmediği için yuvalarını terk etmiş olabilir). Peki, neden daha parlak erkekler daha fazla besin getirir? Muhtemelen parlaklık genel bir sağlık belirtisi olduğu için. Erkek ispinozların kırmızı rengi, yedikleri tohumlardaki karoten maddesinden gelir – bu maddeleri kendileri üretemezler. Yani daha parlak renkliler daha iyi beslenmiştir ve muhtemelen genel anlamda daha sağlıklıdır. Dişiler parlak renkli erkekleri, renk onlara “aile ambarını en iyi stoklayacak erkek benim” dediği için bunları seçiyor gibiler. Dişilere daha parlak erkekleri seçmesinde yardımcı olan herhangi bir gen o dişilere doğrudan yarar sağlar ve böylece seçilim bu tercihi artıracaktır. Ve buradaki tercihle, tohumları parlak tüylere çevirebilen her erkek aynı zamanda avantajlı olacaktır çünkü daha fazla eşi güvenceye alacaktır. Zamanla eşeysel seçilim bir erkeğin kırmızı rengini abartacaktır. Dişiler ise solgun kalacaktır çünkü parlak olmaktan kazanacakları hiçbir şey yok; hatta yırtıcılara daha çekici gelmekten yakınabilirler. Sağlıklı ve güçlü bir erkek seçmenin başka doğrudan yararları da vardır. Erkekler, dişiye, çocuğuna veya her ikisine de aktarabilecekleri parazit veya hastalıklara sahip olabilir ve bu tip erkeklerden kaçınmak bir dişinin yararınadır. Bir erkeğin rengi, tüyleri ve davranışı hastalıklı veya zararlı olup olmadığına dair ipucu sağlayabilir: sadece sağlıklı erkekler yüksek sesle şarkı söyleyebilir, güçlü bir duruş sergileyebilir veya parlak, yakışıklı tüyler çıkartabilir. Mesela eğer bir türün erkekleri normalde parlak maviyse, soluk mavi bir erkekle çiftleşmekten kaçınmak en iyisidir. Evrim teorisi dişilerin, erkeğin iyi baba olacağını gösteren herhangi bir özelliği seçeceğini gösterir. Tek gereken bu özellik için tercihi artıran bazı genlerin olması ve o özelliğin anlatımındaki çeşitliliğin erkeğin durumu hakkında ipucu vermesidir. Gerisi kendiliğinden gelir. Çalı tavuğunda, parazit bitler erkeğin ses kesesinde kan benekleri oluşturur, bu özellik leklerde kasılarak yürürken kabarık, yarı saydam bir kese gibi durur. Ses keselerine suni yolla kan benekleri boyanmış erkekler kayda değer şekilde az eş edinebilir: bu benekler dişiye erkeğin hastalıklı ve muhtemelen kötü baba olduğuna dair tüyo verir. Seçilim sadece dişinin beneksiz keseleri tercih etmesini sağlayan genleri elverişli kılmayacaktır, aynı zamanda bu durumu belli eden erkek özelliğini sağlayanları da elverişli kılacaktır. Erkeğin ses kesesi daha da büyüyecektir ve dişinin pürüzsüz ses kesesi tercihi artacaktır. Bu, erkeklerde abartılı özelliklerin evrimine neden olabilir, örneğin saçma bir şekilde uzun olan Whydah ispinozu kuyruğu gibi. Bütün bu süreç, erkek özelliğinin daha fazla arttığında yaşamını tehlikeye düşürecek kadar abartılı hale geldiği an, yani döl üretiminin net sayısı kötü etkilendiği an sona erer. Peki, dolaylı yarar sağlayan dişi tercihlerinde durum nasıldır? Bu yararlardan en aleni olanı bir erkeğin döllerine sürekli verdiği şey, yani genleridir. Ve bir erkeğin sağlıklı olduğunu gösteren özellikler aynı zamanda genetik yönden iyi özellikler taşıdığını da gösterebilir. Daha parlak renkli, daha uzun kuyruklu veya daha yüksek sesli erkekler, rakiplerinden daha iyi yaşamalarına ve üremelerine olanak sağlayan genlere sahip olduğu için bu özellikleri gösteriyor olabilir. Bu, aynı şekilde, özenli çardaklar üretme yeteneğine sahip olan veya büyük taş yığınları oluşturabilen erkekler için de geçerli olabilir. Bir erkeğin daha iyi yaşama yeteneği veya daha fazla üreme yeteneği sağlayan genleri olduğunu gösteren pek çok özellik hayal edebilirsiniz. Evrim teorisi bu durumlarda üç tür genin frekansının birlikte artacağını söyler: bir erkeğin iyi genlere sahip olduğunu yansıtan “gösterge” özellik genleri, bir dişinin bu gösterge özellikleri tercih etmesini sağlayan genler ve son olarak varlığı gösterge sayesinde yansıtılan “iyi” genler. Bu karmaşık bir senaryodur, fakat çoğu evrim biyoloğu bunu, ayrıntılı erkek özellikleri ve davranışları için en iyi açıklama olarak görür. Fakat “iyi genler” modelinin gerçekten doğru olup olmadığını nasıl test edebiliriz? Dişiler doğrudan mı yoksa dolaylı yararları mı arar? Bir dişi daha az güçlü veya daha az gösterişli bir erkeği geri çevirebilir, fakat bu o erkeğin zayıf genetik yapısını değil de enfeksiyon veya yetersiz beslenme gibi sadece çevresel etkilerle oluşmuş bir halsizliği gösteriyor olabilir. Bu karmaşıklıklar herhangi verili bir koşulda eşeysel seçilimin nedenlerini ortaya çıkarmayı zorlaştırır. Belki de iyi genler modelinin en başarılı sınaması Missouri Üniversitesi’nden Allison Welch ve arkadaşları tarafından gri ağaç kurbağası üzerinde yapılmıştır. Erkek kurbağalar, ABD’nin güneyinde yaz gecelerinin simgesi olan yüksek sesler çıkararak dişileri etkiler. Yakalanan kurbağalarla yapılan çalışmalar dişilerin daha uzun naralar atan erkekleri tercih ettiğini göstermiştir. Bu erkeklerin daha iyi genlere sahip olup olmadığını test etmek için araştırmacılar farklı dişilerden yumurtaları bölüp her dişinin yumurtasının bir yarısını in vitro uzun naralı erkeklerden aldıkları spermlerle, diğer yarısını ise kısa naralı erkeklerden aldıkları spermlerle döllediler. Bu çaprazlamalardan çıkan iri başlar olgunlaşıncaya kadar beklendi. Uzun naralıların dölleri iribaş halindeyken daha hızlı büyüdü ve daha iyi yaşadı, metamorfozda (iri başların kurbağaya dönüştüğü süreç) daha büyüktü ve metamorfozdan sonra da daha hızlı büyüdü… Jerry A. Coyne

http://www.biyologlar.com/eseyli-ureme-seks-evrimi-nasil-yonlendiriyor

Helicobacter pylori

Helicobacter pylori (Helikobakter pilori- Hp) mide ve duodenum'um çeşitli alanlarında yerleşen, gram (-), mikroaerofilik bir bakteridir. Yerleştiği yerlerde kronik enflamasyona neden olur. Bu kronik enflamasyon sonucunda duedenum ülseri, mide ülseri ve mide kanseri gelişebilir. Önceleri Campylobacter pylori olarak adlandırılan bu bakteri, yapılan birçok araştırmanın sonucunda 1989 yılında Camplobacter ailesine ait olmadığına karar verilmiş ve kendi adıyla anılan Helicobakter ailesine taşınmıştır. Dünya'da insanların %50'sinden fazlasının üst gastrointestinal bölgede H. pylori taşımaktadır. Enfeksiyon gelişmekte olan ülkelerde daha sık görülmektedir. Bununla beraber, H. pylori ile enfekte insanların %80'den fazlası asemptomatiktir. Birçok kişi kronik H.pylori enfeksiyonu geçirse de herhangi bir semptom göstermez. Bazılarında ise mide ve duodenal ülserler de dahil olmak üzere birçok ciddi probleme neden olabilir. Ülserler çeşitli semptomlara neden olabilir veya hiçbir semptom göstermeyebilir. Sık görülen şikayetler; ağrı veya sızı (genellikle üst abdomende), şişlik, çok az yemek yedikten sonra dahi doyma hissi, iştah eksikliği, bulantı, kusma, koyu renkli gayta'dır. Bunlara ek olarak, kanamalı ülserler yorgunluk hissi ve düşük kan sayımına neden olabilir. Helikobakter pilori (Hp); spiral yapıda, mikroaerofilik gram (-) bir bakteri olup yaklaşık 3 mikrometre uzunluğunda ve 0.5 mikrometre çapındadır. Oksijenli solunum yapar ancak yaşayabilmesi için atmosferdeki oksijen oranı çok fazladır. Daha düşük oranda oksijen bulunan ortamlarda üreyebilirler, bu nedenle bu bakterilere mikroaerofilik (%1'den az oksijenli ortamda yaşayabilen) bakteri denir. İntestinal bakteriler tarafından üretilen moleküler hidrojenin (H2) oksidasyonu yoluyla enerji üretmeye yarayan hidrojenaz enzimini ihtiva eder. Bu enzimin yanı sıra katalaz, oksidaz ve üreaz enzimlerine de sahiptir. Üreaz enzimi; mide mukozasının iç kısmında mukus tabakasının içerisine yerleşen bu bakteriyi, üre'den oluşturduğu bazik bir ürün olan NH3 (amonyak) sayesinde mide asitinden kendini korur. Yoksa asit ortama dayanaksız, çok narin bir bakteridir. Ayrıca biofilm oluşturma özelliği de vardır. H. pylori 5 major dış membran proteini (OMP) ailesine sahiptir. Bilinen en büyük aile adhezyon proteinleridir. Diğer 4 aile ise porinler, demir transporterları (taşıyıcıları), flagellum-ilişkili protein ve fonksiyonu bilinmeyen proteinlerdir. Diğer gram-negatif bakteriler gibi, H. pylori'nin dış membranında da lipopolisakkarit (LPS) ve fosfolipitler bulunur. Ayrıca dış membranında kolesterol de ihtiva eder ki, bu H. pyloriden başka çok az bakteride daha bulunmaktadır. Flagella sayesinde tüm gastrik ve enterohepatik Helikobacter türleri hayli hareketlidir, H. pylori ise 4-6 adet flagellaya sahiptir. Helikobakter pilori (Hp); spiral yapıda, mikroaerofilik gram (-) bir bakteri olup yaklaşık 3 mikrometre uzunluğunda ve 0.5 mikrometre çapındadır. Oksijenli solunum yapar ancak yaşayabilmesi için atmosferdeki oksijen oranı çok fazladır. Daha düşük oranda oksijen bulunan ortamlarda üreyebilirler, bu nedenle bu bakterilere mikroaerofilik (%1'den az oksijenli ortamda yaşayabilen) bakteri denir. İntestinal bakteriler tarafından üretilen moleküler hidrojenin (H2) oksidasyonu yoluyla enerji üretmeye yarayan hidrojenaz enzimini ihtiva eder. Bu enzimin yanı sıra katalaz, oksidaz ve üreaz enzimlerine de sahiptir. Üreaz enzimi; mide mukozasının iç kısmında mukus tabakasının içerisine yerleşen bu bakteriyi, üre'den oluşturduğu bazik bir ürün olan NH3 (amonyak) sayesinde mide asitinden kendini korur. Yoksa asit ortama dayanaksız, çok narin bir bakteridir. Ayrıca biofilm oluşturma özelliği de vardır. H. pylori 5 major dış membran proteini (OMP) ailesine sahiptir. Bilinen en büyük aile adhezyon proteinleridir. Diğer 4 aile ise porinler, demir transporterları (taşıyıcıları), flagellum-ilişkili protein ve fonksiyonu bilinmeyen proteinlerdir. Diğer gram-negatif bakteriler gibi, H. pylori'nin dış membranında da lipopolisakkarit (LPS) ve fosfolipitler bulunur. Ayrıca dış membranında kolesterol de ihtiva eder ki, bu H. pyloriden başka çok az bakteride daha bulunmaktadır. Flagella sayesinde tüm gastrik ve enterohepatik Helikobacter türleri hayli hareketlidir, H. pylori ise 4-6 adet flagellaya sahiptir. Enfeksiyonun teşhisi genellikle dispeptik semptomların varlığı ve H. pylori enfeksiyonunu gösteren testler yapılması sonucunda konur. Bakterinin antikorlarının varlığını kanıtlamak için kan testi, Dışkıda helikobakter antijen testi, veya üre-nefes testi yoluyla noninvaziv olarak H.pylori enfeksiyonu varlığı tespit edilebilir. Bununla beraber, H.pylori enfeksiyonunu saptamak için daha güvenilir yöntemler; mideden doku parçası alarak hızlı üreaz testi, histolojik inceleme, ve mikrobiyal kültürdür. Bu testlerin hiçbiri hatasız değildir. Biyopsi için alınan materyalin lokalizasyonuna bağlı olarak biyopsi yönteminde dahi hata payı vardır. Mesela, kan antikor testi %76 ila %84 sensitive (hassaslık) oranına sahiptir. Bazı ilaçlar H. pylori üreaz aktivasyonunu etkilediğinden, üre testlerinin yanlış negatif sonuç vermesine sebep olabilir. H. pylori üst gastrointestinal hastalıklarının en sık sebebidir. Bu enfeksiyonun eradikasyonu dispepsi, gastrit, peptik ülser semptomlarını azaltcaktır ve belki de mide kanseri önlenecektir. Antimikrobiyal direncin artması, bu bakterinin önlenme stratejilerine ihtiyacı arttırmaktadır. Fare modelleri üzerinde yapılan aşı çalışmaları umut verici sonuçlara sahiptir. Araştırmacılar değişik adjuvanlar, antijenler ve immun sistemin korunmasında en uygun yöntemi anlamak için immunizasyon yolakları üzerinde çalışmaktadır. Araştırmacıların çoğu daha yeni hayvan çalışmaları safhasından insanlar üzerinde yapılan çalışmalara geçmiştir. H. pylori enfeksiyonuna karşı geliştirilen intramusküler bir aşının Faz I klinik çalışmalar sürmektedir. Bakterinin keşfedilme tarihi olan 1982'den önce sigara, alkol, kafein, asit, baharatlı yiyecekler ve stres ülserin temel nedenleri olarak kabul ediliyordu. Hastaların çoğuna uygulanan tedaviler semptomları azaltmakla birlikte, etken olan enfeksiyon ortadan kaldırılmadığından kalıcı bir çözüm oluşturmaktan uzaktı. Artık ülserlerin büyük bir kısmına HP’nin neden olduğunu biliyoruz. Uygun antibiyotik kullanımı ile hastaların çoğunda enfeksiyon başarıyla ortadan kaldırılmakta ve ülserin yeniden oluşma olasılığı çok azalmaktadır. Günümüzde, Hp antibiyotikler ile proton pompası inhibitörleri gibi mide asidini baskılayan ilaçların bir kombinasyonu kullanılarak başarıyla yok edilebilmektedirler. Mide çeperinin direncini azaltarak mide asitlerinden etkilenmesini sağlayan bakteri ayrıca mide kanserine de yol açmaktadır. Midenin ph'ında bile yaşayabilen bir bakteri olduğundan tedavi için güçlü antibiyotikler kullanılmalıdır. Dünya nüfusunun üçte biri ile yarısı arasında bir kesim Hp bakterisini taşımaktadır. Son yıllara kadar gözden kaçırılan bu bakteri, hemen hemen tüm gastrit ve ülser ile bazı mide kanseri vakalarının ardında yatan neden olarak açıklanmaktadır. Uzun yıllar çektikleri mide rahatsızlığının Hp'den kaynaklandığından habersiz sayısız kişi pek de yararını görmedikleri anti-asit ilaçları kullanmaktaydı. Ülser uygun antibiyotik tedavisiyle çoğunlukla bir haftada ortadan kaldırılabilmekte iken, yapılan bir araştırma ABD'de ülser tedavisi için yazılan reçetelerin sadece %3'ünün antibiyotik içerdiğini ortaya koymuştur. Hp sebep olduğu kronik mukozal inflamasyon ile uzun dönemde başka faktörlerle beraber mukozanın değişimine katkıda bulunarak mide kanseri gelişmesinde rolü olabilir. Ayrıca son zamanlarda gastroenteroloji dışında şeker hastalığı, koroner damar hatalığı, baş ağrısı, Reynaud fenomeni ve safra taşı gibi durumlarda rolü olabileceğine ait yayınlar vardır. Kesin korunma, geliştirilecek aşı ve aşı uygulaması ile olacaktır. H. pylori kolonileri midede kolonize olur ve midenin uzun süreli enflamasyonuyla kronik gastrit oluşmasını tetikler. Birçok insanda on yıllarca midede varlığını sürdürür. H. pylori ile enfekte birçok kişi kronik gastritleri olsa dahi hiç klinik semptom göstermez. H. pylori kolonilernin yaklaşık %10-20'si er geç mide ve duodenum ülserinin gelişmesine neden olur. Ayrıca bu enfeksiyon, mide kanseri için ömür boyu %1-2 ve gastrik MALT lenfoma gelişmesi açısından %1'den az oranda risk faktörüdür. Tedavinin olmadığı inancı oldukça yaygındır, H. pylori enfeksiyonu, bakteri bir kez mideye yerleşince, ömür boyu sürer. Bununla beraber mide mukozasında kolonizasyon için uygun olmayan koşulların ve atrofinin artması sonucunda enfeksiyonun yok olması da muhtemeldir. Akut enfeksiyonlara karşı dayanıklılık oranı bilinmemekle beraber, birçok araştırmada enfeksiyonun kendiliğinden elimine edildiğini göstermiştir. Mide kanseri ve Hp Mide kanseri, tüm dünyadaki kanserler arasında ikinci sırayı işgal etmekte ve her yıl yaklaşık 650.000 kişinin ölümünden sorumlu olduğu bilinmektedir. Yapılan araştırmalar Hp'nin mide kanserine yakalanma riskini arttırdığını ortaya koymaktadır. Hp'nin kronik enfeksiyonunun midede kalıcı, hatta ömür boyu süren kronik gastrite, bunun da zamanla çok odaklı “atrofik gastrit” denen özel bir gastrit türüne dönüştüğünü, süregelen bu yangı ve tahrişin de zamanla kansere yol açabileceği söylenilmektedir. 15 yıllık bir süreçte kronik gastrit vakalarının en az yüzde 10’unda kansere ilerleme görülebileceği bilinmektedir. Sosyo-ekonomik ve hijyenik durumu iyi olmayan bölgelerde yaşayan insanların midesinde bulunma ihtimali %80'e kadar çıkabilir. Gelişmiş toplumlarda yaklaşık %10 seviyesindedir. Yüksek dozda ve kombine olarak bazı antibiyotiklerin kullanılmasıyla tedavisi mümkündür. Barry Marshall ve Robin Warren adlı iki bilim adamı Avustralya'nın Perth şehrinde 14 Nisan 1982 tarihinde, yüzyılın en önemli keşiflerinden biri olarak kabul edilen Helicobacter pylori’yi kültürde izole etmişlerdir. Bu başarıları onlara 2005 yılında Nobel Tıp ödülünü kazandırmıştır. Çoğu tarihi buluş gibi bu buluş da tesadüfi bir olay sonucu gerçekleşmiştir. Mide biyopsi kültür vasatlarının Paskalya bayramı tatili nedeniyle her zamanki bekleme süresi olarak belirledikleri 3 gün aşılmış, birkaç gün daha fazla vasatlar etüvde kalması sonucu çok nazlı ve güç üreyen bu bakteri izole edilebilmiştir. Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı 1994 yılında bakteriyi mide kanseri açısından birinci sınıf kanserojen olarak ilan etmiştir. Ayrıcai duodenal ülserlerin %90’nından fazlasında ve mide ülserlerinin yaklaşık %80’inin nedenidir. İnfeksiyon gelişiminde risk faktörleri arasında düşük sosyo-ekonomik koşullar, kalabalık aile ortamı, sanitasyon yetersizliği, Anne ve babanın bu bakteri ile infekte olması, yeterli dezenfeksiyon işlemi uygulanmadan endoskopların diğer hastalarda da kullanılması sayılabilir. Bulaşta fekal-oral yolun yanı sıra oral-oral yol da suçlanmaktadır. Bakteri dünya nüfusunun yaklaşık %50’sinden fazlasını etkilemektedir ve tüm dünyada ülserlerin en yaygın nedenidir. H.pylori infeksiyonu olan altı hastadan birisinde duodenum ya da mide ülseri gelişmektedir. Bakterinin bulaştığı bireyler, bakteriyi yok etmek için ilaçlar verilmedikçe, genellikle infeksiyonu yaşam boyunca taşırlar. Alman bilimadamları 1875 yılında, insan mide mukozasında spiral şekilli bir bakteri tespit etti, fakat kültür edilme imkânı yoktu ve nihayetinde unutulup gitti. İtalyan araştırmacı Giulio Bizzozero, 1893 yılında köpeklerin midesinde asidik ortamda yaşayan benzer şekilli bir bakteri tarif etti. Prof. Walery Jaworski 1899 yılında insanlardan mide içeriğinde sedimentleri araştırdı. Bazı çubuk şekilli bakterilerin yanı sıra karekteristik spiral şekilli bakteriler buldu ve bu bakterileri Vibrio rugulo olarak adlandırdı. Ayrıca Prof. Walery Jaworski, mide hastalıklarının patogenezinde bu organizmanın olası rollerinin olduğunu öne süren ilk kişi oldu. 1900'lü yılların başında yapılan birçok küçük çapta araştırma mide kanseri ve peptik ülserli birçok hastanın midesinde virgül şeklindeki bakterilerin varlığını gösterdi. Bununla beraber Amerikan bilimadamlarının 1954 yılında yayınlanan; 1180 mide biyopsisinde bu bakterinin gözlenmemesi husundaki bir çalışmanın ardından bu bakteriye olan ilgi azaldı. Mide hastalıklarında bakterinin rolünü anlama husundaki ilgi, 1970'lerde mide ülseri olan hastalarda bakterinin gösterilmesini takiben yeniden alevlenmiştir. Avustralyalı patolog Robin Warren tarafından da 1979 yılında bu bakteri gösterildi, ardından 1981 yılında Avustralyalı doktor Barry Marshall ile çalışmalarını ilerletti. Mideden bu bakterinin kültürü üzerine yapılan birçok başarısız denemenin ardından, en sonunda Paskalya tatili nedeniyle bilinçsiz olarak Petri kaplarının 5 gün inkübasyonu sonunda 1982'de kolonilerin gösterilmesi başarıldı. Warren ve Marshall yayınladıkları makalede, H. pylori enfeksiyonunun birçok mide ülseri ve gastritin nedeni olduğunu, daha önce sanıldığı gibi stres yahut baharatlı yemeklerle alakası olmadığı fikrini ileri sürdü. Başlangıçta bazı şüpheli yaklaşımlar olsa da, yıllar içinde, birçok araştırma grubu H. pylori ile ülser ve gastrit ilişkisini doğruladı. H. pylori'nin gastrite neden olduğunu göstermek ve hiçbir etkisi olmadığı sadece orda bulunduğu savını çürütmek için, Marshall içinde H. pylori bulunan deney şişesini içti. Birkaç gün sonra kusma ve bulantı ile ciddi şekilde rahatsızlandı. İnokülasyondan 10 gün sonra yapılan endoskopide gastrit işaretleri ve H. pylori varlığı gösterildi. Bu sonuçlar ışığında H. pylori'nin gastritin esas nedeni olduğunu kanıtlandı. Marshall ve Warren birçok gastrit vakasının tedavisinde antibiyotik tedavisinin etkinliğini göstermek üzere çalışmaya başladı. 1994 yılında, ABD'de bulunan Ulusal Sağlık Enstitüsü (National Institutes of Health) sık tekrarlayan duodenal ve gastrik ülserilerin H. pylori sebepli olduğu söyledi ve tedavisi için antibiyotiklerin kullanılmasını önerdi. Warren ve Marshall, H. pylori üzerine yaptıkları çalışmanın ardından 2005'te Tıp dalında Nobel Ödülü ile ödüllendirildi.

http://www.biyologlar.com/helicobacter-pylori

HÜCRELERİN ÇÖZÜLMESİ

1) -196 ºC’den alınan kriyovial 37 ºC’lik su banyosunda hızlı bir şekilde eritilir 2) Kriyovialin içindeki hücre süspansiyonu 6 ml besiyeri içeren falkon tüpe yavaşça aktarılır. Hücreler DMSO içerisinde oldukları için maniplasyonlar nazik olmalıdır. 3) Tüp 1800 rpm’de 5 dk santrifüj edildikten sonra üst sıvı atılır ve pelete 1 ml medyum uygulanır. 4) Hücreler 1 ml içinde iyice çözüldükten sonra üzerlerine 4 ml besiyeri eklenir. 5 ml’lik hücre süspansiyonu 60 mm’lik medyumlu’lu kültür kabına aktarılır. 5) Ertesi gün medyum değiştirilir (2. gün). Kültür kabı her gün invert mikroskop ile kontrol edilip hücreler konfluent oldukları gün tripsinlenerek pasajlanabilir. Kullanılan çözeltiler 1) Hücre Kültür Medyumu: DMEM/F12 %10 FBS ve %1 Antibiyotik (250 ml için; 225 ml DMEM/F12, 25 ml FCS ve 250 μl antibiyotik) 2) dPBS: Ticari solusyon 3) Tripsin /EDTA % 0,25 : Ticari Solüsyon 4) Dondurma Medyumu : % 80 FCS ve %20 DMSO KULLANILAN MALZEMELER Kimyasallar: 1. DMEM/F12 (SİGMA D0547 1 LX10) 2. DPBS (SİGMA D5652 1 LX10) 3. %0,25 TRİPSİN-EDTA (SİGMA T4049) 4. DMSO (SİGMA D 2650 ve D 4540 ) 5. ANTİBİYOTİK (SİGMA A 5955) 6. FCS (SİGMA F9665 veya BİOLOGİCAL INDUSTRIES HEAT INACTİVATED) Kültür malzemeler: 1. DONDURMA KABI MR. FROSTY (NALGENE 5100-0001) 2. DONDURMA TÜPLERİ CYROVİALLER (NUNC 377267 1,8 ml) 3. PİPET UÇLARI ( 5 ML 160510, COSTAR 10 ML 4488, 50 ML LİK PLASTİK PİPET UCU) 4. KÜLTÜR PETRİLERİ ( TPP 35 mm-93040, TPP 60 mm-93060, TPP 100 mm) 5. CAM PASTÖR PİPETİ (ISOLAB) 6. PASTÖR PİPETLER İÇİN OTOKLAVA DAYANIKLI METAL KUTU 7. KÜLTÜR TÜPLERİ (TPP 15 ML VE 50 ML-90050)

http://www.biyologlar.com/hucrelerin-cozulmesi

ANTIBIYOTIKLERIN BAKTERISIDAL ETKILERININ BELIRLENMESI

Infeksiyon hastalıklarının tedavisinde antibiyotiklerin kullanılmaya baslamasıyla yeni bir çıgır açılmıs ve geçmis yüzyıllarda en önemli ölüm nedeni olan infeksiyon hastalıklarını bu sıralamada daha gerilere itmistir. Tedavide kullanılan antibiyotiklerin bir kısmının etkisi, yalnızca bakterilerin çogalmasını durdurmakla sınırlı kalmakta, antibiyotik baskısı kalktıgında bu etki de ortadan kalkmakta ve bakteriler çogalmalarına devam etmektedir. Antibiyotiklerin bu etkilerine “bakteriyostatik etki” denir. Makrolid grubu antibiyotikler ve kloramfenikol bu tip etki göstermektedirler. Ilk kullanılan antibiyotik olan penisilinin de içinde yer aldıgı ß-laktam grubu antibiyotikler ise “bakterisidal” etki gösterirler, yani bakterinin ölümüne neden olurlar. Bakteriyostatik etkili antibiyotikler, immün sistemin de yardımıyla çogu infeksiyonda basarılı sonuç vermektedir. Immün sistemi yeterli olmayan hastalarda, immünosüpresif ilaç kullananlarda bakteriostatik etki yeterli olmamakta ve bakterisid etkili antibiyotiklerin kullanımı gerekmektedir. Bu antibiyotiklerin mutlaka kullanılması gereken durumlar; endokardit, menenjit, osteomiyelit gibi infeksiyon hastalıklarıdır. Immün sistemin infeksiyon alanında yeterince etkili olamadıgı bu tip durumlarda bakterisidal etkili antibiyotikler tercih edilmelidir. Antibiyotiklerin bakteriler üzerinde olusturdukları etkileri incelemek için pek çok yöntem gelistirilmistir. Diger bölümlerde çogalmayı baskılayan en düsük antibiyotik yogunlugunun yani MIK ölçümü veya antibiyotik disklerinin uygulanmasıyla duyarlılık ölçümü anlatılmıstır. Bu bölümde ise bakterisidal etki belirlenmesi için kullanılan yöntemler anlatılacaktır. YÖNTEMLER Antibiyotik - bakteri etkilesimini degerlendirmek için olusturulan yöntemlerde, belirli miktarda bakterinin belirli yogunluktaki antibiyotikle belirli bir süre teması gerekmektedir. Bu süre sonrasında canlı bakteri sayılması ise bakterisidal etki belirlenmesinde temeldir. Bakterisidal etkiden bahsedebilmek için canlı bakterilerin miktarının %99.9 azalması gerekmektedir. Iki farklı yöntem bu etkinin belirlenmesinde kullanılır: a) En küçük bakterisidal konsantrasyon (MBC): Bir gecelik inkübasyondan sonra (18-24 saat) canlı bakterilerin sayımı esasına dayanır. Bu ise, baslangıçtaki bakterilerden belirli bir kısmını öldüren en düsük antibiyotik yogunlugudur. b) Time kill: Zamana ve antibiyotik yogunluguna baglı olarak, antibiyotigin bakterisidal etkisini dinamik olarak ortaya koyan bir yöntemdir. Bu yöntemde, bakteri miktarındaki azalma zamana baglı olarak her bir bakteri yogunlugu için ayrı verilir. Zamana baglı azalma için farklı zamanlarda canlı bakteri sayımı yapılır. Minimal Bactericidal Concentration (MBC) : MIK degerinin belirlenmesinin ardından yapılır. MIK degeri ve üzerindeki konsantrasyonlarda canlı bakteri sayımı yapılır. Bakterisidal etki, baslangıçtaki canlı bakterilerin azalmasını saglayan en düsük konsantrasyondur. Bu azalma Fransa’da %0.01, Ingiltere’de %0.1 olarak degerlendirilir. Baslangıçtaki inokülum 105 bakteri (CFU) / ml’dir (100000). Yani Fransızlara göre <101 CFU / ml (<10), Ingilizlere göre <102 CFU / ml (<100). Eger MBC degerinin MIK degerine oranı 1 veya yakınsa bakterisidal etkiden bahsedilebilir. Bu oran, antibiyotik bakterisidal etkili olmasına karsın bazı suslar için 32 veya daha fazla olabilir. Bu durumda toleranstan bahsedilir. Vankomisine toleranslı Streptococcus pneumoniae susu tanımlanmıstır. MIK degerleri degismemekle birlikte, streptograminlerin stafilokoklar ve enterokoklar için bakterisidal etkilerinin, bu susların ribozomu metilleyen bir enzim için kodlanan erm genleri içeren suslarında görülmüstür. TIME KILL YÖNTEMI Besi yeri: Sıvı besi yeri olarak Mueller Hinton Broth kullanılır. Canlı bakteri sayımı için bakteri cinsine göre Triptik Soy Agar veya Kanlı Agar kullanılabilir. Inokülum: Baslangıçta 105 CFU / ml kullanılır. Gerekli malzemeler: Hemoliz tüpleri 15 ml’lik tüp Çalkalamalı ben mari Etüv Dilüsyon tüpleri Hazırlanısı MIK degerinin 2 alt ve üst konsantrasyonlarında antibiyotik içeren 5 ml MH besiyeri hazırlanır. Örnegin; eger test edilecek bakterinin MIK degeri 1mg/L ise 0.25, 0.5, 1, 2 ve 4 mg/L antibiyotik içeren tüpler seri dilüsyonla inokülum eklenmesine hazır hale getirilir. Inokülum Hazırlanması Time kill için baslangıçta 105 CFU / ml bakteri gerekmektedir. Gecelik besi yeri 109 CFU /ml bakteri içerir. Eger bu kültürden 50 μl alırsak 5X107 CFU almıs oluruz. Bunu 5 ml besiyerinde dilüe edersek yaklasık 5X105 CFU / ml bakteri inoküle etmis oluruz. Saat 0’da örnek alınması Kontrol tüpü ve antibiyotik içeren tüpleri bakteri ile inoküle eder etmez her tüpten 100 μlalınır ve 900 μl su içeren hemoliz tüplerine aktarılır. Aktarılan 1. tüpten 100 μl alınarak yine 900 μl su içeren 2. tüpe aktarılır. En az 3 kez pipetajla karıstırıldıktan sonra 100 μl alınır ve 3. tüpe aktarılır. Her konsantrasyon tüpünden ve kontrol tüpünden 6 dilüsyon hazırlanır. Yani total 0. Saat için 6X6=36 tüp hazırlanır. Hazırlanan her tüpten 100 μl alınarak agar besi yerine yayılır. Agar petrilerinin arkasına hangi antibiyotik dilüsyonundan alındıgı petrilerin arkasına hangi k onsantrasyondan, kaçıncı saatte alındıgı ve hangi dilüsyon oldugu yazılmalıdır. Inokülasyon sonrası 3. saatte örnek alınması Inokülasyon saatinden 3 saat geçtikten sonra, 0. saatte yapıldıgı gibi her konsantrasyondan 0.1ml örnek alınarak 6 seri dilüsyon hazırlanır ve her bir dilüsyon TS agar içeren besi yerine yayılarak ekilir. Petrilerin yazılmasının önceden yapılması daha uygun olur. Diger saatlerde örnek alınması Laboratuvara göre degismekle birlikte en uygun yöntem 0, 3, 6, 12 ve 24. saatlerde örnekleme yapılmasıdır. 12. saat geceye kalacagı için bazı laboratuvarlarda 0, 2, 4, 6 ve 24. saatlerde örnekleme yapılması tercih edilmektedir. Koloni sayımı Çalısılan saatlerde her konsantrasyon için 6 petriye dilüsyonlarla ekim yapılmıstır. Bu petrilerden her biri için sayım yapmaya gerek yoktur. Hangi dilüsyonda 30-300 arası koloni olusmussa o petrideki koloniler sayılır. Petrinin iki veya dörde bölünerek yalnızca bir alanda sayım yapılıp, bölünen alan sayısıyla çarpılması suretiyle toplam koloni sayısının elde edilmesi uygun bir yöntem degildir. Sayım gözle, kalemle veya otomatik sayıcılarla yapılabilir. Koloni sayısının hesaplanması Ekim yapılırken dilüsyon yapıldıgı için koloni sayımında da bu göz önüne alınmalıdır. Örnegin; eger 3. dilüsyonda 112 koloni saydıysak antibiyotikli besiyerinde mililitreye düsen canlı bakteri sayısını CFU / ml cinsinden nasıl hesaplarız? 112 koloni demek 1,12 X 102 koloni denektir. 3. dilüsyon oldugu için 103 eklenir. Besiyerinden 0.1ml örnek aldıgımız için ml’deki konsantrasyonu hesaplamak için 101 daha eklenir. 3. dilüsyonda 112 koloni sayılan antibiyotikli besi yerindeki total koloni sayısı 1,12 X 102+3+1 yani 1,12 X 106 olur. Sekil 3’de verilen örnekte koloni sayımı MIK konsantrasyonu için 5. Dilüsyon sayım için kullanılacaktır. Diger petrilerde koloni sayısı 30-300 koloni sınırında olmadıgı için bu petriler sayım için kullanılmaz. Bu dilüsyondaki sayıma göre MIK konsantrasyonunda 4,1X101+1+5 koloni yani 4,1X107 koloni vardır. 2XMIK konsantrasyonunda ise 2. dilüsyon koloni sayımının yapılması gereken petridir. Bu petride 48 koloni oldugu için total 2 MIK konsantrasyonundaki bakteri miktarı 4,8X101+2+1 yani 4,8X104 olarak hesaplanır. 4XMIK konsantrasyonunda da dilüsyonlarda sayılabilir petri yoktur. Sayım için dilüsyonsuz ekime basvurulabilir. Veya 4X101 olarak degerlendirilebilir. Eger baslangıç konsantrasyonu 106 ise 3 log’dan fazla azalma vardır (6.9-1,6=5,3 log) ve bu konsantrasyonda antibiyotik bakterisidal etkilidir. Log(10) cinsinden degerlerin hesaplanması Örnegimizde MIK konsantrasyonu için 4,1X106 koloni hesaplamıstık. Bu degeri grafik olarak ifade etmek için Log(10) degerlerini hesaplanması gerekmektedir. Bunu logaritma hesaplayan bir hesap makinesinde yapabiliriz. Sekil 3’de verilen örnekte 3. saatteki MIK, 2MIK ve 4MIK degerleri logaritmik degerlere dönüstürdügümüzde elde ettigimiz sonuçlar Sekil 4’deki grafikte kullanılmıstır; 4,1X106 için log degeri 6,61, 4,8X104 için 4,68 ve 4X101 degeri için 1,6 degerleri bulunmustur. Bu degerleri Excel sayfasına yerlestirdigimizde ve zaman-konsantrasyon iliskisi ile grafik çizdirdigimizde time kill grafigi elde etmis oluruz. PROTOKOL Hazırlık Test edilecek bakteri için test edilecek antibiyotigin MIK degerinin bilinmesi gerekir. Bu amaçla kitabın makrodilüsyon bölümünde yazıldıgı gibi MIK tayini yapılır. Hemoliz tüpleri agızları pamukla kapalı halde pastör fırınında steril edilir. Bir antibiyotigin 1 sus üzerine bakterisidal etkisini ölçmek için 1 kontrol ve 5 antibiyotik konsantrasyonu olmak üzere 6kültür / her kültür için 6 / 0, 3, 6, 12 ve 24 olmak üzere toplam 5 zamanda ölçülecegi için 6 X 5 X 5 = 150 hemoliz tüpü / 150 agar pleyt gerekmektedir. Hemoliz tüplerine 0.9 ml steril distile su veya MH broth eklenir. Bir önceki aksamdan 5ml MH broth’a test edilecek bakteri antibiyotik eklenmeden ekilir. 1. Gün Eger vankomisin MIK degeri 2 olan S. aureus susu ile çalısıyorsak; 30 -1/4MIK, 1/2 MIK, MIK, 2MIK ve 4 MIK konsantrasyonlarında bakteri kültürü hazırlamak gerekir. Eger test edilecek susun MIK degeri 2 μg/ml ise 4X MIK degeri 8μg/ml olacaktır. 10 ml MH broth bulunan besi yerinde 8μg/ml antibiyotik konsantrasyonu için 80μg vankomisin eklemek gerekir. Eger 2 mg / ml vankomisin içeren antibiyotik solüsyonumuz varsa içeren her μl’de 2 μg vankomisin içereceginden 40 μl stok solüsyonunu 10 ml besi yerine eklenir. Eklemeden önce 10 ml’den 40 μl besi yerini alınması gerekir ki hacim degisikligi konsantrasyonu etkilemesin. Pipetleme yoluyla karıstırdıktan sonra 5 ml alıp 5ml MH broth bulunan tüpe aktarılır ve karıstırılır. Böylece 2. tüpteki antibiyotik konsantrasyonu yarıya yani 4 μg / ml’ye düsmüs olur bu da 2X konsantrasyonudur. Sırayla 3., 4. ve 5. tüplere de seri dilüsyon yapılır ve 2, 1 ve 0.5 μg / ml’lik MIK, 1/2MIK ve 1/4MIK konsantrasyonları elde edilmis olur. Son tüp dilüsyonunda karıstırdıktan sonra 5 ml alınarak atılır böylece tüm tüplerde 5 ml kalmıs olur. Çogalma kontrolü için 1 tüp de antibiyotiksiz hazırlanır. -Hazırlanan 6 adet 5 ml besi yeri içeren tüplere 50 μl, gecelik kültürden eklenir ve karıstırılır. -Bakteri çogalmaya baslamadan örnek alınması gerekir. Her bir konsantrasyondan ve kontrol kültürden 100 μl alınıp 900 μl distile su bulunan hemoliz tüpüne eklenir. Kültürler 37ºC’da çalkalamalı ben mari içinde inkübe edilir. -Kültürden 100 μl eklenmis 1. dilüsyon tüpünden 100 μl alınır ikinci dilüsyon tüpüne eklenir karıstırılır ve 100 μl 3. dilüsyon tüpüne eklenir ve sırayla 4., 5. ve 6. dilüsyon tüplerinde seri dilüsyona tabi tutulur. Ekim Dilüsyonlar hazırlandıktan sonra mümkün oldugunca çabuk ekim yapılması gerekir. Her dilüsyonda 100 μl alınarak TS veya kanlı agara ekilir. Petrinin her alanına yayılacak sekilde ekilir. L haline geririlmis Pastör pipeti veya plastik L bageti bakterileri yaymak için kullanılabilir. Eger en küçük dilüsyondan yaymaya baslanırsa aynı pastör pipeti ile yayılabilir. Inkübasyon. Inkübasyon sıcaklıgı ve ortamı test edilen bakteriye göre degisir. Eger S. aureus için test yapılıyorsa 37ºC ve normal havada inkübasyon yapmak gerekir. Inkübasyon süresi 18-24 saattir. -Ekim ve örnekleme islemleri 3., 6., 12. ve 24. saatte tekrarlanır Sonuç. Bakterisidal etki zaman ve konsantrasyon bagımlı olarak time kill testi ile gösterilir. Eger 3 log azalma varsa bakterisidal etkiden bahsedilir. Sekil 5’de 100000 yani 11X105 koloni ile MIK ve 2MIK konsantrasyonlarında antibiyotikli besi yerinde inkübe edilen bakterilerde MIK konsantrasyonunda koloni sayısı 10X105 den 10X103 düzeyine kadar inmis yani bakterisidal etki 24 saat boyunca gözlenmemistir. 2 MIK konsantrasyonunda ise 3. saatte koloni sayısı 10X102 ‘nin altına inmis ve 24 saat boyunca bu düzeyin altında kalmıstır. 3 log’luk azalma <10X10 CFU oldugundan “2MIK konsantrasyonda test edilen antibiyotik 3. saatten itibaren bakterisidal etki gösteriyor” denebilir. Kaynakça Antibiogramme. 2006. Courvalin P, Leclercq R, Bingen E. Edition ESKA Paris L’Antibiogramme 1985. Courvalin P, Goldstain F, Philippon A, Sirot J. Edition MPC Brüksel. Bactericidie: Aspects Theorique et Therapeutiques. 1990. Courvalin P, Drugeon H, Flandrois JP, Goldstein F. Edisyon Maloine. Paris  

http://www.biyologlar.com/antibiyotiklerin-bakterisidal-etkilerinin-belirlenmesi

Clostridium perfringens Aranması

Tüm gıda numunelerinde, ısıl işlemini takiben uygun koşullarda soğutulmayan gıdalarada Clostridium perfringens aranması amacını taşır. Et ve et ürünleri riskli gıda arasındadır.Clostridium perfringens; gram pozitif, spor oluşturan, anaerobik, hareketsiz ve çobuk şeklindeki bakterilerdir. Ancak diğer anaeroblara göre oksijene daha toleranslıdır. Enterotoksin A,C ve D tipi Clostridium perfringens türlerinden izole edilir. Clostridium perfringens doğada çok yaygın bulunmakla beraber yüksek sayılara ulaştığında insan sağlığını tehdit eder. Prensip Clostridium perfringens anaerob bir bakteri olduğu için ekim yapılan besiyerlerinin anaerob ortamda inkübe edilmesi gereklidir. Alet ve Ekipmanlar Otoklav Sterilizatör ( 160+5 oC lere ayarlanabilen) İnkübatörler (35+1oC) Analitik teraziler Su banyosu(80-100oC) Stomacher pH metre Bunzen beki Steril bıçak, pens,spatül, vb. malzemeler Tüp karıştırıcı Plastik steril petriler (15x90mm ) Otomatik pipet ve steril pipet ucu Cam tüpler ve tüp sporlar Erlen , beher, mezür vb. standart laboratuvar cam malzemesi Koloni sayacı Platin öze Anaerobik jar veya aerogen ortam torbası Anaerobik ortam oluşturma kitleri Mikrodalga Kullanılan Besiyerleri Maximum Recovery Diluent : Formül : Pepton : 1,0 g Sodium clorür : 8,5 g Distile su : 1 litre Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir. Tryptose Sulfite Cycloserine (Tsc) Agar: Formül: Tryptose : 15g Yeast extract : 5g Soyone : 5g Ferric ammonium citrate : 1g Sodyum metabisulfit : 1g Agar : 20g Distile su : 900ml Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,6+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 10 dakika sterilize edilir. D-cyclocerineSolusyonu: D-cyclocerine1g, steril distile su 200ml filitreden geçirilerek sterilize edilir.Yada hazır formu kullanılır. Egg yolk emülsion Otklavdan çıkan besiyeri 50 oC ‘ye geldiğinde Hazır besiyerinin etiketinde yazdığı ölçülerde D-cyclocerineSolusyonu eklenir ve bir kısmı, ekim sonrası ikinci tabaka oluşturmak için aseptik koşullarda tüplere bölünür.Geri kalan besiyerine Egg yolk ilave edilir ve petrilere aseptik koşullarda bölünür. Streç filme sarılarak +4 oC‘de saklanır. · Thioglyconat Besiyeri Formül: L-cystine : 0.5g Agar : 0.75g NaCl : 2.5g Dextrose : 5g Yeast extract : 5g Tryptone : 15g Sodyum thioglycollate : 0.5g Rezazurin (%0.1 sodyum solusyonu) : 1ml Distile su : 1000ml Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,1+0,2 olacak şekilde ayarlanır.Tüplere 10ml olarak bölünür. 121+1oC‘de 20 dakika sterilize edilir. Kullanılan Biyokimyasal Besiyerleri (istenirse hazır biyokimyasal test kitleri kullanılabilir) Laktoz Jelatin Besiyeri Formül: Tryptose : 15g Yeast extract : 10g Lactose : 10g Phenol red(%1’lik etanoldeki): 5ml Gelatin : 120g Distile su : 1000ml Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,5+0,2 olacak şekilde ayarlanır.Tüplere 10ml olarak bölünür. 121+1oC‘de 10 dakika sterilize edilir. Hareket Nitrat Besiyeri Formül: Beef extract : 3g Peptone : 5g KNO3 : 1g Na2HPO3 : 2.5g Agar : 3g Galactose : 5g Glyserin : 5ml Distile su :1000ml Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,3+0,2 olacak şekilde ayarlanır.Tüplere 11ml olarak bölünür. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir. Uygulama 25 g(ml) örnek 225 ml (yada x numune miktarı x9 dilisyon sıvısı) Maximum Recovery Diluent ile gıda mikrobiyolojisi laboratuvar kurallarına uygun olarak homojenize edilir.Bu 1/10’luk dilüsyondan 1ml alınarak önceden hazırlanmış olan TSC(Egg yolk’lu) besiyeri içeren petrilere yayma yöntemine göre yüzeye ekim yapılır. Eğer numunedeki Clostridium perfringens sayısı yüksek bekleniyorsa seri dilisyonlar da yapılabilir. Ortalama 45oC ye getirilen Egg yolk katılmamış TSC besiyeri ikinci tabaka oluşturmak üzere ekim yapılmış petrilere dökülür.Bu petriler anaerobik jar veya anerogen torbalara anaerobik ortam oluşturma kitleri ile beraber konur. 35oC de 18-24 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası Clostridium perfringens için tipik koloniler lesitinaz aktivitesinden dolayı opak zon oluşur. Sulphide indirgediği için 2-4mm çapında tüm siyah koloniler tipiktir.Petrilerdeki koloni sayısı 25-250 arası olursa sayılabilir. Sonuç kob/g veya kob/ml olarak verilir. Sülfit indirgeyen Clostridia aranması istendiğinde petrideki siyah koloniler sayılarak hesaplanır. Doğrulama Testi Tipik koloniler Thioglycollate besiyerine alınıp 35-37 oC de18-24 saat anaerob ortamda inkübasyondan sonra tekrar TCS agara geçilerek buradaki kolonilerden identifikasyon yapılır. Biyokimyasal test Sonuç Hareket - Nitratı nitrite indirgeme + Laktoz Asit oluşunu Gaz + Jelatıni eritme +

http://www.biyologlar.com/clostridium-perfringens-aranmasi

KEMİK DOKU PREPARATLARININ

Preparasyon 2 teknikle yapılabilir. 1-Yumuşatma tekniği : Gerekli maddeler varsa daha kolay ve uygun bir tekniktir. 2-İnceltme tekniği :Daha çok el becerisine dayanır. a-Kemiğin yumuşatılarak preparat hazırlanması: Uzun kemik parçasının üzerindeki yağ ve kas kısımları bistüri ile temizlenir. Kemiği dekalsifiye etmek için % 5 veya % 7.5’luk nitrik asit (100 cc % 65’lik HNO3 +1200 cc distile su) içine konur. 24-48 saat bırakılır. Sık sık çalkalanır. Beş saatte bir çözelti tazelenir. Kemikler jiletle kesilecek kadar yumuşayınca çıkarılır. 24-48 saat kadar % 5’lik sodyum sülfat içinde bırakılır. Asitin giderilmesi için çeşme suyunda 1-2 gün yıkanır. Keskin jiletle çok ince kesitler alınarak % 50 ve % 70’lik alkol bırakılan petri kaplarında 10-60 dakika bırakılır. Kreozot (karanfil yağı) içine alınarak 15-20 dakika şeffaflandırılır. Temiz bir lam üzerine alınan kemik üzerine entellan damlatılarak lamel kapatılır. Kesitler yeterli incelikte ise Havers lamelleri ve kemik kanalları izlenebilir. Mikroskopta inceleme yapılırken diyafram kısılırsa daha iyi görüntü alınır. b-Kemiğin inceltilmesi ile preparat hazırlanması: Uzun kemiklerden kemik testeresi ile enine parçalar kesilir. Bunlar elektrikli veya kolla dönen döner zımpara taşlarında mümkün olduğu kadar inceltilir. Bir tahta üzerine konarak ince dişli demir eğe ile inceltilmeye devam edilir. Bu arada incelen kemikten kopmalar olur. Kopan parçalar ponza taşında tekrar inceltilmeye devam edilir. Ponza taşı üzerinde düzgün bir yüzey elde edilir. Bu yüzey üzerine su damlatılır. Kesitler parmak ucu ile taş üzerine sürtülerek daha da inceltilir. Parmak ucunda tutulan kesitlerden parmak izleri görünüyor ise kemik parçaları yeteri kadar incelmiştir. İncelmiş kesitler 5-10 dakika kadar nitrik asitte bekletilir. Sonra distile suda birkaç değişim yapılarak iyice yıkanır. Filtre kağıdı ile süzülür. Dikdörtgen ve kare şeklinde kesilerek lama yerleştirip, entellan damlatılıp lamel kapatılır.

http://www.biyologlar.com/kemik-doku-preparatlarinin

 
3WTURK CMS v6.03WTURK CMS v6.0