Biyolojiye gercekci yaklasimin tek adresi.

Arama Sonuçları..

Toplam 78 kayıt bulundu.

LİKENLERİN TIPTAKİ KULLANIMLARI VE ANTİBİYOTİK ÖZELLİKLERİ

Likenler özellikle Ortaçağ’da şifalı ot olarak kullanılmaktaydı. Likenler yakın zamanlarda da halk ilacı olarak kullanılmaya devam etmişlerdir. Florida eyaletindeki bazı şifalı ot doktorları likenleri ilaç olarak özellikle de balgam sökücü olarak kullanırlar. Cetraria islandica İskandinavya’da şifalı ot dükkanlarında yaygın olarak satılmaktadır ve diyabet hastalıklarına, akciğer hastalıklarına ve nezleye iyi geldiğine inanılmaktadır. Peltigera canina Hindistan’da karaciğer hastalıklarına çare olarak yenilmektedir ve yüksek metiyonin aminoasitini içermesi güç kaynağı olarak kullanılmasını da sağlamaktadır . Halk ilacı olarak kullanılan çoğu likenin antibiyotik etkinliklerinin sebebi olan herhangi bir aktif madde tanımlanamamıştır. Ama likenler 1944 yılından sonra penisilin ve streptomisin bulunduktan sonra biyolojik materyaller içine katılmıştır. Kloromisetin antibiyotiğinin bulucusu Burkholder K.D. Amerika’da 52 farklı liken türünden özütün çeşitli bakteri tiplerinin büyümesini inhibe ettiğini keşfetmiştir. Bu likenlerden antibiyotik bulma yarışına dönüşmüş ve 10 senelik bir periyotta yüzlerce tür ve saflaştırılmış liken maddeleri tüm dünya laboratuarlarında test edilmiştir. Kural olarak bunlar Escherichia, Salmonella ve Shigella gibi gr ( - ) bakterilere karşı etkili değildir ancak gr ( + ) bakteriler önemli derecede usnik asit, protolichesterinik asit ve birkaç orkinol türevinden inhibe olur. Pulvinik asit ve ß – orkinol türevleri nispeten inaktiftir. Biyolojik olarak aktif ama daha henüz tanımlanamamış az sayıda bileşiklerde mikobiyont kültürlerinden izole edilmektedir. Liken maddeleri aynı zamanda bitki patolojisinde de antibiyotikler olarak incelenmektedir. Mesela likenlerden elde edilen sodyum usnatın domates çürüklüklerine (Corynebacterium michiganensis) karşı etkili olduğu bulunmuştur. Tütün mozaik virusuda çeşitli liken özütleri ile inhibe edilmiştir ve müessir maddelerin lekanorik, psoromik ve usnik asit olduğu ispat edilmiştir . Aynı zamanda liken maddelerinin antifungal özellikleri de incelenmektedir. Bir küf mantarı olan Neurospora crassa’nın büyümesi güçlü biçimde usnik asit, haematommik asit ve bazı liken maddelerinin monosiklik fenol türevleri ile inhibe olur. Nephroma arcticum’un suda çözünen özütleri ve daha az oranda Hypogymnia physodes ve Platismatia glauca’nın 7 adet odun çürüten fungus üzerinde fungisit etkisi vardır. Vulpinik, physodic, salazinic ve usnik asitlerin maviye boyanan odun fungusu Trichosporium üzerinde az derecede inhibisyon etkisi vardır. Su özütlü liken maddelerinin aynı zamanda otlarda tohum çimlenmesini ve kök başlamasını inhibe ettiği gösterilmiştir. Mesela Peltigera canina yanındaki ot kolonilerinde kök sistemleri çok az gelişir. Cladonia cinsine ait likenler Finlandiya’daki konifer ormanlarında ağaç fidelerinin çimlenmesini inhibe eder. İnhibasyon mekanizmalarından bir tanesi de metafaz evresinde kromozom hatalarında artış olarak gözükür. Toprak habitatında yaşayan diğer Cladonia türleri karayosunu sporlarının çimlenmesini inhibe eder.

http://www.biyologlar.com/likenlerin-tiptaki-kullanimlari-ve-antibiyotik-ozellikleri

Listeria Besiyerleri

FRASER Listeria Selective Enrichment Broth (Merck)Listeria 'nın 2 aşamalı selektif zenginleştirmesi için kullanılan bu besiyerinde Listeria, yüksek besin içeriği ve geniş tampon kapasitesi ile iyi bir gelişme gösterirken refakatçi flora lithium chloride, nalidixic acid ve acriflavine hydrochloride ile inhibe edilir. Listeria 'nın ß-D-glucosidase aktivitesi esculin ve ammonium iron (III) citrate ile belirlenir. Glucoside esculin, ß-D-glucosidase ile esculetin ve glukoza parçalanır, esculetin ise demir (III) iyonları ile zeytin yeşili-siyah bir renk veren bileşik yapar. Dolayısı ile bu besiyerinde Listeria varlığına bağlı olarak bir renk kararması olur.2 aşamalı selektif zenginleştirmenin birinci adımında yarı konsantrasyonda hazırlanmış FRASER Broth, materyal ile inoküle edilir ve 30oC'da 18-24 saat inkübe edilir. 2. adımda ise 1. adım kültüründen 0,1 mL alınarak 10 mL FRASER Broth besiyerine aşılanır, 37oC'da 24 saat inkübe edilir. İnkübasyonun 18. ve 24. saatlerinde Listeria için geliştirilmiş selektif katı besiyerlerine sürme yapılır.L-PALCAM Broth (Merck)İstenmeyen mikroorganizmaların gelişimi polymyxin-B-sulfate, acriflavine, lithium chloride ve ceftazidime ile inhibe edilir. Soya lesitini, yumurta sarısı emilsiyonu yerine kullanılır. Esculin, ammonium iron (III) citrate, mannitol ve phenol red Listeria 'nın ayrımında kullanılır. 30oC'da 24-48 saat inkübasyondan sonra besiyeri renginde kararma olursa, buradan Listeria için selektif bir katı besiyerine sürme yapılır ve inkübasyondan sonra koloni izole edilebilir.PALCAM Agar (Merck) Dışkı, biyolojik örnekler, gıdalar ve yoğun kontamine olmuş çevre örneklerinde Listeria 'nın doğrudan geliştirilmesi ve dolayısıyla sayımı için geliştirilmiş bir besiyeridir. İstenmeyen mikroorganizmaların inhibisyonu polymixin, acriflavine, ceftacidim ve lithium chloride ile sağlanırken Listeria kolonileri zeytin yeşili-siyah renk ile ayrılır. İnhibe olmayan mannitol pozitif enterokok ve stafilokoklar sarı zonlu sarı koloni yaparlar.Cl. perfringens için TCS Agar (Merck)Yüksek besin içeriği Clostridium 'lar için uygundur. H2S oluşumuna bağlı olarak Clostridium perfringens kolonileri siyah renk alır. Cycloserine, refakatçi floranın inhibisyonunu ve zayıf kolonizasyonunu sağlar. Bu besiyeri için hazırlanan özel katkı 4-Methylumbelliferyl-phosphate (MUP) alkali ve asit fosfotaz için fluorejenik bir substrattır. Asit fosfotaz Cl. perfringens için yüksek spesifiklik gösteren bir indikatördür.Asit fosfotaz MUP 'u uzun dalga boylu UV ışığı altında fluoresans veren 4-methylumbelliferone 'a parçalar. İnkübasyon sonucunda oluşan siyah renkli ve fluoresans veren koloniler Cl. perfringens kolonileridir.

http://www.biyologlar.com/listeria-besiyerleri

Besiyeri Hazırlanmasında Kullanılan Maddeler

Besiyeri bileşimine giren maddeler gelişme açısından; a) Gelişme için gerekli olanlar, b) inhibitörler olarak 2 gruba ayrılabilir. Gelişme için gerekli olan maddeler doğrudan mikroorganizmaların beslenme şekilleri ile ilgilidir ve bu maddeler besiyeri içinde bir anlamda zorunlu olarak bulunurlar. İnhibitörler ise gelişmesi istenmeyen mikroorganizmalar için gerektiğinde selektif besiyerlerine ilave edilirler. Besiyerlerine giren kimyasal maddeler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir.1. SuBesiyeri hazırlamada kullanılan suyun; distilasyon veya deiyonizasyon ile taze hazırlanmış olması, başta bakır olmak üzere toksik metallerden arı olması gerekir. İyon değiştirici reçineden geçirilerek elde edilen deiyonize (= demineralize) su kullanıldığında bu suyun içinde yüksek sayıda mikroorganizma bulunabileceği dikkate alınmalıdır. Destile (= Distile) su için en ideali cam sistemlerin kullanılmasıdır.Gerek deiyonize, gerek destile su eldesinde saf su sisteminin ve benzer şekilde saf suyun depolandığı kapların belirli aralıklarla temizlenmesi gerekir.Taze hazırlanmış saf suyun pH'sı 6,5-7,5 arasında olmalıdır. Depolanmış saf su atmosferik karbondioksitin absorbe edilmesi sonucu asit pH gösterir. Eğer saf suyun pH'sı 5,5'in altında ise bu su ısıtılarak CO2 uzaklaştırılır ve pH yeniden kontrol edilir. Eğer pH hala düşük ise NaOH ile saf su nötral pH 'ya getirilir ve saf su sistemi kontrol edilir. Besiyeri hazırlamada kullanılan su, asit özellik gösteriyor ise ve besiyeri bileşimde bikarbonat tamponlar varsa bunları etkileyerek hazırlanmış besiyerinde bir takım olumsuzluklara yol açabilir.2. Peptonlar"Pepton" deyimi ilk kez 1880 yılında Nageli tarafından kullanılmıştır. Nageli, kemoorganotrof mikroorganizmaların kısmen parçalanmış (hazmedilmiş = sindirilmiş = digested) protein içeren besiyerinde iyi geliştiklerini ilk açıklayan bakteriyologdur. Bugün pepton deyimi, proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel isimdir. Yaşayan tüm hücreler gibi mikroorganizmalar da azot, karbon, tuzlar ve diğer besin maddelerine gereksinirler. İstisnalar dışında mikroorganizmalar genel olarak proteini azot kaynağı olarak kullanamazlar ve azotlu bileşikleri daha kolay kullanabilecekleri protein hidrolizatlarına gerek duyarlar.Peptonlar sadece azot değil, aynı zamanda karbon kaynağı olarak da mikroorganizmalar tarafından kullanılırlar. Bunun yanında peptonların bileşiminde bulunan bazı aminoasitler ve vitaminler bazı mikroorganizmaları için gelişme faktörü olarak işlev görürler.Proteinler; kuvvetli asitler, kuvvetli alkaliler ile ya da enzimatik olarak temel bileşenleri olan peptit ve amino asitlere ayrışırlar. Bu amaçla en çok kullanılan proteolitik enzimler papain, pepsin ve pankreatin'dir.Peptonlar çeşitli ticari firmalar tarafından çeşitli hayvansal dokulardan, sütten ve soyadan farklı yöntemlerle elde edilirler ve farklı ticari isimler ile pazarlanır ve/veya dehidre besiyerleri içine ilave edilirler. Hammadde ve üretim yöntemi farklılığı doğal olarak peptonların bileşimlerinde farklılıklar oluşturur. Dolayısı ile farklı amaçlar için farklı peptonlar kullanılır.3. Ekstraktlar1. Maya EkstraktıMaya ekstraktı (maya özütü = yeast extract) otolize edilmiş (parçalanmış) bira mayasının (Saccharomyces cerevisiae) sulu ekstraksiyonu ile elde edilir. Özellikle yüksek B kompleksi vitamin konsantrasyonu nedeniyle çoğu mikroorganizmanın iyi bir şekilde gelişmesini sağlar. Bileşimindeki amino asitler, peptidler, vitaminler, karbohidratlar ve mineraller sayesinde pek çok mikrobiyolojik çalışmada kullanılır. Doğal karbohidratları nedeniyle fermentatif çalışmalarda kullanılmaz.2. Et EkstraktıEt ekstraktı (et özütü= meat extract = beef extract = lab lemco powder) genellikle yağı ve tendonları ayrılmış, ekstraksiyon öncesi hafifçe hidrolize edilmiş etten elde edilir. Karbohidrat içermez. Bu nedenle fermentasyon çalışmalarında kullanılabilir. Besiyerlerinde et peptonları yerini alabilir.3. Malt EkstraktıMalt ekstraktı (malt özütü = malt extract) biralık arpadan elde edilir. Başta maltoz olmak üzere çeşitli karbohidratların yüksek konsantrasyonuna bağlı olarak maya ve küflerin geliştirilmesi için kullanılır.4. Beyin ve Kalp EkstraktıBeyin ekstraktı (= brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) zor gelişen (= fastidious) patojen bakterilerin (streptokoklar, pneumokoklar, meningokoklar, gonokoklar vs) geliştirilmesi için besiyeri bileşimine katılır (Brain Heart Broth, Brain Hearth Infusion).5. Pirinç EkstraktıPirinç ekstraktı (rice extract), başta Candida türleri olmak üzere mayaların ayrımında kullanılan Rice Extract Agar 'ın bileşimine girer. Bu besiyerinde besin maddesi olarak sadece pirinç ekstraktı bulunur.4. Jelleştiriciler1. AgarBesiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştirici agar (= agar agar)'dır. Agar, bir poligalaktozid olup "agarophytes" olarak tanımlanan bazı kırmızı deniz yosunlarından (Gellidium, Eucheuma, Gracilaria, Acanthopeltis, Ahnfeltia, Pterocladia türleri) elde edilir. Bazı hidroksil grupları sülfürik asit ile esterifiye edilmiştir.Katılaştırma (= jelleştirme) özelliğini bileşimindeki D-galakton sağlar. Bileşiminde ayrıca inorganik tuzlar, çok az miktarda protein benzeri maddeler ve eser miktarda yağ vardır. Mikrobiyolojide kullanılan agarlar özel olarak saflaştırılırlar ve antimikrobiyel maddelerden arındırılırlar.Agarın bileşimindeki agaroz ve agaropektin adlı 2 polisakkarit agarın etkisini belirler. Agaroz, agarın yüksek jelleştirme özelliğinden sorumlu iken, agaropektin viskoz özellikler verir. Agardaki agaroz : agaropektin oranı hammaddelere göre değişmekle beraber agaroz oranı % 75'e kadar çıkabilir.Agar, besiyeri bileşimine sadece jelleştirici olarak katılır. Bir kaç istisna dışında mikroorganizmalar için agar, uzun ve dallanmış zincir yapısı nedeniyle mikroorganizmalar için besin maddesi değildir.Agar, 85 oC'da erir, 40 oC'da jelleşir. Gerek erime, gerek jelleşme sıcak-lığına ortamın pH'sı etkilidir. 5'in altındaki pH 'larda agar jelleşme özelliğini yitirir. Agarın jelleşme sıcaklığı literatürde 32-36 oC ve 32-39 oC olarak verilmektedir. Bununla beraber, petri kutularına döküm sırasında petri kutularının oda sıcaklığında (20 oC) olduğu ve dolayısıyla petri kutusu ile besiyeri arasında ısı değişimi olacağı dikkate alınarak döküm sıcaklığının 40 oC kadar olması gerekir.Agar, besiyerine amaca göre % 0,05-3 gibi geniş bir sınırda ilave edilebilir. Düşük agar konsantrasyonları (% 0,05-0,3) genellikle hareketliliğin belirlenmesi, mikroaerofillerin geliştirilmesi vb özel amaçlarla kullanılır. Standart kullanım konsantrasyonu %1-1,5'dur. Yüksek konsantrasyonlar ise yüksek asitli besiyerlerinde agarın jelleşme özelliğini göreceli olarak geri kazanması amacıyla kullanılır.2. JelatinMikrobiyolojinin gelişme yıllarında ilk kez Robert KOCH tarafından jelleştirici olarak kullanılan jelatin bu gün daha ziyade proteolitik aktivitenin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.Kollegen protein yapısında olup fermente olabilir karbohidratları içermez. Jelleştirici olarak besiyerine ilave edildiğinde jelatinin ısıya duyarlığı nedeni ile 115 oC 'da 10 dakika gibi düşük sterilizasyon normu kullanılmalıdır. Jelatin, 121 oC'da sterilizasyonda ise jelleşme özelliğini kayda değer ölçüde yitirir. Besiyeri bileşimine % 12-15 düzeyinde katılır. Yaklaşık 28 oC 'da eridiğinden jelatin kullanılan besiyerleri 28 oC 'ın altında inkübe edilmelidir.5. KarbohidratlarBazı besiyerlerinin bileşimine bakteriler için enerji ve karbon kaynağı olarak katılan karbohidratların bir başka kullanım şekli karbohidrat fermentasyonuna dayalı identifikasyon testleridir.Besiyeri bileşiminde karbon kaynağı olarak en çok kullanılan karbohidratlar glukoz, laktoz ve sakkarozdur. Bunlardan glukoz pek çok bakteri tarafından kullanılabildiği için daha çok genel besiyeri bileşimlerinde yer alır.Adonitol, arabinoz, sellobioz, sellüloz, dekstroz (= glukoz), dulsitol, galaktoz, inositol, inulin, laktoz, levuloz (= fruktoz), maltoz, mannitol, mannoz, melezitoz, mellibioz, nişasta, rafinoz, rhamnoz, sakkaroz (= sukroz), salisin, sorbitol, trehaloz, ksiloz çeşitli fermentasyon testlerinde kullanılmak üzere sıvı besiyerlerine katılabilmektedir.Glukoz, laktoz sakkaroz, mannitol gibi bazı karbohidratlar çeşitli katı besiyerlerine yine fermentasyonun izlenmesi ve buna göre koloninin ön identifikasyonunda yararlanmak amacı ile katılır.Koliform grup bakterilerin geliştirileceği besiyerlerinin hemen hepsinde C kaynağı olarak laktoz kullanılır. Koliform grubun geliştirilmesine yönelik olarak hazırlanmış besiyerlerinde laktozdan gaz oluşumu koliform grup için belirleyicidir.Nişasta, kullanımı (hidrolizi) bazı bakteriler için tipik olduğundan çeşitli özel besiyerlerinin bileşimine katılır.Karbohidratların genel olarak filitrasyon ile sterilize edilmesi önerilir. Bazı besiyerlerinin bileşimine katılan glukoz, laktoz, sakkaroz gibi bazı şekerler besiyeri ile birlikte otoklavda sterilize edilebilirler.6. TuzSodyum klorür, çoğu besiyerinin bileşimine izotonik bir ortam oluşturmak için katılır. Tuza dayanıklı bakterilerin selektif izolasyonu için yüksek konsantrasyonlarda özel besiyerlerinin bileşimine katılır.7. Tampon MaddelerMikroorganizmalar genel olarak nötr ve nötre yakın pH 'larda iyi gelişirler. Bazı mikroorganizmalar alkali pH 'ları yeğlerken (örneğin Rhizobium bakterileri) bazıları (örneğin mayalar, küfler, asidofilik bakteriler) asidik ortamları severler.Bir besiyerinde elden geldiğince çok sayıda mikroorganizma geliştirilmesi isteniyorsa pH nötre yakın değerde olmalı, tersine olarak geliştirilmesi istenen mikroorganizma yüksek asitliğe veya yüksek alkaliliğe dirençli (= rezistans) ise besiyeri pH'sı bu mikroorganizmanın gelişebileceği pH 'ya ayarlanmalıdır.Asitlik/alkalilik, besiyerlerinin selektivite kazandırılmasında çok kolay ve dolayısıyla çok yaygın olarak kullanılan bir faktördür. Örneğin maya ve küflerin, asidofilik bakterilerin geliştirileceği ortamlarda pH düşürülerek pek çok mikroorganizmanın gelişmesi kayda değer ölçüde önlenir/kısıtlanır.Metabolizmaya bağlı olarak besiyeri pH 'sında değişmeler meydana gelir. Bazı çalışmalarda inkübasyon sırasında pH 'nın değişmesi geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vereceği için istenmez. pH değişmesinin minimumda tutulması amacıyla besiyerine çeşitli tampon (buffer) maddeler ilave edilir. Tampon olarak en çok kullanılan maddeler, fosfatlar (K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, ß gliserofosfat), karbonatlar, asetatlar ve sitrat 'dır.8. İndikatörler1. pH İndikatörleriMikrobiyel metabolizma sonunda bazı besiyeri bileşenlerinden çeşitli asit veya alkali ürünler meydana gelir. PH 'daki değişme en kolay olarak pH indikatörleri ile belirlenir ve pH indikatörlerinin renk değişimine bağlı reaksiyonlar o besiyerinde gelişen mikroorganizmalar için önemli göstergelerdir.Aşağıda, besiyeri bileşiminde kullanılan çeşitli pH indikatörleri ve pH 'ya bağlı renkler verilmiştir.İndikatör Asit pH / renkAlkali pH / renkFenol blueFenol redBrom Cresol GreenBrom Cresol PurpleBrom Thymol BlueCresol RedLitmusMetil RedNeutral RedRosalic Asit 2. Redoks indikatörleriEn yaygın olarak kullanılan redoks indikatörü TTC (2,3,5 Triphenyl-tetrazolium chloride)'dir. Enterokokların selektif geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılır. Enterokoklar TTC 'yi indirgeyerek kırmızı renkli bir bileşiğe (formazon) dönüştürürler. Özel besiyerinde oluşan kırmızı renkli kolonilerin enterokok kolonileri olduğu bu şekilde anlaşılır.Resazurin, yaygın olarak kullanılan bir diğer redoks indikatörüdür.3. Diğer İndikatörlerMikrobiyel metabolizmaya bağlı olarak bazı kimyasalların çeşitli reaksiyonlar sonucu oluşturdukları ürünlerin belirlenmesi bu besiyerlerinde gelişen mikroorganizmaların ön identifikasyonunda kullanılır. Aşağıda bu tip reaksiyonlarda kullanılan indikatörlere örnekler verilmiştir.- MUG (4-Methylumbelliferyl-ß-Glucuronide): E. coli tanımında son yıllarda en yaygın olarak kullanılan bir bileşiktir. E. coli 'deki MUGase enzimi MUG 'u UV ile fluoresans veren bir bileşiğe parçalar. MUG hakkında aşağıda 7.1.1. bölümünde ayrıntılı bilgi verilmiştir.- Kan: Defibrine kan (çoğunlukla koyun kanı) hemoliz reaksiyonunun belirlenmesi için besiyeri bünyesine katılır.- Lesitin: Yumurta sarısı ve soya fasulyesinde bulunan lesitin, çeşitli bakterilerdeki lesitinaz enzim aktivitesi sonunda parçalanır ve lesitin katılmış katı besiyerinde koloni etrafında berrak zonlar görülür.- Jelatin ve kazein: Jelatin ve kazein proteolitik bakterilerin belirlenmesi amacıyla besiyeri bünyesine katılır. Proteolitik bakteri kolonileri etrafında proteoliz sonunda berrak zonlar oluşur.- Tributirin: Lipolitik aktivitenin belirlenmesi için kullanılır. Lipolitik bakteri kolonileri etrafında lipoliz sonunda berrak zonlar oluşur.9. İnhibitörlerSelektif besiyeri bileşimlerinde istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini engelleyen/baskılayan çeşitli inhibitör maddeler kullanılır.İnhibitör maddelerin etki şekilleri çok farklıdır. Etkileri, öncelikle konsantrasyonlarına bağlıdır.Bir yaklaşıma göre her maddenin yüksek konsantrasyonlarda inhibisyon etkisi vardır. Örneğin çoğu besiyerine ozmotik basınç sağlamak için katılan NaCl, yüksek konsantrasyonlarda pek çok mikroorganizmanın gelişimini engeller. Çoğu mikroorganizma için C kaynağı olarak kullanılan glukoz, % 50 konsantrasyonda ozmofilik/ozmotolerant mayaların gelişimine izin verirken, diğer mikroorganizmaların gelişimini inhibe eden bir etki yapar.Besiyerlerinde inhibitör olarak kullanılan maddeler genel ve selektif inhibitörler olarak kabaca 2'ye ayrılabilir. Genel inhibitörler daha geniş bir spektrumda istenmeyen mikroorganizma gelişimini engellerken, selektif inhibitörler belirli mikroorganizmaların gelişimini etkiler.İnhibisyon etki, yukarıda belirtildiği gibi öncelikle konsantrasyona bağlıdır. Bunun dışında mikroorganizma cinsi ve hatta türü inhibisyonda önemlidir. Belirli bir madde (örneğin tellurit) bazı bakteriler için inhibitör etki yaparken bazı bakteriler telluriti metalik telluriuma indirgerler, sonuçta gri-siyah renkli koloni oluşumu tipik bir morfolojik göstergedir.İnhibitör olarak kullanılan maddenin görevi, istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önlemek iken, kuşkusuz gelişmesi istenen mikroorganizma için inhibitör etki yapmamalıdır. Sadece belirli bir türün dışında tüm mikroorganizmaların gelişimini etkileyen inhibitör madde kullanımı oldukça nadirdir. Örneğin Malahit yeşili (Malachite Green) ve Cetrimide, Pseudomonas aeruginosa dışında, tüm refakatçi florayı inhibe eder.Besiyerinde tek bir inhibitör kullanımı yerine birden fazla inhibitör kullanmak ve/veya gelişmesi istenmeyen mikroorganizmayı kısıtlı besin maddesi bulundurmak, O/R potansiyelini değiştirmek, inkübasyon sıcaklığını ayarlamak vb yöntemlerle engellemek yaygın olarak uygulanan inhibisyon şekilleridir.İnhibitör olarak kullanılan tüm maddelerin hangi mikroorganizmalar için hangi konsantrasyonda ve hangi mekanizma ile inhibisyon etki sağladıklarını listelemek çok güçtür ve bu kitabın kapsamı dışındadır. Bununla beraber en çok kullanılan inhibitörler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir.- Boyalar: Metakrom sarısı (Metachrome Yellow) Proteus kolonilerinin yayılmasını; Eosin Y, metilen mavisi (Methylen Blue) gram pozitif bakterilerin gelişimini; malahit yeşili (Malachite green) Pseudomonas aeruginosa dışındaki refakatçi floranın gelişimini engeller/baskılar.- Sodyum Azid: Gram negatif bakterilerin gelişimini engeller.- Safra Tuzları (Bile salts, Ox bile): Gram pozitiflerin gelişimi engeller. - Antibiyotikler: Genellikle bakterileri engellemek için geniş spektrumlu olarak küf geliştirme besiyerlerinde veya refakatçi bakteriyel florayı inhibe etmek için dar spektrumlu olarak kullanılırlar.- Deoksiçolat (Deoxycholate): Gram pozitif bakterileri, kısmen koliformları ve zayıf olarak Shigella 'yı engeller.Bunların dışında selenit, tetratiyonat, bizmut, lauryl sülfat, yüksek konsantrasyonda asetat vb maddeler çeşitli besiyerlerinde inhibitör madde olarak kullanılırlar.

http://www.biyologlar.com/besiyeri-hazirlanmasinda-kullanilan-maddeler

Besiyeri Çeşitleri

Besiyerleri farklı mantıklar altında gruplandırılabilir. Örneğin, besiyerleri fiziksel özelliklerine göre sıvı ve katı olmak üzere 2 gruba ayrılırken bir başka bakış açısı ile orijinlerine göre bitkisel, hayvansal, sentetik, türev, karışık vb şekillerde sınıflandırılabilirler. Besiyerlerinin kullanım amacına (=fonksiyonlarına) göre sınıflandırılması ise bir anlamda besiyerlerinin formülasyonları ile doğrudan ilgilidir ve sınıflandırmada en çok kullanılan şekildir.Besiyerlerinin kullanım amaçlarına göre sınıflandırılmalarında da farklı yaklaşımlar vardır. Bir kısım araştırıcıya/kullanıcıya göre belirli bir grupta yer alan bir besiyeri bir diğer kısmına göre ise başka bir grupta sınıflandırılmaktadır. Aşağıda, besiyerleri kullanım amacına göre en çok kabul gören sınıflandırma şekli ile gruplandırılmıştır. Bu sınıflama şeklinde besiyerleri öncelikle "genel besiyerleri" ve "özel besiyerleri" olarak 2 gruba ayrılmakta, özel besiyerleri ise kendi içinde alt gruplara ayrılmaktadır.1. Genel BesiyerleriHerhangi bir inhibitör madde içermeyen, besin maddelerince yeterli veya zengin, herhangi bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor gelişen (fastidious) mikroorganizmaların da dahil olduğu çok sayıda bakterinin gelişmesini sağlayan besiyerleridir.Genel besiyerleri başlıca, çeşitli örneklerdeki toplam mezofil aerob bakteri sayımı, toplam psikrofil aerob bakteri sayımı, bozulma/hastalık etmeninin ön izolasyonu amaçları ile kullanılır.- Başta gıda maddeleri olmak üzere pek çok örnekte "toplam mezofil aerob bakteri sayısı" ile "toplam psikrofil aerob bakteri sayısı" tayinleri önemli kalite kriterleridir. Toplam mezofil aerob bakteri sayısından kasıt 37 oC'da gelişebilen aerob bakterilerin sayısıdır. Kuşkusuz 37 oC'da gelişebilen aerob bakterilerin tümü bu tip besiyerlerinde gelişemez. Ancak pratik uygulamada genel besiyerlerinde gelişebilenler dikkate alınır.- Nedeni hakkında bir ön fikir edinilemeyen bozulma/hastalık etmeninin izolasyonu için yine genel besiyeri kullanılır. Burada amaç, "bozulma/hastalık etmeninin her ne olursa olsun öncelikle izole edilmesidir" ve genel bir besiyeri kullanmak bir anlamda zorunludur. Bozulma/hastalık etmeninin zor gelişen bir mikroorganizma olabileceği varsayımı ile bu tip izolasyonlarda zor gelişen mikroorganizmaların da gelişebileceği besiyerleri kullanmak daha doğru olur.Tüm bakterilerin geliştirilebileceği nitelikte bir genel besiyeri yoktur. Genel besiyerleri, zor gelişen bakterilerin sadece bir bölümünün gelişmesini sağlayabilir. İnkübasyon koşullarının değiştirilmesi ile psikrofillerin, mikroaerofillerin, aerotolerantların ve özel inkübasyon koşullarının sağlanması ile kısmen anaerobların geliştirilmesinde kullanılır.2. Özel BesiyerleriBir tarife göre genel besiyerleri dışında kalan tüm besiyerleri "özel besiyerleri" grubuna girer.2.1. Selektif BesiyerleriSelektif besiyerleri, karışık bir mikrobiyel floradan gelişmesi istenmeyenleri baskılamak ve inhibe etmek, ancak gelişmesi istenenler için herhangi bir olumsuz etki yapmamak üzere formülüze edilirler. Bu amaçla çeşitli inhibitör maddeler kullanılır.İnhibitör maddelerin konsantrasyonu ile inhibe edilmesi hedeflenen mikroorganizma(lar)ın cins ve türlerine göre değişmek üzere, selektif besiyerleri istenmeyen mikroorganizmalar için zayıf, orta veya yüksek selektivite gösterirler. Selektif besiyerleri, belirli bir grup hatta yüksek selektivite gösterenlerde tek bir cins/tür mikroorganizmanın gelişmesine izin vereceğinden bu besiyerleri selektif izolasyon, selektif sayım ve hatta ön identifikasyon amaçları ile kullanılır.Bir besiyerine selektivite kazandırılması her zaman inhibitör madde ilavesi ile yapılmaz. Geliştirilmesi istenilen mikroorganizmanın kullanabileceği, ancak refakatçi mikroflora tarafından kullanılamayan besin maddeleri besiyerine karbon ve azot kaynağı olarak verilerek selektivite sağlanabilir. Örneğin GSP Agar (Merck) besiyerinde glutamat ve nişastadan başka besin maddeleri yoktur. Nişasta ve glutamat Pseudomonas ve Aeromonas türleri tarafından besin maddesi olarak kullanılırken gıda maddeleri, atık sular ve gıda endüstrisi ekipmanında bu bakteriler ile birlikte bulunan bakteriler (=refakatçi mikroflora) bu maddeleri metabolize edemez ve dolayısıyla gelişemez ya da bu maddeleri çok kısıtlı olarak kullanabilenler ihmal edilebilecek kadar küçük koloni oluştururlar.2.2. Diferansiyel BesiyerleriSelektif besiyeri hazırlamak ve kullanmak; inhibitörlerin gelişmesi istenen mikroorganizmaya az da olsa bir miktar zarar verebilmesi, inhibitör kullanımı ile istenmeyen mikroorganizmaların inhibisyonun her zaman mümkün olmaması, bazı inhibitörlerin insan sağlığı için de zararlı olması vb nedenlerle her zaman istenilen sonucu vermemektedir. Mikrobiyolojide besiyeri olarak selektif ortamlar yerine diferansiyel besiyerlerinin hazırlanması ve kullanılması ile çoğu kez tatmin edici sonuçlar alınmaktadır.Diferansiyel besiyerlerinde gelişmesi istenen mikroorganizma yanında diğer mikroorganizmalar da gelişebilir, ancak başta koloni morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır.Bu tarif altında diferansiyel besiyerleri zayıf ve orta güçte selektivite gösteren selektif besiyerlerinin modifikasyonu olarak nitelendirilebilir.Ayırt edici (fark ettirici) koloni özelliği, çeşitli pH indikatörleri, boya maddeleri, indirgeyiciler, diğer indikatörler vb maddelerin besiyerine ilavesi ile yapılır. En basit olarak besiyeri bünyesine, ayırt edilmek istenen mikroorganizmanın kullanabileceği, ancak ortamda bulunan diğer bakterilerin yararlanamayacağı bir karbohidrat ilave edilir ve mikroorganizmanın bu karbohidratı kullandığı çeşitli indikatörlerle belirlenir. Örneğin koliform grup bakteriler için laktozdan gaz oluşturulması tipik bir ayırt edici özelliktir ve gaz oluşumu durham tüpleri kullanılarak belirlenir. Pek çok mikroorganizma belirli bir karbohidratı kullanırken asit oluşturur ve bu asitlik pH indikatörü ile rahatlıkla belirlenebilir. Tersine olarak gelişmesi istenen mikroorganizma besiyerine katılan bir maddeden alkali ürünler oluşturabilir. Bu durum yine pH indikatörleri ile belirlenebilir. Ya da mikroorganizmanın jelatinaz, lipaz, lesitinaz vb enzim aktiviteleri besiyerinde oluşan çeşitli berrak zonlar ile belirlenebilir.Diferansiyel besiyerinde gelişen mikroorganizmaların ayrımı koloni morfolojisi, enzimatik aktivitelerin belirlenmesi, gaz oluşumunun izlenmesi vb çıplak gözle yapılabileceği gibi bunlara ilave olarak fluoresansa dayalı olarak da yapılabilmektedir. MUG ilave edilmiş besiyerleri E. coli için yaygın bir şekilde kullanılırken, setrimid (=cetrimide) katılmış besiyerlerinde Pseudomonas aeruginosa yine UV ile ayırt edilmektedir.Diferansiyel besiyerleri sadece selektif besiyerlerinin bir modifikasyonu değildir. Çeşitli genel besiyerlerine ilave edilen özel bazı katkılar bu besiyerlerine diferansiyel bir nitelik kazandırabilir. Hemoliz reaksiyonları için kullanılan kanlı agar besiyeri buna en tipik örnektir. CASO Agar (Merck) besiyerine MUG ilave edilerek yapılan besiyerinde toplam mezofil aerob bakteri sayımı yanında E. coli sayımı da fluoresans ile yapılabilmektedir.Diferansiyel besiyerleri, amaca göre selektif izolasyon, selektif sayım ve ön identifikasyon amaçları ile kullanılmaktadır.2.3. Zenginleştirme BesiyerleriKarışık bir mikroflora içinde hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek, sayısını artırmak vb amaçlarla kullanılan zenginleştirme besiyerleri, önzenginleştirme besiyerleri ve selektif zenginleştirme besiyerleri olarak 2 alt gruba ayrılırlar.Önzenginleştirme besiyerleri genel olarak hasar görmüş (= injured = yaralanmış) mikroorganizmaların aktivitelerini kazanmaları için kullanılan, bileşiminde inhibitör içermeyen ve dolayısı ile aktivite kazanması istenen mikroorganizma yanında refakatçi mikrofloranın da gelişmesini sağlayan sıvı besiyerleridir ve bu tarif altında "özel amaçla kullanılan genel besiyerleri" olarak nitelendirilebilir. Önzenginleştirmede kullanılan besiyerlerine en tipik örnek gıdalarda Salmonella aranmasına yönelik çalışmaların ilk aşaması olan "önzenginleştirme" amacıyla kullanılan Tamponlanmış Peptonlu Su besiyeridir. Bileşiminde litrede 10 g et peptonu, 5 g NaCl ve 10 g fosfat tampon olan bu besiyerinde Salmonella yanında ortamdaki diğer bakteriler de gelişebilmektedir.Selektif zenginleştirme besiyerleri ise özel amaçla kullanılan selektif sıvı besiyerleridir. Bunlara en tipik örnekler ise Listeria ve Salmonella aranmasında kullanılan besiyerleridir. Selektif zenginleştirme aşamasında karışık kültür olarak bulunan bakterilerden gelişmesi istenmeyenler çeşitli selektif inhibitörler ile engellenir. Selektif zenginleştirme aşamasını genellikle selektif bir katı besiyerine sürme yapılarak aranan bakterinin selektif izolasyonu aşaması izler. Bu çerçevede selektif zenginleştirmenin amacı, selektif izolasyonda başarı şansını artırmak için aranan mikroorganizmanın karışık kültür içindeki sayısını artırmaktır.Selektif zenginleştirme aşaması her zaman önzenginleştirme aşamasını izlemez. Gıda maddelerinde Salmonella aranırken yukarıda da belirtildiği gibi işlem sırası önzenginleştirme/selektif zenginleştirme/selektif katı besiyerine sürme şeklinde iken Salmonella 'dan şüphe edilen gayta (=dışkı) örnekleri doğrudan selektif zenginleştirme /selektif katı besiyerine sürme aşamalarını izler. 2 farklı örneğe farklı işlem uygulanmasının nedeni gayta örneğinde aktif ve yüksek sayıda Salmonella olmasıdır. Gıda maddesi ise önzenginleştirme aşamasından geçirilerek bir anlamda önzenginleştirme kültürü Salmonella sayısı ve aktivitesi açısından gayta örneğine benzer bir hale getirilir.2.4. İdentifikasyon BesiyerleriTam selektif ve diferansiyel besiyerlerinin ön identifikasyonda kullanılabileceğine yukarıda değinilmiş idi.Tam selektif bir besiyerinde gelişen bir mikroorganizmanın identifikasyonu cins ve hatta bazı durumlarda tür bazında tamamlanabilir. Diferansiyel besiyerlerinde de aynı durum geçerlidir.Bir mikroorganizma izolatının identifikasyonu için en çok kullanılan testler biyokimyasal nitelikli olanlardır. İdentifikasyon besiyerleri, mikroorganizmanın belirli bir besin maddesini (genellikle karbohidratlar) kullanıp/kullanmadığının saptanması, belirli bir besin maddesinden metabolizma sonunda tayin edilebilecek metabolitleri (örneğin triptofandan indol) oluşturup/oluşturmadığının belirlenmesi vb amaçlar ile kullanılır. Bakterinin hareketli olup olmadığının saptanması amacıyla kullanılan yarı katı (semi solid) besiyerleri de identifikasyon besiyerleri grubuna katılmaktadır.3. Diğer BesiyerleriAntimikrobiyel duyarlık testlerinde kullanılan agar disk difüzyon besiyerleri ile minimal inhibisyon konsantrasyonu testlerinde kullanılan sıvı ve katı besiyerleri, vitaminlerin ve amino asitlerin mikrobiyel yolla belirlenmesinde kullanılan besiyerleri, saf kültürlerin korunması (=kolleksiyonu) amacıyla kullanılan besiyerleri gibi özel amaçlara yönelik olarak kullanılan çeşitli besiyerleri de vardır.BESİ YERİ AYRINTILI BİLGİ İÇİN http://www.orlab.net/mikrobiyoloji/942300030.pdf TIKLAYIN

http://www.biyologlar.com/besiyeri-cesitleri

Mikrobiyal Biyoteknoloji Bölüm 4

MİKROBİYAL FİTAZLAR Tahıl ve baklagil tohumlarının olgunlaşması sırasında fitik asitin (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihidrojen fosfat) önemli bir miktarı birikmekte olup (Honke ve ark. 1998) bu tohumların çoğunda ve yan ürünlerinde %1-2 fitik asit bulunmaktadır (Reddy ve ark. 1982). Fitik asit; tahıl, baklagil ve yağlı tohumlarda fosforun ana depo formudur. Kimyasal olarak tam tarifi myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hekza-dihidrojen fosfat’tır (IUPAC-IUB 1977). Moleküler formülü ise C6H18O24P6’dır. Fitik asitin tuzları fitat olarak tanımlanır. Fitat, fitik asitin potasyum-magnezyum ve kalsiyum tuzlarının karışımıdır (Vohra ve Satyanarayana 2003) Fitaz (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase), fitik asiti (myo-inositol hekzafosfat), inorganik monofosfat, myo-inositol fosfat ve serbest myo-inositol’e hidrolize eden enzimdir (Kerovuo 2000). Bitkilerde, hayvansal dokularda ve çeşitli mikroorganizmalarda fitaz aktivitesinin olduğu bildirilmiştir (Miksch ve ark. 2002). Fitatı parçalayan enzimler IUPAC-IUB (International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry) tarafından iki sınıfa ayrılmıştır: Fitatın D3 pozisyonundaki ortofosfatı uzaklaştıran 3-fitaz (myo-inositol-hekzakisfosfat 3-fosfohidrolaz, EC 3.1.3.8) ve myo-inositol halkasındaki L-6 (D-4) pozisyonundaki defosforilasyonu sağlayan 6-fitaz (myo-inositol-hekzakisfosfat 6-fosfohidrolaz, EC 3.1.3.26). Mikrobiyal fitazlar genellikle 3-fitaz sınıfında yer alırken bitkisel kökenli fitazlar 6-fitaz sınıfında yer almaktadır (Konietzny ve Greiner 2002). Fitaz parçalayan enzimlerle yem hammaddelerinde ve insanlar için hazırlanan gıdalardaki fitat içeriğini azaltmak amacıyla özellikle son yıllarda birçok çalışma yürütülmektedir. Fitatı parçalayan enzimler bitkisel materyalin besleyici değerini artırmak amacı ile tavsiye edilmektedir. Son yıllarda fitaz enzimlerinin özellikle entansif hayvan yetiştiriciliği yapılan alanlarda hayvan gübresiyle ortaya çıkan fosfor kirliliğini azaltmak amacıyla kullanımını da gündeme getirmiştir. Yapılan bir çok çalışmada fitatı parçalayan enzimlerin fitatdan fosfor kullanımını artırmakta olduğu ve çevrede ortofosfat birikimini önemli derecede azalttığı bildirilmiştir (Cromwell ve ark. 1995, Simons ve ark. 1990). Ayrıca bunların yanı sıra myo-inositol fosfatların hazırlanması, kağıt endüstrisi ve toprak iyileştirme alanlarında da fitaz enzimi kullanılmaktadır. Ayrıca son yıllarda biyoteknoloji alanındaki gelişmeler sonucunda heterolog mikrobiyal ekspresyon sistemleriyle büyük miktarlarda ve düşük maliyetli fitaz üretimi de mümkün olabilmektedir. Fitaz enzimi bitkilerde, mikroorganizmalarda ve bazı hayvansal dokularda bulunmasına rağmen yapılan son araştırmalar mikrobiyal fitazların biyoteknolojik uygulamalar için en ümit verici olduğunu göstermiştir (Pandey ve ark. 2001, Vohra ve Satyanarayana 2003). Bakteri, maya ve funguslardan fitaz enzimleri karakterize edilmiş olup, günümüzde ticari olarak üretimde toprak fungusu olan Aspergillus üzerinde durulmaktadır. Ancak substrat spesifitesi, proteolisise karşı direnç göstermesi ve katalitik aktivitesi gibi özelliklerinden dolayı bakteriyel fitazlar, fungal enzimlere alternatif oluşturabilmektedir (Konietzyn ve Greiner 2004). Bakteriyel fitazların ortalama olarak moleküler ağırlığı (40-55 kDa) glukolizasyon farkı olduğu için fungal fitazlardan (80-120 kDa) daha küçüktür (Choi ve ark. 2001, Golovan ve ark. 2000, Han ve Lei 1999, Kerovuo ve ark. 1998, Rodriguez ve ark. 2000a, Van Hartingveldt ve ark.1993). İzole edilen fitazların çoğunun pH optimumu 4.5-6.0 arasında yer almaktadır. Ancak Bacillus sp.’ye ait nötral veya alkali fitazlar da bulunmaktadır (Choi ve ark. 2001, Kim ve ark. 1998). A. niger fitazının (phyA) pH optimumu ise asidik sınırlarda olup 2.5 ve 5.5’dir. Bu iki sınır arasında aktivitede azalma meydana gelmektedir. Mikrobiyal fitazların çoğunun sıcaklık optimumu ise 45-60°C arasında yer almaktadır. Ancak Pasamontes ve ark. (1997a,b) A. fumigatus’a ait sıcaklığa dirençli fitazın 100°C’ye kadar olan sıcaklıklarda 20 dakikalık inkübasyonlarda sadece %10’luk kayıpla aktivitesini koruduğunu bildirmişlerdir. E. coli ve Citrobacter braakii fitazı, ticari olarak kullanılan Aspergillus niger fitazına kıyasla pepsin ve pankreatine daha dirençlidir (Kim ve ark. 2003; Rodriquez ve ark. 1999). Ayrıca C. braakii fitazı tripsine de dirençlidir (Rodriquez ve ark. 1999). E. coli fitazı, Bacillus fitazı ile karşılaştırıldığında, pankreatine benzer hassasiyetlik gösterirken pepsine karşı daha hassastır (Simon ve Igbasan 2002). E. coli ve C. braakii fitazları yem katkısı olarak uygun özelliklere sahiptirler. E. coli fitazı asidik koşullar altında yüksek bir pH stabilitesine sahip olup pH 2.0’de birkaç saat sonunda bile önemli bir aktivite kaybı göstermemektedir (Greiner ve ark. 1993). Fitaz Enziminin Uygulama Alanları 1-) Yem katkısı: Fitat, tohumların çimlenmesi sırasında enerji ve fosfor kaynağı olarak görev alsa da bağlı fosfor tek mideli hayvanlarca çok az miktarda kullanılabilmektedir. Bu nedenle inorganik fosfor yenilenemez ve pahalı bir mineral olup kanatlı, domuz ve balık rasyonlarında fosfor kaynağı olarak ilave edilmektedir (Lei ve Porres 2003). Fitat ve fitata bağlı fosfor tüm kanatlı rasyonlarında bulunmakta ve fitat fosforunun da kısmen kullanıldığı bilinmekteydi (Lowe ve ark. 1939). İlk olarak Warden ve Schaible (1962), broylerde, ekzogen olarak verilen fitazın, fitat fosforunun kullanımını ve kemikteki mineralizasyonu artırdığını bildirmişlerdir. Ancak bundan yaklaşık 30 yıl sonra, yem katkısı olarak, fitata bağlı fosforu serbest bırakacak ve fosfor atığını azaltacak Aspergillus niger fitazının ticari olarak kullanımı başlamıştır. Günümüzde tek mideli hayvanlarda yem katkısı olarak fitaz kullanımı oldukça yaygınlaşmış olup hatta nişasta tabiatında olmayan polisakkaritleri parçalayan enzimlerden daha fazla kullanılmaktadır (Bedford 2003). Geçtiğimiz 10 yıl içerisinde kanatlı ve domuz rasyonlarında mikrobiyal fitaz kullanımı ile bu konudaki bilimsel çalışmalar ve deneyimler artmakta ve yem katkısı yeni fitaz enzimleri araştırılmakta ve kullanılmaktadır. Bazı kanatlı yem maddelerindeki toplam fosfor, fitat fosforu ve toplam fosfordaki fitat fosfor oranları Çizelge 2’de verilmiştir. Ruminantlar ise, rumendeki mikrobiyal flora tarafından üretilen fitaz enzimi ile fitatı parçalayabilmektedirler (Yanke ve ark. 1998). Fitatın parçalanması ile açığa çıkan fosfor hem mikrobiyal flora hem de konakçı ruminant tarafından kullanılmaktadır. Birçok farklı kaynaktan elde edilen mikrobiyal fitaz ürünleri günümüzde ticari olarak kullanılmaktadır. Bunlar arasında yem katkısı olarak en yaygın olarak kullanılanları A. niger (3-fitaz), Peniophora lycii (6-fitaz) ve Escherichia coli (6-fitaz) fitazlarıdır. Kanatlı rasyonlarına fitaz, granül veya sıvı formda veya yüksek peletleme sıcaklığındaki (>80ºC) enzim denatürasyonu probleminden kaçınmak için peletleme sonrasında uygulanabilmektedir (Selle ve Ravindran 2006). Bitkisel fosfor kaynaklarındaki kullanılmayan fitat fosforu zaman içerisinde birikmekte ve entansif olarak hayvan yetiştirciliği yapılan alanlarda çevre kirliliğine neden olmaktadır. Topraktaki aşırı fosfor deniz ve göllere akmakta ve burada yaşayan canlılarda birikerek insanlarda da nerotoksik etki oluşturmaktadır (Lei ve Porres 2003). Su ürünleri üretiminde, soya küspesi ve diğer bitki kökenli küspeler kullanılarak birçok çalışma yürütülmüştür (Mwachireya ve ark. 1999). Pahalı protein kaynakları yerine daha düşük fiyatlı bitkisel protein kaynakları kullanıldığında masraflarda önemli derecelerde azalmaların olabildiği bildirilmektedir. Balık üretim masraflarının %70’ini yem giderleri oluşturmaktadır (Rumsey 1993). Kanatlı ve domuzlarda olduğu gibi balıklarda yem maddeleri içerisindeki fitin fosforundan yararlanacak sindirim enzimine sahip olmadığından suda fosfor birikimi meydana gelmektedir. Bu nedenle fitaz su ürünleri üretmede, hem düşük fiyatlı bitkisel kökenli maddelerin kullanımını artırmak hem de suda fosforu kabul edilebilir seviyede tutabilmek amaçları ile kullanılmaktadır. Balık beslemesinde, yüksek seviyelerde bitkisel kökenli maddeler içeren yemlerde fitaz enziminin kullanılması ile ilgili birçok çalışma yürütülmektedir (Robinson ve ark. 1996, Mwachireya ve ark. 1999). 2-) Gıda sanayi: Fitik asit tuzları olarak tanımlanan fitatlar, bitki tohumları ve danelerde fosfat ve inositolün başlıca depo formudur. Fitat bitki tohumlarının olgunlaşması sırasında oluşur ve olgun tohumlarda toplam fosfatın %60-90’nını oluşturur (Loewus 2002). Fitat bu nedenle bitkisel kökenli gıdaların başlıca bileşenidir. Bazı bitkisel kökenli gıdalardaki kuru maddedeki fitat miktarı Çizelge 3’de verilmiştir. Diyetlerdeki bitki kökenli gıdaların miktarına ve gıdaların işlenme derecelerine bağlı olarak günlük fitat tüketimi en fazla 4500 mg’a kadar yükselmelidir. Ortalama olarak vejetaryen diyetlerinde ve gelişmekte olan ülkelerde kırsal kesimlerde günlük fitat tüketimi yaklaşık 2000-2600 mg olup bu değer karışık diyetlerde 150-1400 mg’dır (Reddy 2002). Diyetlerde fitatın varlığı ile ilgilenilmesinin nedeni mineral alımındaki negatif etkisidir. Bu mineraller çinko, demir, kalsiyum, magnezyum, manganez ve bakırdır (Konietzny ve Greiner 2003, Lopez ve ark. 2002). Fizyolojik pH değerlerinde çözünmez mineral-fitat komplekslerinin oluşumu düşük mineral emiliminin temel nedeni olarak bildirilmektedir. Çünkü bu kompleksler aslında insan sindirim sisteminde absorbe olmamaktadır. Ayrıca sindirim sisteminin üst kısmında sınırlı miktarda mikrobiyal popülasyonun olması ve içsel fitatı hidrolize edici enzimlerin olmaması nedenleri ile ince bağırsakta, fitat çok sınırlı miktarda hidroliz olabilmektedir (Iqbal ve ark. 1994). Fitat, asidik ve alkali pH’da proteinlerle kompleks oluşturmaktadır (Cheryan 1980). Bu interaksiyon proteinin yapısında değişiklikler meydana getirmekte ve bunun sonucunda enzimatik aktivitede, proteinin çözünürlüğünde ve proteolitik parçalanmada azalmalar meydana gelebilmektedir. Fitaz enzimi yem katkısı olarak kullanılmasının yanı sıra gıda sanayinde de büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak şimdiye kadar marketlerde fitaz enzimi kullanılmış gıdalar bulunmamaktaydı. Bu alandaki çalışmalar, gıda işlemede teknik geliştirmenin yanı sıra bitki kökenli gıdaların besleyici değerlerinin artırılması üzerine yoğunlaşmıştır. Fitat içeriği yüksek diyetler mineral maddelerin absorbsiyonunu oldukça azaltmakta (Konietzny ve Greiner 2003, Lopez ve ark. 2002) ve gıdaların işlenmeleri sırasında fitatın defosforilasyonu, sadece kısmen fosforile olmuş myo-inositol fosfat esterlerinin oluşmasına neden olmaktadır (Sandberg ve ark. 1999, Sandström ve Sandberg 1992, Han ve ark. 1994). Myo-inositol fosfat esterleri insanlar için önemli fizyolojik özelliklere sahiptir (Shears 1998). Bu nedenle fitaz enziminin gıda üretimi sırasında kullanılması ile fonksiyonel gıdaların üretilmesi mümkün olacak (Greiner ve ark. 2002) ve böylelikle fitaz enzimi ile biyokimyasal olarak aktif myo-inositol fosfat esterleri oluşacak ve insanlarda mineral maddelerin emilmesi de sağlanmış olacaktır. Gıda sanayinde gıdaların işlenmesi sırasında fitaz ilavesi ekmek yapımı (Haros ve ark. 2001), bitkisel protein izolatlarının üretimi (Fredrikson ve ark. 2001, Wang ve ark. 1999) ve tahıl kepeklerini parçalamada kullanılmaktadır (Kvist ve ark. 2005). Gıda işleme ve hazırlama sırasında, fitat genel olarak, bitkilerde ve mikroorganizmalarda doğal olarak bulunan fitazlarla tamamen hidrolize olmamaktadır. Özellikle demir olmak üzere minerallerin yararlanımını artırmak için fitat çok düşük düzeylere indirilmelidir (Hurrell 2003). Myo-İnositol fosfatların hazırlanması: Günümüzde, transmembran sinyalizasyonunda ve intraselülar kaynaklardan kalsiyumun hareketini sağlamada görev alan inositol fosfat ve fosfolipidlere olan ilginin artması, çeşitli inositol fosfatların hazırlanmasını gündeme getirmiştir (Billington 1993). S.cerevisiae fitazı kullanılarak fitik asitin enzimatik hidrolizi ile D-myo-inositol 1,2,6-trifosfat, D-myo-inositol 1,2,5-trifosfat, L-myo-inositol 1,3,4-trifosfat ve myo-inositol 1,2,3-trifosfatların hazırlandığı bildirilmiştir (Siren 1986a). Ayrıca E. coli fitazı kullanılarak inositol 1,2,3,4,5-pentakisfosfat, inositol 2,4,5-trifosfat ve inositol 2,5-bifosfat da hazırlanmaktadır (Greiner ve Konietzny 1996). İnositol fosfat türevleri enzim stabilizatörü (Siren 1986b), enzim inhibitörü, biyokimyasal ve metabolik araştırmalarda enzim substratı ve ilaç olarak da kullanılmaktadır (Laumen ve Ghisalba 1994). İnositol fosfat karışımları eklem iltihabı ve astım gibi solunum hastalıklarına karşı kullanıldığı ve spesifik inositol trifosfatların ağrı kesici olarak önerildiği de bildirilmiştir (Siren 1998). İnositol veya inositol fosfatların endüstriyel üretiminde, fitik asitten myo-inositol fosfat türevleri, serbest myo-inositoller ve inorganik fosfat eldesinde fitaz enzimi kullanımı önerilmektedir (Brocades 1991). Bu enzimatik hidrolizin avantajı fitaz enziminin spesifitesi ve reaksiyon koşullarına uygun olmasıdır. 3-) Kağıt endüstrisi: Kağıt endüstrisinde bitki fitik asitinin uzaklaştırılması oldukça önemlidir. Günümüzde termostabil fitazlar, kağıt hamuru ve kağıt yapma aşamalarında fitik asiti parçalamak amacıyla kullanılan biyolojik maddelerdir. Fitik asitin enzimatik olarak parçalanması sonucunda kanserojen veya toksik maddeler içeren ürünler oluşmaz. Bu nedenle kağıt endüstrisinde fitaz enzimlerinin kullanımı, daha temiz bir teknolojinin kullanılmış olması ve dolayısıyla çevreyi koruma açısından önem taşımaktadır (Liu ve ark. 1998). 4-) Toprak iyileştirme: Bazı alanlarda toprakta, fitik asit ve türevleri toplam organik fosforun %50’sini oluşturabilmektedir (Dalal 1978). Findenegg ve Nelemans (1993), mısır bitkisi için topraktaki fitik asitten fosforun kullanılabilmesinde fitazın etkisini araştırmışlardır. Toprağa fitaz ilave edildiğinde fitinin parçalanma oranının artmasına bağlı olarak büyümeyi uyardığını bildirmişlerdir. Bu çalışma bitkilerin köklerinde fitaz geninin ekspresyonu ile transgenik bitkilerle topraktaki fosforun kullanılabileceği düşüncesini ortaya çıkarmıştır (Day 1996). 5-) Biyoteknoloji : Geçtiğimiz 20 yıl içerisinde fitaz enzimi, besleme, çevre koruma ve biyoteknoloji alanlarındaki bilim adamlarının dikkatini çekmektedir. Fitazlar özellikle biyoteknolojik uygulamalarda (özellikle yem ve gıdalardaki fitat içeriğini azaltmada) büyük bir önem taşımaktadır (Lei ve Stahl 2001, Vohra ve Satyanarayana 2003). ANTİBİYOTİKLER Ticari olarak üretilen mikrobiyal ürünlerin içerisinde en önemlisi antibiyotiklerdir. Antibiyotikler mikroorganizmalar tarafından üretilen, diğer mikroorganizmaları öldüren veya büyümesini inhibe eden kimyasal maddelerdir. Antibiyotikler tipik sekonder metabolitlerdir. Ticari olarak faydalı antibiyotiklerin birçoğu filamentöz funguslar ile Bacteria’nın aktinomiset grubu tarafından üretilmektedir. Endüstriyel fermentasyonla büyük ölçekte üretilen en önemli antibiyotikler Çizelge1’de gösterilmiştir. Çizelge 1. Ticari olarak üretilen bazı antibiyotikler. Antibiyotik Üreten mikroorganizma* Basitrasin Sefalosporin Kloramfenikol Siklohekzimid Sikloserin Eritromisin Griseofulvin Kanamisin Linkomisin Neomisin Nistatin Penisilin Polimikzin B Streptomisin Tetrasiklin Bacillus licheniformis (EOB) Cephalosporium sp.(F) Kimyasal sentez (daha önce Streptomyces venezuela’ (A)dan mikrobiyal yolla üretilmekteydi) Streptomyces griseus (A) Streptomyces orchidaeus (A) Streptomyces erythreus (A) Penicillium griseofulvin (F) Streptomyces kanamyceticus (A) Streptomyces lincolnensis (A) Streptomyces fradiae (A) Streptomyces noursei (A) Penicillium chrysogenum (F) Bacillus polymyxa (EOB) Streptomyces griseus (A) Streptomyces rimosus (A) *EOB, endospor oluşturan bakteri; F, fungus; A, aktinomiset Günümüzde 8000’in üzerinde antibiyotik maddesi bilinmektedir ve her yıl yüzlercesi keşfedilmektedir. Daha fazla antibiyotik keşfedilmesi beklenmektedir mi, buna gerek var mıdır diye bazı sorular akla geldiğinde bunun cevabı evettir. Bu nedenle Streptomyces, Bacillus, Penicillium gibi birkaç genusa ait mikroorganizmaların çoğu antibiyotik üretip üretmedikleri açısından sürekli olarak incelenmektedir. Antibiyotikler konusunda araştırma yapan birçok araştırıcı, diğer mikroorganizma gruplarının da incelenmesi sonucunda birçok yeni antibiyotiğin keşfedileceğine inandıklarını belirtmektedir. Son yıllarda büyük ilerleme gösteren genetik mühendisliği tekniklerinin yeni antibiyotiklerin yapılmasına izin vereceği ve yeni ilaçlar için kompüter modellemesinin klasik eleme (screening) metotlarının er geç yerini alacağı düşünülmektedir. Fakat günümüzde bunlar henüz çok yaygın bir kullanıma sahip olmadığı için yeni antibiyotikler klasik yol olan “screening” yoluyla keşfedilmektedir. Screening yaklaşımında, çok sayıda muhtemelen antibiyotik üreticisi olan mikroorganizma izolatı doğadan saf kültürler halinde izole edilmektedir (Şekil 1-a) daha sonra bu izolatlar Staphylococcus aureus gibi bir test bakterisinin büyümesini inhibe eden diffüzlenebilen maddeler üretip üretmedikleri açısından test edilmektedir. Şekil 1-a’daki fotoğrafta görülen kolonilerin çoğu Streptomyces türlerine aittir ve antibiyotik üreten bazı kolonilerin etrafında indikatör organizmanın (Staphylococcus aureus) büyüyemediği inhibisyon zonları görülmektedir. Bu amaçla kullanılan test bakterileri çok çeşitli ve genellikle bakteriyal patojenlere yakın veya onları temsil eden türler olup çeşitli literatürlerde tip kültür numaralarıyla belirtilmektedir. Antibiyotik üretimi için yeni mikrobiyal izolatların test edilmesinde, “karşıt-çizgi metodu” (Şekil 1-b) yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde Streptomyces gibi potansiyel üretici olduğu bilinen bir tür petrinin üçte birlik kısmını kaplayacak şekilde bir köşesine ekilir ve petri uygun sıcaklıkta inkübe edilir. İyi bir büyüme elde edildikten sonra sıvı besi yerinde geliştirilmiş olan test bakterileri Streptomyces hücre kütlesine dikey olacak şekilde çizilerek inkübasyona bırakılır. Şekil 1-b’deki fotoğrafta da görüldüğü gibi bazı test bakterilerinin Streptomyces hücre kütlesine yakın kısımlarda büyüyemediği görülmektedir. Bu Streptomyces’in test bakterilerinin büyümesini inhibe eden bir antibiyotik ürettiğini göstermektedir. Fotoğrafta (Şekil 1-b) görülen test organizmaları (soldan sağa): Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Mycobacterium smegmatis’tir. Bu şekilde ekim yapılan izolatlardan antibiyotik üretimi belirlenenler daha sonra daha ileri denemelere alınarak antibiyotiğin yeni olup olmadığı bakımından test edilirler. Çoğu screening (eleme) programlarında elde edilen izolatların çoğu bilinen antibiyotikleri üretmektedir. Bu nedenle endüstriyel mikrobiyologların bilinen antibiyotik üreticilerini çok hızlı belirlemesi gerekmektedir böylece çalışmalarında hem zamanın hem de kaynakların boşa gitmesi önlenecektir. Bir organizmanın yeni bir antibiyotik ürettiği keşfedildiğinde bu antibiyotik yapısal analizler için yeterli miktarlarda üretilmelidir ve daha sonra enfekte olmuş hayvanlarda terapötik aktivite ve toksisite için test edilmelidir. Burada yeni antibiyotiğin selektif toksisiteye sahip olup olmadığı ortaya çıkmaktadır. Maalesef yeni bulunan antibiyotiklerin bir çoğu hayvan testlerini geçemezken sadece birkaç tanesi geçebilmektedir. Bu nedenle her yıl yüzlerce yeni antibiyotik bulunmasına karşılık bunların sadece birkaç tanesinin medikal kullanım için yararlı olduğu kanıtlanabilmekte ve ticari olarak üretilmektedir. VİTAMİNLER VE İLİŞKİLİ BİYOFAKTÖRLER Dengesiz beslenme ve besin işleme alışkanlıkları, gıda kıtlığı, açlıktan dolayı hayvan ve bitki orijinli vitaminlerden başka ekstra vitaminlere ihtiyaç duyulmaktadır. Vitaminlerin kullanım alanları gıda/yem sektörü, sağlık ve tıbbi alanlardır. Ekstra vitaminler günümüzde kimyasal veya biyoteknolojik olarak fermentasyon ya da biyodönüşüm prosesleriyle hazırlanmaktadır. Vitaminler ve diğer biyofaktörlerin çoğu kimyasal olarak veya ekstraksiyon işlemi ile üretilirken bazıları da hem kimyasal hem de mikrobiyal proseslerle üretilmektedir. Bunun yanı sıra vitamin B12 ve B13 gibi vitaminler ise sadece mikrobiyolojik yolla üretilmektedir. Aşırı miktarlarda vitamin üreten mikrobiyal suşların doğadan taranması ve bulunması veya bunların genetik mühendisliği yoluyla yapımı zordur, bunun yerine geliştirilmiş fermentasyon prosesleri ve immobilize biyokatalist biyodönüşümleri önem kazanmıştır. ENZİMLER Bütün organizmalar hücresel faaliyetlerini sürdürebilmek için küçük miktarlarda çok çeşitli enzimleri üretmektedir. Günümüze kadar tanımlanmış olan 3000’den fazla enzimin büyük bir çoğunluğu mezofilik organizmalardan izole edilmektedir. Buna karşılık bazı enzimler bazı organizmalar tarafından çok yüksek miktarlarda üretilmekte ve hücre içinde tutulmayarak hücre dışına salgılanmaktadır. Ekstraselüler enzimler olarak isimlendirilen bu enzimler selüloz, protein, nişasta, vb. gibi suda çözünmeyen polimerleri parçalama yeteneğindedir. Bu ekstraselüler enzimlerin bazıları gıda, tekstil ve ilaç endüstrilerinde kullanılmaktadır ve mikrobiyal sentez yoluyla büyük miktarlarda üretilmektedir. Son yıllarda enzim terminolojisinde ortaya çıkan yeni bir terim olan “ekstremozimler” ise ekstrem çevrelerde yaşayan prokaryotlardan elde edilen enzimleri ifade etmektedir. Ekstremozimler, ekstrem olarak yüksek sıcaklık, düşük sıcaklık, çok yüksek tuz, çok yüksek asit veya alkalin pH’larda yaşayan ve “ekstremofiller” olarak isimlendirilen mikroorganizmalar tarafından üretilmektedir. Bu enzimleri yüksek miktarlarda üreten mikrobiyal kaynakları doğadan izole etmek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır ve yeni mikrobiyal kaynakların araştırılması sürekli olarak devam eden bir iştir. Burada biyoçeşitlilik önemli bir konu olup farklı ve yabancı çevrelerden (ekstrem çevreler) izole edilen mikroorganizmalar önemli enzim kaynakları olarak düşünülmektedir. Ülkemiz en önemli ekstrem çevreler olan sıcak su kaynakları (kaplıcalar) açısından çok zengindir. Ayrıca soda gölleri, tuz gölleri, vb. ekstrem çevrelere de sahip olduğumuz göz önüne alınırsa, buralardaki biyoçeşitliliğin bir an önce belirlenerek ortaya konması ülkemiz açısından çok önemli bir konudur. Lipazlar bakteri, maya ve küfleri içeren mikrobiyal flora tarafından bol miktarda üretilmektedir. Lipazlar gıda endüstrisinde, biyomedikal uygulamalarda, biyosensörler ve pestisidlerin yapımında, deterjan ve deri sanayiinde, çevre yönetiminde, kozmetik ve parfüm sanayiinde uygulama alanları bulmaktadır. Endüstriyel olarak en yaygın kullanılan lipaz üreticisi mikroorganizmalar Candida spp., Pseudomonas spp., Rhizopus spp.’dir. Son yıllarda biyoteknoloji alanında lipazların kullanımında eksponansiyel bir artış gözlenmektedir. Bu nedenle lipazların aşırı üretimini sağlamak amacıyla yönlü mutasyonlar yardımıyla suş geliştirme çalışmalarına ağırlık verilmiştir. Endüstriyel olarak en fazla üretilen enzimlerden biri olan proteazlar ise ekmekçilikte, deterjan ve temizleme sanayiinde, biyomedikal uygulamalarda, gıda sanayiinde etlerin olgunlaştırılmasında, tabaklama sanayiinde, atık arıtımı ve kimyasal endüstride kullanılmaktadır. Son yıllarda alkalofilik mikroorganizmaların ürettiği ve aşırı alkali ortamlarda aktivite gösteren alkalin proteazlar endüstriyel olarak çok önem kazanmıştır.Şu anda alkalin proteazların ticari üretimi Bacillus licheniformis ve diğer alkalofilik Bacillus spp.’den yapılmaktadır. Bu enzimlerin üretimi için öncelikle ümit verici organizmaların seçilmesine olanak sağlayan farklı izolasyon yöntemlerinin belirlenmesi daha sonra endüstriyel suş geliştirilmesi için mutasyon ve/veya rekombinant DNA teknolojisinin kullanımı üzerinde yoğun çalışmalar sürdürülmektedir. α-amilaz, β-amilaz ve glukoamilaz gibi mikrobiyal amilazlar, enzimler arasında en önemlileri olup günümüzde biyoteknolojide oldukça büyük önem kazanmışlardır. Mikrobiyal amilazlar uygun preparasyonlarda hazırlandıktan sonra ilaç sanayiinde analitik kimya alanında, nişastanın sakkarofikasyonu, tekstil ve gıda sanayiinde, bira sanayii ve damıtma endüstrilerinde geniş bir uygulama alanına sahiptir. Hayvanlar ve bitkilerde de bulunmasına karşılık amilazlar en yaygın olarak mikroorganizmalarda bulunmaktadır. Amilazların ticari üretiminde birçok bakteri ve fungus türleri kullanılmaktadır. α-amilazın ticari üretiminde Bacillus türleri çok önemlidir. Ticari amilaz üreticisi suşların geliştirilmesinde gen klonlama yöntemleri kullanılmaktadır. Gen klonlmanın en temel amaçları; termostabil enzimlerin ifade edilmesi, yüksek enzim verimliliği ve iki enzimin aynı organizmada ifade edilmesinin sağlanmasıdır. AMİNOASİTLER Organizmaların primer metabolitleri arasında en önemlileri amino asitlerdir. 1950’lerin sonlarına doğru Corynebacterium glutamicum’un bazı suşlarının doğal olarak önemli miktarlarda L- glutamat sentezlediğinin bulunmasının ardından amino asit üreticisi mikroorganizmaların taranması ve ıslah edilmesi çalışmaları büyük hız kazanmıştır. O zamandan beri amino asit salgılama yeteneğinde olan bir çok organizma belirlenmiş ve bu konu endüstriyel mikrobiyolojinin önemli bir konusu olmuştur. Dünya çapında 1.5x106 ton amino asit üretimi gerçekleşmektedir. Amino asitler tıpta, gıda endüstrisinde katkı maddesi olarak, kimya endüstrisinde başlatıcı maddeler olarak kullanılmaktadır. En önemli ticari amino asit lezzet arttırıcı olarak monosodyum glutamat (MSG) formunda kullanılan Glutamik asittir. Diğer iki önemli amino asit diyet içecekler ve yiyeceklerde tatlandırıcı olarak kullanılan Aspartam’ın bileşenleri olan Aspartik asit ve Fenil alanindir. Bundan başka lisin, glutamin , arjinin, triptofan, treonin, izolösin ve histidin amino asitleri de ticari olarak mikrobiyolojik yolla üretilmektedir.Mikrobiyolojik üretim için Corynebacterium ve Brevibacterium türleri ile Escherichia coli en bilinen ticari türlerdir. Corynebacterium ve Brevibacterium türlerinde metabolizma nispeten basit olduğu için regülasyon sistemlerinin kolaylıkla değiştirilmesiyle, Enterobacteriaceae üyelerinde ise karmaşık rekombinant DNA tekniklerinin kullanımıyla verimli amino asit üreticileri elde edilebilmektedir. Kaynak: Doç. Dr. Rengin ELTEM /Ege Üniversitesi /Mühendislik Fakültesi Biyomühendislik Bölümü POLİMER ÜRETİMİ Modern biyoteknolojiyi komodite amaçlı ürünlerin üretiminde de kullanmak mümkündür. En çarpıcı örneklerden biri, mikroorganizmaları uygun ortamlarda besleyip polimer ürettirmektir. Birçok mikroorganizma besin kısıtlaması koşullarında, tepkisel olarak hücre içinde polimer biriktirir. (Şekil 3’de hücre içindeki beyaz dairesel şekilli olanlar). Bunlar bilimsel adıyla “polialkalonatlar”, “mikrobiyal poliesterler” dir. Polibuturat ve poli(buturat-valarat) teknolojik olarak üretilen mikrobiyal poliesterlerdir. Bunların işlenmesi biraz zor, komodite plastiklere göre biraz pahalı, ancak doğada parçalanabilen türden, dolayısıyla çevre dostu polimerlerdir. Bunlardan üretilen şampuan, parfüm, vb. şişeleri piyasaya sunulmuş durumdadır. Buradaki ilginç gelişme yine genetik modifiye mikroorganizmaların kullanımıdır. Bunlarda hücre içinde polimer birikimi kuru ağırlıkta %99’lara kadar çıkarılmıştır, dolayısıyla verim çok yüksektir. Bu yöntemle üretilen polimerlerin molekül ağırlıkları sentetik yollarla çıkılması çok yüksek değerlerdedir (20 milyon hatta daha fazla). Mikroorganizmalar ile polimer üretimi teknolojisini bitkilere de uygulamak mümkündür. Özellikle mısır’ın çok da değerli olmayan koçanında ve kabuğunda polimerler biriktirilebilir. Faj Yerdeğiştirme “phage display” Teknolojisi Alternatif yöntemlerden biri de genetik modifiye mikroorganizmaları kullanmaktır. Yaygın olarak E.Coli’nin kullanıldığı “faj yerdeğiştirme” (“phage display”) tekniği böyle bir yaklaşımdır. Burada, istenilen üretim bilgisini taşıyan DNA, B lenfositlerinden izole edilir ve bakteriye yerleştirilir. Daha sonra bakteri, filament fajlar (bir çeşit virüs) ile enfekte edilir. Fajlar, bakteri içinde, genellikle çok sayıda antibadi fragmanını da taşıyacak şekilde çoğalır. İstenilen fragmanı taşıyan fajlar, bir biyoafinite sistemi ile ayrılır ve bunlarla yine bakteriyi enfekte edilerek üretimi gerçekleştirilir. Elde edilen monoklonal antibadi fragmanları saflaştırılıp ya doğrudan yada bir antibadi gövdesine takılarak kullanılabilir. Bu teknikte kullanılan reaktörler, hibridoma teknolojisinde kullanılanlardan çok daha düşük fiyatlı ve iyi tanımlanmış klasik fermentörlerdir, dolayısıyla üretim ucuz ve kolaydır. Kaynak: www.biyomedtek.com/bmt-konular-no3.htm Hazırlayanlar: Enver Ersoy ANDEDEN&Ahmet TEZER

http://www.biyologlar.com/mikrobiyal-biyoteknoloji-bolum-4

Potasyum Siyanid Testi

Bu test, mikroorganizmaların potasyum siyanid (KNC) içeren besi yerlerinde canlı kalma ve üreyebilme durumlarını belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda testten, mikroorganizma cins (Citrobacter freundii (+), Salmonella (-), Arizona (-) Klebsiella (-), Enterobacter (+) ve E. coli (-) ve türleri (P. aeruginosa (+) ve Alcaligenes faecalis (-) ayırmada da işe yarar. Siyanid (CN) , bir sitokromoksidase inhibitörüdür. Demir içeren enzimler siyanid tarafından bloke edilirler. Siyanid demirle birleşerek enzimi inaktive eder. Sitokrom oksidase de ağır metalli bir pigment olup (ferro sitokrom oksidase) siyanidle birleşerek elektron transport mekanizmasını sekteye uğratır ve respirasyon durur. Oluşan inhibisyonun derecesi siyanid’in miktarı ile ilgilidir. Bazı mikroplar, ortamda 0.001 M siyanid bulununca üremezler.Materyal 1) İçinde potasyum siyanid (1/13000 KCN) bulunan sıvı ortam ( pH 7.6 ve 1 ml).2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri 3) Kontrol pozitif (P. aeruginosa veya K. aerogenes) ve negatif (E. coli) suşlarının kültürleri4) Ekilmemiş tüpler MetotKültürlerden siyanidli brotha ekim yapılır ve 37 °C de 1-3 inkube edilir.Değerlendirme Pozitif olgularda tüpte üreme yoktur. Negatif durumlarda üreme meydana gelir. Sonuçlar kontrollerle karşılaştırılarak değerlendirilir.Dikkat edilecek noktalar1) KCN çok zehirli olduğu için, bu teste çok gerekli olduğu zaman başvurulmalıdır. KCN solusyonu, pipetle ağız yardımıyla çekilmemelidir. KNC dumanları da teneffüs edilmemelidir. Şırıngadan yararlanılır.2) Bazal ortamdaki pepton yoğunluğu %0.3 kadar olmalıdır. Yüksek konsantrasyon (%1) şüpheli sonuç verebilir (Salmonella 'larda).3) KCN 'li besi yeri buzdolabı sıcaklığında 3-4 hafta muhafaza edilebilir.4) Kültürlerden yapılan inokulasyonlar, bir bulanıklık oluşturmayacak durumda olmalıdır.5) Siyanidli besi yerleri, içerlerine ferro sulfate ve alkali ilave edildikten sonra otoklava konmalıdırlar.

http://www.biyologlar.com/potasyum-siyanid-testi-1

NASTİLER

Nastik hareketler, bitki organlarının uyartı yönüne bağlı olmaksızın uyartıya karşı daima aynı yönde yaptıkları hareketlere denir. Nastik hareketler genellikle turgor asimetrisine dayanır. Bazıları da büyüme asimetrisinden kaynaklanır. Büyüme asimetrisine dayanan nastik hareketlere en tipik örnek "epinasti" ve "termonasti" hareketleridir. Turgor asimetrisinden kaynaklananlara ise "niktinasti" ve "tigmonasti" örnek verilebilir. Turgor asimetrisiyle meydana gelen hareketler büyüme asimetrisiyle oluşanlara göre daha hızlıdır. Ayrıca turgor asimetrisine dayanan hareketlerde "turgorinler" adı verilen ve hormon oldukları tahmin edilen kimyasal maddelerin rol oynadıkları ileri sürülmektedir. BÜYÜME ASİMETRİSİNE DAYANAN NASTİLER Epinasti Yaprak sapı petiolün aşağıya doğru kıvrılmasına epinasti denir. Bunun sebebi önceleri yerçekimine bağlanıyordu. Fakat sonradan yapılan klinostat deneyleri epinastinin geotropistik bir hareket olmadığını göstermiştir. Çünkü klinostata konulan bitki de ve konulmayan da epinastik cevap göstermektedir. Epinastide rol oynayan hormonun oksin olduğu anlaşılmıştır. Oksin fazlalığında etilen oluşumuyla izah edilen olayda petiolün dorsaline göre ventralinde daha çok oksin ve bundan kaynaklanan etilen oluşur. Bu durumda alt kısım büyüme inhibisyonuna uğrayarak üst kışını lehine bir büyüme asimetrisi oluşur ve yaprak sapı aşağıya bükülür.Dolayısıyla oksin fazlalığına veya etilen artışına sebep olan her türlü dış ve iç uyartı epinastik hareketin uyaranıdır. Bazen epinastinin tersine yaprak sapının yukarı kıvrılarak yaprağı yukarı kaldırdığı da görülür. Buna da hiponasti denir. Hiponastide giberellin hormonlarının rol oynadığı tahmin edilmektedir. Termonasti Lâle (Tulipa) bitkisinde tipik olarak görüldüğü gibi diğer bazı Liliaceae familyası bitkilerinde de görülen çiçeklerin sıcaklığa bağlı olarak açılıp kapanması büyüme asimetrisine dayanan termonastik bir harekettir. Gece-gündüz sıcaklık farkından dolayı bu çiçekler gündüz açık gece kapalıdır. Özellikle lâle bitkisinde yoğun olarak araştırılan bu hareket, tepallerin dış ve iç yüzey dokularının sıcaklıktan farklı etkilenmesi sonucu meydana gelir. 10°C'nin altındaki sıcaklıklar tepallerin dış yüzey hücrelerinin büyümesine ve çiçeğin kapanmasına sebep olur. 17°C ve yukarısındaki sıcaklıklar ise tepallerin iç yüzey hücrelerinin büyümesine ve çiçeğin açılmasına sebep olur. Diğer bir ilginç sıcaklık mdikatörü, orman gülü (Rhododendrori) bitkisinin yapraklarıdır. Bitkinin daimi yeşil olan yapraklan, kışın sıcaklık -15°C civarına düştüğünde aşağıya doğru gövdeye kapanırken, sıcaklık 0°C üzerinde olduğunda yukarı doğrularak horizontal pozisyona geçer. TURGOR ASİMETRİSİNE DAYANAN NASTİLER Niktinasti (Uyku Hareketi) Bazı Leguminaceae familyası bitkilerinde görülen bu harekette yapraklar ritmik olarak gündüz horizontal pozisyonda açık iken geceleyin dikey pozisyonda kapalı bir pozisyon gösterir. Bu yüzden insanların gece uyuması gündüz uyanmasına benzetilerek uyku hareketleri adı da verilmiştir. Bu tanımdan da anlaşıldığı gibi bu harekette uyarıcı faktör ışıktır. Yaprağın hareketini sağlayan yapı yaprak veya yaprakçıkların sap veya gövdeye birleştikleri yerde bulunan pulvinus'tur. Yaprak hareketleri, pulvinusun motor hücreleri adı verilen subepidermal korteks hücrelerindeki turgor değişimine bağlıdır. Dorsal motor hücrelerindeki suyun ventral motor hücrelerine geçmesi sonucu dorsaldeki hücreler turgorunu kaybederken ventraldekiler turgor durumuna geçer ve bu durumda yaprak açılır. Tersi durumda ise dorsaldeki hücrelerin turgor haline geçmesiyle yaprak kapanır. Yaprağın kapanma yaptığı tarafı ventral, aksi tarafı ise dorsaldir. Uyku hareketleri en tipik olarak akasya ağacı ve ipek ağacı (Albizzia julibrissin) yapraklarında görüldüğünden bu bitkiler üzerinde daha çok çalışılmıştır. Bu bitkilerin yapraklan bileşik yaprak tipinde olup her bir yaprak üzerinde çok sayıda karşılıklı yaprakçıklar yer alır. Lâle çiçeğinin açılıp kapanmasında değişen sıcaklığın etkisi. Solda kapalı çiçek ve dış yüzey dokusunu gösteren ok, sağda ise açık çiçek ve iç yüzey dokusunu gösteren ok yer almaktadır Albizzia julibrissin yapraklarının solda gündüz sağda ise geceleyinki durumları. Alttaki şekiller her iki durumda yaprakçıklann anatomisinden birer kesit göstermektedir (Salisbury ve Ross, 1985). Niktinastik harekette uyartının alınmasında fitokrom pigmentinin rol oynadığı tahmin edilmektedir. Yaprakların açılmasında ışığın mavi ve kırmızı ötesi dalga boylarının etkili oldukları deneylerle gösterilmiştir. Fitokrom ışığı aldıktan sonra pulvinuslardaki motor hücrelerinin zar geçirgenliğini etkileyebilir. Zardaki aktif transporttan sorumlu ATPaz gibi enzimleri kontrol etmek suretiyle bu iş başarılmış olabilir. Böylece hücreler arasında K+ iyonlarının geçişi ve dağılımı sağlanır. Gerçekten yapılan deneylerde motor hücrelerinin turgor veya plazmoliz durumuna geçmelerinde K+ iyonlarının rol oynadığı belirtilmiştir. Hücrelere K+ girişi turgora, K+ çıkışı ise plazmolize sebep olmaktadır. Bu hareketin ilginç bir yönü de bir günlük sürelerle ritmik olarak meydana gelmesidir. Coleus bitkisinde yapılan araştırmalarda bitkinin devamlı karanlık veya devamlı ışık gibi şartlara konulması durumunda dahi 24 saatlik sürelerde yaprakların açılıp kapanma ritmi gösterdikleri belirlenmiştir. Bu da olayda ışığın rolü olmakla birlikte esas olarak iç ritm adı da verilen biyolojik saatin rol oynadığını gösterir. Tigmonasti Tigmonastik hareketler dokunma ve benzeri uyartılara karşı bazı bitkilerin gösterdikleri nastik cevaptır. Mekanik bir uyartıyla meydana gelen asimetrik turgor değişimi sonucu hareket ortaya çıkar. Bu olay en tipik olarak Mimosa pudica küstüm otu bitkisinde görüldüğünden bu bitki üzerinde çalışmalar yoğunlaşmıştır. Bir uyartı verildiğinde bu bitkinin bileşik yapraklarının önce yaprakçıklan sonra da yaprakların kendisi hızla kapanır. Bu hareket birkaç saniyede tamamlanan en hızlı bitki hareketidir. Mimosa'daki bu hareket sadece dokunmaya değil sarsıntıya karşı da meydana geldiği için bu harekete aynı zamanda "sismonasti" adı da verilmiştir. Tek bir yaprak uyarıldığında dahi bu uyartı bitkinin her tarafına yayılıp diğer yaprakların da kapanmasına sebep olur. Tigmonasti hareketinin mekanizması da niktinastide olduğu gibidir. Pulvinustaki ventral motor hücrelerinin K+ iyonu ve buna bağlı su büzülmesi ile yaprak kapanır. 15-20 dakika sonra K+ iyonları ventral motor hücrelerine tekrar geri dönerek hücrelerin su almasına ve şişmesine sebep olur. Böylece yaprak açılır. Mimosa'daki hareketin dokunma ve sarsıntı dışında ısınma, elektrik ve kimyasal uyartılara karşı da meydana geldiği belirlenmiştir. Uyartının sadece yapraklarda değil bütün bir bitkinin her tarafında 50cm/sn hızla taşındığı anlaşılmıştır. Bitkide uyartının bu kadar hızlı nasıl taşındığı hale bir sırdır. Bazı fizyologlara göre hayvanlarınkine benzer bir sinir sisteminin varlığından söz edilir. Bazı araştırıcılara göre hormon taşınımıyla iletilmektedir. Ancak hormon taşınımı bu kadar hızlı değildir. Tigmonastik hareketin bitkiye faydası muhtemelen sinek ve böcekleri ürkütüp kaçırmak içindir. Tigmonastik hareketin başka bir çeşidini böcek kapan bitkilerde görmekteyiz. Bu bitkilerin yapraklan, sinek ve böcekleri yakalamak üzere tuzak adı verilen özel yapılarla donatılmıştır. Genellikle böcek, yaprak ayasına konduktan sonra yaprak sineğin üzerine kapanarak onu hapseder ve salgıladığı enzimlerle onu sindirir. Hususan Dionaea bitkisinin yaprak ayası kurt kapanı şeklinde iki parçalı olup yaprak kenarlarının çıkıntıları birbiri arasına geçen özelliktedir. Böcek yaprağa konduğunda dokunma uyartısı aya üzerindeki küçük tüyler vasıtasıyla alınmakta ve ayanın iki parçası karşılıklı kenetlenmektedir. Dionaea muscipula bitkisinin böcek kapan yapraklan. Sol öndeki yaprağa böcek konmuş, sağ önde kapanmış yaprak. Drosera genusuna giren böcekçil bitkilerde yapraklar yapışkan uçlu tentaküllerle donatılmıştır. Tentaküllerin hareketi böceklerin tentakiillere dokunnıasıyla uyarılır ve böcek buraya yapışarak yaprağın merkezine alınır ve burada sindirilir. Droseradaki hareket daha yavaştır. Ancak böcek yapıştığı için kaçamıyacaktır. Hidronasti Bir çok otsu bitkide yapraklar kuraklık stresine maruz kaldığında rulo şeklinde yaprağın uzun ekseni boyunca katlanır. Bu sırada stomalar da kapanır. Hareketin mekanizması, Şekil'de görüldüğü gibi yaprağın ana damarının iki tarafında dizilmiş bulliform adı verilen motor hücreleriyle ilgilidir. Kuraklık durumunda bu hücreler komşu hücrelere su vererek büzülürler ve yaprak kapanır. Normal şartlarda turgor durumuna geçerler ve yaprak açılır. Bu hareketin uyaranı kuraklıktır amacı ise yaprak yüzeyini küçülterek su kaybını azaltmaktır. DİĞER HAREKETLER Buraya kadar gördüğümüz tropistik ve nastik hareketler bir düzlemde meydana gelen hareketlerdir. Oysa nadir de olsa iki düzlemde oluşan ve burulma şeklinde ortaya çıkan "torsiyon hareketleri" de vardır. Bu tür hareketlerin mekanizması dokunmaya bağlı tigmotropistik özellikte ise de esasen çok daha karmaşıktır. Bu sayede bitkiler iki hatta üç düzlemde devam eden burulma ve sarılma hareketleri yaparlar. Fasulye gibi sarılıcı bitkilerde görülen bu hareket, organların tek tarafında değil, ön, arka, sağ yan, sol yan gibi farklı kısımlarında beliren büyüme farklılığı sonucu meydana gelir. Bu harekette farklı kısımlardaki büyüme farkının büyüme hormonlarının farklı konsantrasyonundan kaynaklandığı tahmin edilmektedir. Bazı bitkilerde özel görevlerin yerine getirilmesi amacıyla patlama ve fırlatma şeklinde beliren ve o organda ancak bir defa meydana gelen hareketler görülür. Ecbalium ve Impatiens balsamına bitkilerinde tohumların fırlatılmasını sağlayan patlama hareketleri turgor değişimiyle meydana gelir. Anterlerin patlamasında, eğreltilerde sporangiumların açılmasında iş gören mekanizmanın bu organlardaki su kohezyon kuvvetlerindeki değişmeyle ilgili olduğu ileri sürülmüştür. Ayrıca bitkilerin cansız dokularında şişme asimetrilerinden meydana gelen hidratasyon hareketleri de vardır. Ancak bu hareketler canlılıkla ve büyümeyle ilgili olmayıp, sadece belli organlardaki cansız yapılarda farklı su alışverişiyle ortaya çıkan şişme derecelerinden kaynaklanan fiziki olaylardır. Çeşitli kuru meyve kısımlarında görülen kıvrılma, eğilme, spiralleşme gibi değişmeler halinde ortaya çıkan bu hareketler meyvalann açılmasında ve tohumların yayılmasında görev yapar.

http://www.biyologlar.com/nastiler

IŞIK SOLUNUMU (FOTORESPİRASYON)

Kloroplastlarda CO2 RuBP karboksilaz enzimi katalizörlüğünde RuBP tarafından yakalanarak PGA oluşturulup C3 yoluna katılır. Ancak O2 yokluğunun çok fazla olması durumunda aynı enzim RuBP ile O2’in birleşmesini sağlar. Bu durumda enzime RuBP oksijenaz denir. Esasen RuBP oksijenaz ve karboksilaz aynı enzim olup Rubisko olarak adlandırılır. Böylece 1 molekül fosfoglikolik asit (P-glikolat) ile 1 molekül PGA meydana gelir. Glikolik asit, peroksizomlarda taşınır. Burada glikolik asit ile O2, glikolat oksidaz enzimi katalizörlüğünde birleştirilerek glioksilik asit oluşturulur. Dolayısıyla fotorespirasyona glikolik asit yolu da denir. Bu esnada oluşan hidrojenperoksit (H2O2) zehirli bir madde olduğundan peroksizomlarda katalaz enzimiyle suya parçalanır. Daha sonra da glioksilattan glisin ve serin gibi amino asitler sentezlenir ve CO2’in bir kısmı serbest bırakılır. Bu olay ışıkta meydana geldiği ve olayda O2 kullanıldığı için ışık solunumu denilmiştir. Burda amaç ATP sentezlemek olmadığından, bu gerçek bir solunum değildir. Işıklandırılmış bir yaprakta fotosentezin aleyhine çalışan bir olaydır. Bu olayın fotosentezin verimini yarı yarıya azalttığı tesbit edilmiştir. Ancak bu sırada bazı aminoasitlerin sentezlenmeside bir avantajdır. Bütün bitkiler ışık solunumu yapmazlar. C3 bitkilerinin tümü ışık solunumu yaparken C4 bitkileri ya hiç yapmazlar veya çok az yaparlar. Çünkü C4 bitkilerinde glikolat oksidaz enzimi ya hiç yok veya çok azdır. Bu da C4 bitkilerinde fotosentez veriminin yüksek olmasının bir diğer sebebidir. Işık solunumu sırasıyla kloroplast, peroksizom ve mitokondride gerçekleşir. Serin amino asitten gliserat ve PGA oluşarak C3 yoluna entegrasyon oluyorsa fotosentezin aleyhine bir durum meydana gelmez. Ancak bitkinin amino asitlere ihtiyacı varsa amino asitler sentezlenecektir ve C3 yolu ile entegrasyon geçişi olarak kalkacaktır. KEMOSENTEZ Ototrof yaşayan sadece yeşil bitkiler değiller bazı bakterilerde ototrofturlar. Ancak bu bakteriler ışığı kullanarak değil kimyasal maddeleri okside ederek açığa çıkardıkları enerji kullanılarak CO2’di karbonhidratlara indirgerler. Bu olaya kemosentez adı verilir. Kemosentez bakterileri bu yaşam biçimleriyle doğada madde döngüsüne katkı sağlarlar. Bir çok toksik maddeyi etkisiz hale getirirler ve erimeyen bazı maddeleri eriterek kullanılır hale koyarlar. Başlıca kemosentez tipleri: Azot oksidasyonu : Toprakta bitki ve hayvan kalıntılarından oluşan NH (amonyak) Nitrosomans cinsi bakteriler tarafından nitrite (NO) çevrilir. Bu reaksiyonda açığa çıkan enerji nitrosomanslarca kemosentezde kullanılır. Ortaya çıkan HNO’lerde diğer bir bakteri grubu olan Nitrobakteriler tarafından nitrata dönüştürülürler ve bitkilere azot sağlamış olurlar. Kükürt oksidasyonu : Beggiatoa, Thiospirillum gibi kükürt bakterileri HS ve S okside ederek enerji sağlarlar ve kemosentez yaparlar. Demir oksidasyonu: Leptotrhrix, spirophyllum gibi bakterileri iki değerli demiri (Fe)üç değerli demire (Fe) demire okside ederek kemosentez yaparlar(PAS). Kemosentezde KH sentezinin nasıl seyrettiği pek bilinmemektedir. SOLUNUM Tüm canlı hücrelerin yapmak zorunda olduğu bir yıkım olayıdır. Amaç hücrenin kendine yetecek enerjiyi temin etme isteğidir. Bu enerji bilindiği gibi sentez ürünlerinde ki kimyasal bağlarda saklıdır. Karbonhidratlar, yağlar ve proteinler başlangıçta güneşten aldıkları enerjiyi solunum reaksiyonlarıyla ATP olarak dışarı vererek canlıların metabolik, büyüme, gelişme, vücut ısısı ayarlama ve eylemlerini gerçekleştirme gibi aktivitelerde kullanmalarında olanak sağlar . Temel organik maddelerin solunum reaksiyonları yolunda parçalanıp kimyasal bağ enerjilerini ATP’ ye dönüştürmeleri için öncelikle yapı taşlarına ayrışmaları gerekmektedir. Örneğin; Nişatanın → glikoza yağ moleküllerinin → yağ asitleri ve gliserol’a proteinlerin → amino asitler’e hidroliz olmaları ve hücrelere kadar taşınmaları şarttır. Solunum sistemli bir yanma olayıdır. Organik moleküller, başta şeker olmak üzere hücrelerde kademe kademe yıkılarak, karbon iskeletlerindeki bağlardan çıkan enerji mitokondri kristalarında yerleşmiş ETS (Elektron Taşıma Sistemi) vasıtasıyla ATP’ye dönüştürülür. Buna oksidatif fosforilasyon yada biyolojik yanma denir. Petrol, odun, kömür gibi fosil yolla organik yakacakların yanması durumunda ise C iskeletlerdeki bağlardan hızla salınan enerjide ısı, ışık olarak etrafa yayılır. Bu bir kimyasal yanmadır. Solunumdaki yanmadan farklıdır. Solunumda esas amaç enerji temini yani ATP üretimi olsada, bu sırada metabolizma için gerekli bir çok yan üründe meydana gelmektedir. Örneğin; çeşitli organik asitler, amino asitler, nükleotidler, pigmentler v.s. oluşmaktadır. Solunum için kullanılan öncelikli molekül glukoz’dur. Glukoz un bulunduğu hücrede daima yıkıma uğrayan bu 6 C’lu molekül olmaktadır. Solunum sitoplazmada başlayıp mitokondride devam eden bir çok biyokimyasal olayın ard arda seyrettiği bir döngüdür. Bütün yüksek bitkiler ve organizmalar solunum (aerobik solunum) yaparlar ama bazı mikroorganizmalar oksijen kullanmadan Enzimleri sayesinde oksijensiz olarak solunum(anaerobik solunum) yaparlar, buna fermentasyon denir. Oksijenli solunum glukoz kullanıldığında başlıca üç aşamada gerçekleşir. 1 - Glikoliz Safhası (sitoplazmada gerçekleşir) 2 - Krebs Döngüsü (mitokondri matriksinde gerçekleşir) 3 - Elektron Taşınım Sistemi (mitokondri kristalarında gerçekleşir) GLİKOLİZ Hücre sitoplazmasında glukozun oksijene gereksinim duyulmadan iki pirüvik asite (pirüvat) kadar parçalanması olayıdır. Bu reaksiyon zincirinde öncelikle 2 ATP kullanılır Bu reaksiyon zincirinde öncelikle 2 ATP kullanılır. Bu ATP’ler ve enzimler sayesinde öncelikle iki 3C’lu aldehite dönüşen glikoz molekülü bir inorganik fosfat (Pi) girişi, 2 H+ ve 4 ATP çıkışı sağlayan bir dizi reaksiyondan sonra 2PA’ te dönüşür ve bu pirüvik asitler normal yolda mitokondrilere taşınırlar. Olağan dışı durumlarda ise Laktik Asit (LE)’e dönüşmek suretiyle 4ATP çıkışının devam etmesini sağlar (anaerobik solunum). KREBS ÇEMBERİ Mitokondri matriksinde PA (3C) ’ tin Asetil CoA (2C)’ya dönüşmesiyle başlayan bu reaksiyonlar döngüsünde 3C’lu molekülün tüm karbonları CO2’te dönüşür. Sonuçta 4 NADH2, bir FADH2 ve substrat reaksiyonu ile bir ATP ortaya çıkmaktadır. 1 glukoz molekülü için bu çıktılar ikiye katlanacaktır. Bu çemberde meydana gelen organik asitler üç karboksil grubu ihtiva ettiği için bu çembere Trikarboksilik Asit Çemberi (TCA)’de denir ELEKTRON TAŞINIM SİSTEMİ Bu sistem mitokondri kristalarında bulunur. ETS’de elektron ve hidrojen taşıyan özel maddeler vardır. Elektron taşınırken ATP sentaz (moleküler değirmen) enziminin aktivasyonuyla ATP sentezi olur. Buna oksidatif fosforilasyon adı verilir. Taşınan elektronlar en son akseptorden (sitokrom a3) ayrılınca matriksteki 2H+ ve O2 ile birleşerek H2O teşkil eder. Buna da terminal oksidasyon denir. Mitokondride cereyan eden bütün bu olaylar (TCA, oksidatif fosforilasyon ve terminal oksidasyon) için O2 gereklidir. O2 yokluğunda meydana gelmezler. ETS’de ATP sentezi, kemiozmotik teoriye göre , oksidatif fosforilasyon ile şöyle olmaktadır; ETS’de yeralan bazı akseptörler H+ ve elektron alarak indirgenir. Bunlar, flavinmononükleotid (FMN) ve ubikinon (UQ) dur. Bunlar hidrojenleri zarlar arası boşluğa pompalarken elektronları elektron akseptörlerine (sitokromlar ve Fe-S proteinleri) verirler. Elektronlar bu şekilde H2O’a kadar taşınırlar. Matriksdeki TCA’dan veya sitoplazmadaki glikolizden gelen hidrojenler bu şekilde zarlar arası boşluğa bırakıldıkça burası asitleşir ve zar potansiyeli oluşur. Bu durumda ATP sentaz enzimi aktive olarak hidrojenleri matrikse geçirir. Bu sırada enzimin katalizörlüğünde ATP sentezi olur. Hidrojen ve elektronlar krista zarındaki ETS’ye NADH2 veya FADH2 halinde getirilerek ETS’ye katılırlar. TCA’nın NADH2’leri ETS’nin başından itibaren zincire katıldığından ve üç yerde hidrojen pompalanması olduğundan NADH2 başına 3 ATP sentezlenir. Oysa TCA’nın FADH2’leri ve glikoliz NADH2’leri ETS’ye UQ’dan itibaren katıldıklarından iki yerde hidrojen pompalanması olur ve 2 ATP sentezlenir. Glikolizden gelen NADH2’ler başına 2ATP sentezlendiğinin sebebi şudur; sitoplazmadan mitokondriye geçişte mitokondri zarında bulunan ve gliserol fosfat mekiği denilen özel bir transport sistemiyle NADH2’lerin H+’leri mitokondri içine geçirilir ve bir flavoprotein (FAD) üzerinden UQ’a aktarılır. Yani sitoplazmadan gelen H+’ler ETS’ye ortadan katıldığı için iki yerde H+ pompalanmasına ve dolayısıyla 2ATP sentezine sebep olur. SOLUNUMDA ENERJİ BİLANÇOSU Glikoliz ve TCA’dan ayrılan Hidrojenleri NAD veya FAD yakalar ve NADH2 veya FADH2 halinde ETS’ ye getirirler. Yapılarındaki hidrojen ve elektronları ETS’ye verip tekrar iş başına dönerler. Şekil’de NADH2 ve FADH2’lerin hangi reaksiyonlardan kaynaklandığı ve her birisi için kaç ATP sentezlendiği belirtildi. Bunları toplarsak 16 ATP eder. Fakat bu reaksiyonlar iki defa meydana geldiğinden 16 x 2 = 32 ATP yapar. Şu halde oksidatif fosforilasyon yoluyla solunumda 32 ATP sentezlenir. Bir de 2 tane glikolizden 2 tane de TCA’dan fosforilatif yolla direkt ATP sentezi vardı. Bunları da eklersek 36 ATP eder. Yani glikoz molekülünün solunuma girip okside olmasıyla 36 ATP sentezlenir. Yapılan hesaplamalarda bir glikozun yıkımıyla esasında 686 Kkal’lik bir enerji çıkmaktadır. Oysa bir ATP’nin hidroliziyle 7,4 Kkal’lik bir enerji açığa çıkar ve 36 x 7,4 = 266,4 Kkal’lik bir enerji solunumda ATP halinde tutulmuş olur. Geriye kalan 420 Kkal2lil enerji ısı olarak yayılır. Yani glikozdan açığa çıkarılan enerjinin % 40 kadarı ATP halinde tutulabilmektedir. SOLUNUM SIRASINDA MEYDANA GELEN YAN ÜRÜNLER Solunumun esas amacı ATP sentezi yapmaktır. Fakat bu esnada değişik basmaklardan kaynaklanan çeşitli organik maddelerin sentezi de yapılır. Bu yüzden solunum bir taraftan yıkılma ve parçalanma iken diğer taraftan organiklerin sentezine sebep olan bir merkezdir. SOLUNUM KATSAYISI Solunumun ölçülmesi, bitkilerin solunumla tükettiği O2’nin ve dışarı verdiği CO2’nin ölçülmesine dayanır. Bu bakımdan solunumda oluşan CO2’in tüketilen O2’e oranı solunum katsayısı olarak adlandırılır ve RQ sembölü ile gösterilir. Solunumda KH’ların kullanılması durumunda bu katsayı 1’dir. Yani KH’ların solunumunda verilen CO2 alınan O2’e eşittir. Mesela; Solunumda yağlar gibi oksijence fakir organik maddeler okside edildiğinde oksidasyon için daha çok O2’e ihtiyaç olduğudan CO2 / O2 oranı düşük olacağından solunum katsayısıda 1’den azdır. Mesela; Yapısında bol oksijen ihtiva eden organik maddelerin oksidasyonu için az oksijen gerekli olduğundan bunların solunum katsayıları 1’den büyüktür. Mesala organik asitler bu şekilde oksijence zengindir. Oksijence fakir olan proteinlerinde solunum katsayıları 1’den azdır. Görüldüğü gibi, solunum yapan bir bitki dokusunda solunum katsayısını ölçerek o dokunun solunumda kullandığı organik madde grubunun ne olduğu hakkında genel bir bilgi sahibi olabiliriz. Normal koşullarda bitkiler ve hayvanlar solunumda öncelikle KH’ları kullanırlar. Ancak depo maddeleri tükenince diğer indirgenmiş maddeleri (yağlar, proteinler gibi) solunum substratı olarak kullanmaya başlarlar. Yağların ve proteinlerin solunuma katkısı KH’ın katkısından farklıdır. Bu maddelerin yıkımında glikoliz safhası yoktur. FERMANTASYON Oksijen olmaksızın besinler nasıl okside edilir? Oksidasyon, elektronların sadece oksijene değil, elektronların herhangi bir elektron alıcısına verilmesidir. Glikoliz, gulukozu iki molekül pirüvata oksitler. Glikolizin oksitleyici ajanı oksijen değil, NAD+’dır. Özet olarak, glikoliz ekzergonik olup, açığa çıkan enerjinin bir kısmı substrat – seviyesinde fosforilasyon ile net olarak 2 ATP üretmek için kullanılır. Eğer oksijen varsa, gulukozdan uzaklaştırılan elektronları taşıyan NADH bu elektronları elektron taşıma zincirine verdiğinde, oksidatif fosforilasyon ile ek ATPler üretilir. Ancak oksijen olsa da olmasa da, yani koşullar aerobik de anaerobik de olsa glikoliz 2 ATP üretir. (aer hava ve bios canlılık demektir; “an” olumsuzluk belirtir) Organik besinlerin anaerobik yıkımı, fermantasyon ile gerçekleşir. Fermantasyon glikolizin uzantısı olup, glikolizin oksidasyon basamağında ortaya çıkan elektronları kabul edecek yeterli NAD+ sağlandığı sürece, substrat seviyesinde ATP üretebilir. NADH dan NAD+ oluşturacak bir mekanizma olmaksızın, hücrenin NAD+ havuzu glikoliz sırasında tükenir ve oksitleyici bir ajan olmadığı için glikoliz durur. Aerobik koşullarda elektronların elektron taşıma zincirine aktarılmasıyla, NADH dan NAD+ oluşturulması sürer. Bu işlemin anaerobik alternatifi, NADH dan glikolizin son ürünü olan pirüvata elektron aktarımıdır. Fermantasyon, glikoliz ile elektronların NADH’dan pirüvata ya da pirüvat türevlerine aktarılmasıyla yeniden NAD+ üreten tepkimeleri kapsar. Bu NAD+ glikoliz ile şekerin okside edilmesi için tekrar kullanılır ve substrat seviyesinde fosforilasyon aracılığı ile net olarak 2 ATP üretilir. Pirüvattan oluşturulan son ürünlere göre bir çok fermantasyon tipi vardır. Alkolik Fermantasyonda pirüvat 2 basamakta etanole dönüştürülür. İlk basamakta pirüvattan CO2 uzaklaştırılır ve 2 karbonlu bir bileşik olan asetaldehit oluşur. İkinci basmakta ise, asetaldehit NADH ile etanole redüklenir. Böylece glikoliz için gerekli olan NAD+ yenilenmiş olur. Laktik Asit Fermantasyonu sırasında pirüvat NADH tarafından doğrudan doğruya redüklenir. Bu sırada CO2 salınmaz. Genelde mikroorganizmalar fermantasyon yapar. Ancak oksijen yetersizliğinde, su stresinde (fizyolojik kuraklık) yüksek bitkilerde biraz yapar. Fazlası bitkiler için toksiktir. Bazı tohumlarda tohum çimlenmesinin ilk basamaklarında da olabilir. Fermantasyon yapan bakterilerin bazısı oksijensiz ortamda yaşar (obligat anaeroblar). Mesela, Basillus botilinus. Bazı mikroorganizmalar ise hem oksijenli hem de oksijensiz ortamda yaşayabilirler (fakültatif anaeroblar). Mesela, Saccharomyces cerevisia mantarı. PENTOZ FOSFAT YOLU Yaşlı ve hasta bitkilerde görülen bu yolda genellikle 5C’lu şekerler sentezlendiği için bu yola pentoz fosfat yolu adı verilir. Pentoz fosfat yolu sitoplazmada cereyan eder ancak karanlıkta kloroplastlarda da meydana gelir. Bu yol glikolizden ayrılıp tekrar ona bağlanan bir yan yoldur. Glikoz-6-Fosfat tan itibaren başlar ve riboz gibi 5 C’lu şekerler sentezlenir. İki önemli ürün nükleik asitlerin yapısında bulunan 5C’lu şekerler ve indirgenme reaksiyonlarının vazgeçilmezi olan NADPH2 sentezlenir. Bu yol bitki hücrelerinde glikoliz ve TCA reaksiyonları ile birlikte yürür. Dışarı verilen CO2’in ¼ nin bu yolla sentezlendiği hesaplanmıştır. GLİOKSİLAT YOLU: Bitkilerde yağlar şekerlere dönüştürülemez. Ancak endospermlerinde yağ depolayan tohumlarda (ay çiçeği, hint yağı, soya gibi) çimlenme sırasında yağlar şekere dönüştürülebilmektedir. Çimlenme sonucu meydana gelen plumula, radikula gibi organalara besin gerektiğinde, endospermadan yağ taşınımı mümkün olmadığı için bu sırada yağlar şekere çevrilerek bu organlara taşınmaktadır. Bu yola glioksilat yolu denir. Reaksiyonlar endosperm hücrelerinde buluna glioksizom adı veilen organellerde gerçekleşmektedir. Bu reaksiyonların yürümesini sağlayan malat sentataz ve izositraz enzimleri sadece glioksizomlarda bulunur. Glioksizomlarda sadece yağ depolayan endosperm hücrelerinde bulunduğu için bu olay başka dokularda görülmez. Glioksilat yolu hem mitokondrideki TCA çemberiyle hem de sitoplazmadaki glikoneogenaz youluyla irtibatlı olarak çalışır. ALTERNATİF SOLUNUM YOLU Siyanür (CN-), azid (N3-) ve karbon monoksit (CO) gibi inhibitörler şekilde gösterilen solunumun ETS safhasını inhibe ederek solunumu engeller. Bu inhibisyon, ETS’nin son basamağında görev yapan sitokrom oksidaz enziminin bloke olmasıyla meydana gelir. Bitkilerde siyanüre dirençli bir alternatif solunum yolu bulunduğu anlaşılmış ancak henüz detaylı bilgi elde edilememiştir. Mevcut bilgilere göre, normal solunumda elektron taşınımı elektronlar 1. ubikinon ’dan sitokrom b ’ye değil kısa yoldan henüz mahiyeti tam bilinmeyen ve terminal oksidaz adı verilen siyanüre dirençli bir enzim üzerinden oksijene taşınır. Dolayısıyla alternatif solunum yolunda ATP sentezi ya hiç olmaz ya da çok az olur. Çünkü ETS’de elektron akışı sağlanamadığı için yeterli bir H+ pompalanması ve zar potansiyeli oluşmaz. Dolayısıyla solunumda açığa çıkan enerji ortama ısı enerjisi olarak dağılır.

http://www.biyologlar.com/isik-solunumu-fotorespirasyon

mikrobiyoloji ödevi

Mikrobiyoloji lab.da ekim yapılmadan önce hangi hazırlıklar yapılır. ekim nasıl yapılır. etken teshisi nasıl yapılır. antibiyogram nasıl yapılır... -MİKROORGANİZMALARIN EKİM YÖNTEMLERİ Bu deneyde saf kültür elde etmek amaçlanmıştır.Dökme plak yöntemi,yayma plak yöntemi ve sürme ekim yöntemleriyle izolasyon sağlanır.Plate Count Agar ve Malt Extract Agar besiyerlerine yayma plak yöntemi kullanılarak kıyma örneğinin uygun dilüsyonları ekilecektir.Violet Red Bile Glucose Agar besiyerine dökme plak yöntemi uygulanarak ekim yapılacaktır.Nutrient Agar besiyerine de sürme ekim yapılacaktır.İnkübasyon sonunda, NA besiyerinde gelişen bakterilere endospor boyama yapılacaktır.MEA besiyerinde gelişen küflere de küf boyama yapılacaktır. NA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak yapılan endospor boyama sonucunda mikroskopta Lactobaciller gözlenmiştir. MEA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak yapılan küf boyama sonucunda Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir. Üzerinde veya içinde mikroorganizma üretilmiş (ya da üremiş) besiyerlerine kültür denir.Saf kültür, besiyerinde yalnızca tek bir mikroorganizma türü üretilmiş kültürlerdir.Saf kültür elde etmenin bazı aşamaları vardır.Öncelikle örnek alnır.Bu örneğin istenen dilüsyonları hazırlanır.Sonra örnek uygun araçlarla (pipet,öze) besiyerine aktarılır.İnokülasyon işlemi gerçekleştirilir.İnkübasyondan sonra, kültür hazırdır. Dökme plak yöntemi,yayma plak yöntemi ve sürme ekim yöntemleriyle izolasyon sağlanır. Sporlu bakterileri görüntülemek için endospor boyama yapılır.Bazı bakteriler (Bacillus ve Clostridium cinsi) yüksek sıcaklık,düşük su aktivitesi gibi dış ortam koşullarına dayanıklı sporlar oluştururlar.Bakteri hücresinin içinde oluşan bu spora endospor denir.Sporların soğuk,sıcak,UV,düşük su aktivitesi gibi fiziksel etkenlere pek çok boya maddesine ve kimyasal maddelere karşı vejetatif hücrelerden daha dayanıklı olması kimyasal ve fiziksel yapılarının farklılığından ileri gelir.Gram boyamada kullanılan boyalar spor çeperine nüfuz edemediklerinden gram boyama yöntemiyle sporlar boyanamaz.Sporların görünmesi için en yaygın yöntem Schaffer-Fulton yöntemidir.Preparat hazırlandıktan sonra malachite yeşili boyası uygulanır,boyanın spor çeperine nüfus edebilmesi için preparat bir süre ısıtılır.Boya yıkanıp,safranin karşıt boyası ile boyanır.Mikroskopta sporlar yeşil,hücre pembe-kırmızı görülür (Temiz, 2000). Küf boyamada küflerin misel ve spor yapılarının mikroskopta görüntülenmesi için yapılır.Lama önce boya çözeltisi konur,üzerine bir miktar agarla birlikte alınan küf miselleri yerleştirilir,lamel kapatılarak mikroskopta incelenir. Gıda sanayiinde boyama yöntemlerinden yararlanarak mikroorganizmaların morfolojik özellikleri belirlenir.Böylece hangi tip mikroorganizma oldukları anlaşılır.Buna göre,mikroorganizma gelişimini önleyici tedbirler alınır. MATERYAL VE METOT Dilüsyon hazırlanması Materyal -Kıyma örneği -Fizyolojik Tuz Çözeltisi -Mekanik çalkalayıcı -Pipet -Deney tüpleri -Pens Uygulama Gıda maddesinden(kıyma) steril pens ve bistüri yardımıyla steril petri kutusuna 10±0.4g tartılır. Kıyma ve bir erlen içerisinde önceden otoklavda steril edilmiş 90 ml fizyolojik tuz çözeltisi,mekanik çalkalayıcıya konur.Mekanik çalkalayıcı cihazında 5 dak,250 devirde homojenize edilir.Böylece örnek 1:10 oranında seyreltilmiş olur (Şekil 1). Homojenizasyonu tamamlanmış gıda maddesinden steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak içerisinde 9 ml dilüsyon sıvısı bulunan tüpe ilave edilir.Böylece örnek 1:100 oranıda seyreltilmiş olur. 10-2 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:1000 oranında seyreltilmiş olur. 10-3 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:10000 oranında seyreltilmiş olur. 10-4 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:100000 oranında seyreltilmiş olur. Böylelikle,kıyma örneğinin 10-2 , 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları ekim için hazırdır. Yayma Plak Yöntemi ile Ekim Yapılması Materyal -Kıyma örneği dilüsyonları -Katı besiyerleri (PCA ve MEA) -Pipet -Drigalski -Bunzen Beki -Tüp karıştırıcı -İnkübatör Uygulama Yayma plak yöntemiyle, PCA besiyerine kıyma örneğinin 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları ekilir.PCA besiyeri genel amaçlı bir besiyeridir. 10-5 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 10-5 dilüsyonundan alınarak, içerisinde PCA katı besiyeri bulunan petri kutusuna 0.1 ml ekilir.Petri kutusunun üzerine 10-6 yazılır.Sonra 10-4 dilüsyonundan aynı şekilde bir diğer petri kutusuna ekim yapılır.Petri kutusu üzerine 10-5 yazılır.Daha sonra, 10-3 dilüsyonundan ekim yapılır.Petri kutusuna 10-4 yazılır. Drigalski adı verilen steril bir cam baget vasıtasıyla ekilen kısım (inokulum) petri yüzeyine yayılır.Ancak drigalski kullanımından önce alkole daldırılıp,bunzen beki alevinden geçirilmelidir.Böyle bir yol izlendiğinde, drigalski ekim öncesinde besiyerinin boş kısmına değdirilerek soğutulmalıdır. PCA besiyerlerini içeren petri kutuları ters çevrilerek inkübatöre konur.PCA için 35-37 °C de 48 saat yeterlidir. Yayma plak yöntemiyle, MEA besiyerine kıyma örneğinin 10-1 ve 10-2 dilüsyonları ekilir.MEA maya ve küflerin teşhisi,izolasyonu ve sayımlarında yararlanılan bir besiyeridir. 10-2 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 10-2 dilüsyonundan alınarak içerisinde MEA katı besiyeri bulunan petri kutusuna 0.1 ml ekilir.Petri kutusunun üzerine 10-3 yazılır.Sonra 10-1 dilüsyonundan aynı şekilde bir diğer petri kutusuna ekim yapılır.Petri kutusu üzerine 10-2 yazılır. Drigalski adı verilen steril bir cam baget vasıtasıyla ekilen kısım (inokulum) petri yüzeyine yayılır. MEA besiyeri düz bir şekilde inkübatöre konur.MEA maya ve küfler için genel bir besiyeridir.Mayalar için, 25 °C de 3 gün,küfler için 25 °C de 2 gün inkübe edilir. Dökme Plak Yöntemi Materyal -Kıyma örneği dilüsyonları -Katı besiyeri (VRBGA) -Pipet -Tüp karıştırıcı -Bunzen Beki -İnkübatör Uygulama Dökme plak (pour plate) yönteminde,steril,boş petri kutusuna önce ekim yapılıp,üzerine yaklaşık 45° C ye kadar soğutulmuş besi yeri dökülür. Kıyma örneğinin 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları VRBGA besiyeri için ekilecektir. VRBGA koliform ve Enterobacteriacea tanımlaması için kullanılan bir besiyeridir. Ekim işlemine en son dilüsyondan başlanır.10-5 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 1 ml alınarak petri kutusuna ilave edilir.Petri kutusu üzerine dilüsyon ile aynı seyreltme oranı yazılmalıdır. 10-3 ve 10-4 dilüsyonlardan da benzer şekilde ekim yapılarak, işlem tamamlanır (Şekil 2). Yaklaşık 45 °C ye soğultulmuş VRBGA besiyeri petri kutusuna ilave edilir.Petri kutusu inokulum ile besiyeri karışımının sağlanması için sekiz çizerek yavaşça karıştırılır. Karıştırma sırasında petri kutusu kapağına bulaşma olmamasına ve agarın petri kutusundan taşmamasına dikkat edilmelidir. Petri kutuları ters çevrilerek inkübatöre konur.VRBGA besiyeri için, 37 °C de 24-48 saat inkübe edilir. NA Besiyerine Sürme Ekim Yapılması Materyal -Öze -Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü -Tüp karıştırıcı Uygulama Sürme ekim yöntemi öze kullanılarak gerçekleştirilir.Bu yöntem tek koloni düşürme tekniği olarak da anılmaktadır. Sıvı besiyerinden Öze ile Ekim Sıvı besiyerini (kıyma örneği) içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılır.Böylece, sıvı besiyerindeki mikroorganizmaların bulundukları sıvı içinde homojen dağılımı sağlanır. Öze sağ elde kalem gibi tutularak uç kısmı Bunzen beki alevinin mavi kısmına daldırılır ve öze dike yakın bir konuma getirilir.10-15 saniye özenin soğuması için beklenir. Sol elde bulunan tüpün ağzındaki pamuk tıkaç,öze tutulan elin parmaklarıyla tüp hafifçe ekseni etrafında çevrilerek açılır. Tüpün ağız kısmı alevden geçirilir ve tüp hafif eğilerek öze ucu sıvı besiyerine daldırılır.Bir öze dolusu örnek alınır. Steril agarlı besiyerini (NA) içeren petri kutusu sol elin ayası içine alınır. İşaret parmağı destek vazifesi görürken,baş parmak aracılığıyla kapak aralanır.Öze bu aralıktan içeri sokularak,öze ucunun örnek alınan kısmı agar yüzeyinin seçilecek bir bölgesine temas ettirilir.Örnek bu bölgede hafifçe ezilerek birkaç mm çapında yayılır.Öze ile bu yayılma alanından başlayarak sürme işlemine geçilir Katı Besiyerinden Öze ile Ekim Öze sağ elde kalem gibi tutularak uç kısmı Bunzen beki alevinin mavi kısmına daldırılır ve öze dike yakın bir konuma getirilir. PCA besiyerini içeren petri kutusunun kapağı alevin yanında aralanır ve öze bu aralıktan içeri sokularak,besiyerinin boş bir alanında soğutulur. Steril özenin ucu PCA besiyerindeki üreme bölgesine veya koloniye hafifçe temas ettirilerek ya da sürülerek örnek alınır. Steril agarlı besiyerini (NA) içeren petri kutusu sol elin ayası içine alınır. İşaret parmağı destek vazifesi görürken,baş parmak aracılığıyla kapak aralanır.Öze bu aralıktan içeri sokularak,öze ucunun örnek alınan kısmı agar yüzeyinin seçilecek bir bölgesine temas ettirilir.Örnek bu bölgede hafifçe ezilerek birkaç mm çapında yayılır.Öze ile bu yayılma alanından başlayarak sürme işlemine geçilir (Temiz, 2000). Endospor Boyama Materyal -Lam -Öze -Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü -Boya çözeltileri; Malachite yeşili,safranin -% 95′ lik etil alkol -Kurutma kağıdı -İmmersiyon yağı -Mikroskop(100X obj.) Malachite Yeşili Malachite green 5g Distile su 100ml Safranin Safranin 0.5g Distile su 100ml Uygulama Preparat hazırlanması Lam steril bir pensle tutulup alkole daldırılır,sonra aleve tutulur.Mikroorganizmalar uzaklaştırılmış olur. Lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır. Öze bek alevinde sterilize edilir,soğuması için beklenir. Steril öze ile katı besiyerinden (NA, 10-3 katı besiyerinden ) bir miktar kültür alınır. Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır. Preparatın kuruması için bir süre beklenir. Bir steril pensle bir ucundan tutulan lam bunzen alevinden 20 kez geçirilir.Böylece mikroorganizma lam üzerine tespit (fiksasyon) edilmiş olur. Boyama Preparatın üzeri kurutma kağıdı ile kaplanır,üzerine malachite yeşili çözeltisi dökülür. Preparat hafif alev üzerinde 5 dakika ısıtılır.Ancak preparat kurutulmamalıdır.Gerekirse üzerine boya ilave edilmelidir. Preparat musluk suyu ile 10 saniye yıkanır. Karşıt boyama için safraninle 15 saniye boyanır. Su ile yıkanır,kurutma kağıdıyla kurutulur. İmmersiyon yağı damlatılarak (100X) objektifle incelenir. Küf Boyama Materyal -Lam -Öze -Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü -Boya çözeltileri; laktofenol -% 95′ lik etil alkol -Kurutma kağıdı -İmmersiyon yağı -Mikroskop(100X obj.) -Lamel Küf Boyama İçin Laktofenol Çözeltisi Laktik asit 20g (16ml) Gliserol 40g (31ml) Fenol kristalleri 20g Anili blue 0.05g Distile su 20 ml Uygulama Lam üzerine 1 damla laktofenol damlatılır. Öze alevde kor haline getirilir,agarın (MEA,10-3) kenarında soğutulur.Ucu yuvarlak ve yumuşak öze yerine sert,düz öze kullanılmalıdır. Öze yardımıyla koloninin kenarından,bir parça agar ile birlikte kültür alınır.Bunun nedeni; küfün asıl yapısının agara nüfus etmiş olmasıdır. Boya çözeltisinin üzerine konur. Üzerine 1 damla alkol damlatılır. Kültürün üzeri arada hava kalmayacak şekilde kapatılır.Eğer hava kabarcığı varsa bir özenin sapıyla lamel üzerine hafifçe bastırılarak bu kabarcık giderilmeye çalışılır. Önce (10x) objektif,sonra (40x) objektif ve en son yağ damlatılarak (100x) objektifle incelenir. Pratik Yol Lam üzerine 1 damla laktofenol damlatılır. Bir bantla küf agardan alınır. Lamın üzerine yapıştırılır. Mikroskopta incelenir. BULGULAR VE TARTIŞMA Violet Red Bile Glucose Agar besiyeri ile yapılan dökme plak yöntemiyle ekim sonucunda koliform bakteriler yerine küf gelişimi gözlenmiştir.Bu küfler havadan besiyerine bulaşmıştır. Malt Extract Agar besiyerine yapılan yayma plak yöntemiyle ekim sonucunda maya ve küf gelişimi gözlenmiştir.Ancak, koloniler çok yoğun olduğu için sayım yapılamamıştır. Plate Count Agar besiyerine yapılan yayma plak yöntemiyle ekim sonuçları: M.o. sayısı (cfu-g)=petrideki Mo sayısıxseyreltme faktörü*/petri kutusuna ekilen miktar(ml) Seyreltme faktörü=1/seyreltme oranı PCA (10-5 ) deki koloni sayısı=8 PCA (10-5 ) deki koloni sayısı=10 PCA (10-4 ) deki koloni sayısı=9 PCA (10-4 ) deki koloni sayısı=19 Koloni sayıları 25 koloniden az olduğu için sayım yapılamaz. Nutrient Agar besiyerlerine sıvı besiyerinden ve katı besiyerinden yapılan öze ile ekim işlemleri sonucunda besiyerlerinde bakteri,maya ve küf gelişimi gözlenmiştir. NA 10-3 katı besiyerinden bir miktar kültür alınarak yapılan endospor boyama sonucunda mikroskopta (100x objektif) uzun çubuk şeklinde sporlu bakteriler (Lactobaciller) gözlenmiştir.Bakterilerin sporları yeşil,vejetatif hücreleri ise pembe-kırmızı renkte görünmektedir(Şekil 4). MEA 10-3 katı besiyerinden bir miktar kültür alınarak yapılan küf boyama sonuçları, önce (10x) objektif, sonra (40x) objektif ve en son yağ damlatılarak (100x) objektifle incelenmiştir.Sonuçta Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir (Şekil 5). SONUÇLAR Dilüsyon yöntemiyle, kıymadaki canlı mikroorganizma sayısı belirlenmiştir. Örneğin uygun seri dilüsyonları hazırlanarak uygun agarlı besiyerlerine ekimleri gerçekleştirilmiştir.Yayma plak yöntemiyle Plate Count Agar ve Malt Extract Agar;dökme plak yöntemiyle de Violet Red Bile Glucose Agar besiyerlerine ekimler yapılmıştır.İnkübasyon sonucunda koloniler sayılmıştır.Nutrient Agar besiyerlerine, sıvı besiyerinden öze ile ve katı besiyerinden (PCA) öze ile sürme ekim yapılmıştır.Yapılan izolasyon sonucundan kısmen izole koloniler elde edilmiştir. NA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak endospor boyama yapılmıştır.Mikroskopta Lactobaciller gözlenmiştir. MEA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak küf boyama yapılmış ve Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir. REFERANSLAR HARRIGAN, W.F.1998.”Laboratory Methods in Food Microbiology.”3rd ed.Academic Press,New York. TEMİZ,AYHAN.2000.”Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri”.3rd ed.Hatiboğlu Yayınevi,Ankara. DART,R.K.1996.”Microbiology For Analytical Chemist”.3rd ed.Redwood Books Ltd,Cambridge. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİNDE GÜVENİLİR SONUÇLARIN ALINMASI İÇİN STANDART YÖNTEMLERİN UYGULANMASI Antibiyogram test için pratikte en yaygın kullanılanı “Disk Diffüzyon” (Kirby-Bauer) yöntemidir. Belirli bir miktar antibiyotik emdirilmiş kağıt diskler, test mikroorganizmasından hazırlanan standart süspansiyonun yayıldığı agar plakları yüzeyine yerleştirilir. Böylece diskteki antibiyotik agarın içerisine gittikçe azalan miktarlarda yayılır ve bakteriye etkili olduğu düzeylerde üremeyi engeller. Bunun sonu-cunda disk çevresinde bakterilerin üremediği dairesel bir inhibisyon alanı oluşur (inhibisyon zonu). İnhibisyon zonunun çapı, bakterinin duyarlılığı ile direkt olarak ilişkilidir. Her antibakteriyel için standart değerler vardır. Disk etrafında inhibisyonun görülmemesi, bakterinin o antibakteriyele karşı dirençli olduğunu gösterir. Bu alanın çapı ölçülerek duyarlı (S), orta duyarlı (I) ve dirençli (R) olacak şekilde duyarlılık dereceleri belirlenir. KIRBY-BAUER DİSK DİFFÜZYON YÖNTEMİ İLE ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ 1- KOLONİ SEÇİMİ: Hastalık etkeni olarak izole edilen ve tanımlanan, 18–24 saatlik üremiş olan bakteri kolonilerinden 3-4 tanesi seçilir. Steril koton bir sıvab kullanılması tercih edilir. 2- İNOKULUM SÜSPANSİYONUNUN HAZIRLANMASI: 5 ml’lik tüp içindeki Mueller-Hinton Broth veya Tryptone Soya Broth’a, agardan alınan 3-4 bakteri kolonisi süspanse edilir. Sıvab tüpün dibine daldırılır,karıştırılır ve bu şekilde alınan kolonilerin Broth’a iyice süspanse olması sağlanır. Sıvab tüpün iç cidarlarına bastırılarak çıkarılır. 2 A- Direkt koloni süspansiyonu yöntemi • Tüm Stafilokoklar • Zor beğenen, önceden Broth içinde üremesi bilinemeyen Streptokoklar 2 B- Log Faz Büyüme yöntemi • Bütün organizmalar için bu yöntem kullanılır • 35° C’de 2-8 saat inkube edilir • Eğer bulanıklık bu saatler içinde yeterliyse bir üst basamağa geçilir • Eğer bulanıklık bu saatler içinde yeterli değilse inkubasyona devam edilir 3- İNOKULUMUN STANDARDİZASYONU: Test süspansiyonunun bulanıklılığı, 2-8 saat üreme sonunda, 0.5 McFarland Standardı ile eşleştirilerek (1.5 x 108 CFU/ml tekabül eden) standardize edilir. Gözle bulanıklık ayarlaması yapılırken hem standardın hem de süspansiyonun çok iyi karıştırıldığına dikkat edilmelidir. 0.5 McFarland Standardının hazırlanması: 0.05 ml % 1.175 Barium Chloride dihydrate (BaCl2. 2 H2O) ile 9.95 ml % 1 sulfuric acid (H2SO4) karıştırılır. Tüplere 5-6 ml olacak şekilde bölünerek buzdolabında saklanır. a- Her iki yöntemde de Süspansiyon çok yoğunsa; • Kullanılan Broth’la veya fizyolojik tuzlu su ile tamamlanır, vortex ile karıştırılır b- Direkt koloni Süspansiyon yönteminde süspansiyon açık renk ise; • Seçilen kolonilerden ilave edilebilir, vortex ile karıştırılır. c- Log Faz yönteminde süspansiyon açık renk ise; • Süspansiyon tekrar inkube edilir, kullanmadan önce vortex ile karıştırılır. 4- PETRİLERE İNOKULUM YAPILMASI: Steril bir koton sıvab süspansiyonun içerisine daldırılır, karıştırılır. Sıvab tüpün iç kenarına bastırılarak çıkarılır. Agar’ın bir tarafından başlanarak tüm yüzeye yayılır. 60 döndürülerek aynı işlem tekrarlanır. Tekrar 60 döndürülerek aynı sıvab ile aynı işlem yapılır. Dördüncü defa sıvab agar’ın petri kenarlarındaki yüzeyine çepeçevre sürülerek işlem tamam-lanır. Agar’ın yüzeyinin kuruması için oda ısısında 10-15 dakika beklenir. 5- ANTİMİKROBİYAL DİSKLERİN YERLEŞTİRİLMESİ Antibiyotik diskleri oda ısısına getirilir. Aynı gruptaki antibiyotiklerin etki mekanizmaları aynıdır. Mümkün olduğu kadar çok sayıda farklı grup antibiyotik diski ile test yapılmalıdır. 150 mm çapı olan petrilere 12 disk, 100 mm olan petrilere 8 diskten fazla yerleştirilmemelidir. Diskler arasında 20 mm mesafe olacak şekilde diskler steril bir pens ile agarın yüzeyine yerleştirilir. Hafifçe üzerlerine pens ile bastırılarak disklerin agarla temasının tam olması sağlanır. Firmalar tarafından örnek olarak verilen antibiyotik diskleri bu metod ve aynı besi yerleri kullanılarak referens suşlarla valide edilerek spesifize edilmişlerdir. 6- MUELLER-HİNTON BESİ YERİNİN İNKUBASYONU 35° C’de 16 – 18 saat inkube edilir. Aerob olanlar, oksijenli (O2) ortamda, anaerob olanlar ise, jarda % 3-10 karbon dioksit (CO2) veya desikatörde oksijensiz ortam (mum yakarak) sağlamak suretiyle, etüvde üretilirler. Jarda yapıldığı taktirde 90-100 mm çaplı petriler tercih edilmelidir. 7- ZONLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ Siyah bir zemin üzerinde disklerde dahil olmak üzere zon çapı cetvel ile ölçülür. Disklerle birlikte verilen zon çapları, ölçüm sonrası her bir disk için ayrı ayrı değerlendirilmelidir. 8- SONUÇ Zon Çapının Tanımlanması: a- Duyarlı (Susceptible, S) Enfeksiyonun önerilen dozda o ilaç ile başarılı bir şekilde tedavi edilebileceğini gösterir. b- Orta derecede Duyarlı (İntermediate, I) İlacın normalden yüksek dozlarının kullanıldığında klinik olarak etkili olacağını gösterir. c- Dirençli (Resistant, R) Tedavide güvenilir bir etkinlik yoktur. Antibiyotik duyarlılık testlerinin sonuçlarının tekrarlanabilir olması, yani aynı koşullarda tekrarlandığında sonuçların aynı veya birbirine yakın olması gerekir. Testlerin uygun koşullarda yapılıp yapılmadığı, kalite kontrol suşları ile (referens suşlar) denetlenir. Bu suşlarla beklenen sonuçlar elde edilemezse antibiyotik duyarlılık testlerinin tekrarlanması gerekir. En son olarak: DOĞRU UYGULANAN VE YORUMU DOĞRU YAPILAN ANTİBİYOGRAM SONUÇLARI KLİNİKTE ANTİBİYOTİK TEDA-VİSİNİN AKILCI OLARAK PLANLANMASINA IŞIK TUTACAKTIR. EKLER: 1- Tryptone Soya Broth (TSB) Casein pepton (pancreatic) 17.0 g Soymeal pepton (pancreatic) 3.0 g D (+) –Glucose 2.5 g NaCl 5.0 g K2HPO4 2.5 g Distilled Water 1000.0 ml Distile su içinde kaynatılarak çözülür. 121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Oda ısısına soğutulur. pH 7.3 ± 0.2 Steril olarak, steril tüplere 5 – 6 ml olacak şekilde taksim edilir. Buzdolabında saklanır. 2- MUELLER-HINTON BROTH Meat infusion 2.0 g/L Casein hydrolysate 17.7 g/L Starh 1.5 g/L Distilled Water 1000 ml Distile su içinde kaynatılarak çözülür. 121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Oda ısısına soğutulur. pH 7.3 ± 0.2 Steril olarak, steril tüplere 5 – 6 ml olacak şekilde taksim edilir. Buzdolabında saklanır. 3- MUELLER-HINTON AGAR Meat infusion 2.0 g/L Casein hydrolysate 17.7 g/L Starh 1.5 g/L Agar-agar 17.0 g/L Distilled Water 1000 ml Distile su içinde kaynatılarak çözülür. pH 7.3 ± 0.2 (oda ısısında) 121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Otoklav sonrası 45-50 derece’de soğutulup, gerekli ise % 5-10 defibrine kan ilave edilir ve steril petri kutularına yaklaşık 12.5 ml olacak şekilde dökülür. Oda ısısına soğutulur. Buzdolabında saklanır. YARARLANILAN KAYNAKLAR 1- Aksoy, A. Murat ( 2006-2007 ): Bakterilerin İzolasyon ve İdantifikasyon Yöntemleri, Labotatuvar Uygulama Kılavuzu. 2- Türk İnfeksiyon Web Sitesi 3- Gür, Y : Antibiyotik Kullanımında Genel Prensipler. 4- Antimicrobial Susceptibility Testing By CLSI (NCCLS) Reference Disk Diffusion Method (Kirby-Bauer).  

http://www.biyologlar.com/mikrobiyoloji-odevi

MİKROBİYAL LİÇİNG

Mikroorganizmalar mineral kaynaklarının oluşması ve çözülmesinde önemli rol oynar. Mineral aranması ve zenginleştirilmesinde biyoteknolojik yöntemlerin kullanılması popüler hale gelmiştir. Mikrobiyal liçing; mikroorganizmalar yaratımıyla maden cevherlerinden metallerin kazanılması işlemidir. Düşük kaliteli cevherlerden metallerin geri kazanımın da kullanılan kimyasal metodlar ekonomik olmamaktadır. Dünya genelinde yüksek oranlarda bulunan düşük kaliteli, bakır cevherlerinin göreneksel kimyasal metodlarla elde edilmesi zor ve pahalı olduğundan, bunların eldesinde mikrobiyal liçing kullanılır. Son yıllarda geliştirilen mikrobiyal liçing yöntemleri metalik hammaddeler için çok önemlidir. Klasik yöntemler ile çözünürleştirilmeyen veya parçalanamayan fakir cevherler ve endüstri atıkları mikoorganizmalar ile ekonomik biçimde geri kazanılmaktadır. Bakterilerin yaptığı iş suda çözünmeyen filizleri suda çözünür hale getirmektir. Bakteriyal liçing daha çok uranyum ve bakır kazanımın da kullanılır. Dünya yüzeyinde kayda değer ölçülerde bulunan Ni, Zn, Cd, ve Co eldeleri içinde bir dizi liçing yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntem bir asidik su içiren bir maden yatağına boru hattı döşeme sırasında meydana gelen bir patlama sonucu ortaya çıkmış ve geliştirmeler sonucunda düşük dereceli maden cevherlerinin geri kazanımı sağlanmıştır. LİÇİNGDE KULLANILAN ORGANİZMALAR Mikrobiyal liçingde kullanılan en yaygın 2 tane bakteri Thiobacillus thiooxidans ve Thiobacillus ferrooxidans’tır. Ayrıca Thiobacillus concretivoru, Thiobacillus concretivorus, Pseudomonas fluorescens, P. putida, Achromobacter, Bacillus licheniformis, B. Cereus, B. luteus, B. polymyxa, B. megaterium ve birçok termofilik bakterilerden Thiobacillus thermophilica, Thermothrix thioparus, Thiobacillus TH1, ve Sulfolobus acidocaldarius kullanılmaktadır. Heterotrafik mikroorganizmaların kullanımı gelişmektedir. Termofilik bakterilerin liçing uygulamalarını hızlandırmasının en büyük etmeni hızlı gelişim oranının varolmasıdır. MİKROBİYAL LİÇİNG KİMYASI Thiobacillus ferrooxidans çok pahalı çalışmayı gerektiren bir bakteridir. Bu bakteri mezofil, spor oluşturmaz, hareketli Gr(-), çubuk şeklinde olup C,5-C,8 m X 1,0-2,0 m boyutlarındadır. Ototrofik aerap olup C ihtiyacını havadaki CO2’in fixasyonundan sağlar. Enerji kaynağı olarak ise Fe2+  Fe3+’ya oksidasyonunudan veya elementel kükürt veya indirgenmiş kükürt bileşiklerinden sağlar. En yaygın kullanılan mikrobiyal liçing proseslerinin amacı az çözünen veya çözünmeyen metal bileşiklerini metal sülfatlar haline getirip çözünürleştirmektir. Bunun için 2 şekilde uygulama çeşidi varadır: Direkt ve indirekt mikrobiyal liçing. 1. Direkt Mikrobiyal Liçing: 4 FeSO4 + 2H2 SO4 + O2  2Fe2(SO4)3 + 2H2O [1] 2S0 + 3O2 + 2H2O  2H2SO4 [2] 2FeS2 + 7O2 + 2H2O  2FeSO4 + 2H2SO4 [3] Çözünmez haldeki sülfürün sülfirik aside aksidasyonu, sülfürle direkt kontak halindeki T.ferroxidans sayesinde gerçekleştirilir. T. ferooxidans tarafından gerçekleştirilen [3] nolu reaksiyon direkt mikrobiyal liçing: göstermektedir. Demir cevherinin yanında bakır, kurşun, nikel, kobalt, molibden ve çinko cevherleride T.ferroxidans sayesinde oksitlenebilirler. MeS + 2O2  Me SO4 2. İndirekt Mikrobiyal Liçing İndirekt liçingde, mikoorganizmalar liçing reaktifini üretir veya rejenere ederler. Örneğin metal sülfür cevherleri mikrobiyal bir etki olmaksızın Fe3+ iyonları tarafından oksitlenip liçing gerçekleştirilebilir. MeS + Fe2 (SO4) MeSO4+S0 Reaksiyonda indirgenen demirin tekrar Fe3+ haline dönüştürülmesi T.ferroxydans tarafından sağlanır. Bakteri bu prosese doğrudan karışmayıp bir katolitik fonksiyon görür. Bakteriyel oksidasyon kimyasal oksidasyondan yaklaşık 1 milyon kat hızlıdır. [2] nolu reaksiyonun oksitlenmesi T.thiooydans tarafından çok daha hızlı oksitlenirler. Bu tepkimeden de anlaşılacağı üzere sülfirik asit oluşumu katalizlediğinden, liçing için asidik koşulların sağlanması önemlidir. Bakteri Aktivitesine Etki Eden Etmenler 1. Besi Ortamı Besi ortamının kimyasal ve minerolojik bileşimi çok önemlidir. Liçing koşulları ve bakteriyel büyüme koşulları çakışıyorsa maksimum metal verimine ulaşır. Enerji veren demir ve kükürt bileşiklerinden başka magnezyum ve amonyum tuzları, fosfatlar ve sülfatlar esansiyel mineral bileşenleridir. Anorganik bileşiklerin bazıları liçing çözeltisinde bulunur. Eğer ortamda yeterli değillerse bir miktar katılırlar. Pirit(FeS2) ilave edilirse indirekt liçing hızlanır. Çok yüksek konsantrasyonda Fe3+ varlığı kompetitif bir inhibisyona neden olur. Tiyobasiller besi ortamı için problemlidir. Mikrobiyal liçingden maksimum verim elde etmek için liçing sırasında O2 transportu yeterli hızla sağlanmalı ve bu transportu etkileyen faktörlere dikkat edilmelidir. 2. pH ve Redoks Potansiyeli Optimum büyüme koşullarındaki pH’nın liçing çalışma koşullarına uyması idealdir. En uygun pH 2-2.5 arasıdır, kükürt ve Fe2+ oksidasyonu da bu pH lara uygundur Eğer pH 2’nin altına inerse T. ferroxydans aktivitesi düşer. Aerobik bir bakteri olduğu için T.ferroxydans pozitif bir redoks potansiyeline ihtiyaç duyar. Redoks potansiyeli logaritmik büyüme fazı sonuna doğru 600 mV a ulaşır. 3. Sıcaklık Fe+2 ve kükürdün mikrobiyal oksidasyonu için optimum sıcaklık 28-35oC arasıdır. T.ferrooxydans’ın büyümesi için de bu sıcaklık aralığı uygundur. Daha düşük sıcaklıkta büyüme yavaşlar, daha yüksek sıcaklıklarda ise termofil bakteriler kullanılır. 4. Liçing Materyalinin Kimyasal ve Mineralojisi Materyal yüksek oranda karbonat içerirse pH artar ve dolayısı ile liçing aktivitesi düşer ve giderek durur. Bunu engellemek için ortama asit ilavesi gereklidir. Mineral bileşimi büyüme ortamının ihtiyacını tam olarak karşılayamaz bazı mineraller dışarıdan ilave edilir. 5. Substrat Konsantrasyonu ve Partikül Büyüklüğü Liçing hızı liçing edilecek substratın yüzey büyüklüğü ile orantılıdır. Partikül boyutu ne kadar küçük ise toplam partikül yüzey o derece yüksektir, spesifik partikül yüzeyi artar, böylece liçing verimi de artar. Bu bilgiler kükürtlü cevherler için geçerli olup düşük tenörlü cevherleri kapsamaz. Substrat konsantrasyonunu artırarak da partikül toplam yüzeyi büyütülebilir. Bu durumda paktikül kütlesi de artar. Fakat substrat konsantrasyonunun artırılması belirli bileşiklerin konsantrasyonlarının artmasına neden olur ki bunların bazılar tiyobasillerin üremesi için toksik etki veya inhibisyon gösterebilir. Pratikte her liçing denemesi için partikül büyüklüğünün ve substrat konsantrasyonunun optimize edilmesi gerekir. 6. Yüzey Aktif Maddeler ve Ekstrasksiyon Maddeleri Eskiden bu maddelerin ilavesinin liçingi hızlandırdığına yani tiyobasillerin üremesini artırdığına inanılırdı. Fakat 1975 ten sonra yapılan çalışmalarda bunun tamamen yanlış olduğu tesbit edilmiştir. Yüzey gerilimi çok düşeceği için O2 kütle transferi çok yavaşlar. Bunun sonucunda bakteriyel gelişme sürekli olarak inhibe olur. Benzer bir etki ekstraksiyonda kullanılan organik çözgenler için de geçerlidir. Organik fazdan metal iyonunun geri alınması yeniden sulu faza çekme şeklinde olur. Eğer bakteriyel liçing ve çözgen ekstaksiyonu birlikte uygulanır ise problem çıkabilir. En önemli problem organik çözgen fazının tam olarak ortamdan ayrılmamasıdır. Sulu fazdan kalan organik çözgen bakterinin büyümesini inhibe eder. 7. Ağır Metaller Birçok ağır metal iyonu çok düşük konsantrasonlardan bile toksik etki gösterebilir. Tiyobasiller ağır metallere çok toleranslıdır. Bununla birlikte bu etkilerin daha önceden bilinmesi gerekir. 8. Işık Tiyobasiller ışığa çok duyarlıdır. Özellikle UV ve görünür ışığın ultraviyoleye yakın bölgesi tiyobasillere çok etkilidir. Mikrobiyal Liçing Prosesleri Optimumu liçing koşulları sadece laboratuar koşulları için tespit edilmiştir. Liçing koşullarının optimizasyonu pilot tesislerde tespit edilir ve daha sonra endüstriyel boyutta uygulanır. Optimizasyon da kullanılan parametreler; - O2 ve CO2 temini - Materyalin nem oranı - pH gradienti - Sıcaklık gradienti - Fe3+ tuzu çöktürmeleri - Partikül büyüklüğü - Partikül parçalanması ve partikül göçü - Geçirgen olmayan tabakaların oluşup, oluşmadığı. Mikrobiyal liçingin teknik uygulamalarının esas işlem sırası şöyle gerçekleşir; 1- Cevherlerin öğütülmesi 2- Cevherlerin bakteri süspansiyonu ile uygun şekilde sulandırılması 3- Sıvının biriktirilmesi 4- Çözünmüş metalin extraksiyonu NOT: Mikrobiyal liçing sonucu oluşan atık sular boş arazilere boşaltılmamalıdır. Mikrobiyal liçing uygulandığı yüze şekillerine göre 3’e ayrılır a) Meyilli yüzeyde liçing b. Kümesel yüzeyde liçing c. İn-situ liçing Mikrobiyal Liçingin Teknik Uygulamaları 1. Bakır Cevherinin Biyoliçingi Günümüzde dünya bakır üretiminin yaklaşık %10’u bakteriyel düşük kalite cevherlerin bakteriyel liçingi ile gerçekleştirilir. Bütün bakır işleticileri bir entegre yığma-boşaltma veya onların maden çıkarma veya porsesleme aktivitesini artıran in-situ liçing porseslerini uygular. En önemli bakır cevherlerinden biri olan kalkosit aşağıdaki denkleme göre bakteri tarafından çözünürleştirilir. Cu2S + 5/2 O2 +H2SO4 Bakteri 2CuSO4 + H2O Bu denklem iki basamakta gerçekleşir. a) Cu2S + ½ O2 + H2SO4 bakteri CuS + CuSO4 + H2O b) CuS + 2O2 bakteri CuSO4 Diğer bakır sülfür cevherleri bornit (Cu5FeS4), kubanit (CuFe2S3) ve kalkopirit (CuFeS2), enargit (Cu3AsS4) ve kovellittir (CuS). 2.Uranyum Cevherlerinin Biyoliçingi Mikrobiyal uranyum liçingi daha çok terk edilmiş uranyum ocaklarında uygulanır. Endüstriyel olarak bakteriyel liçing prosesleri ile cevherlerden uranyum ekstrakte edilir. Ekstraksiyonun kimyası çözünmeyen dört değerlilikli uranyum oksitlenerek çözünen altı değerlikli durumuna değişimi ile ifade edilir. UO2 + Fe2 (SO4)3+2H2SO4 U4[UO2(SO4)3] + 2 FeSO4 FeSO4 daha önce belirtildiği gibi bakteriyel oksidasyon ile Fe2(SO4)3 a dönüştürülür. SONUÇ Mikrobiyal liçing düşük kalitedeki cevherlerden metal kazanımın da kullanılan ve klasik yöntemlere göre ekonomik olan bir uygulama çeşididir. Bu yöntemle özellikle altın, gümüş gibi pahalı ve uranyum gibi stratejik elementlerin eldesinde büyük önem taşımaktadır. Bakır ve uranyum eldesinde özellikle in-situ liçing yöntemi uygulanmaktadır. Endüstriyel olarak Çinko, Nikel Cobalt ve Molibden üretimi için mikrobiyal liçing uygulamalarının yaygınlaştırılacağı kesin gibi gözükmektedir. Ayrıca mikrobiyal liçingle atıklardan metallerin geri kazanımı için alternatifsiz bir yöntemdir. Mikrobiyal liçing tesisleri maden yataklarının yanına kurulmalıdır. Böylece transport masrafları indirgenmiş olur. Mikrobiyal yöntem klasik yöntemlerden daha ekonomiktir. Detaylı teknik bilgi gerektirmez, ayrıca yüksek teknolojiye gerek yoktur. Bu nedenlerden dolayı yer altı kaynakları bakımından zengin ve gelişmekte olan ülkeler için çok iyi bir yöntemdir.

http://www.biyologlar.com/mikrobiyal-licing

ANTİSENS TEKNOLOJİLERİ HAKKINDA BİLGİ

ANTİSENS TEKNOLOJİLERİ HAKKINDA BİLGİ

Antisens teknolojisi insan, hayvan ve bitkilerdeki hastalıkların daha spesifik tedavisi ve yeni keşifleri için ayrıca, fonksiyonel genomik çalışmalar için çok güçlü silahlardan oluşan uygun tekniklerdir. Antisens teknoloji olarak bilinen yöntemde, antisens RNA moleküllerinin hedef genin RNA mesajına spesifik olarak bağlanarak gen ifadesinin moleküler düzenlenişine engel olunmaktadır. Hastalıkların oluşumunda büyük bir paya sahip olan proteinlerin üretimini durdurmak için bu teknoloji, oligonükleotidler olarak adlandırılan modifiye olmuş ya da olmamış DNA/RNA segmentlerinin kullanımını içermekte ve hücre içinde, nukleus ve protein üretim bölgeleri arasındaki genetik bilginin iletimini bloke etmektedir (1). Antisens nükleik asit sekanslarının hedef olacak spesifik mRNA’ ya bağlanması veya hibridizasyonu, genin genetik mesajının kesilmesine yol açmaktadır. Bir genin genetik mesajının hücresel proses ile kesilmesi “Knock - Down” veya “Knock – Out” olarak isimlendirilir. Bu proses, bu genin işleyişini saptamak için araştırıcılara olanak sağlamıştır. Diğer bir önemli antisens teknolojisi ise"RNA interferens" olarak adlandırılır. Antisens alanındaki araştırmalar RNAi (RNA interferens) ’nin keşfi ile hız kazanmıştır. Doğal olarak oluşan bu mekanizma sekansa spesifik olup ilk kez Caenorhabtidis elegans nematodunda keşfedilmiştir. Çoğu ilaç (Drug) proteinlere bağlanırken, antisens moleküller kendilerine komplementer hedef RNA ile eşleşirler. Antisens oligonükleotidler mRNA’ nın translasyonunu bloke eder veya RNAaz – H ile mRNA’ nın degredasyonuna neden olurlarken, ribozim ve DNA enzimleri hedef RNA’ yı keserler. RNAi yaklaşımları, RISC ile etkileşen siRNA (small interfering RNA) molekülleri ile gerçekleştirilir (2). Antisens Oligonükleotidler Oligonükleotid bazlı antisens tekniklerin birçok ortak yanı vardır ve genetik mesajın eleminasyonu veya baskılanması üzerine çok başarılı yöntemler uygulanmıştır. Sentetik oligonükleotid sekansın antisens etkisi 1970 yıllarında Zamecnik ve Stephenson tarafından gösterilmiştir. Bu araştırmacılar Rous Sarcoma virusün (RSV)35SRNA’ sının 5’ ve 3’ uçlu nükleotid sekansını kullanarak viral integrasyonda önemli olarak görünen 21 nükleotidlik tekrarlayıcı sekansları identifiye etmişler ve viral sekansın bir kısmına komplementer olan d(AATGCTAAAATGG)13 mer’ lik oligonükleotidi sentezlemişlerdir. Bu sentetik oligonükleotid sekansı RSV ile enfekte olmuş fibroblast hücre kültürlerine verildiğinde, viral üretim büyük ölçüde inhibe olmuştur. Böylece araştırmacılar önemli sekanslara hibridize olarak onları bloke eden oligonükleotidlerin viral integrasyonu inhibe ettiği sonucuna varmışlardır. Hücreye verilen bu oligonükleotide “hibridon” adı verilir (1). Şekil 1. Farklı antisens stratejilerinin karşılaştırılması Sentetik oligonükleotidler, genetik proseslerde bir ajan olarak kullanılmak isteniyorsa bir takım konular aydınlatılmalıdır. Bu konuların en önemlisi “Kalıcılık”tır. Sentetik oligonükleotidler yabancı bir hücreye verildiklerinde hemen endonükleazlara yem olurlar. Onun için bu oligonükleotidlerin endonükleazlardan korunması gerekir. Mümkün olan koruma modifikasyonları 2003 yılında Kurreck tarafından 3 tip olduğu ortaya çıkmıştır. Birinci sınıf modifikasyon, DNA ve RNA nükleotidlerindeki baz veya fosfat bağlarının değişimidir. DNA nükleotidlerinde olmayan, RNA nükleotidlerindeki 2’(OH) hidroksil grubu olan (Riboz) modifiye edilebilir. Bu modifikasyon, nukleaz degredasyonuna karşı bir tür kamuflajdır. 1969 yılında araştırıcılar fosfat bağlarında köprü oluşturmayan oksijen atomundan birini sülfür ile yer değiştirmişlerdir. Bu modifikasyon insan serumunda 10 saatin üzerinde nükleazlara karşı dayanıklı bir şekilde kalmış, aynı sekansa sahip modifiye olmamış oligonükleotid ancak 1 saat kalabilmiştir. Bu modifikasyona fosforotiat denmiştir. 1990 yıllarında başka araştırıcılar kültüre edilmiş hücrelerde HIV replikasyonuna karşın fosforotiatın etkili bir hibridon olduğunu bulmuşlardır. Diğer yandan, fosforotiatlı nükleotidler azda olsa hibridizasyon kinetiği düşük ve spesifik olmayan proteinlere bağlanarak sitotoksik etkiye neden olan özelliklere sahiptirler (1). İkinci sınıf modifikasyon, Riboz şekerinin 2’ pozisyonundaki alkil modifikasyonlar içeren RNA nükleotidleridir. Bu modifikasyonların en önemli ikisi, 2’-O-metil (OMe) ve 2’-O-metoksi-etil (MOE)RNA’ larıdır. Modifikasyona uğramış antisens oligonükleotidlerin hibridizasyon afinitesi arttırılmış ve daha düşük bir toksik etki yaratmışlardır. 2’-O-alkil modifikasyonlarının en önemli eksikliği, en güçlü antisens mekanizması olan RNAaz-H kesimine elverişli olmamasıdır. Buna karşın avantajı da, istenmeyen çeşitli kesimleri baskılayarak bazı proteinlerdeki beklenen değişik kesimlerin ifadesini arttırmasıdır. Antisens etki için, RNAaz-H kesimi, nukleazlara dayanıklılık için 2’-O-alkil modifikasyonlarının tercih edilmesi araştırıcıları yeni bir modele ihtiyaçları olduğu gerçeğini ortaya çıkarmış ve araştırmacılar, bu her iki karakteristiği bir araya getirerek antisens oligonükleotid formunda hibrid bir oligonükleotid oluşturmuşlardır. Bu oligonükleotid nukleazların degredasyonundan internal bloğu koruyan 2’-O-metil ile modifiye olmuş ribonükleotidler ile, RNAaz-H kesimini uyarmak için deoksinükleotidlerin merkezi bloklarını içermektedir(1). Bu model diğer antisens konularına cevap oluşturmak için henüz gelişmemiştir. Modifiye olmamış oligonükleotidler, DNA : DNA ve DNA : RNA dublekslerini oluştururken , DNA ve RNA hedeflerinin tanınmasına yüksek afinite sağlayan çeşitli modifikasyonların sentezleri büyük çaba gerektirmektedir. Modifiye olmamış DNA:DNA ve DNA:RNA dubleksleri ile karşılaştırıldığında, DNA ve RNA’lara hibridize olduğunda termal stabilitesi yükselmiş bir çeşit nükleik asit analoğu geliştirilmiştir. Bu modifikasyon üçüncü sınıf antisens oligonükleotidleri oluşturur. Bu sınıf 4’e ayrılır. Peptid nükleik asitler (PNAs), 2’-floro N3-P5’-fosforoamidler, 1’, 5’- anhidroheksitol nükleik asitler (HNAs) ve locked nükleik asitler (LNA)’dır. 3.sınıf modifikasyonlar ile hibridizasyonda termal stabilite artmış ve hedefin tanınması zenginleşmiştir. Bu tipler arasında ençok bilinen PNA’dır (1991). Şeker fosfat bağları poliamid bağları ile tümüyle değişmiştir. Bu oluşumlar stabiliteyi arttırıcı ve yüksek hibridizasyon kinetiği sağlarkan, hücreye verilimi ve RNAaz H kesim mekanizması için elverişli değildir. PNA’lar, fosforotiat ve 2’-O-alkil RNA’lardan sonra üzerinde çalışılmış ve başarı sağlanmış oluşumlardır (2002). Bu 3.sınıf oluşumlar arasında en yeni olan LNA’lardır. LNA’larda da termal stabilitenin arttığı ve hedef tanınmasının zenginleştiği görülmüştür (1). RNA İnterferens (RNAi) İlaç sanayi, tedavi amaçlı gen baskılanması için her geçen gün kendini yenilemektedir. Daha önceki araştırmalar, antisens oligonükleotid ve ribozimleri kapsayan sekansa – spesifik RNA baskılanması üzerineydi. Bazı pozitif sonuçlar, bu ilaç platformunda elde edilirken, stabilite, hedefi bloke etme potansiyeli, hücreye iletimi ve hedef sekans seçimi gibi teknik konular, klinik olarak ilaçların etkinliğinin gelişimini yavaşlatmıştır. Son yıllarda, nükleik asit bazlı gen inhibisyon yaklaşımlarının klinik olarak gelişiminde yeniden bir etki yaratma potansiyeline sahip olan RNA interferens (RNAi), gen regülasyonunun yeni bir mekanizması olduğu gerçeğini ortaya çıkarmıştır (3). A. Normal transkripsiyon ve translasyon prosesi B. DNA’yı hedefleyen ajanlar ile transkripsiyonun önlenmesi C. pre–mRNA hedeflenmesi ile olgun mRNA’nın oluşumunun engellenmesi D. Translasyonel aparatürlerin engellenmesi ile translasyonun bloke edilmesi E. RNAaz- H ile mRNA’nın etkileşimi sonucu translasyonun önlenmesi (1). RNAi, bitkilerde, solucanlarda, mayalarda ve insanlar arasında yüksek oranda korunmuş, doğal olarak oluşan biyolojik bir prosestir. Hücre içinde iki bölümden oluşan bir yol izine sahiptir. Hücrede oluşan öncül dubleks RNA molekülü ilk olarak, Dicer endonukleaz ile 21-23 nükleotidlik kısa fragmentlere ayrılır. siRNA (short interfering RNA) olarak bilinen bu effektör RNA’ lar, RNA uyarıcı protein kompleksi ile etkileşir (RNA inducing silencing protein compleks; RISC). Bu protein kompleksi, siRNA’nın bir ipliğini lider sekans olarak kullanarak, hedef homolog RNA’ları kesmektedir. Bitkilerde, RNAi hücre savunmasında rol oynar; virus infeksiyonundan, transpozonlardan (sıçrayıcı gen) ve tekrarlayıcı sekansların uygun olmayan ifadelenmesinden, hücreyi korumaktadır. Memeli hücreleri de benzer savunma sistemine sahiptir. Bu endogenik RNA’lar, veya miRNA (microRNA ), dicer tarafından siRNA effektörlerine dönüştürülür ve çeşitli hücresel proseslerde örneğin, çoğalma, apoptozis ve farklılaşmada görev yapan genlerin ifadesinin düzenlenmesinde rol oynar. siRNA molekülleri, kimyasal olarak sentezlenip ekzogenik olarak memeli hücrelerine verildiğinde, hücresel RISC kompleksine maruz kalır ve siRNA’ya homolog olan RNA’ların parçalanmasına aracılık eder (3). RNAi, gen işleyişinin validasyonu ve hızlı identifikasyonunda, hedef ilaç keşfinde, biyolojik kaynak olarak devrim yapmış, hatta 2002 yılında, “Science Magazine” tarafından “yılın keşfi” olarak nitelendirilmiştir ve bazı şirketler, RNAi bazlı tedaviler geliştirme yönünde adımlar atmıştır (3). RNAi Tedavisinin Avantajları Spesifitesi Sekans bazlı gen inhibisyon teknolojilerinin potansiyel avantajlarından birisi, herhangi bir gen için tedavi amaçlı dizayn edilebilmesidir. Özellikle, tek bir allelde mutasyonla oluşan onkoloji ve genetik nörolojik hastalıklar alanında sadece defektif genin ifadelenmesini seçici olarak bloke etme fırsatı yaratılmıştır. Bunun yanında, tek bir polimorfizim ile ayırd edilebilen hedef sekansı identifiye etmek önemsiz değildir. Ayrıca, optimal siRNA’ nın hedef seçimi limitli olsada, RNAi aktivitesi önemli sayılmaktadır. Kanser ve nörolojik hedefler de, allele spesifik olacak kadar yeterli bir spesifiteye sahiptir (2). Şekil 3. Memeli sistemlerindeki RNA interference mekanizması (4) Potansiyel Etkinliği Optimal dizaynı ve hedef sekans seçiminde kurallardaki farklılıklardan dolayı gen inhibisyon teknolojisinin etkinliğini direk olarak karşılaştırmak zor olmakla birlikte, RNAi bazlı inhibisyon, antisens oligonükleotidler ile başarılmış çalışmalardan daha etkindir (2). Değişkenliği RNAi hedef bölgelerini identifiye etme kolaylığı, RNAi’ nin süper etkinliği ile ilişkili olabilir. Optimal RNAi etkinliliği için gerekli olan kurallar saptanmış olsa da, CG içeriği ve 3’ uçlarının kompozisyonu temel parametreler olarak karşımıza çıkmaktadır. Diğer yandan, ribozim ve antisens oligonükleotid hedef sekanslarını identifiye etmek, kesim için gerekli olan özel sekans motiflerinin uygunluğu ile sınırlandırılmıştır. Bir grup gende bulunan multipli sekansları uyarabilen RNAi – bazlı inhibisyon ile değişkenlik daha kolaydır (2). RNAi Tedavisinde Öne Çıkan Noktalar Hücreye İletimi Hücreye verilim problemi, sadece RNAi tedaviye özgü değildir fakat, RNAi bazlı ilaçların klinik olarak kullanımına önemli bir engel olarak görülmemektedir(2). RNAi Effektörleri RNAi effektörleri, 2 farklı yaklaşımla hücreye verilmektedir. İlki, laboratuvarda sentezlenmiş siRNA’lar bir ilaç gibi verilir. Diğeri ise, gen terapi yaklaşımı yani, shRNA (small hairpin RNA) kodlayan DNA, hücrelere verilir ve böylece shRNA’ nın hücre içi ifadelenmesi başlatılmış olur. Daha sonra shRNA’ lar, konukçu hücre tarafından aktif siRNA’ ya dönüştürülür. DNA yaklaşımının potansiyel avantajı, verilen plasmid DNA’ların yüksek stabilite içermesidir yani, her bireysel DNA kalıbından sentezlenmiş olan shRNA’ ların büyük miktarını içeren hücresel amplifikasyon basamağından oluşmaktadır. İlaveten, ister genoma integre olan, ister epizomal formda replike olabilen DNA’ yı stabil ifade vektörü şeklinde vermek de mümkündür (2). Lokal Verilimi Antisens ilaçların başarılı lokal uygulamasına en iyi örnek olarak “göz” verilebilir. Göz içine direk olarak siRNA’ların lokal injeksiyonu ile, yaşla ilişkili oluşan makular dejenerasyonun RNAi bazlı tedavisi geliştirilmiş ve ayrıca, merkezi sinir sistemi içine direk iletimi de mümkündür (2). Sistemik İletimi Sistemik verilim, siRNA’nın stabilizasyonuna, effektörün istenen dokuyu hedef alması ve hücresel alınımın kolaylığına gereksinim duyar. siRNA ilaçlarının hücresel alınımı ve stabilitesini geliştirmek için gerekli olan yaklaşımlar, nükleik asitin kimyasal değişimi ve koruyucu partiküller içine effektörün çeşitli yöntemler ile paketlenmesini içeren antisens oligonükleotid uygulaması için de geçerlidir. Effektörün özel hücre tiplerini hedef alması için, farklı ligand ve antikorların RNAi effektörü ile konjuge olması gereklidir. Viral vektörlerin kullanımı, RNAi effektörünün sistemik verilmesi için kullanılabilir fakat, viral vektörler klinik olarak hücreye iletilmesi için gerekli olan dokuya spesifik tropizm ve transdüksiyonu sağlasa da, her tip viral vektör, risk ve güvenlik sorunlarını beraberinde getirmektedir (2). Güvenlik İstenen etkilerin oranını en üst düzeye çıkarmak, her tedavinin ana temelini oluşturur. Kemoterapi, interferens tedavisi ve yüksek oranda aktif antiretroviral tedavilerde bu oran ideal değildir ve tedavi ile birlikte toksisite önemli bir seviyeye ulaşabilir. RNAi, hedeflenen genin spesifitesini arttırma yetisine sahip olurken, hücrenin herhangi bir ekzogenik (siRNA veya iletim ajanı) moleküle maruz kalması, normal hücresel işleyişini bozabilir (2). Hedef Dışı Etkileri Spesifite, en önemli avantajlardan biri olmasına karşın, hedef dışındaki etkileri hala sorundur çünkü, genin inhibisyonunda aracılık eden siRNA’ların minumum homoloji seviyesini saptayan parametreler henüz bilinmemektedir. İnhibisyon sonucunda siRNA’nın sekansına bağlı olarak tek iplikli RNA ile 11 baz çiftlik bir homoloji gösterdiği bulunmuştur (2). Spesifik Olmayan Etkileri Spesifik olmayan etkileri konusunda RNAi için toksisite 2 kattır. Çünkü, hem hücreye verilmesi hem de siRNA’nın kendisi beklenmedik hücresel tepkiler doğurabilir. İlk olarak, bazı katyonik lipozomlar, siRNA’nın hücreye verilmesinde kullanılmış ve interferon molekülleri uyarılmış; aynı şekilde, shRNA ifade kasetlerini hücre içine transport etmek için kullanılacak herhangi bir viral vektör, istenmeyen bir tepki ile karşılaşabilir. İkinci olarak, siRNA effektörlerinin kendileri, çift iplikli RNA hücresel savunma mekanizmasını tetikleyebilir. Bazı durumlarda, terapi için interferon indüksiyonu yararlı olmasına karşın; başlangıç defans mekanizmasının kontrolden çıkması durumunda sitotoksik olabilmekte ve bu yüzden sorun yaratmaktadır. Son yıllardaki çalışmalar, siRNA’nın interferonu uyarması ile oluşan farklılıkları sistematik olarak analize etmeye başlamıştır. Örneğin, interferon sinyalini uyaran bir siRNA effektörünün içeriğinde,"tehlikeli motif" olarak adlandırılmış 9 baz çifti identifiye edilmiş ve interferon indüksiyonunu başlatan siRNA’nın 5’ fosfat ucu olduğu belirlenmiştir (2). Stabilitesi Bazı veriler siRNA’nın, serumda ve memeli hücrelerinde antisens oligonükleotid ve ribozimlerden daha stabil olduğunu gösterse de, birçok araştırma in vivo’da siRNA’nın yarı ömrünü arttımak için siRNA’nın farmokinetik özelliğini değiştirmeyi hedeflemiştir. Özellikle, geniş spektrumlu kimyasal modifikasyonlar ile uyumlu siRNA’ların gen ekspresiyonunu inhibe ettiği kanıtlanmıştır. Araştırmacılar, enjekte edilen siRNA’nın %1’inden daha azının hedef organa ulaştığını kaydetmişlerdir (2). Tedavi Amaçlı Uygulamaları Viral İnfeksiyon Birçok şirket viral infeksiyonu inhibe etmek için, RNAi bazlı tedaviler geliştirmeye başlamışlardır (2). Hedeflenen Viral RNA’lar Birçok makalede, invivo ve invitro’da birçok virusun replikasyonunu veya ekspresiyonunu inhibe etmek için virusa spesifik siRNA’ların kullanıldığı belirtilmiştir. Özellikle RNAi’nın potansiyel antiviral yararları üzerine araştırmalar, HIV ve Hepatit viruslarına ışık tutmuştur. Her özelliği tanımlanmış HBV (hepatit B virusu)fare modelleri bu viruslara popüler bir hedef konsepti hazırlamıştır. Başlangıçta invivo’da transfeksiyon deneyleri, fare karaciğerine HBV’ ye spesifik siRNA ve HBV ekspresiyon plazmidlerinin aynı anda verilmesinin HBV’ nin gen ekspresiyonunu ve replikasyonunu bloke ettiğini ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmaları genişletmek için, araştırıcılar fare modellerini kullanarak HBV tedavisi için, RNAi’ nin ileri tedavi etkinliğini incelemişlerdir. Bazı viral RNA’lar, baskılanmaya dirençlidir ve HIV’ e benzer bazı memeli virusları, RNAi aktivitesini engelleyen proteinlere sahiptir. HBV konusunda, RNAi effektörlerinin, viral gen ekspresiyonu ve replikasyonunu bloke ettiği görülmüştür. Aynı şekilde İnfluenza virusunun inhibisyonu, coxsackievirus B3 ve respiratör syncytial virus infeksiyonları, farede infeksiyon oluşumundan sonra verilen siRNA ile inhibe olmuşlardır (2). Konukçu Hücre Genlerinin Hedeflenmesi Bunun nedeni, virusların siRNA’lar kendi genomlarını hedeflediklerinde hızlı bir şekilde kaçış mutasyonları oluşturmasıdır; diğer bir potansiyel RNAi antiviral strateji ise, infeksiyonu devam ettiren hücresel faktörlerin ekspresiyonunu inhibe etmeye yöneliktir. Özellikle CD4 ve CCR5 gibi, HIV hücresel reseptörlerinden inhibisyon için yararlanılmaktadır. Viral temizlik için etkinliğe göre RNAi’nin viral RNA’ları parçalaması, viral infeksiyonu tamamen elemine etmeye benzemez. Eğer, konukçu immün yanıt, infeksiyon ile başarılı bir şekilde mücadele ederse, viral replikasyon ve virusun yayılması etkili bir şekilde azaltılmakta, böylece etkili bir antiviral olduğu kanıtlanmış olmaktadır. Örneğin, HBV konusunda, hatta kronik olarak infekte olmuş hastalarda infeksiyon süresince virusa spesifik sitotoksik T-lenfosit üretimi sürmektedir. Bu immün yanıt, virusu temizlemek için güçlü olmasa bile, HBV antijenlerini ifadeleyen hücreleri yok etmektedir (2). Nörolojik Hastalıklar Parkinson, hungtington, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) ve spinobulbar muscular atropi, RNAi bazlı terapilerin yararlı olduğunu kanıtlayan sinirsel hastalıkların önde gelenlerindendir. Sekansa spesifik RNAi’ ler, mutant olan hedef genin ifadesini bloke etmektedir. Örneğin, siRNA’ lar, ALS modelinde gösterilmiş mutant ve yabani tip RNA’lar arasındaki farklılıkları tek nükleotidte fark eder. ALS, tedavisi olmayan letal bir motor nöronun dejenere olduğu bir hastalık olup, Cu/Zn süperoksid dismutazı (SOD1) kodlayan gende tek bir nükleotid’teki mutasyon sonucu oluşmaktadır. Diğer bir örnek, Alzheirmer, β – amiloid üretiminde artış ile tetiklenir. β amiloid , β sekretaz (BACE1) tarafından kesilir ve bu enzim, hastaların beyinlerinde yüksek seviyede regüle edilir. β-sekretazın regülasyonunu inhibe eden siRNA’lar, işleyişi bloke eder. Bunu kanıtlamak için, Kao adında bir araştırıcı primer fare nöronlarında β sekretaz ekspresiyonunu bloke etmiş ve böylece, β amiloid üretiminde azalma gözlemlemiştir (2). İnflamasyon ve Apoptozis Bazı hastalıklarda hücresel proseslerin aktivasyonunun neden olduğu patoloji gözlemlenmiş hatta bunun gelişiminde önemli rol oynayan kilit moleküllerin hedeflenmesi ile hücresel proseslerin kontrol altına alınması anlamında RNAi tedavisi yarar sağlayabilmiştir. Örneğin, Tümör nekrozis faktör (TNF-α ), rheumatoid arthritisin kronik patojenitesinde gerekli olan pro-inflatör sitokindir. TNF- α işleyişini bloke etmede kullanılan ilaçlar, inflamasyonun azalmasında etkili olduğu ve hastalığın yavaşladığı gözlemlenmiştir. Bazı riskler tabiki mevcuttur, TNF - α bloke edicilerin kullanılması ile ilişkili ciddi infeksiyonlar, lenfoma, sistemik eritomozus gibi hastalıklarda risk unsuru bulunmuştur. Son yıllarda lokal injeksiyon ve TNF- α’ ya spesifik siRNA’ların elektroporasyonu, faredeki paw inflamasyonunu inhibe ettiği görülmüştür (2). siRNA Gen ifadelenmesini spesifik olarak kesintiye uğratan moleküller, güçlü araştırma kaynaklarıdır. Bu moleküllerin gelişimine yönelik çalışmalar sonucunda farklı potansiyelde ajanlar ortaya çıkmıştır. siRNA’ lar, sekansa spesifik silencing ajanı olarak ortaya çıkan en son keşiftir. Çoğu kilit organizmanın sekansı ortaya konmuş ve nükleik asit bazlı yaklaşımlarla gen işleyişinin incelenmesi için fırsat doğurmuştur. Bu nükleik asit molekülleri, tedavi amaçlı olarak geliştirilmiş ve hastalığa sebep olan virusları hedef almıştır. siRNA’ lar, RNAi yol izinin effektör molekülleridir. Nematodlardaki RNAi’nın keşfi, bitkilerde post-transkripsiyonel gen silencing ve funguslarda "Quelling" gibi prosesler dubleks – RNA ile tetiklenir. Uygulamalarda, uzun dubleks RNA’ lar kullanılmış fakat, bu RNA’ lar çoğu memeli hücreleri için etkin değildir çünkü, antiviral interferon (IFN) yanıtını uyarmaktadır. Antiviral interferon yanıtı, hücre ölümüne neden olur. Farklı organizmalarda var olan RNAi mekanizmasının genetik ve biyokimyasal incelemeleri, bu hücresel mekanizmanın korunduğu gerçeğini ortaya koymaktadır. Bu mekanizma, dubleks RNA’yı keserek 21-28 nükleotid uzunluğundaki, siRNA’ya dönüştürür ve bu siRNA mRNA’ların sekansa spesifik degredasyonuna yol açmaktadır (5). Nükleik – Asit Bazlı Gen Silencing mRNA’ ların spesifik sekanslarını hedefleyerek gen ifadesini inhibe edecek birkaç farklı molekül istenilen düzeyde dizayn edilebilir. Başlıca 3 tip nükleik asit bazlı gen silencing molekülü vardır. Bunlar, kimyasal olarak modifiye olmuş antisens oligodeoksiribonükleik asitler (ODN ), ribozim ve siRNA’lardır (5). Tablo 1. İnvivo'da test edilmiş anti-kanser RNAi hedefleri i.v: intravenöz, i.t: intratumoral, hd: hidrodinamik infeksiyon CEACAM 6: karsinoembriyonik antijen ile ilişkili adhezyon molekül 6 ATA: aurintrikarboksilik asit (3). Antisens ipliği (kırmızı çizgi) içeren RISC’lerin oranını etkileyen siRNA veya siRNA’ların sens ipliklerinin ilk birkaç baz çiftinin termodinamik stabilitesi. Sens ipliğin 5’ ucundaki yüksek termodinamik stabilite (yeşil kutucuk) ile antisens ipliğin 5’ ucundaki düşük termodinamik stabilite (mavi kutucuk) karşılaştırıldığında termodinamik stabilite ile ilişkili olarak antisens iplik RISC ile etkileşime girmek için daha yatkındır. Antisens ipliği içeren birden fazla RISC daha fazla etkili siRNA demektir ve sens ipliğin neden olduğu hedef dışındaki etkinlik şansını azaltmış olur. siRNA’ların 3’ ucundan çok 5’ ucu hedef tanımada etkin rol almaktadırsiRNA ve mRNA ‘nın 5’ ucundan devam eden en az 11 – 14 baz çiftinde hedef genin baskılandığı gözlemlenmiştir. Bir siRNA için minimal substrat merkezinde 13 nükleotidten oluşmaktadır (5). Şekildeki turuncu renkli üçgen; mRNA’nın kesim bölgesini, nt; nükleotid, RISC; RNA’ca indüklenen silencing compleks, siRNA; small interfering RNA. Şekil 4. Etkili ve spesifik siRNA ‘nın özellikleri ODN: Genellikle 20 nükleotid uzunluğunda olup, pre-mRNA ve mRNA’ya hibridize olarak ribonükleaz-H için bir substrat oluştururlar. Bu enzim, RNA – DNA dublekslerinden, RNA ipliğini degrede eder. RNAaz-H aktivitesini engellemek için, modifiye olmuş ODN’ler mRNA’ların translasyonunu veya pre-mRNA’nın kesilmesine mani olmaktadır. ODN’ ler ve modifikasyonları bu yüzden, çift iplikli DNA’yı hedef alarak, 3’ lü heliks oluşumu ile transkripsiyonu inhibe etmek için kullanılmaktadır (5). Uzun çift iplikli RNA (dsRNA) RNAaz pol III enzimi olan Dicer tarafından tanınır ve 21 – 23 nükleotid uzunluğundaki siRNA dublekslerine dönüştürülür (1). Sentetik siRNA (2) veya endogenik siRNA ‘lar (3) RISC ile etkileşirler bundan dolayı Dicer prosesi bypass olmuş olur. siRNA’ lar multiprotein kompleksi olan RISC ile etkileşir (4). RISC kompleksindeki bir helikaz siRNA dubleksini açar ve tek iplikli siRNA’yı içeren RISC mRNA’ya komplementerize olur (5). (6) RISC içinde identifiye olmamış bir RNAaz (silecer) mRNA‘ yı degrede eder (6). Şekil 5. siRNA ‘nın mekanizması Ribozimler: Ribozimler, RNA’ya Watson – Crick modeli ile bağlanır ve fosfodiester bağlarının hidrolizini katalizleyerek, hedef RNA’yı degrede etmektedir. Ribozimler birkaç sınıf olup, en çok kullanılan “çekiç başlı“ adı ile anılan hammerhead ribozimlerdir. Hedef mRNA’ya hibridize olduğunda, tek bir sekonder yapı oluştururlar. Ribozimlerde katalitik olarak önemli parçalar, hedef RNA kesim bölgesinin içinde bulunduğu hedef – komplementer sekans ilişkisi ile bağlantılıdır. Ribozim ile kesim magnezyum gibi divalent iyonlara, hedef RNA yapısına ve hedefe ulaşılabilirliğine gereksinim duyar. Hücre içinde bu hedef RNA ile ribozimin birlikte lokalizasyonu, silencing etkinliğini arttırıcı sinyaller doğurur. Hammerhead ribozimler, kimyasal olarak sentezlenmesi veya vektörlerden transkribe olabilmesi için yeteri kadar kısadır ve hücre de ribozimin devamlı üretimine olanak sağlar (5). siRNA: RNAaz III (Dicer)enzimi ile dubleks RNA’nın stoplazmik prosesinden türevlenmiştir. Dicer, uzun dubleks RNA’yı keserek, 21-28 nükleotid’lik bir siRNA dubleksini oluşturur. Bu dubleks, 5’ fosfat ucunda 2-nükleotid eksik iken, 3’ hidoksil (OH) ucunda 2-nükleotid fazla şeklindedir. RNAi mekanizmasının bileşenleri spesifik olarak siRNA’yı tanır ve (RISC) RNA-uyarıcı silencing kompleksi olarak bilinen protein kompleksi ile siRNA’nın tek ipliği ilişkiye girer. mRNA’ları kesen RISC kompleksi, tek iplikli siRNA’nın 5’ ucundaki 10 nükleotide komplementer sekanslar içerir. Ribozimler gibi, siRNA ‘lar da sentetik olarak üretilebilir veya transkribe olan kısa çift iplikli hairpine benzer RNA’lar vektörlerden ifadelenip, daha sonra siRNA’ya dönüşmektedir. siRNA’lar, ODN ve ribozimler gibi memelilerde hedef pre-mRNA’nın degredasyonunda etkin değildir. Birkaç organizmanın, kromatin modifikasyonlarını ve transkripsiyonel olarak bloke edici genlerini hedef almak için, RNAi ile ilişkili mekanizmaları kullandığı hakkında deliller ortaya çıkmıştır. siRNA’lar, kod oluşturmayan RNA molekülleri olan miRNA’lara benzerler. Bu miRNA’lar, gen ekspresiyonunu regüle etmek için hücreler tarafından doğal olarak kullanılır. Olgun bir miRNA tek iplikli 21-22 nükleotid uzunluğunda ve stoplazmada, 70 nükleotid’lik hairpinden meydana gelir. Olgun miRNA ‘lar, protein kompleksi (miRNP) ile ilişkiye girmekte ve bu kompleks ribozom ile ilişkili olup, miRNA’ya bir kısım komplementer sekanslar içeren mRNA’ların translasyonunu inhibe etmektedir. Mükemmel bir substrat ile sıkı bir komplementerlik oluşursa , miRNA , siRNA gibi davranıp , mRNA degredasyonuna aracılık etmektedir (5). Gen Silencing Yaklaşımlarının Karşılaştırılması Bazı araştırıcılar, kültür modellerinde ODN ve siRNA’nın aracılık yaptığı gen tutuklanmasının farklı yönlerini karşılaştırmışlardır. Bu çalışmalardan çıkan sonuçlar pek belirgin değildir, çünkü gen tutuklanmasının etkinliği, ajanın konsantrasyonuna, transfeksiyon tekniğine, hücre tipine, hedef bölge seçimine, kimyasal modifikasyonlarına ve analize edilecek bilgilerin süresine bağlıdır. RNA’ya bağlanan proteinler ve mRNA’da oluşan tersiyer, quarterner yapılar, ODN’ ler ile hedef RNA molekülü arasındaki hibridizasyonu etkilediği ve bu varyasyonların siRNA’ların etkisini etkilediğine inanan araştırıcılar incelemelere başlamışlardır. Bu çalışmaların çoğunda, mRNA üzerindeki hedef pozisyonuna bağlı olarak ODN ve siRNA’ların etkinliği arasında bir korelasyon bulunmuştur. Modifiye olmuş fosfotiat ODN’ ler toksik olabilir, çünkü, endogenik proteinlere bağlanarak spesifik olmayan bir tavır sergilemektedirler. CpG (sitidin fosfat guanozin) motifi içeren ODN’ ler, IFN’nun ifadesini veya diğer başka immün yanıtta oluşan molekülleri uyardığı görülmüştür. Bu uyarı, Toll – Like reseptör (TLR)’ e bağlanılması ile oluşur. ODN’lerin bu spesifik olmayan özelliği, bazı ODN’lerin tedavi amaçlı olması sonucunda keşfedilmiştir. Ribozimler, ODN’ ler gibi hedeflerine herhangi bir molekülün yardımı olmaksızın hibridize olurlar ve bu hibridizasyon, genlerin baskılanması için ihtiyaç duyulan yüksek konsantrasyon ile ilişkilidir ayrıca, kimyasal olarak modifiye olmuş ribozimler spesifik olmayan etkiler oluştururlar. RNA lokalizasyon sinyallerinden yararlanma veye RNA şaperon’ ları bu problemi çözebilir. Böylece, ribozimin düşük konsantrasyonu ile ilişkili etkili bir gen baskılanmasını sağlamaktadırlar. En son bilgiler, insan ve farelerde ifadelenen TLR’ nin, üridin / guanozin veya üridin bakımından zengin olan tek iplikli RNA oligonükleotidler tarafından aktivite olduğunu ispatlamıştır (5). Tek iplikli RNA ile bu TLR ‘lerin aktivasyonu, plazmositoid dendritik hücrelerin endozomal kısımlarında oluştuğu ve böylece, IFN – γ ve diğer sitokinlerin ifadelenmesine neden olduğu görülmüştür. Kimyasal olarak modifiye olmuş siRNA veya ribozimler, invivo’da hücreye verilip denature olduğunda, siRNA sekansına bağlı olarak, bu özel TLR’leri aktive etmekdedir. Etkili bir gen baskılanması sağlamak için gerekli olan, siRNA’nın düşük konsantrasyonudur. Buna bağlı olarak siRNA’lar spesifik ve hızlı bir şekilde RISC kompleks ile etkileşmekte böylece, spesifik olmayan proteinlere bağlanma potansiyeli azalmaktadır. Bazı çalışmalar, normal konsantrasyondaki siRNA’ların transfeksiyonunun, gen ekspresiyonunda spesifik olmayan global etkilere neden olmadığını göstermiştir. Memelilerdeki RNAi uygulamaları, gen ekspresiyonunu spesifik olmayan şekilde etkiler, tabiki siRNA konsantrasyonuna, hücre tipine, siRNA ekspresiyonunun moduna ve ajanın hücreye veriliş şekline de bağlıdır. Bu spesifik olmayan etkiler, IFN yanıtının oluşmasından sorumlu genlerin stimülasyonunu içerir hatta, bu çalışmalardaki IFN’yi oluşturan genlerin indüksiyonu, hücresel büyümeyi engellemesede böyledir. Eğer, tam bir IFN yanıtı oluşursa, büyümeyi engelleyebilir. Uzun dubleks RNA ile transfekte olmuş, veya IFN tip 1 ile yada yüksek konsantrasyondaki siRNA ile tedavi edilmiş HeLa hücrelerinin mikroarray gen profillerinin bir kısmı birbiri ile çakışmaktadır. Bu çalışmalarda, tedavi ve araştırma çalışmalarındaki siRNA uygulamalarının potansiyel yan etkileri belirlenmiş ve tanımlanmış efektif siRNA’ların önemi üzerinde durulmuştur. Gen baskılanması için mümkün olan en düşük konsantrasyon kullanılmalıdır. Farelerin, kısa RNA hairpini üreten vektörler ile tedavi edildiğinde, IFN oluşturan genleri uyarması çok ilginç bulunmuştur. Spesifik olmayan etkileri yanında, nükleik asit bazlı gen baskılayan moleküller, hedefin etkilerini bloke etmeye hazırdır. Hedef etkilerinin yok edilme seviyesi, nükleik asit hibridinin stabilitesine ve baskının moduna bağlıdır. ODN’ler, hedef etkisini bloke etmeye eğilimlidir, çünkü 6 veya 7 sıralı DNA / RNA baz çiftleri RNAaz-H tarafından tanınmaktadır. Bu problemi çözmek için, antisens oligonükleotid gamper adında bir yapı geliştirilmiş, böylece ODN’lerin yaklaşık 10 nükleotidinden sadece bir tanesi RNAaz – H yanıtı göstermiştir. siRNA’lar dikkatlice seçilmez ise, bir mRNA hedefine kısmen komplementer olan siRNA’lar , endogenik miRNA’lar gibi davranıp translasyonu baskılar. Aynı transkripte karşı hedeflenmiş farklı siRNA’lar ile oluşmuş gen ekspresiyon profilleri karşılaştırıldığında, hem siRNA hem de mRNA ipliklerinin 5’ uçları arasındaki en az 11 – 14 nükleotidlik komplementerlik, transkript düzeyinde hızlı bir düşüşe sebebiyet verir. Antisens sekanslar olarak seçilmiş ODN, ribozim DNAzim ve siRNA’ lar, seçici olarak tek bir nükleotid ile hedefi diğerlerinden ayırabilir (5). siRNA’ların Hücrelere Verilimi ODN’ler ve ribozimler, farklı stratejiler kullanarak in vivo’da başarılı bir şekilde hücrelere verilir. Klinik denemelerde, ODN’lerin en popüler modu, intravenöz injeksiyonudur. siRNA-, siRNA üreten plasmid veya siRNA üreten virüslerin memeli model organizmalara verilmesinde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır (5). Bu yöntemler içinde, elektroporasyon ve hem lokal hem de sistemik injeksiyonu yer almaktadır. Çok etkili bir silencing için hücreye verilim yöntemi hakkında genelleme yapmak zordur çünkü hücre içine injeksiyonda, farklı dokuların farklı istekleri söz konusudur. Özellikle farklı boyutlardaki hücreler için fare dokularına siRNA’ ların verilmesinde ilk prosedür, fizyolojik solusyondaki siRNA’ ların, damar ucuna injeksiyonudur. Bu yöntem ile karaciğerde %90 oranında hedef gen ekspresiyonunun azaldığı görülmüştür. Bu oran akciğer, böbrek ve pankreas’ta daha azdır. Silencing süresi, 1 haftadan fazla sürer ve silencing seviyesi tam net değildir çünkü hayvandan hayvana varyasyonlar mevcuttur. siRNA üreten virusların gelişmesi, özellikle insan hastalıkları için gen terapinin alternatif modudur. Birkaç çeşit virus, siRNA’ların üretimi için dizayn edilir. Virus çoğunlukla epizomal form’da bulunur yani, konukçu genomuna entegre olması düşüktür. siRNA üreten AAV (Adeno associated vektör)’nin fare beyni içine injeksiyonundan 7 hafta sonra etkili bir silencing sonucu alınmıştır. siRNA üreten Adenovirusun fare karaciğerine damar yolu ile veya fare beynine direk injeksiyonu ile verilimi gen ekspresiyonunda etkili bir baskılanma yaratmıştır. siRNA’lar tedavi amaçlı deneylerde kullanılıcaksa, in vivo’da siRNA’ların hücreye verilmesinde pozitif sonuç elde edilmesi ve Amerika’da FDA tarafından “yetim ilaç” statüsü verdiği kimyasal olarak modifiye edilmiş ODN’lerin hücreye verilimini de kapsayan yöntemler için çalışmaların sürdürülmesi gerekmektedir. Son yıllarda ODN’lerin de içinde bulunduğu birkaç makromolekülün transdermal penetrasyonunu sağlayacak küçük moleküller keşfedilmiş. Akciğerler içine gen enjeksiyonu için kullanılmış aerosol yöntemler, yakın gelecekte siRNA’ların hücrelere iletiminde de benzer şekilde kullanılacaktır (5). siRNA Bazlı Tedaviler Birkaç ODN ve ribozim molekülleri klinik denemelerde test edilmiştir. Gözdeki sitomegalovirusun infeksiyonunun tedavisi için, FDA tarafından onaylanmış bir antisens ODN (fomivirsen) geliştirilmiştir. Klinik deneylerde kullanılmış antisens oligonükleotidlerin çoğu, modifiye olmuş fosforatiat ODN veya "gamper" dedikleri ODN’lerdir (5). Fakat bunların hedef RNA’lara afinitesi düşük ve yüksek konsantrasyonda toksisiteye neden olan problemleri vardır. Kimyasal modifikasyonların tiplerini içeren ikinci generasyon antisens oluşumlar, klinik deneylerde kullanılmış ve fosforatiat ODN’ ler den daha yararlı olduğu görülmüş. Son çıkan yayınların içerikleri bu farklı ilaçlardan ve onların hedeflerinden bahsetmektedir. siRNA ve onların memeli hücrelerindeki fonksiyonları 3 yıl önce keşfedilmiş fakat henüz klinik denemelerde kullanılması çok erkendir. Klinik programların gelişimi üzerine siRNA bazlı şirketlerin kurulmasından sonra siRNA, tedavi amaçlı gelişimde ODN ve ribozimleri hızlı bir şekilde yakalamıştır. Birkaç deneme siRNA’nın tedavi amaçlı potansiyel yetisini göstermiş; fulminant hepatitlerden, viral infeksiyondan, sepsisden, tümör gelişiminden ve macular dejenerasyondan fareleri koruduğu kanıtlanmış. Yüksek basınç ile damar ucundan verilen siRNA’lar, fare karaciğer hücrelerinde etkilidir hatta, bir grup araştırıcı, çeşitli karaciğer hastalıkları için tedavi amaçlı ajan olarak siRNA’nın potansiyelini test etmişlerdir (5). Karaciğerde ifadelenen apoptozis ile ilgili genler olan caspase 8 ve FAS hücre ölüm reseptörlerinin hedeflenmesi ile fare karaciğerini, çeşitli ajanlar tarafından uyarılmış ani gelişen hastalıklardan korumuştur. Diğer bir grup araştırmacı, virus tarafından direk olarak meydana gelen Hepatit B (HBV) infeksiyonunun tedavisi için siRNA’ların tedavi amaçlı potansiyelinin olup olmadığını araştırmıştır. Protein üretimi ve viral replikasyonu etkili bir şekilde azaltmak için, HBV genomunun bazı kısımlarını hedefleyen siRNA’lar hücrelere verilmiştir (5). siRNA virus oranını azaltsada, infeksiyonu sonlandırıcı etkisi başarısızlıkla sonuçlanmıştır. Bu sonuçlar, siRNA’ların tedavi amaçlı potansiyelini ve uygulamalar için pozitif sonuçlar doğurabilecek yöntemler üzerinde çalışmaların yoğunlaşması gerekliliğini göstermiştir. Nükleik asit bazlı gen baskılanmasının etkinliğini optimize etmek için, birkaç parametreyi incelemek gerekmektedir. Silencing molekül, dokudaki gibi dolaşım sisteminde de stabil olmalı ve toksik etki yaratmadan kan proteinlerine bağlanmalı ancak boşaltım sistemine girmemelidir. Nükleazların etkini azaltmak için kimyasal olarak modifiye olmuş nükleik asitlerin identifikasyonu üzerine denemeler gerçekleşmiş ve bu gerçekleşen denemeler ile tedavi amaçlı gen silencing kullanım sağlanmıştır. Sistemik verilim için yapılan, yapılması gerekli olan oluşumlar, klinik denemelerde modifiye edilmiş fosforatiat ODN’ler için açıklanmıştır. Modifikasyon ODN’nin hedef RNA’sına olan afinitesini azaltsa da in vivoda, stabilite, hücre içinde kalma ve hücresel alınımlarının gelişmesi ile moleküllerin etkinliğini arttırmış. Fosforatiat modifikasyonlar ODN’ lerin kan proteinlerine afinitesini arttırır ve nükleazların aktivitesinden ODN’ leri uzak tutar. Tek iplikli spesifik endonükleazlardan korunmuş, siRNA dubleksleri, serumda hem ODN hem de ribozimlerden daha stabildir. Modifiye olmamış siRNA’lar hücreler tarafından tam olarak alınmaz, hatta kan proteinleri için etkili bir afiniteye sahip olmazlar. siRNA’lar tedavi amaçlı kullanılacak ise, modifiye edilirler. Virusların kullanımını içeren gen terapi bazlı platformlar hariçtir. siRNA’ların modifikasyonu, siRNA’nın RISC kompleksi ile etkileşimini engeller (helikaz aktivitesi ile siRNA dubleksinin açılması hedef kesme oranı ve ürün oluşumunu etkiler). Bazı araştırıcılar, iyi bir silencing etkisi yaratıcı ayrıca, siRNA stabilitesini arttırıcı kimyasal modifikasyonları identifiye etmeye başlamışlar. Fosforatiat modifikasyonları siRNA dublekslerini tolere edebilirler ve siRNA’ ların hücresel alınımlarını kolaylaştırırlar. İn vivo’da kimyasal olarak modifiye olmuş siRNA’ ların etkinliği üzerine bir gelişme yoktur. siRNA’ların yapılarına spesifik olan nükleik asit modifikasyonlarının yeni tiplerini geliştirmek için girişimler başlamıştır (5). miRNA miRNA’lar küçük RNA’nın ikinci sınıfıdır. Bitki ve hayvan genomlarının protein kodu oluşturmayan bölgelerinde kodlanır ve Dicer tarafından proses edilir. miRNA’lar RISC’e benzer bir kompleks ile etkileşirler. Hedef mRNA’ya komplementerizasyon derecesine bağlı olarak translasyonel baskılama veye mRNA kesimi oluşmaktadır (7). Bu gizli genlerin çoğu kod oluşturmayan RNA’ lardır ve protein için kod veya open reading frame (ORF) içermezler (8). Yaklaşık 22 nükleotidlik RNA‘lardır ve RNAi yol izinde gen ekspresiyonunu regüle ederler. miRNA’lar, RNA pol II tarafından (pri – miRNA) primer transkript olarak meydana gelirler. Bu tanskriptler ORF içersin ya da içermesin, splice edilir, poliadenillenir ve mRNA’lara benzerler. Bir intron veya ekzonda lokalize olmuş stem loop yapısı, fonksiyonel komponenttir. Örneğin miRNA genleri olan mir -106b, mir – 93 ve mir-25 protein kodlayan genin intronunda lokalize olmuşlardır. Stem loop yapısı ribonükleaz olan Drosha ve Dicer tarafından proses edilip, olgun miRNA oluştururlar. Bu RNA, RISC kompleksi ile etkileşir ve bu kompleks mRNA’ların baskılanmasını yönlendirir. İnsanda identifiye edilmiş miRNA genlerinin sayısı 300’den yüksek olup, hücre bölünmelerinde ve gelişimsel proseslerde rol alırlar (8). miRNA Genlerinin Kanserdeki Genomik Değişimler ile ilişkisi İnsan miRNA’ların çoğu genomlardaki kırılma noktalarının hemen yakınlarında lokalize oldukları görülmüştür (8). Örneğin, kromozom 13q14’teki delesyon yıllardır çalışılmaktadır, kronik lenfosit lenfoma ve birkaç tümörün oluşumuna neden olmaktadır. Bu lokustaki kansere neden olan şüpheli genlerin çoğu, miRNA diziliminden oluşur. Bu dizilim, mir - 15a ve mir – 16 – 1 içermektedir. Acaba, bu miRNA’ların delesyonu tümör oluşumunu nasıl etkiler? En son datalar, hem miR-15a ve miR-16, anti – apoptik gen olan BCL-2 genini hedeflemesi ile normal apoptik bir yanıt meydana getirdiğini göstermiştir. Bu bakımdan, bu miRNA’ların tümör supresör olarak fonksiyon göstermesi ve limfoma hücrelerindeki miR – 15a – 16‘ nın yeniden ekspresiyonu, apoptozisi ilerlettiği görülmüş. Buna ilaveten, delesyonlar için miRNA lokusları haritalanmıştır. Bunun bir örneği, akciğer, baş, dil, B-hücre ve foliküler limfomada amplifiye edilmiş 13q31 kromozomu çok iyi bir şekilde çalışılmış. Chr13orf25 (kromozom 13, open reading frame 25) genin ifadelenmesi ile hastalıkların ilişkisi vardır. Bu gen protein oluşturmayan küçük ORF’ye sahiptir. Bu transkripteki miRNA öncüleri miR – 17, 18, 19a, 20, 19b ve 92‘ dir. Bu dizilerden 28 miRNA’ların ekspresiyonunun artması, primer limfomada ve tümör oluşturan hücrelerin meydana gelmesini tetikler. Tümör oluşumundaki bu miRNA’ların rolleri, Burkitt’in lenfoma için fare modelinde gösterilmiştir. Tablo – 2 Kanser genlerinin siRNA tedavileri (6) Kök Hücreler, miRNA’lar ve Kanser Bir tümördeki hücrelerin bazı bölümlerini inceleyen tümör oluşum modelinde kök hücre özelliklerine sahip oldukları meydana çıkmıştır (8). Bu kanser kök hücreleri, tümör oluşumunu başlatma ve sürdürme özelliğine sahiptir. Halbuki tümör’deki hücre yığınları bazı farklılıklar gösterip, tümorogenik değildirler. Bunun miRNA’lar ile ilişkisi nedir? Tümörler, kök hücrelerini andıran bir biçimde miRNA profili sergiler. Çoğu miRNA’ların ekspresiyonunu azaltırlar fakat miR–17-92 içeren kök hücre miRNA’ların ekspresiyonunu etkilemezler. RNAi ve kök hücrelerin devamlılığı arasında biyokimyasal bir ilişki vardır. Drosophila ve bitkilerde, kök hücre devamlılığı için RISC komponenti olan Argonaute gereklidir. Dicer – 1 ‘in mutasyonu tarafından miRNA fonksiyonunun kaybı, Drosophiladaki üreme kök hücrelerinin çoğalmasını azaltmıştır. Siklin bağımlı kinaz inhibitörü olan Dacapo’nun ekspresiyonundaki artış, G1 ve S fazı arasındaki tutuklanmaya yol açmıştır (8). Tahmin edilen miRNA hedef bölgeleri, Dacaponun 3’UTR (Translate edilmemiş) kısmında bulunur. Önemli olan bu bölgelerin kök hücrelerde eksprese olmuş miRNA’lara uygunluğudur. Bir S-faz indüksiyon regülatörü olan p27 – Kip1, Dacoponun insandaki homoloğudur. Bu gen memelilerdeki bir miRNA hedefi olup olmadığı bilinmiyor, eğer öyle ise, hücre çoğalmasını ilerletmek için onkogenik miRNA‘ nın ekspresiyonunu engelleyici bir gen sağlanmış olur. Tedavi Amaçlı miRNA’lar İnsandaki kanser için miRNA’lar anahtar yapılar sunarsa, potansiyel tedavi amaçlı olarak gözden geçirilir (8). Tedavi amaçlı molekül hücresel alınımı ve serumdaki stabilitesi için modifiye edilmiş nükleik asit özelliğinde olmalıdır. Bir grup araştırıcı, kültüre olmuş hücrelerde miRNA fonksiyonunun antisens inhibitörü olarak modifiye olmuş 2’-O-metil RNA’ların görev yaptığını gözlemlemişler. Bu moleküller miR – 17, 92 olan hedef onkogenik miRNA’lar için kullanılır. Tümör suppresör miRNA’lar konusunda istenilen tedavi amaçlı strateji hücrelerdeki fonksiyonlarını arttırmak için olabilir. Serumda stabilize olmuş pre – miRNA’lar bunu başarabilir. Buna bir örnek, per–let-7‘nin hücreye verilimi RAS ekspresiyonunu durdurarak tümörün ilerlememesine neden olmasıdır. Ribozim Katalitik RNA’lar olarak bilinen ribozimler, intraselüler ortamda aktivitelerini optimize etmek için dizayn edilirler (10). Aktif ribozimlerin kütüphanelerinin hücre içine verilmesi gen işleyişinin identifikasyonuna olanak sağlar. Gen işleyişini saptamak için siRNA kütüphanelerini baz alan RNA bazlı araçlara, ribozim teknolojisi bir alternatif sunmaktadır. Tablo 3. Hastalıklarda ve hayvanlarda miRNA’ların biyolojik fonksiyonları (9) Pri – miRNA ‘lar nukleusta transkribe olmaktadır (1). dsRNA’ya spesifik olan Drosha nukleustaki pri-miRNA ‘yı degrede ederek stoplazmaya verilmeden önce pre-miRNA’ya dönüştürür (2). Exp5 (exportion-5) pre-miRNA’ların nukleustan stoplazmaya geçişinden sorumludur (3). siRNA’lara benzer olarak miRNA’lar dicer tarafından olgun miRNA‘ ya dönüştürülür ve bir ipliği ribonükleoprotein kompleksi olan miRNP ile etkileşir (4) (RISC kompleksine benzer). miRNA ve hedefi arasındaki baz eşleşmesi RISC kompleksinin mRNA’yı parçalamasına veya proteine translasyonunu durdurmaya sebebiyet verir (6). Şekil 6. miRNA ‘nın mekanizması İnvivo'da Ribozim Ekspresiyonunu Optimize Etmek Sekonder yapısının şeklinden dolayı ismi konan “hammerhead ribozim“, infekte olmuş bitkide orijinal olarak keşfedilmiş katalitik RNA moleküdür (10). Hammerhead ribozimin kendi başına kesim aktivitesi, tek iplikli yaklaşık 350 nükleotidlik, protein kılıfından yoksun RNA olan “virusoid“ moleküllerinin replikasyonu için zorunludur. Hammerhead ribozimler, herhangi bir RNA’yı kesmek için dizayn edilebilir (10). Bu dizayn, ribozimin substrat tanıma kısımlarında yapılır böylece, hedef sekansa komplementer tanıma bölgeleri içerebiliyor. Substrat kesimi, hedef RNA’daki NUX (N, herhangi bir baz ise X, A, C veya U dur.) sekansına göre ayarlanıyor. Dizayn edilen ribozimler, farklı RNA’ları kesebilir. Bu ribozimler, ya hammerhead veya hairpin ribozimlerdir. Ribozimler sentez ve modifikasyonları kolay ve yüksek oranda spesifik durumları ile hedef mRNA’ların ekspresiyonunu regüle ederler. İnvitroda, ribozimlerin kesim aktiviteleri, hücresel ortamdaki aktiviteleri ile koralasyon göstermek zorunda değildir. Bu yüzden memeli hücrelerindeki spesifik RNA’ların kesimi için ribozimlerin uygulamaları ifade sistemlerinin gelişimine gereksinim duyar (10). Tablo 4. Ribozimlerin invivo aktivitesini optimize etmede gerekli olan unsurlar (10) Şekil - 7 Hammerhead ribozimin ifadelenmesi a. Hammerhead ribozimin sekonder yapısı, onun substratı RNA (açık mavi) ve substratın kesim bölgesi gösteriliyor. N herhangi bir baz ve X A , C veya U ‘ yu simgelemektedir. b. Oklar, 3’ tRNaz veya RNaz P tarafından wild-type tRNAVAl (yabani tip)‘nın proses edilen bölgelerini göstermektedir. Transkripsiyon için RNA polimeraz III‘ ün etkileşimde bulunduğu promotor, internal promotordur; transkriptler, tRNA sekanslarının içindeki promotor elementlerini içerir (A ve B kısımları, kırmızı renkli). Ribozim sekansı doğal formdaki tRNA sekansının 3’ ucuna bağlanırsa, 3’ tRNaz ribozim – tRNA transkriptinden ribozim kısmını keser. Sonuçta oluşan ribozim endogenik RNaaz tarafından degrede olur. Bu yüzden modifiye olmuş yapıda, wild – type tRNA ‘nın 3’ kısmının bir bölümü linker sekans ile yer değiştirilir ve stem yapısı oluşur. Stem yapısı ribozimin tRNAval kısmından ayrılmasını bloke etmektedir (10). Yüksek İfade Seviyeleri RNA pol III tarafından tanınan promotorlar, tRNA ve küçük nüklear RNA olan küçük RNA’ların transkripsiyonundan sorumludur(10). Bu sebebten dolayı, Pol III ifade sistemleri, hammerhead, hairpin ribozimler ve siRNA olarak bilinen küçük RNA’ların transkripsiyonunda rol oynar. Pol III transkriptleri, pol II transkriptleri ile karşılaştırıldığında, ekstra sekanslar içermektedir (her transkriptin 3’ ve 5’ uçlarında polyA ve cap yapısı vardır). Bu özellikler, pol III sistemini ribozim ve siRNA’ların ekspresiyonu için ideal yapıyor yani, transkriptlerin yüksek seviyeleri güçlü aktivite için gereklidir ve ekstra sekanslar inhibitör etkisi yapar. tRNAmet tRNAva veya tRNAlys gen promotorunu veya U1, U6 veya adenovirus VA1 promotorunu içeren PoI III ifade sistemleri, hücrelerdeki hammerhead ve hairpin ribozimlerin ifadeleri için gereklidir. U6 promotoru çoğunlukla siRNA ifade vektörleri için kullanılır. Bunun yanında, farklı promotorlardan transkribe olmuş siRNA ve ribozimler sahip oldukları çeşitli özellikleri kendi promotorlarından alırlar (10). Kanser Biyolojisindeki Araştırmalar Tümör hücrelerine, hairpin ribozim transfeksiyonu yapılmış ve transforme olmuş hücreler birkaç hücresel proses olan apoptozis, kontak inhibisyonu ve üreme gibi normal regulasyonunu kaybetmiş (10). Hairpin ribozimleri alan hücrelerde tümör supressör gibi regülatör protein fonksiyonu olan bir gen hedeflenmiş ve biyolojik yol izlerinde birkaç yeni genler identifiye edilmiş. Bunların içinde insandaki gene homoloji gösteren D. melanogaster’de “ppan” ve"Mtert"geni keşfedilmiş. Ppan, hücre büyümesinin inhibitörü olarak, Mtert geni ise fibroblast transformasyonunun supressörü olarak identifiye edilmiş. Metastazi Genlerinin İdentifikasyonu Kanser hücrelerinin metastazisinde görev yapan genleri identifiye etmek için rastgele dizayn edilmiş ribozim kütüphaneleri kullanılmış. Kanserin erken safhalarında genellikle malignant hücreler lokalize olur. Hastalık ilerlediğinde metastazi için hücreleri uyaran çeşitli genler ifadelenir veya baskılanır. İnvaziv kanser hücrelerinin hareketi, invaziv olmayan veya zayıf invaziv özellik gösteren hücrelerden daha fazladır (10). Metastazinin mekanizması, kompleks ve çoğunlukla bilinmeden kalmıştır. Bu yüzden metastatik proseslerdeki basamakları identifiye etmek için, farklı prosedürler keşfetmişler. Bunlardan ilki, kemotaksi denemesi, rastgele dizayn edilmiş 33 genler yüksek oranda hareketli olan HT1080 hücrelerine verilir. Transfeksiyondan 24 saat sonra ekstraselüler matriks jeli ile çevrilmiş porlu filtre ile ayrılmış kemotaksi denemesine maruz bırakılmış. Kemoattranktant olarak fibronectin içeren bu denemede yüksek konsantrasyon içeren kısımdan daha düşük konsantrasyon içeren kısma doğru bir geçiş olur. 24 saat sonra yüksek konsantrasyonda bulunan çok az seviyedeki hücreler incelenmiş (invaziv olmayan hücreler). Ribozim taşıyan vektörleri alan bu hücrelerde migrasyonu tetikleyen genler bloke olmuş. İkinci yaklaşım, hücre invazyon denemesi. Bu deneme ilk denemeye benzer, sadece alt kısımın matriks jeli çevrelenmesi hariçtir. Retroviral vektörler (ribozim genlerini içerir)fare fibroblast NIH3T3 hücrelerine verilir. Bu hücreler jel ile çevrelenmiş filtre içinden çok zor geçer ve matriks jeline penetre olmuş hücrelerden RNA izole edilir. Bu RNA’nın, reverse transkripsiyonundan sonra, fibroblastların invaziv aktivitesini sağlayan 8 ribozim bulunmuş. Hücre kültür koşulları fizyolojik durumu tam olarak yansıtmasada, ribozim teknolojisi fare pulmonar tümörogenezis için bir yoldur. Ribozim kütüphaneleri, viral hayat çemberi, apoptik yol izleri, alzhemier hastalığı, kas ve neuronal farklılaşma fonksiyonu gösteren genleri identifiye etmede yararlanılır. Özellikle ribozim kütüphaneleri sinirsel kök hücrelerin farklılaşmasını regüle eden kod oluşturmayan RNA ‘yı identifiye etmede kullanılır. Şekil – 8 Metastazide görev yapan genlerin identifikasyonu a. Rasgele dizayn edilmiş ribozimler, hareketli HT 1080 hücrelerine veriliyor. b. Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücreler ekstraselüler matriks jel ile kaplı porlu bir filtre ile ayrılmış alanda kemotaksi denemesine maruz bırakılmış. Üst kısımdan ekstraselüler matriks yolu ile alt kısma göç eden invaziv hücreler gözlemlenmiş. c. 24 saat sonra üst kısımdan göç edememiş hücreler alınmış. d. Alınan hücrelerdeki ribozimler çıkartılmış ve yeniden daha zor şartlar altında test edilmiş. e. Bu ribozim sekansları kullanılarak databazlı araştırmalarda istenen genler saptanmıştır (10). siRNA ve Ribozim Kütüphanelerinin Karşılaştırılması Son yıllarda RNAi, gen baskılanması için güçlü bir araç olarak dikkatleri üstüne çekmiştir (10). C. elegans hücresine dubleks RNA’nın verilmesi sonucunda ilk gen baskılanması ortaya çıktıktan sonra, bitkilerde, D. melanogaster, protozoa ve memeli türlerindeki varlığı saptanmıştır. RNAi mekanizmasında, ekzogenik dubleks RNA’lar 21-23 nükleotidlik siRNA oluştuktan sonra RISC kompleks ile ilişkiye girer. siRNA – RISC kompleksi, sekansa spesifik olarak hedef mRNA’yı keser. Bu reaksiyon, ribozimler tarafından hedef mRNA’nın kesimine benzemektedir. RNAi ‘nin potansiyel gücü, bilimsel kominitelere, genom analizleri ve gen işleyişleri için işe yarar bir araç olarak bakma cesaretini vermiştir. siRNA ifade vektörlerini ve kütüphanelerini kullanarak memeli genomunun karşılaştırmalı sistemik analizlerini yapılmıştır. siRNA kütüphaneleri ile, TRAIL ile indüklenmiş apoptozis, P53‘ e bağlı üremenin tutuklanması ve fosfadilinositol 3 – kinaz (P13)yol izlerinde yeni komponentler identifiye edilmiştir (10). Etkinliği ve Hedef Spesifitesi Ribozim ve siRNA teknolojileri arasındaki en büyük farklılık, siRNA’lar endogenik proteinler ile iş birliği içindedir (10). Halbuki ribozimlerin aktivitesi hücresel faktörlere bağlı değildir. Bu yüzden, siRNA’lar birçok hücresel enzimi kullanır örneğin helikaz ve RNAaz’lar, hedef mRNA’nın kesiminde görev yaparlar. Bundan dolayı, hedef mRNA’ların baskılanmasında ribozimlerden daha etkili bir araçtır. Her iki teknolojide de, hedef bölgelerin seçimi aktiviteyi belirlese de, daha düzenli bir mRNA’nın yapısı siRNA’dan çok, ribozim aktivitesini daha güçlü etkiler. Buna karşın siRNA’ların baskılayıcı aktivitesi, mRNA’nın düzenli yapısından çok, siRNA ve bir grup endogenik protein arasındaki etkileşime bağlıdır. siRNA’ların en önemli dezavantajı, spesifik olmayan baskılayıcı aktivitesidir. Bu baskılayıcı aktivite interferon üretiminin indüklemesi veya hedef olmayan genlere karşı sekansa spesifik silencing etki anlamına gelmektedir. siRNA’nın bir ipliği (antisens) hedef mRNA’ya komplementer, diğer ipliği (sense) değildir. Sense ve antisense iplikler, hedef olmayan mRNA’nın translasyonunu inhibe edebilir. Hedef olmayan genler üzerindeki etkilerin tahmin edilmesi zor olduğundan, bu konuda ribozimler daha düşük aktiviteye sahip olmalarına rağmen, siRNA’ların bir adım önünde bulunmaktadır. Son yıllarda siRNA alanındaki gelişmeler hız kazanmıştır (10). Örneğin, daha önceleri kullanılan 21 – 23 mer siRNA’ların nanomolar konsantrasyonları yerine günümüzde 27 mer’ lik siRNA’ların pikomolar konsantrasyonları kullanılmaktadır. Bu konsantrasyonun kullanılması, hedef dışındaki etkisini minimize edebilir Ayrıca, siRNA ifade vektörlerini dizayn etmek mümkün; shRNA (short haırpın RNA – sens ve antisens sekansları içermekte, Dicer tarafından shRNA siRNA‘ ya dönüştürülür.)‘ nın sadece sens ipliğinin degrede olacağı vektör düzenlenir ve böylece hedef dışı etkileri minimize edilmiş olur. İnterferon uyarılması, sekansa bağlı olmadan spesifik olmayan etki demektir yani, ekzogenik dubleks RNA tarafından immün yanıtın aktive olması demektir. siRNA’lar bu yanıtı uyarmayabilir. Uzun dubleks RNA 30bp’den büyük olursa bu yanıt oluşmaz. Ayrıca, siRNA ‘nın interferon yanıtını uyardığı ve bu yanıtın oluşmaması için bazı faktörler identifiye edilmiştir. Stem (gövde) bölgesinde bir mutasyonun meydana getirilmesi ile (C→U veya A→G) interferon yanıtı azaltılır. Yalnız bu çözüm dsRNA>100bp olduğu durumlar için geçerlidir. Antisens Teknolojisinin Çözüm Bekleyen Sorunları İlk sorun, genlerin insana verilmesini sağlayacak daha kolay ve etkili yöntemlerin bulunmasıdır. Bir başka sorun ise, nakledilen genin hastanın genetik materyalinin hedeflenen bölgesine yerleşmesini sağlamak ve böylece olası bir kanser ya da başka bir düzensizlik riskini ortadan kaldırmaktır (11). Bu konudaki başka bir sorun da, yerleştirilen yeni genin vücudun normal fizyolojik sinyalleriyle etkin bir biçimde kontrolünün sağlanmasıdır. Örneğin insülin, doğru zamanda ve doğru miktarda üretilmediği zaman, hastaya yarar yerine zarar getirecektir. Şu ana kadar yapılan çalışmalar sonrası iyi sonuçlar alınabilmiş fakat kalıcı tedavi çoğu zaman başarılı olamamıştır (11). Bunun bir nedeni, vektörlerin taşıdıkları genin uzun süreli ekspresyonuna izin vermeyişleri, diğeri ise denemelerde etkinlikten çok güvenliğin ön plana çıkmasıdır. Kanser tedavisi için antisens oligonükleotidleri major kaynak olarak görmeden önce, iki temel zorluğu çözmek gerekmektedir. İlaç verilmesinde en çok aranan özellik basitliktir (12). Oligonükleotidin hücresel alınımı sınırlı ve hücre tipleri arasında varyasyonlar göstermektedir. Örneğin, normal lenfositlerin antisens nükleotidleri çok zayıf aldığı gözlemlenmiştir. Lipozomal taşıyıcılarında içinde bulunduğu çeşitli formulasyonlar sonuçlarına bakılmaksızın denenmiştir. Antisens oligonükleotidlerin direk injeksiyonu en yüksek tümör konsantrasyonlarında verilir fakat sistemik tümör tedavisi için kullanımı limitlidir. Gut epitel hücreleri, antisens oligonükleotidleri çok iyi bir şekilde almaktadır, bu yüzden oral formulasyonu mümkündür ve uygulamalar arasında en çok umut veren olabilir. İkinci çözülmeyen konu, hedef onkogen zaman zaman mı aktif oluyor yoksa, bir tümör hücresi olarak mı kalıyor? Tümör hücreleri bazen hareketsiz kalabiliyor ve büyüme aktivitesi, antisens oligonükleotidin verilmesi ile eş zamanlı olmayabiliyor (12). Şu anki duruma göre, önümüzdeki yıllarda gen tedavisindeki eğilim, genleri istenilen hücrelere en etkin biçimde taşıyabilecek vektörlerin dizayn edilmesi yolunda olacak gibi görünüyor. O zaman, gen tedavisinin daha başarılı sonuçlar vereceği söylenebilir. Kaynaklar 1. IDT Tutorial. 2005. Antisense Technologies, 1-12. 2. Kurreck, J. 2003. Antisense Technologies improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem, 270: 1628-1644 3. Uprichard, S. L. 2005. The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Letters, 579: 5996-6007. 4. Aigner, A. 2006. Gene silencing through RNA interference (RNAi) in vivo: Strategies based on the direct applications of siRNAs. Journal of Bıotechnology, 124 (1): 12-25. 5. Dorsett, Y and Tuschl, T. siRNAs:2005. Applications in Functional Genomıcs and Potential as Therapeutics. Nature Biotechnology, 40-51. 6. Rychahou, G. P., Jackson, N. L., Farrow, J. B and Evers, M.B. 2006. RNA interference: Mechnanisms of action and therapeutic consideration. Surgery ; 140: 719-25. 7. Matzke, A.M and Birchler, J.A. 2005. RNAi – Mediated Pathways in the Nucleus. Nature Reviews Genetics, 6: 24-35. 8. Hammond, S. M. 2006. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion in Genetics and Development , 16:4-9. 9. Wienholds, E., Plasterk, H.A R.2005. MicroRNA function in animal development. FEBS Letters, 579: 5911-5922. 10. Akashi, H., Matsumoto, S. and Taira, K. 2005. Gene Dıscovery By Rıbozyme and siRNA Libraries. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6: 413-422. 11. Yaşar, Ü. 2006. Gen Tedavisi; Hastalıkların biyolojik temeli III. www.medinfo.hacetttepe.edu.tr/ders. 12. Cunnıngham, C.C. 2002. New modalities in oncology: antisense oligonucleotides. BUMC Proceedings, 15: 125-128.   PDF KAYNAK: documents/tipbil14_3_11.pdf

http://www.biyologlar.com/antisens-teknolojileri-hakkinda-bilgi

GİBERELLİNLER : Bitki Boyu Düzenleyicileri

Giberellinler Japonya’da 2. Dünya Savaşı yıllarında keşfedilmiştir, fakat bu sırada batı ile ilişkiler kopuk olduğundan batı bu keşfi 1950’lerde öğrenmiştir. Yüzyıl önce, Asya‟daki çiftçiler çeltik tarlalarındaki pirinç fidelerinin aşırı ölçüde boylandıklarını ve ince kaldıklarını gözlediler. Bu durumda, fideler olgunlaşmadan ve çiçek oluşturmadan önce, ince ve cılız oluyor ve bu sebepten dik duramayıp erkenden ölüyordu veya verim düşüyordu. Japon bitki pataloğu Kurusowa, 1926‟da, sersem fide hastalığı denen bu hastalığa Ascomycetes türü olan Gibberella fujikuroi isimli mantarın sebep olduğunu buldu. 1930‟lu yıllara kadar, fungusun giberellin adı verilen (Gibberella fujikuroi türüne itafen) bir kimyasal salgılayarak pirinç gövdelerinin aşırı uzamasına neden olduğunu buldular. Araştırmacılar, 1950‟lerde bitkilerinde giberellinleri sentezlediklerini keşfettiler. Her ne kadar sayıları her bir bitki türünde çok daha az ise de, bilim adamları son 40 yılda bitkilerde doğal olarak sentezlenen 100‟den fazla giberellin bulmuşlardır. Bunlar GA1,GA2,GA3…. şeklinde isimlendirlirler. En yaygın olanı ise GA3 yani giberellik asit (giberellan çekirdek)‟tir. Diğer giberellinler bu temel yapıya bağlı çeşitli yan gruplara sahiptir. Giberellin Biyosentezi ve Metabolizması Giberellin sentezi, bitkide asetil-KoA‟nın asetil biriminden başlar. Solunumdan kaynaklanan mevalonik asit yoluyla birkaç reaksiyondan sonra giberellin sentezlenir. Giberellinler diterpenler grubundadır. Giberellin sentezinin kaurenik aside kadar sitopolazmada, ancak giberellinlerin birbirine dönüşümünün kloroplastlarda olduğu bilinmektedir. 20 karbonlu kauren tüm gibberellinlerin çıkış noktasıdır. Piyasada giberellin antagonisti (büyüme engelleyici) olarak satılan Fosfon-D, Amo-1618, CCC gibi sentetik engelleyiciler giberellin sentezinin belirli reaksiyonlarını inhibe ederler. Bitkide genç yapraklarda ve daha çok tohum embriyosunda sentezlenirler. Buralardan bitkinin diğer kısımlarına taşınırlar. Çimlenen tohumlarda floem vasıtasıyla fideye taşınan giberellinlerin, genç yapraklardan diğer kısımlara hangi yolla taşındığı çelişkilidr. Daha çok floem dışıyollarla korteks ve öz parankimasından difüzyonla taşındığı düşünülmektedir. Dolayısıyla giberellinlerin taşınımı oksin taşınımı gibi polar olmayıp, olasılıkla, her yönde aynı hızdadır. Giberellinler sentezlendikten sonra çok yavaş parçalanırlar. Giberellinleri parçalayan enzimler bilinmemektedir. Giberellinler şekerlerle veya proteinlerle birleşerek inaktive olurlar. Ayrıca aktif olan giberllinler daha az aktif giberellinlere kolayca dönüşebilmektedir. Örneğin, GA4‟ün daha az aktif GA34‟e dönüşümü çok sık gerçekleşir. Giberellinlerin Fizyolojik Etkileri ve Pratik Değeri Gövde Uzaması Giberellinler esas olarak kökler ve genç yapraklarda üretilir. Giberellinler hem yapraklarda hem de gövdelerde büyümeyi teşvik etmekle birlikte, kök büyümesi üzerinde çok az etkiye sahiptir. Giberellinler, gövdelerde hücre uzamasını ve hücre bölünmesini uyarır. Oksinler gibi giberellinler de hücre gevşemesine neden olurlar. Ancak bunu çeperi asitleştirerek yapmazlar. Bir varsayıma göre, giberellinler hücre çeperi gevşetici enzimleri uyarmaktadır. Bu enzimler hücre çeperine ekspansinlerin girişini kolaylaştırmaktadır. Böylece, büyüyen bir gövdede uzamayı artırmak için oksin ve sitokininle birlikte hareket etmektedir. Bu süreçte, oksin hücre çeperini asitleştirmekte ve ekspansinleri aktifleştirmekte; giberellinler ise ekspansinlerin girişini kolaylaştırmaktadır. Cüce bitkilere (mutantlar) giberellin uygulanarak, giberellinlerin gövde uzamasına artırıcı etkisi ortaya konmuştur. Örneğin, bazı cüce bezelye bitkilerine (Mendel‟in çalıştığı türler dahil) giberellin uygulanırsa, çoğunlukla yanıt alınmaz. Çünkü, bu bitkiler önceden optimum dozda hormon üretmişlerdir. Çiçek sapının hızla büyümesi giberellinin teşvik ettiği gövde uzaması ile ilgili en dikkat çekici durumdur. Lahana benzeri bitkiler vejetatif evrede rozet formundadırlar: yani çok kısa internodyumlu oluşları nedeniyle toprağa çok yakındırlar. Bitki üreme evresine geçince; giberellinlerin artması internodyum uzamasını hızla artırır. Bunun sonucunda gövde uçlarındaki çiçek tomurcuklarının boyu uzar. Meyve Büyümesi Pek çok bitkide, meyve bağlanması için hem oksin hem de giberellinlerin bulunması gerekir. Giberellinlerin en önemli ticari uygulaması, Thompson isimli çekirdeksiz isimlere püskürtülmesidir. Hormon, tüketicilerin istediği biçimde, üzüm tanelerinin büyümesini ve salkımların internodyumlarının uzamasını sağlar. Taneler arasında hava dolaşımını artırdığından, diğer meyvelerin ve diğer mikroorganizmaların hastalık bulaştırıcı etkisi de azalır. Çimlenme Tohum embriyoları, zengin bir giberellin kaynağıdır. Suya batırıldıktan sonra, embriyodan serbest bırakılan giberellinler dormansinin kırılması ve çimlenmenin başlaması için tohuma sinyal gönderir. Çimlenme için ışık yada düşük sıcaklık gibi özel ortam koşullarına gereksinim duyan bazı tohumlara giberellin uygulanması durumunda dormansi kırılır. Giberellinler depo besin elementlerini mobilize eden α – amilaz gibi sindirici enzimlerin sentezini teşvik ederek tahıl fidelerinin büyümesini destekler. Ayrıca giberellinler çiçeklenme hormonu olarak bilinir. Bir çok bitkide çiçeklenmeyi teşvik eder. Gerek fotoperyodizmle gerekse vernalizasyonla çiçek açmada giberellinler rol alırlar. ABSİSİK ASİT : Stres Hormonu Absisik asit (ABA) kimyasal grup olarak seskuiterpenler grubundan bir maddedir. ABA‟nın giberellinlerle ortak noktası her ikisinin de ana grup olarak terpenlerden olmalarıdır. ABA bitkiler tarafından sentezlenen en önemli engelleyici hormondur. Tomurcuk dormansisinden önce ortaya çıkan kimyasal değişiklikleri çalışan bir araştırma grubu ve yaprak absisyonundan (son baharda yaprak dökülmesi) önce ortaya çıkan kimyasal değişiklikleri çalışan bir diğer ekip, 1960‟da, aynı bileşiği yani absisik asiti (ABA) izole etmiştir. Aynı yıllarda başka araştırma grupları akça ağaç ve baklada da ABA‟yı izole ettiler. Daha sonrayapılan çalışmalarda ABA‟nın ciğer otları, algler, bakteriler ve mantarlar dışında genel olarak bitki aleminde mevcut olduğu tespit edildi. ABA bulunmayan bitkilerde başka engelleyicilerin bulunduğu düşünülmektedir. Diğer açıdan işin garip tarafı ise, şu anda, ABA‟nın ne tomurcuk dormansisinde ne de yaprak absisyonunda önemli bir rol oynamadığı düşünülmektedir; fakat ABA bir çok etkiye sahip önemli bir bitki hormonudur. Şu ana değin incelediğimiz oksin, sitokinin ve giberellinlerin aksine, ABA büyümeyi yavaşlatıcı etki gösterir. Genel olarak büyüme hormonlarının etkilerine zıt etki yapar. Bir yada daha fazla büyüme hormonuna ABA oranı, fizyolojik etki gösterecek sonucu belirler. ABA Biyosentezi ve Metabolizması ABA 15 karbonlu bir seskuiperten olup kloroplastlarda ve diğer plastidlerde mevalonik asit yoluyla sentezlenir. Kaynaklandığı öncül maddenin bir ksantofil karotenoidi olan vialoksantin‟in fotokimyasal veya enzimatik yıkımıyla başladığı belirtilmektedir. (bu yol izopentil difosfat (IPP) la başlar ve C40 ksantofili olan vialoksantinle devam eder). Bu yıkımın ilk ürünü ksantoksin‟dir ki bununda bir engelleyici madde olduğu ve fototropizmada rol oynadığı ileri sürülmektedir. ABA‟nın inaktivasyonu ya karboksil grubuna bir glukoz bağlanmasıyla yada faseik asit ve dihidro fasetik asit‟e oksitlenmesiyle olmaktadır. ABA‟nın bitkide başlıca sentez yerleri yaşlı yapraklar, gövde ve yeşil meyvalardır. Tohumlarda da sentezlendiği bazı bitkilerde ise tohumlara başka yerlerden taşındığı düşünülmektedir. ABA’nın taşınımı giberellin taşınımına benzer. Hem ksilemden hem floemden taşındığı gibi parankima hücrelerinden difüzyonla da her yönde taşınabilir. Kuraklıkta, tuzlulukta, mineral eksikliği gibi çeşitli stres şartlarında yaprakta ABA sentezi artar. ABA‟nın bu ekstrem koşullarda bitkiye dayanıklılık sağladığı düşünülmektedir. Kuraklık stresinde ABA‟nın stomaların kapanmasına yol açtığı ve böylece transpirasyonla su kaybınıo azalttığı bilinmektedir. ABA’nın Fizyolojik Etkileri ve Pratik Değeri Tohum Dormansisi Tohum dormansisi, yaşamın sürmesinde büyük önem taşır; çünkü dormansi tohumun optimum ışık, sıcaklık ve nemlilik koşullarında çimlenmesini sağlar. Sonbaharda çevreye yayılan bir tohumun, kış koşullarında ölmesini engelleyecek şekilde, hızla çimlenmesini önleyen nedir? Bu tür tohumların ilkbaharda çimlenmesini hangi mekanizmalar sağlar? Hatta, meyvenin nemli iç ortamında, karanlıkta, tohumların çimlenmesini engelleyen nedir? Bu soruların yanıtı ABA‟dır. Tohum olgunlaşması sırasında ABA düzeyi, 100 kat artabilir. Olgunlaşan tohumlardaki yüksek ABA düzeyi, çimlenmeyi engeller ve özel proteinlerin üretimini teşvik eder. Bu proteinler, olgunlaşmayla birlikte oluşan aşırı su kaybına karşı tohumun ayakta kalmasına yardım eder. ABA, bazı yollarla yok edilir yada etkisizleştirilirse, tohumlar çimlenir. Bazı çöl bitkilerinin tohumlarında dormansi, sadece şiddetli yağmurların ABA‟yı tohumdan yıkayarak uzaklaştırmasıyla kırılır. Diğer tohumlar ise ABA‟nın etkisizleştirilmesi için ışığa yada uzun süren düşük sıcaklığa gereksinim duyar. Çoğunlukla ABA‟nın giberelline oranı, tohumun uyku halinde kalıp kalmayacağını yada çimlenip çimlenmeyeceğini belirler; çimlenme için suya daldırılmış tohumlara ABA ilave edilirse, tohumlar yeniden dormansi koşullarına döner. Tohumlar henüz koçan içindeyken çimlenen bir mısır mutantı, işlevsel bir transkripsiyon faktöründen yoksundur; bu transkripsiyon faktörü belirli genlerin ifade edilmesini sağlamak için ABA‟ya gereksinim duyar. Kuraklık Stresi ABA, bitkilerin kuraklığa karşı koymasını sağlayan asıl iç sinyaldir. Bir bitki solmaya başlayınca yapraklarda ABA birikerek stomaların hızla kapanmasını sağlar. Bunun sonucu transpirasyon (buharlaşmayla su kaybedilmesi) azalır ve su kaybı önlenir. ABA bekçi hücrelerinin (stomalarda bekçi ve arkadaş hücreleri ile birlikte bir por bulunur) plazma zarındaki dışa doğru yönelmiş potasyum (K+) kanallarının açılmasını artırır. Bunu, kalsiyum gibi sekonder mesajcıları etkileyerek yapar. Potasyum kanallarının açılmasıyla, bekçi hücrelerinden büyük miktarda potasyum çıkışı olur. Suyun ozmotik olarak kaybı, bekçi hücrelerinin turgorunun azalmasına ve stoma porunun küçülmesine neden olur. Bazı durumlarda su kıtlığı kök sistemini gövde sisteminden daha önce baskı latına alır. Köklerden yapraklara taşınan ABA, erken uyarı sistemi olarak iş görür. Solgunluğa özellikle duyarlı mutantlar genelde ABA üretemezler. Ayrıca, ABA‟nın hücrede RNA ve protein sentezini engelleyici etkisininde olabileceğine dair deneysel veriler vardır. ABA‟nın pratik kullanımı çok nadirdir. Tahıllarda dane verimini artırmak ve yatmaya karşı mukavemet kazandırmak için, bazı durumlarda da sormansi süresini uzatmak ve çeşitli stres şartlarına karşı bitkiye dayanıklılık sağlamak için kullanılır. ABA pahalı ve kolayca katabolize olduğu için bunun yerine fosfon-D kullanılmaktadır. ETİLEN : Gaz Hormon Kömür gazının bahçe ışıklandırılmasında kullanıldığı 19. yüzyılda, gaz lambalarından çıkan aydınlatma gazı sızıntısı çevredeki ağaçların yapraklarını erkenden dökmelerine neden olmuştur. Dimitri Neljubow isimli bir Rus bilim adamı, 1901‟de aydınlatma gazındaki aktif faktörün etilen gazı (C2H4) olduğunu göstermiştir. Ayrıca etilenin bitkiler tarafından sentezlenen (üretilen) bir hormon olduğu, ve bununla birlikte, etilen miktarının ölçümünü basitleştiren gaz kromatografisi tekniği geliştirilince yaptığı iş önemli ölçüde kabul görmüştür. Bitkiler, kuraklık, su baskını, mekanik basınç, zarar ve enfeksiyon gibi streslere yanıt olarak etilen üretir. Aynı zamanda meyve olgunlaşması ve programlanmış hücre ölümü sırasında etilen üretilir. Ayrıca dıştan yüksek konsantrasyonlarda oksin uygulanmasından sonrada etilen üretilmektedir. Dikkat çekici olan bir diğer noktada; daha önce kök uzamasının engellenmesi gibi, oksinle ilişkilendirlen bir çok biyolojik etkinin, şu an oksinin uyardığı etilen üretimine bağlı olduğudur. Etilen Biyosentezi ve Metabolizması 1970‟li yıllarda etilen sentezinin bitkide metionin amino asitinden kaynaklandığı belirlendi. Metionin‟den amino siklopropan karboksilik asit (ACC), ondanda dekarboksilasyon ve deaminasyonla etilen oluşmaktadır. Etilen sentezinin ACC üzerinden olduğunu, avokado meyvesinin hasatından sonra olgunlaşmasında meyvede ACC ve etilen konsantrasyonlarının pozitif korelasyonlu değişim göstermeleri doğrulamıştır. Amino etoksivinil glisin (AVG) ve aminooksi asetik asit (AOA) bileşiklerinin etilen sentezini inhibe ettikleri bilinmektedir. CO2 gazıda yüksek konsantrasyonlarda etilen üzerinde inhibisyon gösterir. Depolanırken olgunlaşması istenmeyen meyvelere CO2 gazının inhibisyon etkisi uygulanır. Gümüş iyonları ve bazı maddelere etilenin bağlanmasıyla, etilen sentezi inhibe edilir. Etilenin Fizyolojik Etkileri ve Pratik Değeri Mekanik Strese verilen Üçlü Yanıt: Bir Sinyal İletim Yolunun İncelenmesinde Mutantların Kullanılması Kaya gibi hareketsiz bir nesnenin altında kalmış ve topraktan yukarıya doğru yükselmeye çalışan bir bezelye fidesini düşünelim. Gövde üstündeki engeli ittikçe, narin yapılı uç bölge mekanik strese maruz kalır,. Bu, fideyi etilen üretmeye teşvik eder. Etilen ise fideyi üçlü yanıt olarak adlandırılan bir büyüme manevrası yapmaya teşvik eder. Bu manevra fidenin engeli aşmasını sağlar. Şekil 19‟da görebileceğiniz bu yanıt gövde uzamasının yavaşlaması, gövdenin kalınlaşması (dayanıklılığı artırır) ve gövdenin yatay olarak büyümesine neden olan bir eğrilme olmak üzere üç kısımdan oluşur. Gövde büyümeye devam ettikçe ucu nazikçe yukarıya dokunur. Eğer bu yoklama sonucu yukarda katı bir cisim olduğunu saptarsa yeniden etilen üretir ve gövde yatay olarak büyümeye devam eder. Bununla birlikte, eğer fidenin uç kısmı katı bir cisim algılamazsa etilen üretimi azalır ve normal olarak yukarı doğru büyümesini sürdürür. Gövdenin yatay olarak büyümesini fiziksel engelden ziyade etilen teşvik eder; ayrıca, fiziksel bir engelle karşılaşmaksızın serbestçe büyüyen fidelere dıştan etilen uygulanması, üçlü yanıttın oluşmasına neden olmaktadır (Şekil 19). Araştırmacılar bu yanıtta yer alan sinyal iletim yollarını araştırmak için anormal üçlü yanıt veren Arabidopsis mutantları üzerinde çalışmışlardır. Etilene duyarsız (ein) mutantlara etilen uygulanınca bu bitkiler üçlü yanıt verememişlerdir. İşlevsel bir etilen reseptörüne sahip olmadıklarından bazı ein mutant tipleri, etilene duyarsızdırlar. Diğer mutantlar ise, toprak dışında, fiziksel bir engelin bulunmadığı hava ortamında bile üçlü yanıt vermişlerdir. Bu tip mutantların bazılarında düzenleyici bir bozukluk bulunur. Bu bozukluk böyle mutantların 20 kat daha fazla etilen üretmelerine neden olur. Bu tür aşırı etilen üreten (eto) mutantlarda fenotip, fidelere etilen sentezi inhibitörleri uygulanmasıyla iyileştirilebilir. Üçüncü tip mutantlar hava ortamında bile üçlü yanıt verirler; ancak, üçlü yanıt (ctr) mutantları olarak adlandırılan bu mutantlar etilen sentezi inhibitörlerine yanıt vermezler. Bu durumda, etilen mevcut olmasa bile etilen sinyal yolu işlevini sürdürür. ctr mutantlarından etkilenen bir gen, bir protein kinazı kodlamak için açılır. Bu mutasyonun etilene verilen yanıtı aktifleştirmesi, yabani-tip allelin normal kinaz ürününün, etilen sinyal iletim işleminin negatif bir düzenleyicisi olduğunu düşündürmektedir. Yabani tip bitkilerde bu yolun nasıl çalıştığına ilişkin bir varsayım aşağıda verilmiştir: Etilenin etilen reseptörüne bağlanması kinazı aktif hale getirir. Bu negatif düzenleyicinin inaktif hale gelmesi üçlü yanıt için gerekli proteinlerin sentezlenmesini sağlar. Şekilde verildiği gibi; bu yolda iki membran proteini, bir engelleyici protein (CTR1), bir de transkripsiyon faktörü olan protein (EIN3) vardır: (eğer etilen varsa) ilki etilen reseptörü (ETR1) ve ikincisi bir kanal proteini olan (EIN2) dir. EIN2 bir sekonder mesajcıya etki eder ve buda bir transkripsiyon faktörü olan EIN3‟ü aktive eder. EIN3 etilen etkisini üretmek üzere ifade olacak genleri harekete geçirir. Eğer etilen yoksa; etilen reseptörü olan ETR1 inaktif kalır ve CTR1‟i inaktif edemez. Aktif kalan CTR1, membran proteini olan EIN2‟yi inaktif tutar. EIN2 nin aktivitesi olmayınca transkripsiyon faktörü olan EIN3 inaktif kalır ve nukleusta herhangi bir etki gösteremez. Apoptosis: Programlanmış Hücre Ölümü Bir yaprağın sonbaharda döküldüğünü yada tek yıllık bir bitkinin çiçek verdikten sonra öldüğünü düşünün. Yada içerdiği canlı maddenin parçalanması sonucu, içi boşalan bir trakenin farklılaşmasındaki son basamağı düşünün. Bu olayların tümü, belirli hücrelerin veya organların yada tüm bitkinin programlanmış ölümünü kapsar. Belirli bir zamanda ölmek için kalıtsal olarak programlanmış hücreler, organlar ve bitkiler, basitçe hücresel mekanizmayı kapatıp ölümü beklemez. Bunun yerine apoptosis olarak adlandırılan programlanmış hücre ölümünü yaparlar. Bu, bir hücrenin yaşamında en yoğun olduğu süreçlerden biridir. Apoptosis esnasında yeni genlerin ifade olmasına gerek duyulur. Bu sırada oluşan yeni enzimler, klorofil, DNA, RNA, proteinler ve zar lipitleri dahil pek çok kimyasal bileşeni parçalar. Bitki parçalanma ürünlerini kurtarabilir. Hücrelerin, organların yada tüm bitkinin apoptosisi sırasında etilen patlaması yaşanır. Yaprak Absisyonu Her sonbaharda yaprakların dökülmesi bir adaptasyondur. Kökten kışın topraktan su absorblayamadığından, bu adaptasyon kış aylarında yaprak döken ağaçların kurumasını önler. Yapraklar dökülmeden önce, ölmekte olan yapraklardan pek çok önemli element geri kazanılarak gövdenin parankima hücrelerinde birikir. Bu besin elementleri, bir sonraki bahar ayında gelişmekte olan yapraklar tarafından yeniden kullanılır. Sonbaharda tekrar üretilen kırmızı pigmentler ve yaprakta önceden bulunan, ancak sonbaharda koyu yeşil klorofilin parçalanmasıyla görünür hale gelen sarı ve turuncu karoteneyidler, yapraklara sonbahar rengini verir. Bir sonbahar yaprağı dökülünce, petiyolün kaidesinin yakınında bir absisyon tabakası oluşur. Daha sonra yaprak buradan koparak yere düşer. Absisyon tabakasındaki küçük parankima hücreleri çok ince çeperli olup, iletim demetlerinin çevresinde lifler bulunmaz. Hücre çeperlerindeki polisakkaritler daha da zayıflar. Sonuçta, rüzgarın da etkisi ile yapraktaki ağırlık absisyon tabakasının kopmasına neden olur. Hatta yaprak dökülmeden önce, absisyon tabakasının dala bakan tarafında mantar tabakası bir iz oluşturur. Bu iz bitkiyi patojenlere karşı korur Absisyonu, etilen ve oksin dengesindeki değişiklik kontrol eder. Yaşlanan bir yaprak, giderek daha az oksin üretir. Bu, absisyon tabakasındaki hücrelerin etilene karşı duyarlılıklarını artırmaktadır. Etilenin absisyon tabakası üzerindeki etkisi arttıkça, selülozu ve hücre çeperlerinin diğer bileşenlerini parçalayan enzimler üretilmektedir. Meyve Olgunlaşması Meyveler, çiçekli bitkilerde tohumların yayılmasına yardım eder. Ekşi, sert ve yeşil olan olgunlaşmamış meyveler, tohum olgunlaşması esnasında yenilebilir hale gelir. Meyvede etilen üretiminin patlaması, enzimatik olarak bu olgunlaşmayı tetikler. Hücre çeperi bileşenlerinin enzimatik olarak parçalanması ve nişastaların ile asitlerin şekerlere dönüşümü meyveyi tatlandırır. Yeni kokuların ve renklerin üretilmesi, olgunlaşan meyvenin, bu tohumları yiyen ve dağıtan hayvanları cezp etmesine yardım eder. Olgunlaşma sırasında bir zincir reaksiyonu ortaya çıkar; etilen olgunlaşmayı tetikler, olgunlaşmada etilen üretiminin artmasına neden olur. Bu, fizyolojide pozitif geri beslenmenin nadir örneklerinden biridir. Sonuçta etilen üretiminde dev bir patlama meydana gelir. Hatta etilen bir gaz olduğundan, olgunlaşma sinyali bir meyveden diğerine geçer; geçerken de çürük bir elma bir kasa elmayı çürütebilir. Eğer yeşil bir meyve satın alırsanız, meyveleri plastik bir torbada tutarak olgunlaşmayı hızlandırabilirsiniz. Çünkü plastik torba içinde etilen gazı birikir. Ticari amaçlı olarak, meyvelerin çoğu etilen gazı düzeyleri artırılmış dev depolarda olgunlaştırılır. Diğer durumlarda ise doğal etilenin sebep olduğu olgunlaşmayı geciktirmek için önlem alınır. Örneğin, elmalar karbondioksit içeren depolarda tutulur. Hava sirkülasyonu etilen birikimini önler ve yeni etilen sentezi engellenir. Sonbaharda toplanmış ve bu şekilde depolanmış elmalar, yaz aylarında bile satışa sunulabilir. Etilenin, meyvelerin hasat sonrası fizyolojilerindeki önemi düşünüldüğünde, etilen sinyal iletim yolları ile ilgili genetik mühendisliğin potansiyel olarak ticari önemi büyüktür. Örneğin, moleküler biyologlar isteğe bağlı olarak olgunlaşan domates meyveleri üretmiştir. Bunu, etilen sentezinde gerekli genlerden birinin transkripsiyonunu durduran bir antisens RNA yerleştirerek yapmışlardır. Yeşil haldeyken toplanan bu tür meyveler, etilen gazı verilmediği taktirde olgunlaşmayacaktır. Bu tür yöntemlerin geliştirilmesi meyve ve sebzelerin çürümesini önleyecektir. Bu sorun, şu an birleşik devletlerde ve bazı ülkelerde hasat edilen ürünün yarısına yakın kısmını yok etmektedir. BRASSİNOSTEROİDLER Brasinosteroidler büyümeyi teşvik edici karakteristik aktiviteleri ile, bitki hormonlarının yeni bir grubudur. 1979‟da kolza bitkisi (Brassica napus L.) poleninden izole ve karakterize edilmişlerdir. Sonradan 44 bitkide bundukları rapor edilmiş ve bitki aleminde muhtemelen her yeder bulundukları kabul edilmiştir. Brassinosteroidler, 37 Angiosperm (9 monokotil ve 28 dikotil), 5 Gimniosperm, 1 pteridofit ve 1 alg olmak üzere 44 bitki türünde izole edilmişlerdir. Brassinosteroidler, çok düşük konsantrasyonlarda etki gösterirler. Brassinosteroidler, büyüme gibi çeşitli gelişimsel etkileri , tohumların germinasyonu, rizogenez, çiçeklenme ve senesens gibi pleotropik etkileriyle dikkate alınmıştır. Ayrıca, çeşitli abiyotik stres durumlarına karşı da bitkiye dayanıklılık sağlamaktadırlar. Brassinosteroidlerin Biyosentezi ve Metabolizması 1974‟te ilk brassinosteroid olan brassinolid keşfedildi. Biyolojik olarak aktif olan bu bitki büyüme düzenleyicisi bir steroid lakton olarak C28H48O6 (MA: 480) formülü ile desteklendi. 1982‟de büyümeyi destekleyici, diğer bir steroid madde, kestane (Castenea crenata) üzerinde böcekler tarafından tahrip edilen kısımlardan izole edildi ve kastesteron (castesteron) olarak adlandırıldı. Brassinolid ve castesteronun keşfi, bitki aleminde büyümeyi destekleyici steroid hormonlarının varlığı düşüncesini desteklemiştir. Brassinosteroidler, doğal polihidroksi steroidlerin yeni bir grubudur. Şimdiye kadar tanımlanan doğal brassinosteroidler genel bir 5α-kolestan yapısına sahiptirler ve bunların varyasyonları yapı üzerindeki işlevlerinin çeşit ve oryantasyonundan oluşmaktadır. Fitosterol ailesine ait bileşikler C27, C28, C29 brassinosteroidler olarak sınıflandırılır. Şu ana kadar 42 brassinosteroid ve 4 brasinosteroid bileşiği karakterize edilmiştir. Brassinosteroidler BR1, BR2, …BRn şeklinde isimlendirilirler. Bitki steroidleri asetil Ko-A, mevalonat, izopentenil pirofosfat, geranil pirofasfat ve farnesil pirofosfattan, isoprenoid yolla sentezlenirler. Mevalonatla başlayan bu yol sonunda sikloartenol sentezlenir. Bu doğal yolun dışında, sentetik olaraktan kampesterol‟den brasinoid‟e kadar sentetik bir yolla sentezlenebilirler. Bitkide gelişmekte olan dokular, olgun dokulşara göre daha fazla konsantrasyonlarda brassinosteroidleri içerirler. Polen ve genç tohum zengin brassinosteroid kaynağıdır. Yapraklar ve sürgünler düşük konsantrasyonlarda brassinosteroid içerirler. Brassinosteroidlerin Fizyolojik Etkileri ve Pratik Değeri Brassinosteroidlerin analizinde göze çarpan iki test vardır; birincisi, fasulyede ikinci internod oluşumu testi ve diğeri pirinç laminasında eğilme testidir. Fasulyede ikinci intenod oluşumu testi, brassinolidin kolza bitkisinden izolasyonunda geliştirilmiştir. Fasulye fidesindeki ikinci internod kesilip, lanolin macunuyla brassinolid uygulanmasıyla uzama, eğilme, şişme ve iki ayrı parçaya ayrılma (splitleşme) göstermiştir. Uzama, eğilme ve şişme düşük konsantrasyonda, iki ayrı parçaya ayrılma ise yüksek konsantrasyonda gerçekleşmiştir. Bu, brasinosteroidlerin büyümeye etkilerinden biridir. Brassinosteroidler genç vejetatif dokuların gelişimine etki ederler. Soya fasulyesi ve bezelye epikotillerinde, Arabidopsis pedinkullarında, yulaf koleoptillerinde uzamayı ve büyümeyi teşvik ederler. Kök gelişimini engellerler fakat gövde gelişimini teşvik ederler. Hücre bölünmesini ve uzamasını, polen tübü uzamasını teşvik ederler. Yaprak absisyonunu geciktirler (Citrus) ve ksilemde farklılaşmayı artırırlar. İletim demetlerinin farklılaşmasında rol alırlar. Tohum germinasyonunu teşvik eder, aynı zamanda absisik asitin inhibe edici etkisini yok ederler. Brassinosteroidler üzüm meyvelerine spreyle muamele edildiğinde; sonbaharda çiçek sayısını artıran, kışın (aynı muamele yapıldığında) çiçek sayılarını azaltan etki göstererek çiçeklenmede rol oynarlar. Brassinosteroidler, Xanthium gibi bazı cinslerde senesensi hızlandırırlar. Ayrıca bitkilerin abiyotik stres şartlarına karşı dayanıklığını artırırlar; düşük sıcaklığa maruz kalan pirinç ve domates bitkilerinde brassinosteroid uygulamasıyla büyümenin daha iyi olduğu gözlenmiştir; mısır ve lahana fidelerinde de düşük sıcaklık stresine karşı toleransı artıran etki gösterirler. Bu etkilerin oksin etkilerine çok benzemesinden dolayı brassinosteroidlerin, oksinden farklı bir hormon olarak kabul edilmesi yıllar sürmüştür. Ek olarak brasinosteroidler kimyasal yapı olarak hayvanlarda bulunan steroid hormonlarına en benzer gruptur; bitki ve hayvan steroid hormonlarının benzer kimyasal yapıları, belirli genlerin ifade olmasında benzer etkiler göstermektedir. Şöyle ki; bitki steroidleri insanlardaki eşey hormonları gibi, aynı olan pek çok şeyi yaparlar. Bir bitkide steroid fazla olduğunda, o bitki daha büyük, daha dayanıklı ve daha kuvvetli olmaktadır. Örneğin; mutasyon nedeniyle bitkiler steroid üretmediklerinde cüceleşirler. Steroidler aynı zamanda bitkide eşeyli üremeyi düzenlemektedirler (burada; belirli bir molekül grubunun farklı organizmalarda sinyal molekülleri olarak iş görmesi ilginçtir). Bir bitkinin steroid sentezlemek için kullandığı enzimlerin çoğu, kendi steroid çeşitlerini üreten hayvanlarda da bulunmaktadır. Dolayısıyla bu enzimlerle ilgili bazı genlerin, bitkiler ve hayvanların bir milyar yıldan daha uzun bir süre önce ortak bir atadan dallanmaları sebebiyle korunmuş olma olasılığı vardır. Buna karşın, steroidlere yanıtlarla ilgili sinyal yolundaki moleküller, bitki ve hayvanlarda çok büyük bir farklılık göstermektedir. KAYNAKLAR Purves, Sadava ve arkadaşları, Life – The Science of Biology, 7inci baskı. Campbell ve Reece, Biology, 6ncı baskı. Salisbury ve arkadaşları, Plant Physiology. Taiz ve Zeiger, Plant Physiology, 3üncü baskı. Ram Rao S. ve ark., Brassinosteroids – A new class of phytohormones, Current Science, Vol. 82, No. 10, 2002. Haydarabad, Hindistan. Kocaçalışkan İ., Bitki Fizyolojisi, Dumlupınar Üniversitesi www.pubmedcentral.nih.gov 4e.plantphysiol.org www.whfreeman.com www.hhmi.org

http://www.biyologlar.com/giberellinler-bitki-boyu-duzenleyicileri

BİYOKİMYA DERSİ ÇALIŞMA SORULARI ( 445 soru )

1) Biyokimyanın tanımı nasıldır? Canlı hücrelerin kimyasal yapı taşlarını ve bunların katıldığı reaksiyonları inceleyen bilim dalı… 2) Biyokimyanın amacı nedir? Canlı hücrelerle ilgili kimyasal olayların moleküler düzeyde tam olarak anlaşılmasını sağlamak 3) Biyokimyanın konuları nelerdir? Hücre bileşenlerinin doğası hakkındaki bilgilerin toplanması Hücre içinde sürekli olarak meydana gelen kimyasal dönüşümlerin incelenmesi 4) Canlı hücrelerin bilinen kimyasal yapı taşları nelerdir? Organik maddeler a) Karbonhidratlar b) Proteinler, amino asitler ve peptitler c) Enzimler d) Lipidler e) Nükleotidler ve nükleik asitler f) Porfirinler g) Hormonlar h) Vitaminler İnorganik maddeler a) Mineraller b) Su 5) Canlı organizmalarda en bol bulunan elementler nelerdir? Karbon (C), hidrojen (H), azot (N), oksijen (O), fosfor (P), kükürt (S) 6) Elementlerin en küçük kimyasal yapı taşı nedir? Atomlar 7) Kimyasal bağlar nelerdir? Kovalent bağlar Hidrojen bağları İyonik bağlar Van der Waals bağları 8) Bir organik moleküle spesifik kimyasal özelliklerini veren atom veya atom gruplarına ne denir? Fonksiyonel grup 9) Hidrofilik ne demektir? Suyu seven 10) Hidrofobik ne demektir? Suyu sevmeyen 11) Su moleküllerin ayrışmasıyla neler oluşur? Proton ve hidroksil iyonları 12) Nötral pH ne ifade eder? H+ ile OH- konsantrasyonlarının eşit olduğunu 13) pH nasıl tanımlanır? Bir çözeltideki H+ iyonları konsantrasyonunun eksi logaritması 14) Asidik çözeltinin pH’ı nedir? 7’den küçük 15) Alkali (bazik) çözeltinin pH’ı nedir? 7’den büyük 16) Nötral çözeltinin pH’ı nedir? 7 17) Asidik çözeltide H+ konsantrasyonu nasıldır? Yüksek 18) Alkali çözeltide H+ konsantrasyonu nasıldır? Düşük 19) Nötral çözeltide H+ konsantrasyonu nasıldır? OH- konsantrasyonuna eşit 20) Asitler nasıl tanımlanır? Sulu çözeltilerde proton dönörleri (vericileri) 21) Bazlar nasıl tanımlanır? Sulu çözeltilerde proton akseptörleri (alıcıları) 22) Bir proton donörü ve ona uygun proton akseptörü ne oluşturur? Konjuge asit-baz çifti 23) Zayıf bir asit (proton donörü) ve onun konjuge bazını (proton akseptörü) içeren sistemlere ne denir? Kimyasal tampon sistemi 24) Küçük miktarlarda asit (H+) veya baz (OH-) eklendiğinde pH değişikliklerine karşı koyma eğiliminde olan sulu sistemlere ne denir Kimyasal tampon sistemi 25) Kimyasal tamponlar nasıl tanımlanır? Küçük miktarlarda asit (H+) veya baz (OH-) eklendiğinde pH değişikliklerine karşı koyma eğiliminde olan sulu sistemler… 26) Vücuttaki önemli tampon sistemleri nelerdir? Karbonik asit/Bikarbonat tampon sistemi [H2CO3 / HCO3-]: Ekstrasellüler sıvılarda Primer fosfat/Sekonder fosfat tampon sistemi [H2PO4- / HPO4-2]: İntrasellüler sıvılarda, böbreklerde Asit Hemoglobin/Hemoglobinat tampon sistemi [HHb / Hb-]: Eritrositlerde Asit Protein/Proteinat tampon sistemi [H.Prot / Prot-]: Hücre içinde 27) Su, erkeklerde vücut ağırlığının % kaçını oluşturur? % 50-65’ini 28) Su, kadınlarda vücut ağırlığının % kaçını oluşturur? % 45-55’ini 29) Vücut sıvı bölükleri nelerdir? İntrasellüler (hücre içi) sıvı bölüğü: Toplam su miktarının %66’sı. Ekstrasellüler (hücre dışı) sıvı bölüğü: Toplam su miktarının %33’ü. Plazma hücreler arası (interstisyel)sıvı transsellüler sıvılar. 30) Klinik laboratuarlarda ölçülen anyon boşluğu nedir? Rutin olarak ölçülen katyonların (Na+, K+) konsantrasyonu ile anyonların (Cl-, HCO3-) konsantrasyonu arasındaki fark 31) Anyon boşluğunun normal değeri ne kadardır? 12 mmol/L 32) Vücut su dengesi bozuklukları nelerdir? Dehidratasyon Hiperosmolar dehidratasyon: Su kaybı sodyum kaybından fazla İzoosmolar dehidratasyon: Su ve sodyum kaybı dengeli Hipoosmolar dehidratasyon: Su kaybı daha az Ödem: Venöz dolaşımda basınç artışı veya plazma proteinlerinin onkotik basıncındaki azalma sonucu hücre dışı sıvı hacminde artış.... 33) Karbohidratların tanımı nasıldır? Kimyasal olarak polihidroksi aldehit veya ketondurlar veya hidroliz edildiklerinde böyle bileşikler veren maddeler... 34) Karbohidratların monomerik birimi nelerdir? Monosakkaritlerdir 35) Molekül yapılarında aldehid grubu olan monosakkaritlere ne denir? Aldozlar… 36) Molekül yapılarında keton grubu olan monosakkaritlere ne denir? Ketozlar… 37) Molekül yapılarında üç karbon atomu olan monosakkaritlere ne denir? Triozlar… 38) Molekül yapılarında dört karbon atomu olan monosakkaritlere ne denir? Tetrozlar… 39) Molekül yapılarında beş karbon atomu olan monosakkaritlere ne denir? Pentozlar… 40) Molekül yapılarında altı karbon atomu olan monosakkaritlere ne denir? Heksozlar… 41) Molekül yapılarında altı karbon atomu ve aldehid grubu olan monosakkaritlere ne denir? Aldoheksozlar… 42) Molekül yapılarında altı karbon atomu ve keton grubu olan monosakkaritlere ne denir? Ketoheksozlar… 43) Molekül yapılarında beş karbon atomu ve aldehid grubu olan monosakkaritlere ne denir? Aldopentozlar… 44) Molekül yapılarında beş karbon atomu ve keton grubu olan monosakkaritlere ne denir? Ketopentozlar… 45) Molekül yapılarında üç karbon atomu ve aldehid grubu olan monosakkaritlere ne denir? Aldotriozlar… 46) Molekül yapılarında üç karbon atomu ve keton grubu olan monosakkaritlere ne denir? Ketotriozlar… 47) Metabolizmada önemli aldotrioz nedir? Gliseraldehit… 48) Metabolizmada önemli ketotrioz nedir? Dihidroksi aseton 49) Metabolizmada önemli aldopentoz nedir? Riboz 50) Metabolizmada önemli aldoheksozlar nelerdir? Glukoz, mannoz, galaktoz… 51) Metabolizmada önemli ketoheksoz nedir? Fruktoz 52) Glukoz hangi sınıftan monosakkarittir? Aldoheksoz… 53) Fruktoz hangi sınıftan monosakkarittir? Ketoheksoz… 54) D- ve L- izomerleri eşit miktarlarda içeren ve optik aktivitesi olmayan karışımlara ne denir? Rasemat (rasemik karışım)… 55) Monosakkaritlerin a- ve b- formları (anomerler) hangi ortamda oluşur? Sulu çözeltilerde… 56) Karbohidratlara indirgeyici özelliklerini veren nedir? Molekülünde serbest yarı asetal veya yarı ketal hidroksili bulunması… 57) Monosakkaritlerin, Cu2+’ı Cu+’a indirgemeleri özellikleriyle ilgili deneyler hangileridir? Trommer ve Fehling deneyleri… 58) Pozitif Trommer ve Fehling deneylerinde gözlenen sarı renkli çökelti nedir? Bakır 1 hidroksit (CuOH) 59) Pozitif Trommer ve Fehling deneylerinde gözlenen kırmızı renkli çökelti nedir? Bakır 1 oksit (Cu2O) 60) Pozitif Trommer ve Fehling deneylerinde gözlenen turuncu renkli çökelti nedir? Bakır 1 hidroksit (CuOH) ile Bakır 1 oksit (Cu2O) karışımı… 61) Metabolizmada önemli bir şeker fosfatı nedir? Glukoz-6-fosfat 62) Metabolizmada önemli bir deoksi şeker nedir? Deoksiriboz 63) Metabolizmada önemli disakkaritler nelerdir? Maltoz, laktoz, sukroz (sakkaroz) 64) Maltozun molekül yapısında hangi monosakkaritler bulunur? Glukoz 65) Laktozun molekül yapısında hangi monosakkaritler bulunur? Glukoz ve galaktoz 66) Sukrozun molekül yapısında hangi monosakkaritler bulunur? Glukoz ve fruktoz 67) İki glukoz molekülünün Glc(a1®4)Glc biçiminde kondensasyonu ile oluşmuş disakkarit nedir? Maltoz 68) Bir galaktoz molekülü ile bir glukoz molekülünün Gal(b1®4)Glc biçiminde kondensasyonu ile oluşmuş disakkarit nedir? Laktoz 69) Bir glukoz molekülü ile bir fruktoz molekülünün Glc(a1®2)Fru biçiminde kondensasyonu ile oluşmuş disakkarit nedir? Sukroz 70) Maltoz çözeltisi ile yapılan bir Fehling deneyi nasıl sonuç verir? Pozitif sonuç 71) Laktoz çözeltisi ile yapılan bir Fehling deneyi nasıl sonuç verir? Pozitif sonuç 72) Sukroz çözeltisi ile yapılan bir Fehling deneyi nasıl sonuç verir? Negatif sonuç 73) Sukroz çözeltisi ile yapılan bir Fehling deneyi niçin Fehling negatif sonuç verir? Molekülünde serbest yarıasetal hidroksili olmadığı için… 74) Bitki hücrelerinin temel depo homopolisakkariti nedir? Nişasta 75) Hayvan hücrelerinin temel depo homopolisakkariti nedir? Glikojen 76) Nişasta molekülünü oluşturan monosakkarit nedir? Glukoz 77) Nişasta molekülünü oluşturan disakkarit nedir? Maltoz ve izomaltoz 78) Nişasta molekülünü oluşturan glukoz polimerleri nelerdir? Amiloz ve amilopektin 79) Nişasta molekülünde düz zincir biçimindeki glukoz polimeri nedir? Amiloz 80) Nişasta molekülünde dallı zincir biçimindeki glukoz polimeri nedir? Amilopektin 81) Glikojen özellikle hangi organlarda depo edilir? Karaciğer ve kasta 82) Sağlıklı bir erişkinde 8-12 saatlik açlıktan sonra enzimatik yöntemlerle ölçüldüğünde kan glukoz düzeyi nedir? %60-100 mg (60-100 mg/dL) 83) Kan glukoz düzeyini düşürücü yönde etkili olaylar nelerdir? 1) Glukozun indirekt oksidasyonu: Glukozun aerobik koşullarda glikoliz ve sitrik asit döngüsüyle yıkılımı. 2) Glukozun direkt oksidasyonu: Glukozun pentoz fosfat yolunda yıkılımı. 3) Glikojenez: Glukozun glikojene dönüşümü. 4) Liponeojenez: Glukozun yağ asitlerine ve yağa dönüşümü. 5) Glukozun glukuronik asit yolunda yıkılımı. 6) Glukozdan diğer monosakkaritlerin ve kompleks karbonhidratların oluşumu 84) Glikoliz nedir? Hücrenin sitoplazmasında altı karbonlu glukozun, on basamakta iki molekül üç karbonlu pirüvata yıkılması olayıdır 85) Glikolize uğrayan her glukoz molekülü için net kaç molekül ATP oluşmaktadır 2 ATP 86) Sitrik asit döngüsü (TCA döngüsü) nedir? Karbohidrat, yağ ve protein katabolizmasının ortak son ürünü olan asetil-CoA’nın asetil gruplarının mitokondride oksitlendiği döngüsel olaylar dizisi 87) Bir tek glukoz molekülünün tamamen CO2 ve H2O’ya oksitlenmesi suretiyle net kaç adet ATP kazancı olur? 38 adet ATP 88) Glukozun pentoz fosfat yolunda yıkılımı hücrenin hangi bölümünde gerçekleşir? Sitoplazmada 89) Glukozun pentoz fosfat yolunda yıkılımı sırasında ne oluşur? NADPH ve riboz-5-fosfat 90) Glikojenez nedir? Glikojen biyosentezi 91) Kan glukoz düzeyini yükseltici yönde etkili olaylar nelerdir? 1) Diyetle karbonhidrat alınması. 2) Glikojenoliz: Glikojenin yıkılımı. 3) Glikoneojenez: Karbohidrat olmayan maddelerden glukoz yapılımı 92) Glikojenoliz nedir? Glikojenin yıkılımı 93) Glikoneojenez nedir? Karbohidrat olmayan maddelerden glukoz yapılımı 94) Hiperglisemi nedir? 8-12 saatlik açlıktan sonra serum glukoz düzeyinin %110 mg’dan yüksek olması durumu 95) Hipoglisemi nedir? Serum glukoz düzeyinin %40 mg’dan düşük olması durumu. 96) Karbohidrat metabolizması bozuklukları nasıl sınıflandırılırlar? Emilim bozuklukları Dönüşüm bozuklukları Depolanma bozuklukları Kullanım bozuklukları 97) Karbohidrat metabolizmasının önemli bir emilim bozukluğu nedir? Laktaz eksikliği (süt intoleransı) 98) Karbohidrat metabolizmasının önemli bir dönüşüm bozukluğu nedir? Herediter fruktoz intoleransı, galaktozemi 99) Karbohidrat metabolizmasının önemli depolanma bozuklukları nelerdir? Glikojen depo hastalıkları (glikojenozlar) 100) Karbohidrat metabolizmasının önemli kullanım bozukluğu nedir? Diabetes mellitus 101) Diabetes mellitus, karbohidrat metabolizmasının ne tür bozukluğudur? Kullanım bozukluğu 102) Amino asitlerin tanımı nasıldır? Molekül yapılarında hem amino (-NH2) hem karboksil (-COOH) grubu içeren bileşikler 103) Standart amino asitler kaç tanedir? 20 142) En basit standart amino asit nedir? Glisin 105) Dallı yan zincirli standart amino asitler nelerdir? Valin, lösin, izolösin 106) Molekül yapılarında hidroksil (-OH) grubu içeren standart amino asitler nelerdir? Serin, treonin, tirozin 107) Molekül yapılarında kükürt içeren standart amino asitler nelerdir? Sistein, metiyonin 108) Molekül yapılarında ikinci bir karboksil (-COOH) grubu içeren standart amino asitler nelerdir? Aspartik asit, glutamik asit 109) Bir çözeltideki bir amino asit molekülü üzerinde net yükün sıfır olduğu pH değeri, ne olarak adlandırılır İzoelektrik nokta (pI) olarak adlandırılır 110) Amino asitlerin amino grupları ile verdikleri reaksiyonlara dayanan önemli bir tanımlama deneyi nedir? Van Slyke deneyi: Nitröz asitle azot gazı çıkışı… 111) Amino asitlerin amino ve karboksil gruplarının birlikte verdikleri reaksiyonlara dayanan önemli bir tanımlama deneyi nedir? Ninhidrin deneyi: Ninhidrin ile mavi-menekşe renk… 112) Amino asitlerin renk reaksiyonlarına dayanan önemli bir tanımlama deneyi nedir? Fenil halkası için ksantoprotein deneyi: Konsantre nitrik asit ile ısıtma sonucu sarı renk 113) Van Slyke deneyi, amino asitlerin hangi grupları ile verdikleri reaksiyonlara dayanan önemli bir tanımlama deneyidir? Amino grupları 114) Ninhidrin deneyi, amino asitlerin hangi grupları ile verdikleri reaksiyonlara dayanan önemli bir tanımlama deneyidir? Amino ve karboksil grupları 115) Önemli bir nonstandart amino asit nedir? 4-Hidroksiprolin 116) İki amino asitten oluşan bileşiklere ne denir? Dipeptit 117) Ona kadar amino asitten oluşan bileşiklere ne denir? Oligopeptit 118) Çok sayıda amino asitten oluşan bileşiklere ne denir? Polipeptit 119) Aminoasitlerin polimerlerine ne denir? Polipeptit, protein 120) Polipeptit veye proteinlerin monomerleri nelerdir? Amino asitler 121) Yapay tatlandırıcı olarak kullanılan aspartam hangi sınıftan bir bileşiktir? Dipeptit 122) Glutatyon hangi sınıftan bir bileşiktir? Tripeptit 123) Metabolizmada önemli bir tripeptit nedir? Glutatyon 124) Oksitosin ve vazopressin hangi sınıftan bir bileşiktir? Nonapeptit 125) Proteinler ne tür bileşiklerdir? Amino asitlerin polimerleri 126) Proteinlerin yapısındaki kovalent bağlar nelerdir? Peptit bağları ve disülfit bağları 127) Proteinlerin yapısındaki kovalent olmayan bağlar nelerdir? Hidrojen bağları, iyon bağları, hidrofob bağlar (apolar bağlar) 128) Proteinlerin primer yapısı hangi bağlarla oluşur? Peptit bağlarıyla 129) Proteinlerin denatüre oldukları deneysel olarak nasıl anlaşılır? Çözünürlüklerinin azalmasıyla… 130) Proteinleri denatüre eden etkenler nelerdir? Isı, X-ışını ve UV ışınlar, ultrason, uzun süreli çalkalamalar, tekrar tekrar dondurup eritmeler, asit etkisi, alkali etkisi, organik çözücülerin etkisi, derişik üre ve guanidin-HCl etkisi, salisilik asit gibi aromatik asitlerin etkisi, dodesil sülfat gibi deterjanların etkisi... 131) Proteinlerin reversibl (geri dönüşümlü) denatürasyonunda hangi yapıları bozulmaz (korunur)? Primer ve sekonder yapılar 132) Proteinlerin irreversibl (geri dönüşümsüz) denatürasyonunda hangi yapı bozulmaz (korunur)? Primer yapı 133) Proteinlerin tam hidrolizi sonucu ne oluşur Amino asitler 134) Proteinlerin yapılarına göre sınıfları ve alt sınıfları nelerdir? Basit proteinler: Globüler proteinler, fibriler proteinler… Bileşik proteinler: Fosfoproteinler, glikoproteinler, lipoproteinler, kromoproteinler, metalloproteinler… Türev proteinler: 135) Proteinlerin biyolojik rollerine (fonksiyonlarına) göre sınıfları nelerdir? Katalitik proteinler: Amilaz, pepsin, lipaz Taşıyıcı proteinler (transport proteinleri): Serum albümin, hemoglobin, lipoproteinler, transferrin Besleyici ve depo proteinler: Ovalbümin, kazein ferritin Kontraktil proteinler: Miyozin, aktin Yapısal proteinler: Kollajen, elastin Savunma (defans) proteinleri: İmmünoglobülinler, kan pıhtılaşma proteinleri Düzenleyici proteinler: İnsülin, büyüme hormonu Diğer proteinler: Fonksiyonları henüz daha fazla bilinmeyen ve kolayca sınıflandırılmayan çok sayıda protein 136) Proteinleri denatürasyon ve çökme tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri nelerdir? Sülfosalisilik asit ile çöktürme Konsantre nitrik asit ile çöktürme Triklorasetik asit (TCA) ile çöktürme Isıtma ile çöktürme 137) Proteinleri renk tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri nelerdir? Biüret tepkimesi: Biüret reaktifi ile mor renkli kompleks oluşması 138) Azot dengesi nedir? Total azot alınımı ile azot kaybı arasındaki fark 139) Pozitif azot dengesi nedir? Azot için alınım>atılım 140) Negatif azot dengesi nedir? Azot için atılım>alınım 141) Esansiyel amino asit deyince ne anlaşılır? Vücutta sentezlenmeyen, besinlerle dışarıdan alınması zorunlu olan amino asitler… 142) Esansiyel olmayan amino asit deyince ne anlaşılır? Vücutta sentezlenebilen, besinlerle dışarıdan alınması zorunlu olmayan amino asitler… 143) Esansiyel amino asitler nelerdir? Valin, lösin, izolösin, treonin, metionin, fenilalanin, triptofan, lizin ve gelişmekte olanlarda arjinin ile histidin 144) Esansiyel olmayan amino asitler nelerdir? Glisin, alanin, serin, sistein, prolin, tirozin, glutamat, glutamin, aspartat, asparajin ve erişkinlerde arjinin ile histidin 145) Amino asitlerin hücre içindeki reaksiyonları nelerdir? Transaminasyon: Bir amino asidin amino grubunun bir keto aside taşınması (yeni amino asitler oluşur) Deaminasyon: Amino asitlerdeki amino grubunun amonyak şeklinde ayrılması (keto asitler oluşur) Amino asitlerden metil ve diğer 1 karbonlu birimlerin sağlanması (çeşitli bileşikler oluşur) Dekarboksilasyon: Amino asidin yapısındaki karboksil grubunun CO2 halinde ayrılması (biyojen aminler oluşur) 146) Protein metabolizması bozuklukları nelerdir? Serum proteinlerinde değişiklikler (Disproteinemiler): Hiperproteinemi Hipoproteinemi Dokularda normalde bulunmayan proteinlerin ortaya çıkışı Amiloidoz Beslenim eksikliği (malnutrisyon) ile ilgili durumlar Kwashiorkor Marasmus 147) Mental gerilikle birlikte olan amino asit metabolizması bozuklukları nelerdir? Fenilketonüri: Fenil alanin metabolizması bozukluğu Homosistinüri: Metiyonin metabolizması bozukluğu Akça ağaç şurubu idrar hastalığı: Dallı zincirli amino asitlerin metabolizması bozukluğu Hiperglisinemi: Glisin metabolizması bozukluğu Histidinemi: Histidin metabolizması bozukluğu Hiperprolinemi: Prolin metabolizması bozukluğu 148) Membranlarda transport bozukluğu ile ilgili amino asit metabolizması bozuklukları nelerdir? Hartnup hastalığı: Triptofan metabolizması bozukluğu Glisinüri: Böbreklerde glisin geri emilimi bozukluğu Sistinüri: İdrarda fazla miktarda sistin atılması 149) Amino asit ve metabolitlerinin depolanması ile ilgili amino asit metabolizması bozuklukları nelerdir? Primer hiperoksalüri: Glisin metabolizması bozukluğu Sistinozis: Özellikle retiküloendoteliyal sistemde olmak üzere sistin kristallerinin birçok doku ve organda birikmesi Alkaptonüri: Tirozin metabolizması bozukluğu 150) Enzimlerin tanımı nasıldır? Biyolojik sistemlerin reaksiyon katalizörleri; biyokimyasal olayların vücutta yaşam ile uyumlu bir şekilde gerçekleşmesini sağlayan kimyasal ajanlar… 151) Enzimlerle katalize edilen tepkimeye katılan kimyasal moleküllere ne ad verilir? Substrat 152) Enzimlerin yapısal özellikleri nasıldır? Katalitik RNA moleküllerinin küçük bir grubu hariç bütün enzimler proteindirler 153) Bazı enzimler katalitik aktivite için ne gerektirirler? Kofaktör 154) Katalitik olarak aktif tam bir enzim, kofaktörü ile birlikte ne olarak adlandırılır? Holoenzim 155) Enzimlerin altı büyük sınıfı nelerdir? 1. Oksidoredüktazlar 2. Transferazlar 3. Hidrolazlar 4. Liyazlar 5. İzomerazlar 6. Ligazlar 156) Laktat dehidrogenaz hangi sınıftan enzimdir? Oksidoredüktaz 157) Kreatin kinaz hangi sınıftan enzimdir? Transferaz. Fosfat grubu transfer eder… 158) a-Amilaz hangi sınıftan enzimdir? Hidrolaz 159) Adenilat siklaz hangi sınıftan enzimdir? Liyaz 160) Fosfoglukomutaz hangi sınıftan enzimdir? İzomeraz 161) Arjininosüksinat sentaz hangi sınıftan enzimdir? Ligaz 162) Katalizör olarak bir enzimin fonksiyonu nedir? Aktivasyon enerjisini düşürmek suretiyle bir reaksiyonun hızını artırmak… 163) Enzimle katalizlenen bir reaksiyon nerede meydana gelir? Enzim üzerinde aktif merkez denen bir cep sınırları içinde… 164) En çok kullanılan enzim aktivitesi birimi nedir? İnternasyonel ünite (IU) 165) 1 IU enzim aktivitesi deyince ne anlaşılır? Optimal koşullarda 1 dakikada 1mmol substratı değiştiren enzim etkinliği… 166) Enzimatik bir reaksiyonun hızını etkileyen faktörler nelerdir? Enzim konsantrasyonu Substrat konsantrasyonu pH Isı veya sıcaklık Zaman Işık ve diğer fiziksel faktörler İyonların doğası ve konsantrasyonu Hormonlar ve diğer biyokimyasal faktörler Reaksiyon ürünleri 167) Bir enzim tarafından katalizlenen bir reaksiyonun hızının zamanla azalmasının nedeleri nelerdir? Reaksiyon ürünlerinin kendi aralarında birleşerek aksi yönde bir reaksiyon meydana getirmeleri Enzimin zamanla inaktive olması Reaksiyonu önleyen maddelerin oluşması Substratın tükenmesi… 168) Enzimatik aktivetinin düzenlenmesi hangi etkilerle olur? Allosterik enzimler Protein/protein etkileşimi Kovalent modifikasyon/kaskat sistemler Zimojen aktivasyon Enzim sentezinin indüksiyonu veya represyonu 169) Proteolitik yıkılım vasıtasıyla aktive edilen enzimlerin inaktif prekürsörü ne olarak isimlendirilir? Zimojen 170) Enzim inhibisyonu çeşitleri nelerdir? Reversibl enzim inhibisyonları 1) Kompetitif (yarışmalı) enzim inhibisyonu 2) Nonkompetitif (yarışmasız) enzim inhibisyonu 3) Ankompetitif enzim inhibisyonu İrreversibl enzim inhibisyonları 171) Bir enzimin izoenzimleri deyince ne anlaşılır? Belli bir enzimin katalitik aktivitesi aynı, fakat elektriksel alanda göç, doku dağılımı, ısı, inhibitör ve aktivatörlere yanıtları farklı olan formları… 172) Kreatin kinaz enzimin izoenzimleri nelerdir? CK1 (CK-BB ) CK2 (CK-MB ) CK3 (CK-MM) 173) Koenzim deyince ne anlaşılır? Bazı enzimlerin aktiviteleri için gerekli olan ve kofaktör diye adlandırılan ek kimyasal komponentlerin organik veya metalloorganik molekül yapısında olanları… 174) Prostetik grup deyince ne anlaşılır? Koenzimlerin enzim proteinine kovalent olarak bağlı olup enzimden ayrılmayanları… 175) Kosubstrat deyince ne anlaşılır? Koenzimlerin enzim proteinine nonkovalent olarak bağlı olup enzimden ayrılabilenleri… 176) Koenzimlerin fonksiyonlarına göre grupları nelerdir? 1) Hidrojen ve elektron transfer eden koenzimler. 2) Fonksiyonel grup transfer eden koenzimler. 3) Liyaz, izomeraz ve ligazların koenzimleri. 177) Hidrojen ve elektron transfer eden koenzimler nelerdir? NAD+ - NADH NADP+ - NADPH FAD - FADH2 FMN - FMNH2 Koenzim Q Demir porfirinler Demir-kükürt proteinleri a-Lipoik asit 178) Fonksiyonel grup transfer eden koenzimler nelerdir? Piridoksal-5-fosfat (PLP) Tiamin pirofosfat (TPP) Koenzim A (CoA×SH) Biotin (vitamin H) Tetrahidrofolat (H4 folat) Koenzim B12 (5'-deoksiadenozil kobalamin) 179) Klinik enzimoloji nedir? İnsanlarda görülen hastalıkların tanı veya ayırıcı tanısının yapılması ve sağaltımın izlenmesinde enzimatik ölçümlerin uygulanması ile ilgilenen bilim dalı 180) Enzimatik ölçümler için uygun biyolojik materyaller nelerdir? Biyolojik sıvılar: Kan, BOS, amniyon sıvısı, idrar, seminal sıvı Eritrositler Lökositler Doku biyopsi örnekleri Doku hücre kültürleri 181) Kanda bulunan enzimlerin kaynakları nelerdir? Plazmaya özgü enzimler: Fibrinojen gibi... Sekresyon enzimleri: a-Amilaz gibi... Sellüler enzimler: Transaminazlar gibi... 182) Serum enzim düzeyini etkileyen faktörler nelerdir? Enzimlerin hücrelerden serbest kalma hızı Enzim üretiminde değişiklikler Enzimlerin dolaşımdan uzaklaştırılma hızı Enzim aktivitesini artıran nonspesifik nedenler 183) Kan enzimlerinin aktivite tayinlerinde dikkat edilecekler nelerdir? Kan, antikoagulansız tüpe (düz tüp) alınmalıdır Kan genellikle venden alınır Kan alırken hemolizden kaçınmalıdır Kan, pıhtılaşmasından hemen sonra santrifüj edilerek serum ayrılmalıdır Günlük taze kan kullanılması en iyisidir 184) Klinik tanıda önemli olan serum enzimleri nelerdir? Transaminazlar (AST ve ALT) Laktat dehidrojenaz (LDH, LD) Kreatin kinaz (CK, CPK) Fosfatazlar (ALP ve ACP) Amilaz (AMS) Lipaz (LPS) Gama glutamiltransferaz (GGT, g-GT) Aldolaz (ALS) 5¢-nükleotidaz (5¢-NT) Lösin aminopeptidaz (LAP) Psödokolinesteraz (ChE) Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G-6-PD) 185) Enzimatik tanı alanları nelerdir? Kalp ve akciğer hastalıkları Karaciğer hastalıkları Kas hastalıkları Kemik hastalıkları Pankreas hastalıkları Maligniteler Genetik hastalıklar Hematolojik hastalıklar Zehirlenmeler 186) Kalp ve akciğer hastalıklarının tanısında yararlı enzimler nelerdir? Total kreatin kinaz (CK, CPK) CK-MB Aspartat transaminaz (AST) Laktat dehidrojenaz (LD, LDH) 187) Karaciğer hastalıklarının tanısında yararlı enzimler nelerdir? Transaminazlar (ALT, AST) LDH GGT (g-GT) ALP 5¢-nükleotidaz (5¢-NT) Lösin aminopeptidaz (LAP) 188) Kas hastalıklarının tanısında yararlı enzimler nelerdir? CK LDH Aldolaz AST 189) Kemik hastalıklarının tanısında yararlı enzimler nelerdir? Alkalen fosfataz (ALP) Asit fosfataz (ACP) Osteoblastik aktivite artışı ile karakterize kemik hastalıklarında ALP yükselir Osteoklastik kemik hastalıklarında ALP yanında ACP da yükselir. 190) Pankreas hastalıklarının tanısında yararlı enzimler nelerdir? a-amilaz Lipaz 191) Malignitelerin tanısında yararlı enzimler nelerdir? Organ spesifik enzimler: ACP, ALP, GGT, 5¢-nükleotidaz, lösin aminopeptidaz (LAP), a-amilaz ve lipaz Organ spesifik olmayan enzimler: LDH, aldolaz, fosfoheksoz izomeraz 192) Genetik hastalıkların tanısında yararlı enzimler nelerdir? Fenilalanin hidroksilaz, Galaktoz-1-fosfat üridiltransferaz, Glukoz-6-fosfataz… 193) Hematolojik hastalıkların tanısında yararlı enzimler nelerdir? Anaerobik glikoliz ile ilgili bazı enzimler Pentoz fosfat yolu ile ilgili bazı enzimler Glutatyon metabolizması ile ilgili bazı enzimler Adenozin deaminaz gibi pürin ve pirimidin katabolizması enzimleri Na+/K+ ATPaz Lesitin kolesterol açil transferaz (LCAT) methemoglobin redüktaz 194) Zehirlenmelerin tanısında yararlı enzimler nelerdir? Organik fosfor bileşikleri ile zehirlenme durumlarında serum kolinesteraz (ChE) düzeyi düşük bulunur 195) Lipidlerin tanımı nasıldır? Ya gerçekten ya da potansiyel olarak yağ asitleri ile ilişkileri olan heterojen bir grup bileşik… 196) Lipidlerin ortak özellikleri nelerdir? Biyolojik kaynaklı organik bileşiklerdir Suda çözünmeyen, apolar veya hidrofob bileşiklerdir Kloroform, eter, benzen, sıcak alkol, aseton gibi organik çözücülerde çözünebilirler Enerji değerleri yüksektir 197) Lipidler yapılarına göre nasıl sınıflandırılırlar? Basit lipitler Bileşik lipitler Lipit türevleri Lipitlerle ilgili diğer maddeler 198) Basit lipidler ne tür bileşiklerdir? Yağ asitlerinin çeşitli alkollerle oluşturdukları esterler… 199) Nötral yağ deyince ne anlaşılır? Trigliseridler (triaçilgliseroller) 200) Trigliseridler yapılarına göre hangi sınıftan lipidlerdir? Basit lipidler 201) Bileşik lipidler ne tür bileşiklerdir? Yağ asitleri ve alkole ek olarak başka gruplar içeren lipidler… 202) Keton cisimleri nelerdir? Asetoasetik asit, b-hidroksibutirik asit ve aseton 203) Lipidler biyolojik rollerine (fonksiyonlarına) göre nasıl sınıflandırılırlar? Depo lipidler Membran lipidleri 204) Depo lipidler nelerdir? Trigliseridler (triaçilgliseroller) 205) Membran lipidleri nelerdir? Kolesterol Glikolipidler Sfingolipidler 206) Yağ asitleri sınıfları nelerdir? Doymuş (satüre) yağ asitleri Doymamış (ansatüre) yağ asitleri Ek gruplu yağ asitleri Halkalı yapılı yağ asitleri 207) Palmitik asit ve stearik asit hangi sınıftan yağ asitleridir? Doymuş (satüre) yağ asitleri 208) Doymuş (satüre) yağ asidi deyince ne anlaşılır? Molekülünde çift bağ içermeyen, sadece tek bağ içeren yağ asitleri… 209) Oleik asit ve araşidonik asit hangi sınıftan yağ asitleridir? Doymamış (ansatüre) yağ asitleri 210) Doymamış (ansatüre) yağ asidi deyince ne anlaşılır? Molekülünde çift bağ içeren yağ asitleri… 211) Tekli doymamış (monoansatüre) yağ asidi deyince ne anlaşılır? Molekülünde bir çift bağ içeren yağ asitleri… 212) Oleik asit ne tür bir yağ asididir? Tekli doymamış (monoansatüre) 213) Çoklu doymamış (poliansatüre) yağ asidi deyince ne anlaşılır? Moleküllerinde iki veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitleri… 214) Araşidonik asit ne tür bir yağ asididir? Çoklu doymamış (poliansatüre) 215) Yağ asitlerinin kimyasal özellikleri nelerdir? Esterleşme Tuz oluşturma Çift bağların hidrojenlenmesi (hidrojenizasyon) Halojenlenme Oksitlenme 216) Trigliseridler (triaçilgliseroller) kimyasal yapılarına göre net tür bileşiklerdir? Gliserolün yağ asidi esterleri… 217) Karbon sayısı 6’dan fazla olan yağ asitlerinin metallerle oluşturduğu tuzlara ne denir? Sabun 218) Sabunlar kimyasal yapılarına göre net tür bileşiklerdir? Karbon sayısı 6’dan fazla olan yağ asitlerinin metallerle oluşturduğu tuzlar… 219) Yağ asitlerinin halojenlenmesi ne demektir? Doymamış yağ asitlerinin yapısında yer alan etilen bağının fluor, klor, brom, iyot gibi halojenlerden biri ile doyurulması… 220) İyot indeksi nedir? 100 g doymamış yağın gram cinsinden tuttuğu iyot miktarı… 221) Steroidler kimyasal yapılarına göre net tür bileşiklerdir? 17 karbonlu steran halkası (gonan halkası, siklopentano-perhidrofenantren halkası) içeren bileşikler… 222) Steroid sınıfları nelerdir? Steroller (sterinler). Safra asitleri. Cinsiyet hormonları. Adrenal korteks hormonları. Vitamin D grubu maddeler. 223) Hayvansal kökenli steroid nedir? Kolesterol 224) Safra asitleri kimyasal yapılarına göre net tür bileşiklerdir? 24 karbonlu steroidlerdir; kolanik asidin oksi türevleridirler… 225) Safra asidi sınıfları nelerdir? Primer safra asitleri: Kolik asit (3,7,12-Trihidroksikolanik asit) ile kenodezoksikolik asit (3,7-Dihidroksikolanik asit) Sekonder safra asitleri: Dezoksikolik asit (3,12-Dihidroksikolanik asit) ile litokolik asit (3-Hidroksikolanik asit) 226) Safra asitlerinin fonksiyonları nelerdir? Yüzey gerilimini azaltıcı etkileriyle emülsiyonlaşmayı kolaylaştırırlar; hem yağların hem yağda çözünen vitaminlerin 0,3-1m çapında emülsiyon veya 16-20Ao çapında miseller halinde emilmelerini sağlarlar. Safra içindeki kolesterolün çökmesini önlerler. İntestinal motiliteyi artırırlar. Kolesterol esterazı ve ince bağırsağın üst kısımlarında lipazı aktive ederler 227) Lipoproteinlerin tanımı nasıldır? Fosfolipitler, kolesterol, kolesterol esterleri ve trigliseridlerin çeşitli kombinasyonları ile apolipoproteinler denen spesifik taşıyıcı proteinlerin moleküler agregatları… 228) Lipoprotein sınıfları nelerdir? Şilomikronlar: VLDL’ler: Çok düşük dansiteli lipoproteinler IDL’ler: Ara dansiteli lipoproteinler LDL’ler: Düşük dansiteli lipoproteinler Lp (a): HDL’ler: Yüksek dansiteli lipoproteinler 229) Eikozanoidlerin tanımı nasıldır? Omurgalı hayvanların çeşitli dokularında son derece güçlü hormon benzeri etkilerinin çeşitliliği ile bilinen, 20 karbonlu poliansatüre yağ asidi olan 20: 4D5, 8, 11, 14 araşidonik asit türevi bileşikler… 230) Eikozanoid sınıfları nelerdir? Prostaglandinler Tromboksanlar Lökotrienler 231) LDL’nin kolesterolü taşıma özelliği nedir? Karaciğerden başka dokulara taşır… 232) HDL’nin kolesterolü taşıma özelliği nedir? Başka dokulardan karaciğere taşır… 233) Sağlıklı bir erişkinin kan plazmasında 8-10 saatlik açlıktan sonra total olarak ne kadar lipid bulunur? %400-700 mg kadar 234) Sağlıklı bir erişkinin kan plazmasında 8-10 saatlik açlıktan sonra total olarak ne kadar kolesterol bulunur? %140-200 mg 235) Hiperkolesterolemi ne demektir? Kan kolesterol düzeyi yüksekliği 236) Kan kolesterol düzeyi yüksekliğine ne denir? Hiperkolesterolemi 237) Dislipoproteinemi ne demektir? Serum lipoprotein düzeylerinin düşük veya yüksek olması… 238) Hiperlipoproteinemi ne demektir? Serum lipoprotein düzeylerinin yüksek olması… 239) Hiperlipoproteinemi sınıfları nelerdir? Tip I hiperlipoproteinemi, Tip IIa hiperlipoproteinemi, Tip IIb hiperlipoproteinemi, Tip III hiperlipoproteinemi, Tip IV hiperlipoproteinemi Tip V hiperlipoproteinemi 240) Nükleik asit monomerleri nelerdir? Nükleotidler 241) Nükleik asit sınıfları nelerdir? Deoksiribonükleik asit (DNA) Ribonükleik asit (RNA) 242) Nükleotidlerin yapısında neler bulunur? Azotlu baz, pentoz ve fosfat 243) Nükleotidlerin yapısında bulunan pentozlar nelerdir? Riboz ve deoksiriboz 244) Nükleotidlerin yapısında bulunan pirimidin bazları nelerdir? Sitozin, timin, urasil 245) Nükleotidlerin yapısında bulunan pürin bazları nelerdir? Adenin, guanin 246) DNA nükleotidlerin yapısında bulunan pirimidin bazları nelerdir? Sitozin ve timin 247) RNA nükleotidlerin yapısında bulunan pirimidin bazları nelerdir? Sitozin ve urasil 248) Nükleotidlerin fonksiyonları nelerdir? Nükleik asitlerin alt üniteleridirler Hücrede kimyasal enerjiyi taşırlar Birçok enzim kofaktörlerinin komponentleridirler Sellüler haberleşmede aracıdırlar 249) DNA’nın tanımı nedir? Canlı hücrelerde genetik bilginin saklandığı kromozomal komponent… 250) DNA’da saklı genetik bilginin kalıtımını sağlayan olay nedir? Replikasyon 251) DNA’da saklı genetik bilginin RNA’ya aktarılmasını sağlayan olay nedir? Transkripsiyon 252) DNA’da saklı genetik bilginin protein haline çevrilmesini sağlayan son olay nedir? Translasyon 253) Bölünme evresinde olmayan ökaryotik hücrelerde nükleustan izole edilen kromozomal materyal ne olarak tanımlanır? Kromatin 254) Bölünme evresinde olan ökaryotik hücrelerde nükleustan izole edilen genetik materyal ne olarak tanımlanır? Kromozom 255) Kromozomların, örneğin göz rengi gibi tek bir karakter veya fenotipi (görünen özellik) belirleyen veya etkileyen bölümleri ne olarak tanımlanır? Gen 256) Gen tanımı nasıldır? Kromozomların, örneğin göz rengi gibi tek bir karakter veya fenotipi (görünen özellik) belirleyen veya etkileyen bölümleri… 257) DNA’da kodlayıcı segmentler ne olarak adlandırılırlar? Ekson 258) DNA’da kodlayıcı olmayan segmentler ne olarak adlandırılırlar? İntron 259) Ekstrakromozomal DNA’lar nelerdir? Viral DNA molekülleri Bakterilerin birçok türünde plazmid Mitokondriyal DNA Fotosentetik hücrelerin kloroplastlarındaki DNA 260) DNA’nın kimyasal özellikleri nelerdir? Çift heliks yapılı DNA, denatüre edilebilir ve denatüre olan DNA renatüre olabilir Farklı türlere ait DNA’lar hibridler (melezler) oluşturabilirler DNA, nonenzimatik transformasyona uğrayabilir DNA moleküllerindeki belli nükleotid bazları, sıklıkla enzimatik olarak metillenirler 261) RNA’nın tanımı nasıldır? DNA’daki genetik bilgiyi bir fonksiyonel proteine dönüştürmekte aracı rol oynayan nükleik asit… 262) RNA çeşitleri nelerdir? Haberci RNA (messenger RNA, mRNA) Taşıyıcı RNA (transfer RNA, tRNA) Ribozomal RNA (rRNA) 263) mRNA’nın tanımı nasıldır? Protein sentezi için gerekli genetik mesajı nükleustaki DNA’dan sitoplazmadaki ribozomlara taşıyan RNA’lardır. Protein sentezi için kalıp görevi görür… 264) mRNA üzerindeki, her biri bir amino aside uyan üçlü baz gruplarına denir Kodon 265) tRNA’nın tanımı nasıldır? Sekonder yapıları yonca yaprağı şeklinde olan RNA’dır. Protein sentezine girecek amino asitleri sentez yerine taşır… 266) İnsanda pürin nükleotidlerinin yıkılımının son ürünü nedir? Ürik asit 267) İnsanda pirimidin nükleotidlerinin yıkılımının son ürünü nedir? b-alanin, CO2, NH3 ve b-aminoizobutirat 268) Pirimidin metabolizması bozuklukları nelerdir? Orotik asidüri 269) Pürin metabolizması bozuklukları nelerdir? Gut hastalığı Lesch-Nyhan sendromu Anormal pürin metabolizması ile ilgili immün yetmezlik hastalıkları Adenozin deaminaz eksikliği Pürin nükleozid fosforilaz eksikliği Hipoürisemi 270) Vitamin tanımı nasıldır? Sağlıklı beslenme için küçük miktarlarda alınmaları zorunlu olan, herhangi birinin eksikliği spesifik bir bozukluk ve hastalık meydana getiren organik maddeler 271) Vitamin sınıfları nelerdir? Suda çözünen vitaminler Yağda çözünen vitaminler Vitamin benzeri bileşikler 272) Önemli suda çözünen vitaminler nelerdir? Vitamin B1 (tiamin, antiberiberik vitamin) Vitamin B2 (riboflavin, laktoflavin) Nikotinik asit (niasin) Vitamin B5 (pantotenik asit) Vitamin B6 (piridoksin) Biotin (vitamin H) Folik asit Vitamin B12 Vitamin C (askorbik asit) 273) Diğer vitaminlerin eksikliği ile birlikte olan hangi vitamin eksikliği hallerinde beriberi hastalığı tablosu ortaya çıkar? Tiamin (B1 vitamini) 274) Diğer vitaminlerin eksikliği ile birlikte olan tiamin eksikliği hallerinde hangi hastalık tablosu ortaya çıkar? Beriberi 275) Diğer vitaminlerin eksikliği ile birlikte olan hangi vitamin eksikliği hallerinde seboreli dermatit, keratokonjunktivit, atrofik glossit, ağız köşesi çatlağı (cheilosis, ragad) görülür? Vitamin B2 (riboflavin, laktoflavin) 276) Diğer vitaminlerin eksikliği ile birlikte olan riboflavin (B2 vitamini) eksikliği hallerinde hangi klinik tablo görülür? Seboreli dermatit, keratokonjunktivit, atrofik glossit, ağız köşesi çatlağı (cheilosis, ragad) 277) Tiamin diye bilinen vitamin hangi vitamindir? B1 vitamini 278) Riboflavin diye bilinen vitamin hangi vitamindir? B2 vitamini 279) Antiberiberik vitamin diye bilinen vitamin hangi vitamindir? B1 vitamini (tiamin) 280) Pellegraya karşı koruyucu faktör (PP vitamini) diye bilinen vitamin hangi vitamindir? Niasin (nikotinik asit) 281) İnsanda nikotinamid eksikliğinde derinin güneş gören yerlerinde dermatitis, diyare ve demans ile karakterize hangi klinik tablo oluşur? Pellegra 282) Derinin güneş gören yerlerinde dermatitis, diyare ve demans ile karakterize pellegra tablosu insanda hangi vitamin eksikliğinde oluşur? Niasin (nikotinik asit) 283) Tüberküloz tedavisinde kullanılan izoniazid verilmesiyle hangi vitaminin eksiklik belirtileri meydana gelebilir? Vitamin B6 284) Yumurta akında bulunan ve avidin adı verilen bir glikoprotein, hangi vitamin ile birleşerek sindirilemeyen ve dolayısıyla bağırsaktan emilemeyen bir kompleks meydana getirir? Biotin (vitamin H) 285) Megaloblastik anemi, lökopeni ve trombositopeni hangi vitamin eksikliğinde ortaya çıkar? Folik asit 286) Pernisiyöz anemi diye tanımlanan megaloblastik anemi tablosu hangi vitaminin eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkar? B12 vitamini 287) Askorbik asit diye bilinen vitamin hangi vitamindir? C vitamini 288) Askorbik asit eksikliğinde insanlarda hangi hastalık meydana gelir? Skorbüt hastalığı 289) Skorbüt hastalığı insanlarda hangi vitamin eksikliğinde meydana gelir? C vitamini (askorbik asit) 290) Önemli vitamin benzeri bileşikler nelerdir? Kolin Karnitin a-lipoik asit PABA (p-aminobenzoat) İnozitol Koenzim Q Biyoflavonoidler (vitamin P) 291) Özellikle uzun zincirli yağ asitlerinin b-oksidasyonla yıkılmak üzere sitoplazmadan mitokondri içine transportunda görev alan vitamin benzeri bileşik nedir? Karnitin 292) Önemli yağda çözünen vitaminler nelerdir? Vitamin A (retinoidler) Vitamin D (kalsiferoller) Vitamin E (tokoferoller) Vitamin K (naftokinonlar) 293) Karanlığa karşı adaptasyon bozukluğu ile karakterize gece körlüğü (niktalopi), hangi vitamin eksikliğinin erken belirtilerinden biridir? Vitamin A 294) Vitamin A eksikliğinin erken belirtilerinden biri olan, karanlığa karşı adaptasyon bozukluğu ile karakterize bulgu nedir? Gece körlüğü (niktalopi) 295) Kalsitriol diye bilinen bileşik nedir? 1a,25-dihidroksi vitamin D3 (aktif vitamin D3) 296) İskeletin gelişmesi döneminde vitamin D eksikliğinin neden olduğu klinik durum, nedir? Raşitizm 297) İskelet gelişimi tamamlandıktan sonra vitamin D eksikliğinin neden olduğu klinik durum nedir? Osteomalazi 298) Kolekalsiferol diye bilinen bileşik nedir? Vitamin D3 299) Ergokalsiferol diye bilinen bileşik nedir? Vitamin D2 300) Karaciğerde, kanın pıhtılaşma faktörlerinden bazılarının oluşmasında gerekli vitamin hangisidir? Vitamin K 301) K vitamini, karaciğerde kanın pıhtılaşma faktörlerinden hangilerinin oluşmasında gereklidir? Faktör II (protrombin), faktör VII (prokonvertin), faktör IX (plazma tromboplastin komponenti) ve faktör X (Stuart faktörü) 302) İnsan vücudunda nispeten önemli miktarlarda bulunan majör mineraller nelerdir? Sodyum (Na) Potasyum (K) Klor (Cl) Magnezyum (Mg) Kalsiyum (Ca) Fosfor (P) 303) İnsan vücudunda oldukça az miktarlarda bulunan minör mineraller (iz elementler, eser elementler) nelerdir? Bakır (Cu) Demir (Fe) Çinko (Zn) Kobalt (Co) Molibden (Mo) Manganez (Mn) Kadmiyum (Cd) Lityum (Li) Selenyum (Se) Krom (Cr) Nikel (Ni) Vanadyum (V) Arsenik (As) Silisyum (Si) Bor (B ) Kükürt (S) İyot (I) Flüor (F) 304) Erişkin sağlıklı bir insanda serum sodyum düzeyinin normal değeri nedir? 140±7,3 mEq/L 305) Serum sodyum düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hipernatremi 306) Serum sodyum düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hiponatremi 307) Hipernatremi deyince ne anlaşılır? Serum sodyum düzeyinin normalden yüksek olması 308) Hiponatremi deyince ne anlaşılır? Serum sodyum düzeyinin normalden düşük olması 309) Erişkin sağlıklı bir insanda serum potasyum düzeyinin normal değeri nedir? 3,5-5,1 mEq/L 310) Serum potasyum düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hiperpotasemi (hiperkalemi) 311) Serum potasyum düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hipopotasemi (hipokalemi) 312) Hiperpotasemi (hiperkalemi) deyince ne anlaşılır? Serum potasyum düzeyinin normalden yüksek olması 313) Hipopotasemi (hipokalemi) deyince ne anlaşılır? Serum potasyum düzeyinin normalden düşük olması 314) Erişkin sağlıklı bir insanda serum klorür düzeyinin normal değeri nedir? 98-108 mEq/L 315) Serum klorür düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hiperkloremi 316) Serum klorür düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hipokloremi 317) Hiperkloremi deyince ne anlaşılır? Serum klorür düzeyinin normalden yüksek olması 318) Hipokloremi deyince ne anlaşılır? Serum klorür düzeyinin normalden düşük olması 319) Erişkin sağlıklı bir insanda serum magnezyum düzeyinin normal değeri nedir? 1,7-3,0 mg/dL 320) Serum magnezyum düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hipermagnezemi 321) Serum magnezyum düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hipomagnezemi 322) Hipermagnezemi deyince ne anlaşılır? Serum magnezyum düzeyinin normalden yüksek olması 323) Hipomagnezemi deyince ne anlaşılır? Serum magnezyum düzeyinin normalden düşük olması 324) Erişkin sağlıklı bir insanda serum kalsiyum düzeyinin normal değeri nedir? 8,5-11,5 mg/dL 325) Serum kalsiyum düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hiperkalsemi 326) Serum kalsiyum düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hipokalsemi 327) Hiperkalsemi deyince ne anlaşılır? Serum kalsiyum düzeyinin normalden yüksek olması 328) Hipokalsemi deyince ne anlaşılır? Serum kalsiyum düzeyinin normalden düşük olması 329) Erişkin sağlıklı bir insanda serum inorganik fosfor düzeyinin normal değeri nedir? 2,5-4,5 mg/dL 330) Serum inorganik fosfor düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hiperfosfatemi 331) Serum inorganik fosfor düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hipofosfatemi 332) Hiperfosfatemi deyince ne anlaşılır? Serum inorganik fosfor düzeyinin normalden yüksek olması 333) Hipofosfatemi deyince ne anlaşılır? Serum inorganik fosfor düzeyinin normalden düşük olması 334) Erişkin sağlıklı bir insanda serum bakır düzeyinin normal değeri nedir? 65-165 mg/dL 335) Serum bakır düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hiperkupremi 336) Serum bakır düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hipokupremi 337) Hiperkupremi deyince ne anlaşılır? Serum bakır düzeyinin normalden yüksek olması 338) Hipokupremi deyince ne anlaşılır? Serum bakır düzeyinin normalden düşük olması 339) Demir taşıyıcı protein nedir? Transferrin 340) Demir depolayan protein nedir? Ferritin 341) Erişkin sağlıklı bir insanda serum demir düzeyinin normal değeri nedir? 90-120 mg/dL 342) Serum demir düzeyinin normalden yüksek olması ne olarak tanımlanır? Hipersideremi 343) Serum demir düzeyinin normalden düşük olması ne olarak tanımlanır? Hiposideremi 344) Hipersideremi deyince ne anlaşılır? Serum demir düzeyinin normalden yüksek olması 345) Hiposideremi deyince ne anlaşılır? Serum demir düzeyinin normalden düşük olması 346) Eksikliğinde vitamin B12 eksikliğine bağlı bozukluklar saptanan iz element nedir? Kobalt 347) Kobalt eksikliğinde hangi vitamin eksikliğine bağlı bozukluklar saptanır? B12 vitamini 348) Psikiyatride manik depresif psikoz tedavisinde kullanılan iz element nedir? Lityum 349) Hangi iz element yetmezliği durumlarında tiroit bezinin endemik guatr denen hastalığı ortaya çıkar? İyot 350) İyot yetmezliği durumlarında ortaya çıkan hastalık nedir? Tiroit bezinin endemik guatr denen hastalığı 351) Porfirin tanımı nasıldır? Porfirin halka sistemi içeren renkli maddeler… 352) En yaygın olarak bulunan biyolojik metaloporfirinler ne içerenlerdir? Demir ve magnezyum 353) Hemoglobin nedir? Kanda eritrositlerde bulunan, kana kırmızı rengini veren, demir-porfirinli bir bileşik protein… 354) Yetişkin erkek için %g olarak kandaki hemoglobin konsantrasyonunun normal değeri nedir? %14-18 g 355) Yetişkin kadın için %g olarak kandaki hemoglobin konsantrasyonunun normal değeri nedir? %12-15 g 356) Hemoglobin molekülü kaç hem kaç globin içerir? 4 hem 1 globin 357) Bir hemoglobin molekülü toplam kaç adet O2 molekülü bağlayarak taşıyabilir. 4 358) Hemoglobinin protein komponenti olan globin, kaç polipeptit zincirden yapılmıştır 4 359) Çeşitli hemoglobin tiplerinde bulunabilen polipeptit zincir tipleri nelerdir? a-zincir, b-zincir, g-zincir, d-zincir 360) Fizyolojik hemoglobinler (normal hemoglobinler) nelerdir? HbA1: Globininde 2a ve 2b polipeptit zinciri. Erişkin bir şahsın eritrositlerinde bulunan hemoglobinin %97-98’ini oluşturur. HbA2: Globininde 2a ve 2d polipeptit zinciri. HbF: Globininde 2a ve 2g polipeptit zinciri. Yeni doğanda total hemoglobinin %70-90’ını oluşturur. 361) Sağlıklı erişkin bir şahsın eritrositlerinde bulunan hemoglobinin en büyük kısmını hangi hemoglobin oluşturur.? HbA1 362) Primitif hemoglobin (HbP) diye de bilinen hemoglobin nedir? HbF 363) HbA1c ne tür hemoglobindir? Glikozile hemoglobin 364) HbS hangi hastalığın ortaya çıkmasına neden olan hemoglobindir? Orak hücreli anemi ( Hb S hastalığı) 365) Önemli hemoglobin bileşikleri nelerdir? Oksihemoglobin (HbO2) Karbaminohemoglobin Karboksihemoglobin (Hb×CO) Methemoglobin Sulfhemoglobin Azotmonoksit hemoglobin Siyanhemoglobin 366) Oksihemoglobin nasıl oluşur? Hemoglobin molekülündeki 4 Fe2+’e akciğerlerde birer O2 molekülü bağlanması sonucu… 367) Kanın oksijenlenmesinde bir azalma sonucu deri ve mukozaların karakteristik mavimtrak bir renk alması ne olarak tanımlanır? Siyanoz 367) Karbaminohemoglobin nasıl oluşur? Hemoglobindeki globinin serbest a-amino gruplarına reversibl olarak CO2 bağlanmasıyla… 368) Karboksihemoglobin nasıl oluşur? Oksihemoglobindeki O2 yerine karbonmonoksit (CO) geçmesi suretiyle… 369) Methemoglobin nasıl oluşur? Hemoglobindeki Fe2+ ’nin Fe3+ haline reversibl olarak oksitlenmesi sonucu… 370) Sulfhemoglobin nasıl oluşur? Oksihemoglobin ile H2S’ün reaksiyonlaşması sonucu… 371) Azotmonoksithemoglobin nasıl oluşur? Nitritli dumanların solunması durumlarında 372) Siyanhemoglobin nasıl oluşur? HCN solunması sonucu… 373) Miyoglobin ne tür bileşiktir? Prostetik grubu hem olan bir kromoprotein… 374) İdrarla miyoglobin atılması ne olarak tanımlanır? Miyoglobinüri 375) İdrarla hemoglobin atılması ne olarak tanımlanır? Hemoglobinüri 376) İdrarla kan atılması ne olarak tanımlanır? Hematüri 377) Sitokromlar ne tür bileşiklerdir? Prostetik grup olarak bir demir-porfirin bileşiği olan hem içeren elektron taşıyıcı proteinler… 378) Erişkinde hemoglobin nerede sentezlenir? Kemik iliğinde 379) Porfirin sentezi için temel prekürsörler nelerdir? Glisin amino asidi ile süksinil-KoA 380) Hemoglobin biyosentezinde neler rol alır? Pantotenik asit (vitamin B5), Piridoksal fosfat (vitamin B6), Vitamin B12 Folik asit Demir Bakır 381) İnsanlarda porfirin biyosentezinde görevli bazı enzimlerde genetik defekt olmasına bağlı olarak ortaya çıkan genetik hastalıklar nelerdir? Porfiriyalar 382) Hemoglobinin hem kısmının yıkılması sonucu ne oluşur? Bilirubin 383) Bilirubin neyin yıkılması sonucu oluşur? Hemoglobinin hem kısmının 384) Hemoglobinin hem kısmının yıkılmasıyla oluşan bilirubin, ne olarak adlandırılır? İndirekt bilirubin (ankonjuge bilirubin) 385) Direkt bilirubin (konjuge bilirubin) nasıl oluşur? İndirekt bilirubinin karaciğerde glukuronik asitle konjugasyonu veya çok az oranda sülfatlanmasıyla 386) Hiperbilirubinemi deyince ne anlaşılır? Serumda bilirubin düzeyinin normalden yüksek olması 387) Hiperbilirubinemiler nasıl sınıflandırılırlar? Serbest (indirekt) bilirubin düzeyindeki artışlar Yenidoğan sarılığı Gilbert hastalığı Crigler-Najjar sendromu tip I Crigler-Najjar sendromu tip II Konjuge (direkt) bilirubin düzeyindeki artışlar Kolestaz Dubin-Johnson sendromu Rotor sendromu 388) Klasik hormon tanımı nasıldır? Endokrin sistemde dokular arası haberleşmeyi sağlayan moleküller… 389) Hormonların etki şekilleri nelerdir? Endokrin etki: Kana salınma ve uzakta etki Parakrin etki: Komşu hedef dokuya etki Otokrin etki: Salgılandığı hücreye etki Jukstakrin etki: Bitişik hücreye etki Ekzokrin etki: Mukozadan salgılanıp uzakta etki Nörokrin etki: Sinir hücresinden yakındaki dokuya etki Nöroendokrin etki: Sinir hücresinden uzakta etki 390) Hormonların sınıflandırılma şekilleri nelerdir? Sentezlendikleri yere göre Yapılarına göre Depolanıp depolanmamalarına göre Etki mekanizmalarına göre 391) Sentezlendikleri yere göre hormon sınıfları nelerdir? Hipotalamus hormonları Hipofiz hormonları Ön lop hormonları Orta lop hormonu Arka lop hormonları Tiroit hormonları Paratiroit hormonu Pankreas hormonları Böbrek üstü bezi hormonları Adrenal korteks hormonları Adrenal medülla hormonları Cinsiyet bezleri hormonları Erkek cinsiyet hormonları Dişi cinsiyet hormonları Gastrointestinal sistem ve diğer doku hormonları 392) Yapılarına göre hormon sınıfları nelerdir? Peptitler ve proteinler: Hipotalamus, hipofiz, paratiroit, pankreas, mide-bağırsak sistemi ve bazı plasenta hormonları Steroidler: Adrenal korteks ve gonadlardan salgılanan hormonlar ile bazı plasenta hormonları Amino asit türevi hormonlar: Adrenal medülla hormonları: Katekolaminler Tiroit hormonları Eikozanoidler Retinoidler NO• 393) Depolanıp depolanmamalarına göre hormon sınıfları nelerdir? Depolanan hormonlar: Peptit ve protein yapılı hormonlar, granüllü endoplazmik retikulumda sentez edildikten sonra Golgi sisteminde membranöz veziküller içinde depolanırlar Katekolaminler, suda çözünür özellikli proteinler olan kromograninler ve ATP ile birlikte granüllerde depolanırlar Tiroglobulin yapısındaki tiroit hormonları, tiroit follikülleri içinde depolanırlar Depolanmayan hormonlar: Steroid hormonlar, sentez sonrası hemen salgılanırlar, depolanmazlar 394) Etki mekanizmalarına göre hormon sınıfları nelerdir? Grup I: Hücre içi reseptörler bağlanan hormonlar Grup II: Hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanan hormonlar Adenilat siklaz aktivasyonu veya inaktivasyonu yapan hormonlar Guanilat siklaz aktivasyonu yapan hormonlar Fosfolipaz C aktivasyonu yapan ve/veya sitozolik Ca2+ konsantrasyonunu artıran hormonlar Tirozinkinaz aktivasyonu yapan hormonlar 395) Hormon salgılanması nasıl kontrol edilir? Sinir sistemi ile Negatif ve pozitif feedback mekanizmalar ile: Kandaki kimyasal maddelerle Tropik hormonlarla 396) Hormon salgılanmasının kandaki kimyasal maddelerle feedback düzenlenmesinin iki güzel örneği nedir? Parathormon salgılanmasının plazma Ca2+ düzeyi ile düzenlenmesi İnsülin salgılanmasının plazma glukoz düzeyi ile düzenlenmesi 397) Hormon salgılanmasının tropik hormonlar ile feedback düzenlenmesinin örnekleri nelerdir? Tiroit, sürrenal korteks ve gonad hormonlarının sentez ve salgılanışı… 398) Hormonların kanda taşınmaları nasıl olur? Hidrofilik özellikli katekolaminler ve peptit/protein yapılı hormonların büyük çoğunluğu serbest olarak… Hidrofobik özellikli tiroit hormonları ile steroid hormonlar proteinlere bağlı olarak… 399) Hormon reseptörü deyince ne anlaşılır? Hormonu tanıyan ve bağlayan; çoğunlukla glikoprotein yapısında maddeler… 400) Hormon reseptörleri nerede bulunurlar? Plazma membranında, sitoplazmada veya çekirdekte 401) Hormon-reseptör kompleksinin oluşumundan sonra ne olur? Hücre içi metabolik olayı etkileyecek sinyal oluşumu mekanizması uyarılır… 402) Endokrin fonksiyon bozukluklarının mekanizmaları nelerdir? Yetersiz miktarda hormon salgılanması Aşırı miktarda hormon salgılanması Hormona karşı doku duyarlılığında azalma 403) Yetersiz hormon salgılanması ne ile karakterizedir? Hormona özgü hipofonksiyon belirtileri ile… 404) Yetersiz hormon salgılanmasının nedenleri neler olabilir? Endokrin hücre sayısında yetersizlik Hormonu kodlayan genin eksikliği veya kusuru Ön madde eksikliği, enzim eksikliği, sentez koşullarının sağlanamaması Adrenal korteks, tiroit ve gonad hormonları için tropik hormonun sentez ve salgılanmasında azalma (sekonder hipofonksiyon) 405) Aşırı miktarda hormon salgılanması ne ile karakterizedir? Hormona özgü hiperfonksiyon belirtileri ile… 406) Aşırı miktarda hormon salgılanmasının nedenleri neler olabilir? Endokrin bezin büyümesi (tümörler) Otoimmün hastalıklar Benzer yapılı aşırı miktardaki hormonun çapraz bağlanması Ektopik olarak hormon sentezi Adrenal korteks, tiroit ve gonad hormonları için tropik hormonun sentez ve salgılanmasında artma (sekonder hiperfonksiyon) 407) Hormona karşı duyarlılığın azalması ne ile karakterizedir? Hormona özgü hipofonksiyon belirtileri ile… 408) Hormona karşı duyarlılığın azalmasının nedenleri neler olabilir? Reseptör veya postreseptör mekanizmalardaki bozukluklar… 409) Hipotalamus hormonları nelerdir? Supraoptik ve paraventriküler çekirdekte oluşanlar Antidiüretik hormon (ADH, vazopressin) Oksitosin (pitosin) Peptiderjik nöronlardan salgılanan, Adenohipofiz hormonlarının sekresyonunu düzenleyen hormonlar Tirotropin salgılatıcı hormon (TRH) Kortikotropin salgılatıcı hormon (CRH) Gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) Büyüme hormonu salgılatıcı hormon (GHRH) Somatostadin (Büyüme hormonu salgılanmasını inhibe edici hormon) Prolaktin salgılatıcı hormon (PRH) Prolaktin salgılanmasını inhibe edici hormon (PIH) 410) Ön hipofiz hormonları nelerdir? Opiyomelanokortin ailesi Kortikotropin (ACTH) Melanosit stimüle edici hormon (MSH) b-endorfin Glikoprotein ailesi Tirotropin (TSH) Gonadotropinler Luteinizan hormon (LH) Follikül stimüle edici hormon (FSH) Somatomammotropin ailesi Somatotrop hormon (Büyüme hormonu, GH) Prolaktin (PRL) 411) Kortikotropin (ACTH)’in fonksiyonu nedir? Adrenal steroidlerin sentez ve salgılanmasını artırır; özellikle kortizolün sentez ve salıverilmesini düzenler… 412) Tiroid stimüle edici hormon (TSH)’un etkisi nedir? Tiroid bezinde tiroid hormonlarının sentezinin tüm aşamalarında etki… 413) LH’ın etkisi nedir? Kadınlarda sıcaklık artışı ve östrus ile ilişkilidir, over folliküllerinin son olgunlaşmasını, çatlamasını ve çatlayan folliküllerin korpus luteuma dönüşmelerini sağlamaktadır. Erkeklerde testosteron salgılayan leydig hücrelerini uyarır… 414) FSH’ın etkisi nedir? Kadınlarda graaf folliküllerinin büyümesini uyarır. Erkeklerde seminifer tüp epitelini uyararak olgun sperm hücreleri ile spermatositlerin sayısal artışına yol açar. 415) Plasentada sentez edilen, hamileliğin ilk 4-6 haftasında korpus luteumun devamlılığından sorumlu hormon nedir? İnsan koryonik gonadotropin (hCG) 416) Büyüme hormonunun (somatotrop hormon, GH) etkisi nedir? İskelet büyüme hızı ve vücut ağırlığındaki artışı kontrol eder. Normal büyüme için gereklidir. 417) İnsanlarda iskelet büyümesinin tamamlanmasından sonra görülen adenohipofiz adenomunda GH sentezinin artışı neye yol açar? Akromegaliye 418) Hipofiz adenomunun puberte öncesinde kemik büyümesi tamamlanmadan gelişmesine bağlı olarak uzun kemiklerde aşırı büyüme görülmesine ne ad verilmektedir? Gigantizm (devlik) 419) Büyüme hormonunun yetersiz salıverilmesi ne ile sonlanır? Dwarfizm (cücelik) 420) Prolaktinin etkisi nedir? Hamilelikte meme dokusunda kendine özgü reseptörlerine bağlanarak laktalbümin dahil bazı süt proteinlerinin sentezini uyarır. Laktasyonun başlaması ve devamlılığı için gereklidir. 421) Galaktore deyince ne anlaşılır? Emzirme dönemi dışında meme bezlerinden süt gelmesi… 422) Hiperprolaktinomi deyince ne anlaşılır? Serum prolaktin düzeyinin normalden yüksek olması… 423) Epifiz hormonu nedir? Melatonin 424) Önemli gastrointestinal sistem hormonları nelerdir? Gastrin Kolesistokinin-pankreozimin (CCK-PZ) Sekretin Gastrik inhibitör polipeptit Vazoaktif intestinal polipeptit (VİP) Motilin 425) Gastrinin en önemli etkisi nedir? Gastrik asit salgılanmasını uyarmaktır. İntrinsik faktör ve pepsinojen salgılanmasını da uyarır. 426) Kolesistokinin-pankreoziminin (CCK-PZ) en önemli etkisi nedir? Oddi sfinkterinin relaksasyonu ile birlikte pankreastan enzim salıverilmesini, gastrointestinal mukozanın ve pankreasın ekzokrin salgı yapan dokularının gelişmesini, intestinal motiliteyi uyarır. 427) Sekretinin en önemli etkisi nedir? Sekretinin etkilerinin çoğu duodenumdaki asidi azaltmaya yöneliktir. Pankreastan, safra kesesinden ve Brunner bezlerinden su ve bikarbonat salıverilmesini, pankreatik büyümeyi uyarır. 428) Eritropoietin nerde sentezlenir? Böbrek dokusunda 429) Eritropoietinin en önemli etkisi nedir? Kırmızı kan hücrelerinin oluşmasını ve olgunlaşmasını hızlandırır. 430) Tiroit hormonları nelerdir? Folliküler hücrelerden sentezlenen hormonlar: Tiroksin (T4, tetraiyodotironin) T3 (triiyodotironin) 431) Tiroit hormonlarının sentez ve salgılanmasını düzenleyen nedir? TSH 432) Tiroit hormonlarının etkileri nelerdir? Genel metabolik etkileri: Organ ve dokularda hücresel tepkimeleri hızlandırırlar Karbonhidrat metabolizmasına etkileri: Glukoz emilimini hızlandırırlar, glikolizi uyarırlar, hepatositlerde epinefrinin glokojenolitik ve glukoneojenik etkilerine duyarlılığı artırırlar Yağ metabolizmasına etkileri: Yağ dokusunda lipolizi uyarırlar, yağ asitlerinin oksidayonunu artırırlar, kolesterolün emilimini azaltırlar Protein metabolizmasına etkileri: Protein sentez hızını artırırlar. Ancak düşük dozlarda katabolik etkilidirler Büyümeye etkileri: Normal büyüme ve gelişmede rolleri vardır. 433) Tiroit işlevleri ile ilgili bozukluklar nelerdir? Hipotiroidi: Tiroit hormon üretiminin baskılanmasıyla… Hipertiroidi: Tiroit hormon üretiminin uyarılmasıyla… 434) Kalsiyum ve fosfor metabolizmasını düzenleyen hormonlar nelerdir? Parat hormon (PTH) Kalsitonin (CT) Kalsitriol (1α,25-dihidroksikolekalsiferol) 435) PTH salgılanması nasıl düzenlenir? Serum iyonize kalsiyum düzeyi tarafından düzenlenir. Serum iyonize kalsiyum düzeyi azaldığında parathormon sentezi uyarılır, serum iyonize kalsiyum düzeyi arttığında ise parathormon sentezi baskılanır. 436) PTH etkisi nedir? Böbrekler ve kemik üzerine doğrudan, gastrointestinal sistem üzerine dolaylı yoldan etki ederek serum iyonize kalsiyum düzeyini artırır. 437) Kalsitonin nereden salgılanır? Tiroit bezinin parafolliküler C hücrelerinden… 438) Kalsitonin salgılanması nasıl düzenlenir? Serum iyonize kalsiyum konsantrasyonu tarafından düzenlenir… 439) Kalsitonin etkisi nedir? Temel hedef organ olan kemiklerde rezorpsiyonu kısıtlayarak kalsiyum ve fosfor kaybını önlemekte, serum kalsiyum ve fosfor düzeylerini azaltmaktadır. Ayrıca böbreklerde kalsiyum ve fosforun tübüler geri emilimini azaltarak renal klirenslerini artırır… 440) Kalsitriol (1α,25-dihidroksikolekalsiferol) nasıl oluşur? Böbrekte, cildin malpigi tabakasında UV ışın etkisiyle oluşan kolekalsiferol (D3 vitamini)’den… 441) Kalsitriol (1α,25-dihidroksikolekalsiferol)’ün etkisi nedir? Kemik mineralizasyonunun oluşması ve devamlılığı için gereken serum kalsiyum ve fosfor düzeylerini düzenlemektir. Bağırsaklarda kalsiyum ve fosforun emilimini uyarır. Kemik dokusundan mineral ve matriks mobilizasyonuna yol açar. Kalsiyum mobilizasyonu için parat hormona gereksinim vardır. Böbreklerde kalsiyum ve fosforun renal atılımlarını kısıtlar 442) Pankreas hormonları nelerdir? Langerhans adacıklarının hücrelerinden salgılanan Glukagon: A (α) hücrelerinden İnsülin: B (b) hücrelerinden Somatostadin: D (l) hücrelerinden Pankreatik polipeptit: F hücrelerinden 443) İnsülinin yapısı nasıldır? 21 AA’lik A ve 30 AA’lik B polipeptit zincirlerini içeren küçük globüler bir proteindir. Oluşumu sırasında bulunan bağlayıcı peptit olan C zinciri olgun insülinde bulunmaz. 444) İnsülinin salgılanmasını düzenleyen nelerdir? Glukoz, arjinin ve lösin gibi amino asitler, çeşitli hormonlar, farmakolojik etkili bileşikler 445) İnsülini    

http://www.biyologlar.com/biyokimya-dersi-calisma-sorulari-445-soru-

Bakteriyosinler

Gıdaların korunması ve muhafaza sürelerinin uzatılmasında, düşük sıcaklık veya ısıl işlem uygulaması, paketleme yöntemleri gibi prosesler ve tuz, şeker ve antimikrobiyal katkı maddeleri gibi katkılar kullanılmaktadır. Ancak yine de gıda kaynaklı sağlık sorunlarıyla karşılaşılabilmektedir. Gıdaların güvenliğinin sağlanmasında mümkün olduğunca proses uygulamalarından kaçınılması ve doğal katkı maddelerinin kullanımı gerekmektedir. Bu amaçla biyokontrol yöntemi önerilmektedir. Bu yöntemde, antagonistik mikroorganizmaların ve metabolitlerinin kullanımıyla patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaların inaktive edilmesi sağlanmaktadır . Gram (+) ve Gram (-) mikroorganizmaların önemli bir kısmı antimikrobiyal bileşenler üretmelerine rağmen, gıdaların biyokontrolünde laktik asit bakterilerinin ayrı bir önemi vardır. Bu bakteriler fermentasyon teknolojisinin tipik bakterileri olup, gıdalarda uzun yıllardan beri güvenli bir şekilde kullanılmaktadırlar .Gıdaların korunmasında laktik asit bakterileri gibi koruyucu kültürlerin kullanımı yanında, bu kültürlerden elde edilen bakteriyosin gibi metabolitler de kullanılmaktadır. Bakteriyosinler bakteriler tarafından sentezlenerek salgılanan, protein yapısındaki antimikrobiyal bileşenlerdir. İnhibisyon etkileri daha çok yakın türler üzerinde bulunmaktadır. Farklı özelliklere sahip birçok çeşitlerinin olmasına rağmen, gıdalarda güvenli bir şekilde ve yaygın olarak daha çok laktik asit bakterilerinden elde edilen nisin kullanılmaktadır. Dolayısıyla, nisinle birlikte diğer bakteriyosinlerin özelliklerinin bilinmesi, bu antimikrobiyal maddelerin birçok gıda maddesinde etkin bir şekilde kullanımını sağlayabilecektir.Bakteriyosinlerin Tanımlanması ve SınıflandırılmasıBakteriyosinlerin tanımlanmasına yönelik ilk çalışma 1925’te E. coli tarafından sentezlenen colicin’in tespit edilmesiyle başlamıştır. Bakteriyosinlerin aynı ya da farklı bakteri grupları tarafından sentezlenen yüzden fazla çeşidi bulunmaktadır. E coli suşlarının yanı sıra Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Staphylococcus ve Enterococcus gibi birçok mikroorganizma bakteriyosin üretmektedir.Daha çok gıdalar da güvenli olduğu düşünülen laktik asit bakterileri tarafından sentezlenen bakteriyosinler üzerinde araştırma yapılmakta ve gıdalarda bu bakteriyosinler kullanılabilmektedir. Bu nedenle laktik asit bakterileri, özellikle de Lactobacillus ve Lactococcus tarafından sentezlenen bakteriyosinler üzerinde önemle durulmaktadır.Bakteriyosinler için farklı sınıflandırmalar yapılmakla birlikte, daha çok Klaenhammer’in özellikle Gram (+) bakterileri dikkate alarak yaptığı sınıflandırma kullanılmaktadır. Biyokimyasal özellikleri dikkate alınarak yapılan sınıflandırmada, bakteriyosinler molekül büyüklüğü, kimyasal yapıları, etki mekanizmaları ve ısı stabilitelerine göre genel olarak 4 sınıfa ayrılmışlardır (Tablo 1). Ancak, biyokimyasal tanımlanması bakımından daha çok ilk 3 sınıf dikkate alınmaktadır..Bakteriyosin Sentezleyen Etki SpektrumlarıGrup I ANisin Lactococcus lactis Lactococcus ssp., Lactobacillus ssp., Streptococcus ssp., Micrococcus ssp., Mycobacterium ssp., Staphylococcus aureus, Corynebacterium ssp., Clostridium ssp., Bacillus ssp., Listeria ssp.Lactocin S Lactobacillus sake Lactobacillus ssp., Lc.mesenteroides, P. acidilactici, P. pentosaceusEpidermin Staphylococcus epidermisGallidermin Staphylococcus gallinarumLacticin 481 Lactobacillus lactis Lactococcus ssp.,L. helveticus, L. bulcaricus,Grup I BMersacidin Bacillus subtilisCinnamycin Streptomyces cinnamoneusAncovenin Streptomyces ssp.Duramycin S. cinnamoneusActagardin Actinoplanes ssp.Grup II APediocin PA-1 Pediococcus acidilactici PAC 1.0 Lactobacillus ssp., Pediococcus ssp.,L. monocytogenesPediocin AcH Pediococcus acidilactici H L. monocytogenes, L. ivanovii, LinnocuaSakacin A L. sake Lactobacillus ssp., L.monocytogenesSakacin P L. sake Enterococcus ssp., Lactobacillus, Pediococcus,L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanoviLeucocin A-UAL 87 Leustonostoc gelidumMesentericin Y105 Leuconostoc mesenteroides L. monocytogenesEnterocin A Enterococcus faeciumDivercin V41 Carnobacterium divergens Enterococcus ssp., Lactobacillus, Pediococcus,L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanoviLactococcin MMFII L. lactis Enterococcus ssp., Lactobacillus ssp., Lactococcus ssp., L. ivanoviGrup II BLactococcin G L. lactisLactococcin M L. lactisLactacin F Lactobacillus johnsonii L. bulcaricus, L. leichmanni, L. helveticus, L. lactis, L. fermentum 1750, E. faecalisPlantaricin A Lactobacillus plantarum L. plantarum, L. paramesenteroides, E. faecalis, Pediococcus pentosaceusPlantaricin S L. plantarum Lactobacillus ssp., Leuconostoc ssp., Pediococcus ssp.Plantaricin EF L. plantarumPlantaricin JK L.plantarumGrup II CAcidocin B Lactobacillus acidophilusCarnobacteriocin A Carnobacterium piscicolaDivergicin A C. divergensEnterocin P E. faeciumEnterocin B E. faeciumGrup IIIHelveticin J Lactobacillus helveticus L. helveticus 1846 ve 1244, L. bulcaricus 1373 ve 1489, L. lactis 970, L.caseiHelveticin V-1829 L. helveticusGRUP I BakteriyosinlerBu gruptaki bakteriyosinler daha çok “lanthionine” içermeleri nedeniyle lantibiyotikler olarak adlandırılmakta ve yapılarında bilinen amino asitlerden farklı olarak lanthionine (Lan) ve methyllanthionine (MeLan) amino asit türevlerini içermektedirler. Bununla birlikte yapılarında biyokimyasal özelliklerini etkileyen dehydroalanine ve dehydrobutyrine de bulunmaktadır .Bu gruptaki bakteriyosinler kimyasal yapılarına ve antimikrobiyal aktivitelerine göre I A ve I B lantibiyotikleri olmak üzere iki gruba ayrılırlar.Grup IA: Bu gruptaki bakteriyosinler net pozitif yüke sahip ve hidrofobik polipeptid yapısındadırlar. Membran aktif peptidler olup, bakteri zarında gözenek oluşturarak antimikrobiyal aktivite göstermektedirler. Grup IB : Bu gruptaki bakteriyosinler yüksüz veya negatif yüklü olup, globüler peptid yapısındadırlar. Spesifik enzimleri inhibe ederek antimikrobiyal aktivite göstermektedirlerGRUP II BakteriyosinlerBu gruptaki bakteriyosinler Grup I’den farklı olarak lanthionine içermezler. Ayrıca, molekül ağırlıkları daha düşük olup, ısı stabilitesine sahiptirler. Antimikrobiyal aktiviteleri, membran aktif olmalarından kaynaklanmaktadır. Çok sayıda bakteriyosin içeren bu grup 3 alt gruba ayrılmaktadır Grup IIA : Bu gruptakiler özellikle listeria’ya karşı aktif olup, yapılarında bulunan peptid’in N-terminalinin sonunda Try-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys amino asit dizisine sahiptirler .Grup IIB :Bu gruptaki bakteriyosinler primer yapıları birbirinden farklı iki polipeptid içerirler. Ayrı ayrı aktivite gösterebildikleri gibi, etkin bir şekilde aktif hale gelebilmeleri için her ikisinin de aktif olması gerekmektedir. İki polipeptidin aktif hale gelmesiyle, hücre membranında gözenek oluşturarak antimikrobiyal aktivite göstermektedir . Grup IIC : Bu gruptaki bakteriyosinler, Grup II deki bakteriyosinlerin özelliklerini gösteren, Grup IIA ve IIB dışındaki diğer bakteriyosinlerdir. Bu gruptakilerin birçoğu sistein amino asit rezidüsü içermekte ve bu bakteriyosinlere thiolbiotic’ler veya cystibiotic’ler denilmektedir. Tiyo-aktif bakteriyosinler olup, aktiviteleri için indirgenmiş cystine rezidüsüne gereksinim duyarlar .GRUP III BakteriyosinlerBu gruptaki bakteriyosinler daha büyük molekül ağırlığına sahip olup, ısıya karşı duyarlı peptid zincirlerinden oluşmaktadırlar. Ancak bu gruptaki bakteriyosinler henüz yeterince karakterize edilememişlerdir.GRUP IV BakteriyosinlerBu gruptaki bakteriyosinler ise büyük ve kompleks moleküller olup, aktiviteleri için karbonhidrat veya lipid bileşenlerine gereksinim duymaktadırlar. Bu bakteriyosinler hakkındaki bilgiler yetersiz olup, biyokimyasal olarak henüz yeterince karakterize edilememişlerdir. Dolayısıyla bu konuda daha fazla bilgiye ihtiyaç duyulmaktadır.Bakteriyosinlerin Sentezlenmeleri ve Etki MekanizmalarıBakterilerin, bakteriyosinleri veya benzeri maddeleri neden sentezledikleri ve nasıl kullanmaya başladıkları hakkında çalışmalar yapılmasına rağmen, henüz bu durum tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Ancak bakteriyosinlerin üretim mekanizmaları, amino asit dizilişleri, etki mekanizmaları, üretici genlerin RNA dizilişleri belirlenmiş ve genel olarak bir çok ortak özelliklere sahip oldukları saptanmıştır. Bakteriyosinlerin daha çok plazmid kökenli oldukları ifade edilmesine rağmen, bir kısım bakteriyosinlerin kromozomal kökenli olduğu da ifade edilmektedir. Genel olarak bakteriyosinlerin üretimlerindeki temel prosesler aynıdır. Polipeptid dizisi RNA tarafından kodlandıktan sonra öncü protein olarak ayrılıp bir moleküler sinyalizasyona uğrayıp, çeşitli modifikasyonların ardından sistein sayısına göre son şeklini kazanmakta, daha sonra sec-dependent mekanizması yardımıyla hücre dışına salgılanmaktadır Bakteriyosinler duyarlı mikroorganizmalar üzerinde farklı etki mekanizmalarına sahiptirler. Hücrenin stoplazmik zarına bağlanarak, hücre içerisine girip, zarda gözenekler oluştururlar. Böylece düşük molekül ağırlığına sahip hücre bileşenlerinin hücre dışına sızmasına yol açarlar. Bununla birlikte, iyonların, özellikle de ATP kaybı ve hücre içi pH dengesinin korunmasında etkili olan K+ iyonunun hücre dışına sızması, hücrede enerji tüketimine neden olmaktadır . Hücrede meydana gelen bu değişimler, DNA ve RNA gibi hücre için hayati önemi olan makro moleküllerin degredasyonuna, bu moleküllerle birlikte protein ve peptidoglycan gibi biyolojik proseslerin inhibisyonuna yol açmaktadırBakteriyosinler ve Gıdada KullanımıBilindiği gibi gıda güvenliği açısından, patojen mikroorganizmaların gıdalarda gelişiminin önlenmesi gerekmektedir. Gıdalarda gelişen patojen mikroorganizmalar üzerinde antagonistik mikroorganizmaların ve bakteriyosin gibi metabolik ürünlerinin etkili olması nedeniyle, gıda güvenliğinde bakteriyosin kullanımının önemi oldukça artmıştır. Bakteriyosinlerin gıdalarda antimikrobiyal aktivitelerinin yanı sıra, doğal olmaları, renksiz, tatsız ve kokusuz olmaları da ürün özellikleri açısından oldukça önemlidir.Peptid veya protein yapılarında olmaları ise pankreas kaynaklı proteolitik enzimlerden, mide salgılarından etkilenebildiklerini ve insan vücudunda sindirilebileceklerini göstermektedir. Ayrıca bazı bakteriyosinlerin (Grup II) ısı stabilitelerinin olması, yüksek sıcaklıkta işlem gören birçok gıda maddesinde kullanılabilirliğini sağlamaktadır . Hatta bazı bakteriyosinler otoklavlama sıcaklığında bile stabil kalabilmektedir. Dolayısıyla bakteriyosinlerin et ve süt ürünleri başta olmak üzere birçok gıdada kullanımı mümkün olmaktadır.Gıdalarda bakteriyosinlerden farklı şekillerde yararlanılmaktadır. Doğrudan gıda maddesine katılabildikleri gibi, bakteriyosin sentezleyen koruyucu kültürlerin gıdaya inokulasyonuyla veya gıdanın koruyucu ambalaj materyali ile birlikte de kullanılabilirler. Bu amaçlarla koruyucu kültür olarak daha çok laktik asit bakterileri, bakteriyosin olarak ise, yasal kullanımına izin verilen nisin kullanılmaktadır. Nisinin etki spektrumu diğer birçok bakteriyosine kıyasla daha geniş olup, asidik gıdalarda ve Gram (+) mikroorganizmalar üzerinde oldukça aktiftirler Nisinin pH 2’deki çözünürlüğü, pH 8’e kıyasla 228 kez daha fazladır. Dolayısıyla pH yükseldikçe çözünürlük azalmaktadır. Nisinin koruyucu katkı maddesi olarak kullanımına ilk kez krem peynirlerinde izin verildikten sonra, günümüzde 47 ülke tarafından güvenli gıda koruyucusu olarak kabul edilerek kullanılmaktadır. Birleşik Devletler Gıda ve İlaç Dairesi (US FDA) yetişkinler için günlük kabul edilebilir nisin miktarını 2.9 mg olarak belirlemiştirNisin et ve et ürünlerinde birçok mikroorganizma üzerinde etkilidir. Bununla birlikte, en önemli özelliklerinden birisi, hastalık ve ölümlere yol açabilen Listeria monocytogenes ‘i inhibe edebilmesidir. Yine nisin, et ve et ürünlerinde oldukça tehlikeli bir patojen olan C. botulinum üzerinde etkilidir. Nisin, antimikrobiyal olarak nitrit için belli düzeylerde alternatif oluşturabilmektedir. Ayrıca nisinin Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium divergens ve L. innocua üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla, karkas yüzeyine spreylenmesi, bu mikroorganizmaların sayısını önemli düzeyde azaltmaktadır. Brochothrix thermosphacta üzerinde etkili nisin seviyesinin 400 IU/ml olduğu da bildirilmektedirSüt ürünleri üzerinde yapılan çalışmalarda, nisinin özellikle eritme peynirlerinde toksin üretebilen C. botulinum ‘u inhibe ettiği ve spor oluşumunu engellediği ifade edilmektedir. Bu ürünlerde inhibisyon etkisini gösterebilmesi için farklı seviyelerde kullanılabileceği ifade edilmekle birlikte, kullanım seviyelerinin pH, tuz ve fosfat içeriği ile proses şartlarına bağlı olarak değişebileceği de ifade edilmektedir. Nisinin yanı sıra farklı bakteriyosinlerin gıdalarda kullanımı ve sonuçlarıyla ilgili bazı bilgiler Tablo 2’de verilmiştir.Bakteriyosin Uygulanan gıda EtkileriNisin A Yeniden şekillendirilen et ürünleri (formed meat products) Bakteriyel inaktivasyonNisin A Ricotta peynirinde L. monocytogenes’in kontrolü için kullanılmıştır L. monocytogenes’i 8 hafta etkili bir şekilde inhibe etmiştirPediocin AcH Pediocin AcH sentezleyen L. plantarum WHE 92, olgunlaşmanın başlangıcında Munstar peynirinin yüzeyine spreylenmiştir L. monocytogenes’in gelişimini engellemiştirEnterocin 4 Enterocin sentezleyen E. faecalis INIA4, Manchego peyniri üretiminde kullanılmıştır L. monocytogenes Ohio ‘yu inhibe ederken, Listeria monocytogenes Scott A’yı inhibe etmemiştirLinocin M-18 B. lines kırmızı peynir üretiminde starter olarak kullanılmıştır L. ivanovi ve L. monocytogenes’te 2 log düşüşe neden olmuşturPiscicolin 126 Jambonda L. monocytogenes kontrolü için kullanılmıştır Ticari bakteriyosinlerden daha etkili bulunmuşturLeucocin A L. gelidium UAL187 vakum paketlenmiş sığır etinde bozulma kontrolü için kullanılmıştır L. sake ‘nin de etkisiyle bozulma 8 haftaya kadar geciktirilmiştir.Lactocin 705 Kıyılmış sığır etinde L. monocytogenes’ in gelişimini önlemek için kullanılmıştır L. monocytogenes’ in kıyılmış etlerde gelişimini önlemiştir.Pediocin AcH Tavuk eti sosisinde L. monocytogenes’i nhibe etmek için pediosin üreten P. acidilactici (Ped+) kullanılmıştır Etkili bir şekilde L. monocytogenes sayısını azaltmıştır.Pediocin Şarap ve fırıncılık ürünlerinde kullanım potansiyeli araştırılmıştır Bu tür ürünlerde kullanım potansiyeli olduğu belirlenmiştirPediocin AcH Tavuk etine pediosin preparatı ilave edilmiştir 5 oC’de 28 gün L. monocytogenes gelişimini kontrol etmiştirPediocin PA-1 Fermente sosiste starter olarak P. acidilactici (Ped+) kullanılmıştır L. monocytogenes’i etkili bir şekilde kontrol etmiştir.Enterocin Jambon, domuz eti, tavuk göğüs eti, pate ve sosis’te kullanılmıştır Çeşitli şartlar altında L. monocytogenes gelişimini kontrol etmiştir.Bakteriyosinlerin Diğer Koruyucu Maddeler ve Prosesler ile Birlikte KullanımıBakteriyosinlerin etki spektrumlarının sınırlı olması nedeniyle gıdalardaki etkileri de sınırlı kalabilmektedir. Özellikle Gram (+) mikroorganizmalar üzerinde etkili olmaları nedeniyle, genellikle Gram (-) mikroorganizmalara karşı fazla etkili olamamaktadırlar. Dolayısıyla Gram (-) olan patojen mikroorganizmaların da olduğu düşünüldüğünde, sadece nisin kullanımıyla gıda güvenliğinin sağlanamayacağı açıktır. Bu nedenle, nisinle birlikte diğer gıda koruyucu katkıların veya proseslerin kullanılması gerekmektedir Gram (-) bakterilerin dış zarlarının bütünlüğü bozulduğunda bakteriyosinlere karşı oldukça hassasiyet göstermektedirler. Bu nedenle nisinle beraber hücre zarını bozabilecek trisodyum fosfat veya EDTA gibi çelatların kullanılmasının inhibisyon etkisi yapabileceği bildirilmektedirÖrneğin EDTA, Gram (-) mikroorganizmanın lipopolisakkarit kısmında Mg+2 ’u bağlayarak dış zarın yapısını bozup, nisinin sitoplazmik zara ulaşmasını sağlamaktadırErkan GÜNEŞGıda MühendisiTarım İl Müdürlüğü

http://www.biyologlar.com/bakteriyosinler

MİKROBİYAL LİÇİNG NEDİR

Mikroorganizmalar mineral kaynaklarının oluşması ve çözülmesinde önemli rol oynar. Mineral aranması ve zenginleştirilmesinde biyoteknolojik yöntemlerin kullanılması popüler hale gelmiştir. Mikrobiyal liçing; mikroorganizmalar yaratımıyla maden cevherlerinden metallerin kazanılması işlemidir. Düşük kaliteli cevherlerden metallerin geri kazanımın da kullanılan kimyasal metodlar ekonomik olmamaktadır. Dünya genelinde yüksek oranlarda bulunan düşük kaliteli, bakır cevherlerinin göreneksel kimyasal metodlarla elde edilmesi zor ve pahalı olduğundan, bunların eldesinde mikrobiyal liçing kullanılır. Son yıllarda geliştirilen mikrobiyal liçing yöntemleri metalik hammaddeler için çok önemlidir. Klasik yöntemler ile çözünürleştirilmeyen veya parçalanamayan fakir cevherler ve endüstri atıkları mikoorganizmalar ile ekonomik biçimde geri kazanılmaktadır. Bakterilerin yaptığı iş suda çözünmeyen filizleri suda çözünür hale getirmektir. Bakteriyal liçing daha çok uranyum ve bakır kazanımın da kullanılır. Dünya yüzeyinde kayda değer ölçülerde bulunan Ni, Zn, Cd, ve Co eldeleri içinde bir dizi liçing yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntem bir asidik su içiren bir maden yatağına boru hattı döşeme sırasında meydana gelen bir patlama sonucu ortaya çıkmış ve geliştirmeler sonucunda düşük dereceli maden cevherlerinin geri kazanımı sağlanmıştır. LİÇİNGDE KULLANILAN ORGANİZMALAR Mikrobiyal liçingde kullanılan en yaygın 2 tane bakteri Thiobacillus thiooxidans ve Thiobacillus ferrooxidans’tır. Ayrıca Thiobacillus concretivoru, Thiobacillus concretivorus, Pseudomonas fluorescens, P. putida, Achromobacter, Bacillus licheniformis, B. Cereus, B. luteus, B. polymyxa, B. megaterium ve birçok termofilik bakterilerden Thiobacillus thermophilica, Thermothrix thioparus, Thiobacillus TH1, ve Sulfolobus acidocaldarius kullanılmaktadır. Heterotrafik mikroorganizmaların kullanımı gelişmektedir. Termofilik bakterilerin liçing uygulamalarını hızlandırmasının en büyük etmeni hızlı gelişim oranının varolmasıdır. MİKROBİYAL LİÇİNG KİMYASI Thiobacillus ferrooxidans çok pahalı çalışmayı gerektiren bir bakteridir. Bu bakteri mezofil, spor oluşturmaz, hareketli Gr(-), çubuk şeklinde olup C,5-C,8 m X 1,0-2,0 m boyutlarındadır. Ototrofik aerap olup C ihtiyacını havadaki CO2’in fixasyonundan sağlar. Enerji kaynağı olarak ise Fe2+  Fe3+’ya oksidasyonunudan veya elementel kükürt veya indirgenmiş kükürt bileşiklerinden sağlar. En yaygın kullanılan mikrobiyal liçing proseslerinin amacı az çözünen veya çözünmeyen metal bileşiklerini metal sülfatlar haline getirip çözünürleştirmektir. Bunun için 2 şekilde uygulama çeşidi varadır: Direkt ve indirekt mikrobiyal liçing. 1. Direkt Mikrobiyal Liçing: 4 FeSO4 + 2H2 SO4 + O2  2Fe2(SO4)3 + 2H2O [1] 2S0 + 3O2 + 2H2O  2H2SO4 [2] 2FeS2 + 7O2 + 2H2O  2FeSO4 + 2H2SO4 [3] Çözünmez haldeki sülfürün sülfirik aside aksidasyonu, sülfürle direkt kontak halindeki T.ferroxidans sayesinde gerçekleştirilir. T. ferooxidans tarafından gerçekleştirilen [3] nolu reaksiyon direkt mikrobiyal liçing: göstermektedir. Demir cevherinin yanında bakır, kurşun, nikel, kobalt, molibden ve çinko cevherleride T.ferroxidans sayesinde oksitlenebilirler. MeS + 2O2  Me SO4 2. İndirekt Mikrobiyal Liçing İndirekt liçingde, mikoorganizmalar liçing reaktifini üretir veya rejenere ederler. Örneğin metal sülfür cevherleri mikrobiyal bir etki olmaksızın Fe3+ iyonları tarafından oksitlenip liçing gerçekleştirilebilir. MeS + Fe2 (SO4) MeSO4+S0 Reaksiyonda indirgenen demirin tekrar Fe3+ haline dönüştürülmesi T.ferroxydans tarafından sağlanır. Bakteri bu prosese doğrudan karışmayıp bir katolitik fonksiyon görür. Bakteriyel oksidasyon kimyasal oksidasyondan yaklaşık 1 milyon kat hızlıdır. [2] nolu reaksiyonun oksitlenmesi T.thiooydans tarafından çok daha hızlı oksitlenirler. Bu tepkimeden de anlaşılacağı üzere sülfirik asit oluşumu katalizlediğinden, liçing için asidik koşulların sağlanması önemlidir. Bakteri Aktivitesine Etki Eden Etmenler 1. Besi Ortamı Besi ortamının kimyasal ve minerolojik bileşimi çok önemlidir. Liçing koşulları ve bakteriyel büyüme koşulları çakışıyorsa maksimum metal verimine ulaşır. Enerji veren demir ve kükürt bileşiklerinden başka magnezyum ve amonyum tuzları, fosfatlar ve sülfatlar esansiyel mineral bileşenleridir. Anorganik bileşiklerin bazıları liçing çözeltisinde bulunur. Eğer ortamda yeterli değillerse bir miktar katılırlar. Pirit(FeS2) ilave edilirse indirekt liçing hızlanır. Çok yüksek konsantrasyonda Fe3+ varlığı kompetitif bir inhibisyona neden olur. Tiyobasiller besi ortamı için problemlidir. Mikrobiyal liçingden maksimum verim elde etmek için liçing sırasında O2 transportu yeterli hızla sağlanmalı ve bu transportu etkileyen faktörlere dikkat edilmelidir. 2. pH ve Redoks Potansiyeli Optimum büyüme koşullarındaki pH’nın liçing çalışma koşullarına uyması idealdir. En uygun pH 2-2.5 arasıdır, kükürt ve Fe2+ oksidasyonu da bu pH lara uygundur Eğer pH 2’nin altına inerse T. ferroxydans aktivitesi düşer. Aerobik bir bakteri olduğu için T.ferroxydans pozitif bir redoks potansiyeline ihtiyaç duyar. Redoks potansiyeli logaritmik büyüme fazı sonuna doğru 600 mV a ulaşır. 3. Sıcaklık Fe+2 ve kükürdün mikrobiyal oksidasyonu için optimum sıcaklık 28-35oC arasıdır. T.ferrooxydans’ın büyümesi için de bu sıcaklık aralığı uygundur. Daha düşük sıcaklıkta büyüme yavaşlar, daha yüksek sıcaklıklarda ise termofil bakteriler kullanılır. 4. Liçing Materyalinin Kimyasal ve Mineralojisi Materyal yüksek oranda karbonat içerirse pH artar ve dolayısı ile liçing aktivitesi düşer ve giderek durur. Bunu engellemek için ortama asit ilavesi gereklidir. Mineral bileşimi büyüme ortamının ihtiyacını tam olarak karşılayamaz bazı mineraller dışarıdan ilave edilir. 5. Substrat Konsantrasyonu ve Partikül Büyüklüğü Liçing hızı liçing edilecek substratın yüzey büyüklüğü ile orantılıdır. Partikül boyutu ne kadar küçük ise toplam partikül yüzey o derece yüksektir, spesifik partikül yüzeyi artar, böylece liçing verimi de artar. Bu bilgiler kükürtlü cevherler için geçerli olup düşük tenörlü cevherleri kapsamaz. Substrat konsantrasyonunu artırarak da partikül toplam yüzeyi büyütülebilir. Bu durumda paktikül kütlesi de artar. Fakat substrat konsantrasyonunun artırılması belirli bileşiklerin konsantrasyonlarının artmasına neden olur ki bunların bazılar tiyobasillerin üremesi için toksik etki veya inhibisyon gösterebilir. Pratikte her liçing denemesi için partikül büyüklüğünün ve substrat konsantrasyonunun optimize edilmesi gerekir. 6. Yüzey Aktif Maddeler ve Ekstrasksiyon Maddeleri Eskiden bu maddelerin ilavesinin liçingi hızlandırdığına yani tiyobasillerin üremesini artırdığına inanılırdı. Fakat 1975 ten sonra yapılan çalışmalarda bunun tamamen yanlış olduğu tesbit edilmiştir. Yüzey gerilimi çok düşeceği için O2 kütle transferi çok yavaşlar. Bunun sonucunda bakteriyel gelişme sürekli olarak inhibe olur. Benzer bir etki ekstraksiyonda kullanılan organik çözgenler için de geçerlidir. Organik fazdan metal iyonunun geri alınması yeniden sulu faza çekme şeklinde olur. Eğer bakteriyel liçing ve çözgen ekstaksiyonu birlikte uygulanır ise problem çıkabilir. En önemli problem organik çözgen fazının tam olarak ortamdan ayrılmamasıdır. Sulu fazdan kalan organik çözgen bakterinin büyümesini inhibe eder. 7. Ağır Metaller Birçok ağır metal iyonu çok düşük konsantrasonlardan bile toksik etki gösterebilir. Tiyobasiller ağır metallere çok toleranslıdır. Bununla birlikte bu etkilerin daha önceden bilinmesi gerekir. 8. Işık Tiyobasiller ışığa çok duyarlıdır. Özellikle UV ve görünür ışığın ultraviyoleye yakın bölgesi tiyobasillere çok etkilidir. Mikrobiyal Liçing Prosesleri Optimumu liçing koşulları sadece laboratuar koşulları için tespit edilmiştir. Liçing koşullarının optimizasyonu pilot tesislerde tespit edilir ve daha sonra endüstriyel boyutta uygulanır. Optimizasyon da kullanılan parametreler; - O2 ve CO2 temini - Materyalin nem oranı - pH gradienti - Sıcaklık gradienti - Fe3+ tuzu çöktürmeleri - Partikül büyüklüğü - Partikül parçalanması ve partikül göçü - Geçirgen olmayan tabakaların oluşup, oluşmadığı. Mikrobiyal liçingin teknik uygulamalarının esas işlem sırası şöyle gerçekleşir; 1- Cevherlerin öğütülmesi 2- Cevherlerin bakteri süspansiyonu ile uygun şekilde sulandırılması 3- Sıvının biriktirilmesi 4- Çözünmüş metalin extraksiyonu Bakteriyel liçing porsesinin ana şeması NOT:Mikrobiyal liçing sonucu oluşan atık sular boş arazilere boşaltılmamalıdır. Mikrobiyal liçing uygulandığı yüze şekillerine göre 3’e ayrılır a)Meyilli yüzeyde liçing b. Kümesel yüzeyde liçing c. İn-situ liçing Mikrobiyal Liçingin Teknik Uygulamaları 1. Bakır Cevherinin Biyoliçingi Günümüzde dünya bakır üretiminin yaklaşık %10’u bakteriyel düşük kalite cevherlerin bakteriyel liçingi ile gerçekleştirilir. Bütün bakır işleticileri bir entegre yığma-boşaltma veya onların maden çıkarma veya porsesleme aktivitesini artıran in-situ liçing porseslerini uygular. En önemli bakır cevherlerinden biri olan kalkosit aşağıdaki denkleme göre bakteri tarafından çözünürleştirilir. Cu2S + 5/2 O2 +H2SO4 Bakteri 2CuSO4 + H2O Bu denklem iki basamakta gerçekleşir. a) Cu2S + ½ O2 + H2SO4 bakteri CuS + CuSO4 + H2O b) CuS + 2O2 bakteri CuSO4 Diğer bakır sülfür cevherleri bornit (Cu5FeS4), kubanit (CuFe2S3) ve kalkopirit (CuFeS2), enargit (Cu3AsS4) ve kovellittir (CuS). 2.Uranyum Cevherlerinin Biyoliçingi Mikrobiyal uranyum liçingi daha çok terk edilmiş uranyum ocaklarında uygulanır. Endüstriyel olarak bakteriyel liçing prosesleri ile cevherlerden uranyum ekstrakte edilir. Ekstraksiyonun kimyası çözünmeyen dört değerlilikli uranyum oksitlenerek çözünen altı değerlikli durumuna değişimi ile ifade edilir. UO2 + Fe2 (SO4)3+2H2SO4 U4[UO2(SO4)3] + 2 FeSO4 FeSO4 daha önce belirtildiği gibi bakteriyel oksidasyon ile Fe2(SO4)3 a dönüştürülür. SONUÇ Mikrobiyal liçing düşük kalitedeki cevherlerden metal kazanımın da kullanılan ve klasik yöntemlere göre ekonomik olan bir uygulama çeşididir. Bu yöntemle özellikle altın, gümüş gibi pahalı ve uranyum gibi stratejik elementlerin eldesinde büyük önem taşımaktadır. Bakır ve uranyum eldesinde özellikle in-situ liçing yöntemi uygulanmaktadır. Endüstriyel olarak Çinko, Nikel Cobalt ve Molibden üretimi için mikrobiyal liçing uygulamalarının yaygınlaştırılacağı kesin gibi gözükmektedir. Ayrıca mikrobiyal liçingle atıklardan metallerin geri kazanımı için alternatifsiz bir yöntemdir. Çizelge : Mikrobiyal Liçingin Potansiyel Uygulama Alanları Mikrobiyal liçing tesisleri maden yataklarının yanına kurulmalıdır. Böylece transport masrafları indirgenmiş olur. Mikrobiyal yöntem klasik yöntemlerden daha ekonomiktir. Detaylı teknik bilgi gerektirmez, ayrıca yüksek teknolojiye gerek yoktur. Bu nedenlerden dolayı yer altı kaynakları bakımından zengin ve gelişmekte olan ülkeler için çok iyi bir yöntemdir.

http://www.biyologlar.com/mikrobiyal-licing-nedir

Apoptozis ve kaspazlar

Apoptozis, organizma tarafından düzenlenen enerji bağımlı hücre ölümüdür. Programlı hücre ölümü olarak da adlandırılan bu süreç, doku homeostazının korunmasında kritik bir role sahip olduğu gibi, fetal gelişim ve erişkin dokulardaki pekçok fizyolojik olayda da önemli rollere sahiptir. Apoptozis terimi ilk kez 1972 yılında Kerr ve arkadaşları tarafından kullanılmıştır (1). Kerr, fizyolojik olarak ölen hücrelerin çekirdeklerinde yoğunlaşmış kromatin parçalarını gözlemlemiş ve organellerin iyi korunduğunu fark ederek bu olayı büzüşme nekrozu olarak adlandırmıştır. Apoptosis terimi köken olarak "ayrı düşmek" anlamına gelmektedir (1). ve hücre kaybını belirtmek amacı ile kullanılmıştır. Apoptotik ölüm sinyali alan hücrenin kromatini yoğunlaşmaya başlar. Benzer şekilde sitoplazma da yoğunlaşmaya ve hücrenin boyutları küçülmeye başlamıştır. Bir süre sonra hücre apoptotik cisimcik denilen daha küçük parçalara bölünür. Bu parçacıkların en büyük özelliği, fragmente olmuş nükleusların ve parçalanan hücreye ait tüm yapıların plazma membranı ile kaplanarak immün sistemi enflamasyon yönünde uyarmamasıdır. Apoptotik cisimcikler, yüzeylerinde yeni sinyal yapıları ortaya çıkarır ve bu sinyalin uyarısı ile yandaki hücre tarafından fagosite edilerek ortadan kaldırılır (2,3). Apoptozis normal gelişimsel süreç içerisinde pek çok fizyolojik olayda görev alır. Embriyogenesis (4,6), normal menstruel siklusda endometrial hücrelerinin yıkımı (5), barsak kripta epitelleri gibi sürekli çoğalan hücre gruplarında hücre sayısının dengelenmesi (6), timusun gelişimi sırasında otoreaktif T hücrelerinin ortadan kaldırılması (6), bunlardan sadece birkaçıdır. Apoptotik hücre ölümü regülasyonundaki defektler hücre birikiminin olduğu kanser, restenoz gibi hastalıklara yol açabildiği gibi, hücre yıkımının arttığı otoimmün rahatsızlıklar, nörodejeneratif hastalıklar, Alzheimer gibi rahatsızlıklara da yol açabilmektedir (7,8 ). Son yıllarda yürütülen araştırmalar neticesinde, apoptosisten sorumlu moleküler mekanizmalar açıklığa kavuşmuştur. Bu çalışmalar sonucunda, kaspaz adı verilen, intrasellüler proteazların; apoptosisin gerek direkt, gerekse indirekt morfolojik ve biokimyasal değişikliklerinden sorumlu olduğu ortaya konulmuştur. Kaspazların apoptozla ilk ilişkisi bir nematod olan Caenorhabditis Elegans'ın genetik analizi sırasında ortaya çıkmıştır (9). Kaspazlar apoptotik hücre ölümü esnasında önemli rol oynayan multigen ailesinden oluşan sistein-proteaz grubu enzimlerdir. Kelime olarak "Cysteine Aspartate Specific ProteASEs- CASPASE" olarak türetilmiştir. Öncelikle inaktif proteinler olarak sentezlenen bu enzimler çeşitli yollarla aktive edilmelerinin ardından hücresel hedeflerdeki tetrapeptit motifleri tanır ve substratı, bir aspartat rezidüsünün karboksil tarafından ayırır. Hücre ölümü sırasında meydana gelen pek çok sellüler ve morfolojik değişimler, bu enzimlerin rol oynadığı birtakım süreçler neticesinde gelişir (10). Kaspaz-1, kaspaz ailesinin prototipidir ve önceleri prointerlökin-1-beta'nın biyolojik aktif formuna dönüşümünden sorumlu, ICE (interlökin-1-beta dönüştürücü enzim) olarak da adlandırılan, bir sistein proteaz olarak tanımlanmıştır (11,12). Daha sonraları ise ICE'nin diğer sistein-proteazlardan farklı olarak amid bağının N-terminalindeki p1 pozisyonu olarak bilinen ucunda aspartik asitin mutlak gerekliliğini gerektiren farklı bir sistein-proteaz olduğu keşfedilmiştir. ICE'nin inflamasyondaki rolü geniş bir şekilde aydınlatılırken bir taraftan da hücre ölümünden sorumlu genetik yoldaki rolü ortaya konmuştur (13). Bir nematod olan Caenorhabditis elegans'ın üzerinde yapılan bu çalışmada, hücre ölümü sırasında görev alan genetik yolda ced-3 isimli bir genin kodladığı proteinin hermafroditin gelişimi esnasındaki tüm programlı hücre ölümlerinden sorumlu olduğu görülmüştür. Daha sonraları ise ced-3'ün memelilerdeki ICE'nin bir homoloğu olduğu gözlenmiştir (14,15). Tüm bu bilgilerin ışığında apoptotik hücre ölümleri esnasında meydana gelen özellikli proteolizler ve bu yıkımlar sonucu oluşan biyokimyasal olaylar aydınlatılmaya çalışılmıştır. Memelilerde en az 14 kaspaz tanımlanmıştır (16). Filogenetik analiz sonucunda gen ailesinin ICE (kaspaz-1) ile ilişkili ve ced-3 benzeri olmak üzere iki subgrubu olduğu görülür. Proenzimlerin kısa (kaspaz 3,6,7) veya uzun prodomain barındırmalarına göre de kaspazları daha alt gruplara ayırmak mümkündür. Alternatif olarak bu proteazlar, substrat spesifitelerine göre de gruplandırılabilir (17,18). Günümüzdeki modern yaklaşım ise proteazları üç gruba ayırmaktadırlar (10). (şekil-1). Şekil 1: Proteolitik aktivitelerine göre kaspazlar Grup 1 : Sitokin matürasyonuna aracılık edenler (caspase-1, 4, 5, 13) - ICE ailesi, Grup 2 : Apoptotik hücre ölümü sürecinde efektör görevi üstlenenler (kaspaz-2, 3, 7) - ced 3 ailesi, Grup 3 : Apoptotik hücre ölümünde aktivatörler (kaspaz-6, 8, 9, 10) - ced 3 ailesi (14). Kaspazlar tetrapeptit motiflerini aminoasit spesifitelerine göre tanır ve p4 pozisyonundaki aminoasitlere göre üç spesifik gruba ayrılır. Grup 1 kaspazlar (kaspaz-1, 4, 5, 13) P4 pozisyonunda hidrofobik aminoasitleri tanırlar ve sitokinlerin maturasyonuna aracılık ederler. Grup 2 kaspazların yeğledikleri ayırma noktası hücre ölümü sırasındaki pek çok proteinlerde gözlenir ve bununla ilintili olarak da grup 2 kaspazlar (kaspaz-2, 3, 7) apoptosisin major efektörleri olarak bilinirler. Grup 3 kaspazlar (kaspaz-6, 8, 9, 10) ise P4 pozisyonunda alifatik aminoasitleri tanır ve grup 2 kaspazların aktivasyonunda görev alır (şekil 2). Kaspazlara ek olarak bir serin proteaz olan granzim-B gibi başka proteazlar da kaspaz aktivasyonunda görev alarak ve bazen de kaspazların yerine fonksiyon görerek apoptotik hücre ölümüne katkıda bulunur (şekil 2). Bu sıralanmanın istisnaları da mevcuttur. Örneğin kaspaz-2 kendiliğinden aktive olabilir. Kaspaz-6 efektör proteaz olarak görev alabilir (10). Kaspazlar inaktif üç parçalı proenzimler olarak sentez edilirler. Aktivasyonları sırasında aspartat (P1) - X (P2) bağının ayrılması ile proenzimden, küçük ve büyük subüniteleri içeren aktif enzim oluşur. Ayrılma noktasında aspartatın bulunması kaspazın oto-aktif ya da aktive edilebilir olmasıyla uyumludur. Ayrılma işleminden sonra 2 büyük ve 2 küçük alt üniteden oluşan tetramer yapısına sahip kaspaz yapısı izlenir (şekil 3). Şekil 3: Kaspaz X-ışını kristal yapılanması. Kaspazların tetramer yapısı 2 adet büyük (dışta) ve 2 adet küçük alt üniteden (içte) oluşmuştur. Bu şekilde kaspaz-3 ve onun inhibitörü Ac-DEVD-CHO (sarı) görülmektedir (24). Kaspaz aracılı apoptozisin aktivasyonunda üç ayrı yolun varlığı bilinmektedir; 1. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis 2. Hücre yüzey reseptörleri aracılığı ile tetiklenen apoptozis 3. Endoplazmik retikulum aracılı apoptozis 1. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı Apoptozis: Hücresel stres durumunda mitokondriden, sitokrom c ve apoptotik proteaz aktive edici faktör (Apaf-1) salınarak dATP kofaktörlüğünde prokaspaz-9 molekülüne bağlanır (şekil 4). Bu yolla aktive olan kaspaz-9, prokaspaz-3'ü aktive eden kaskadı başlatır ve devamında sitoplazmada yapısal poteinlerin sindirimi, kromozomal DNA'nın degradasyonu ve hücrenin fagositozu sağlanır (19,20,21). Şekil 4: Sitokrom c ve Apaf-1 aracılı apoptozis Apaf-1 molekülündeki konformasyonel değişiklikler apoptozom oluşumuna ve apoptozisin aktivasyonuna neden olur. Apoptozomun oluşum ve fonksiyon görmesi ise mitokondrial ve sitozolik faktörler tarafından düzenlenir (22). 2. Hücre yüzey reseptörleri aracılığı ile tetiklenen apoptozis: Fas-ligand (Fas-L) ve Tumor necrosis factor (TNF) gibi moleküllerin, hücre yüzeyindeki Fas ve TNF reseptörlerine bağlanmasıyla sitoplazmaya Kaspaz-8'i aktive eden sinyaller yayılır. Kimyasal, fiziksel ya da viral enfeksiyonlarla hasar görmüş hücrelerde, interlökin-1 (IL-1) gibi pro-enflamatuar sitokinlerin etkisi ile hücre yüzey Fas ekspresyonu başlar. Bu süreç Fas antijeninin up-regülasyonu olarak adlandırılır. Bu süreç sırasında sitotoksik T hücreleri de Fas-L yapımı için uyarılırlar ve Fas- FasL bağlanması ile prokaspaz 8 ve 2'nin aktivasyonu sağlanır (23). Böylece hücrenin apoptozise gitmesi indüklenmiş olur (24). Fas-Fas-L etkileşimi FADD (Fas bağımlı ölüm domain proteini) aracılığıyla olur (25) (şekil 5). Bir yandan da, ilk kez granülositlerde keşfedildiği için Granülosit-enzim kelimelerini birleştirerek ifade edilen Granzim B (GrB ), sitotoksik T hücrelerinden salgılanarak GrB reseptörlerine bağlanır. GrB bir serin proteaz enzimidir. Sitoplazma içine alınan GrB, kaspas kaskadı üzerinden apoptozisi başlatır (26,27,28,29). 3. Endoplazmik retikulum aracılı apoptozis: Endoplazmik retikulum (ER), hücre içi kalsiyum dengesi, sentezi ve membran proteinlerinin katlanmasını içeren birçok süreçte kritik öneme sahiptir. Hücre içi kalsiyum seviyeleri yükseldiğinde ER membranında lokalize olan prokaspaz-12 aktifleşir ve sitoplazmaya yönelir. Kaspaz-9 ile karşılıklı olarak etkileşerek kaspaz kaskadını aktive eder (30,31). Kaspasların etkilediği hedef noktalar; DNA hasarının tamirinden sorumlu Poli ADP Riboz Polimeraz (PARP) (9,32), DNA-bağımlı protein kinaz (DNA-PK) (33,34), nükleus membranının integritesini sağlayan laminler (35) ve UlRNP (9), DNA'nın parçalanmasına yol açan nükleazları inhibe eden DNA fragmentasyon faktörü (DFF 45) adlı protein (36), hücre içi kolesterol homeostazisinden sorumlu bir integral protein olan Sterol Düzenleyici Element Bağlayıcı Protein (SREBP-1) (16-37), bir tümör supresör gen olan retinoblastom geni ve hücre iskelet proteinlerinden Fodrin (23) olarak özetlenebilir. Apoptozisi saptamak icin çok çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. 1972 yılında, apoptozis terimi ilk kez kullanıldığında hücrenin morfolojik görünümüne göre karar verilmişti. Günümüzde ise morfolojik değerlendirmenin yanı sıra, apoptozise özgü olduğu bilinen bazı aktivasyonların (örn, aktif kaspaz-3 tayini) moleküler düzeyde belirlenmesiyle de apoptosiz saptanabilmektedir. Bu yöntemler şu şekilde sıralanabilir (38): I. Morfolojik görüntüleme yöntemleri 1. Işık Mikroskobu • Hematoksilen Boyama • Giemsa Boyama 2. Floresan Mikroskobu / Lazerli Konfokal Mikroskop 3. Elektron Mikroskobu 4. Faz Kontrast Mikroskobu II. İmmunohistokimyasal yöntemler 1. Anneksin V Yöntemi 2. Tunnel Yöntemi 3. M30 Yöntemi 4. Kaspaz 3 Yöntemi III. Biyokimyasal yöntemler 1. Agaroz Jel Elektroforezi 2. Western Blot 3. Flow Sitometri III. İmmunolojik yöntemler 1. Elisa 2. Flourimetrik Yöntem IV. Moleküler Biyoloji yöntemleri (DNA Microarrays) Günümüzde pekçok çalışmada bu yöntemlerden bir veya birkaçından birlikte faydalanıldığı ve gerek çeşitli çevresel toksinlerin gerekse birtakım hastalıkların dokulardaki etkisini göstermek amacıyla kullanıldığını görmekteyiz. KAYNAKLAR 1. Kerr J.F., Wyllie A.H, Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26 (4): 239-245. 2. Lipponen P, Aaltomaa S, Kosma VM, Syrjänen K. Apoptosis in breast cancer as related to histopathological characteristics and prognosis. Eur J Cancer. 1994; 30A(14): 2068-73. 3. Wyllie AH, Kerr JF, Currie AR. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol. 1980;68:251-306. 4. Majno G, Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 1995 Jan;146(1):3-15 5. Hopwood D, Levison DA. Atrophy and apoptosis in the cyclical human endometrium. Pathol. 1976 Jul;119(3):159-66. 6. Cohen JJ. Apoptosis: mechanisms of life and death in the immune system. J Allergy Clin Immunol. 1999 Apr;103(4):548-54. 7. Kiess W, Gallaher B. Hormonal control of programmed cell death/apoptosis. Eur J Endocrinol. 1998 May;138(5):482 - 91. 8. Hetts SW. To die or not to die: an overview of apoptosis and its role in disease. JAMA. 1998 Jan 28;279(4):300-7. 9. Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci. 1997 Aug; 22(8):299-306. 10. Nicholson DW. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death Differ 1999; 6:1028-1042. 11. Thornberry NA, Bull HG, Calaycay JR, Chapman KT, Howard AD, Kostura MJ, et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1 beta processing in monocytes. Nature 1992; 356: 768 - 774. 12. Cerretti DP, Kozlosky CJ, Mosley B, Nelson N, Van Ness K, Greenstreet TA, et al. Molecular cloning of the interleukin1 beta converting enzyme. Science 1992; 256: 97 - 100. 13. Ellis RE, Yuan JY and Horvitz HR. Mechanisms and functions of cell death. Annu. Rev. Cell. Biol. 1991; 7: 663 - 698 14. Xue D, Shaham S and Horvitz HR. The Caenorhabditis elegans celldeath protein CED-3 is a cysteine protease with substrate specificities similar to those of the human CPP32 protease. Genes. Dev. 1996; 10: 1073 - 1083 15. Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM and Horvitz HR. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 1993; 75: 641 - 652 16. Alnemri ES, Livingston DJ, Nicholson DW, Salvesen G, Thornberry NA,Wong WWand et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell 1996; 87 (2): 171 17. Thornberry NA, Rano TA, Peterson EP, Rasper DM, Timkey T, Garcia-CalvoM, et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J. Biol. Chem. 1997; 272: 17907 - 17911. 18. Rano TA., Timkey T., Peterson EP., Rotonda J., Nicholson DW., Becker JW., et al. A combinatorial approach for determining protease specificities: application to interleukin-1beta converting enzyme (ICE). Chem. Biol. 1997; 4: 149 - 155. 19. Hu Y M, Benedict M A, Ding L Y. Role of cytochrome c and dATP/ATP hydrolysis in Apaf-I-mediatcd caspase-9 activation and apoptosis. EMBO J. 18: 3586- 3595, 1999. 20. Krajewski S, Krajewska M, Ellerby L M, Welsh K, Xie Z, Deveraux Q L, Salvesen G S, Bredesen D E, Rosenthal R E, Fiskum G, Reed J C: Release of caspase-9 from mitochondria during neuronal apoptosis and cerebral ischemia. Proc Natl Acad Sci, USA 96: 5752-5757, 1999. 21. Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 1997; 91: 479 - 489 22. Cozzolino M, Ferraro E, Ferri A, Rigamonti D, Quondamatteo F, Ding H, Xu ZS, Ferrari F, Angelini DF, Rotilio G, Cattaneo E, Carrì MT, Cecconi F. Apoptosome inactivation rescues proneural and neural cells from neurodegeneration. Cell Death Differ. 2004 Nov;11(11):1179-91. 23. Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science. 1995; 267:1449-56. 24. Grell M, Krammer PH, Scheurich P. Segregation of APO- 1/Fas antigen- and tumor necrosis factor receptor-mediated apoptosis. Eur J Immunol. 1994 Oct; 24(10): 2563-6. 25. Bhojani MS., Chen G., Ross BD., Beer DG., Rehemtulla A. Nuclear localized phosphorylated FADD induces cell proliferation and is associated with aggressive lung cancer. Cell Cycle. 2005 Nov;4(11): 1478-81. Epub 2005 Nov 20. 26. Srinivasula SM., Ahmad M., Fernandes-Alnemri T., Litwack G., Alnemri ES. Molecular ordering of the Fas-apoptotic pathway: the Fas/APO-1 protease Mch5 is a CrmA-inhibitable protease that activates multiple Ced-3/ICE-like cysteine proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:14486-91. 27. Darmon AJ., Nicholson DW. ,Bleackley RC. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature 1995; 377: 446 - 448. 28. Martin SJ., Amarante-Mendes GP., Shi L., Chuang TH., Casiano CA., O'Brien GA., et al. The cytotoxic cell protease granzyme B initiates apoptosis in a cell- free system by proteolytic processing and activation of the ICE/CED-3family protease, CPP32, via a novel two-step mechanism. EMBO J. 1996; 15: 2407-2416. 29. Andrade F., Roy S., Nicholson D., Thornberry N., Rosen A., Casciola-Rosen L. Granzyme B directly and efficiently cleaves several downstream caspase substrates: implications for CTL-induced apoptosis. Immunity 1998; 8: 451-460. 30. Nakamura K, Bossy-Wetzel E, Burns K, Fadel MP., Lozyk M. et al. Changes in endoplasmic reticulum luminal environment affect cell sensitivity to apoptosis. J Cell Biol 2000; 150: 731-740. 31. Rao RV., Hermel E., Castro-Obregon S., del Rio G., Ellerby LM. et al. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program: mechanism of caspase activation. J Biol Chem 2001; 276: 869-874. 32. Hirata H., Takahashi A., Kobayashi S., Yonehara S., Sawai H., Okazaki T. et al. Caspases are activated in a branched protease cascade and control distinct downstream processes in Fas-induced apoptosis. J Exp Med. 1998;187:587-600. 33. Casciola-Rosen L, Nicholson DW, Chong T, Rowan KR, Thornberry NA, Miller DK, et al. Apopain/CPP32 cleaves proteins that are essential for cellular repair: a fundamental principle of apoptotic death. J Exp Med. 1996 May 1;183(5):1957-64. 34. Song Q., Lees-Miller SP., Kumar S., Zhang Z., Chan DW., Smith GC. DNA-dependent protein kinase catalytic subunit: a target for an ICE-like protease in apoptosis. EMBO J. 1996;15:3238-3246. 35. Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R, Wang X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell. 1996; 86:147-157. 36. Chen WJ, Huang YT, Wu ML, Huang TC, Ho CT, Pan MH. Induction of apoptosis by vitamin D2, ergocalciferol, via reactive oxygen species generation, glutathione depletion, and caspase activation in human leukemia Cells. J Agric Food Chem. 2008 May 14;56(9):2996-3005. Epub 2008 Apr 37. Zou H, Henzel WJ, Liu X, Lutscha A, Wang X. Apaf-1, a human protein hoınologous to C.elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Celi. 1997;90:405-13. 38. Ulukaya E. Apoptozis ders notları. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı 2003;15-26. Yazışma Adresi: Dr. K. Beril YÜKSEL Dr. Zekai Tahir Burak Kadın Sağlığı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Hamamönü / ANKARA Tel: 0 312 310 31 00 e-mail: berilyu@hotmail.com Bu metin dergi.ztb.gov.tr adresinden alınmıştır.   Yüksek organizmalarda hücre ölümü iki farklı mekanizma ile gerçekleşir. Klasik hücre ölümü nekroz olarak adlandırılır.Şiddetli bir travma, zararlı bir uyarı ile meydana gelir. Genellikle gruplar halinde hücreleri etkiler.Morfolojik olarak ER, mitokondride dilatasyon, plazma membranının iyon transportunun bozulması,hücrelerin şişmesi ve lizisi tipiktir.Nükleer kromatin flokulasyonu, DNAnın nonspesifik klavajı, hücrelerin parçalanması ile hücre içeriği ve lizozomal enzimler eksrasellüler ortama dökülür.Bu enzimlerde komşu hücre ve dokuları zedeleyerek inflamatuar yanıta yol açar. Hücre ölümünün diğer şekli Apoptosis genellikle tek tek hücreleri etkiler.Birçok fizyolojik ve patolojik koşulda ortaya çıkar ve genellikle inflamatuar yanıt söz konusu değildir. Müllerian kanalın ve interdigital perdelerin regresyonu, B ve T hücrelerin negatif seleksiyonu, self antijenleri tanıyan immunkompetan hücrelerin delesyonu, hormon bağımlı dokuların, hormon yokluğunda involusyonu gibi birçok fizyolojik olayda rol alır. Apoptosis, hücrelerin öldürülmesinde fizyolojik bir süreçtir.Çok hücreli organizmaların gelişimi, işlevselliğinde çok önemlidir. Bu hücre ölümünün kontrolündeki anormallikler : --Kanser --Otoimmun Hastalıklar --Dejeneratif Hastalıklar oluşumuna neden olur Organizmanın bütünlüğü ve homeostazisi, hücre çoğalması ve farklılaşması yanısıra, hücre ölümü ile sağlanabilir. Apoptosis sinyallenmesi ya hücre içinden gelen tetikleyici olaylar yada ölüm reseptörlerinin ligasyonu gibi hücre dışındaki olaylarla olur.Tüm apoptosis sinyalleyici yollar, proteinleri aspartat rezidülerine bölen, sistein proteazlar (Kaspazlar) ile olan ortak hücre yıkımı işleminde birleşir.Doku transglutaminaz aktivitesi ise proteinlerin çapraz bağlanmasına yol açarak intrasellüler yapıların ekstraselüler alana dökülmesine engel olur. Ölü hücrelerin yıkımı ve uzaklaştırılması, komşu hücrelerin fagozitozu ile olur. Apoptosisdeki Morfolojik Değişiklikler: Elektron mikroskobunda apoptosis esnasında; -Kromatin kondansasyonu -Stoplazmik büzülme -Plazma membran kabarması Apoptosis erken safhasında ER, mitokondri, golgide gözlenebilir değişiklikler olmadığı gösterilmiş olmakla beraber son zamanlarda, mitokondri dış membranında şişme, mitokondrial membran aralıgında sitokrom c ve bir oksidoredüktaz ile ilişkili flavoprotein olan Apopitos İndükleyici Faktör salınımı olduğu bildirilmiştir. Apoptosis esnasındaki moleküler degişiklikler arasında ; -DNA ayrılması -İç ve dış plazma membran yaprakları arasında PS dağılımının randomizasyonu vardır. Bu değişiklikler; -DNA kırılmasında,nukleotitlerin terminal deoksinükleotidil transferaz yolu ile belirlenmesi, -PS in annexin ile boyanması , -Subdiploid DNA içeriği olan hücrenin, DNA ekleyen boyalar ile belirlenmesi ile gösterilebilir. Apoptosisdeki Major Oyuncular: 1-Kaspazlar 2-Kaspazların başlatıcı etkinliğini kontrol eden Adaptor Proteinler 3-TNF-R 4-Bcl-2 proteinleri KASPAZLAR: İnisiatör K. Efektör K. Cytokin Maturasyon Ced-3 C-3 C-1 C-13 C-2 C-6 C-4 C-14 C-9 C-7 C-5 C-10 C-11 C-8 C-12 Bir grup sistein proteaz enzimidir. Apoptosis için gereklidir. Kaynağına yada ölüm uyaranına bakılmaksızın apoptosise giden tüm hücrelerde sistein proteaz aktivitesi tespit edilir. Basulovirus protein P35, tüm kaspazların potent inhibitörüdür. Kaspazlar, apoptosisin son devresindeki hücresel substratların degradasyonundan sorumlu olduğu gibi apoptosisin başlatılmasında da kritik önemi vardır.Memelilerde en az 14 kaspaz vardır.Bunlar tetrapeptit motifleri tanır ve substratı, bir aspartat rezidüsünün karboksil tarafından ayırır. Kaspazlar, düşük intrensik etkinlik gösteren zimojenler olarak sentezlenir.Aktif enzim, 20kD luk subünite ilaveten 10kD luk subünit bulunan bir heterotetramerdir. Kaspaz 8 ve Kaspaz 9, baslatıcı kaspazlardır ve efektör kaspazların aktivasyonunu başlatır.Bazı kaspazlar ise self processingdir. Efektör kaspazlar;-DNA onarım enzimleri -Lamin -Gelsolin -MDM2(P53inhibitörü) -Protein Kinaz Cd , gibi yaşamsal proteinleri ayırmakta ve inaktive etmektedir.Kaspaz yollu proteoliz ile aktive olan enzimlerde vardır.Kaspaz yolu ile aktifleşen DNAase (CAD) normalde bir inhibitöre İCAD(DNA fragmantasyon faktör) a bağlanarak inaktive olmaktadır.Apoptosis esnasında İCAD kaspazlar tarafından ayrılmakta ve bu durum karekteristik internükleozomal DNA ayrılması oluşturur. Aktif endonükleazın salınmasına yol açar. - ADAPTÖR PROTEİNLER: Adaptor proteinler: Apaf-1 Ced-4 RAIDD FADD/MORT1 RIP FLIP1 -Hücre ölüm efektörleri, -Hücre ölüm regülatörleri, -Ölüm reseptörleri, -Bcl-2 gen ailesi , arasındaki bağlantıyı kurarlar. Kaspazlar, TNF-Rleri ve Adaptör Proteinler arasındaki bağlantılar, ölümsahası(DD), ölüm effektör sahası(DED) ve Kaspaz Toplama sahası(CARD) olarak bilinen alanlar arasındaki homotipik etkilesimler yolu ile sağlanmaktadır. DD içeren bir TNF-R üyesinin adaptör proteini çapraz bağlanmasından sonra TNF-R’nin DD ile adaptör proteinin DD i arasındaki homotipik etkileşimler, kaspaz agregasyonuna ve aktivasyonuna izin verir. Kaspaz toplanması ve birikimi adaptör proteinlerde bulunan başka bir alan olan DED yolu ile de olur. DEDler FADD ve Kaspas 8 de de vardır. Bu nedenle CD95in çapraz bağlanması prokaspaz 8, agregasyonu ve FADD yolu ile aktiflenmesi sonucunu doğurabilir. DR --FADD--Kaspas 8, sinyallenmesi , FLİP molekülleri ile bloke edilebilir. FLİP molekülleri prokaspaz 8 in toplanması ve aktiflenmesini önlemektedir. FLİP in, FLİPL ve FLİPS şekilleri vardır. FLİPL daha yaygındır ve prokaspaz 8 e çok benzer.FLİPS ise sadece iki DED içerir. Bütün kaspazlar TNF-R çapraz bağlanma yolu ile aktive olmadığı gibi bütün başlatıcı kaspazlar DED içermezler. Memeli prokaspaz 9 ve prokaspaz 2 ve C.elegans Ced-3 ü aynı zamanda kendi spesifik adaptörü olan Apaf-1 ve Ced-4 te bulunan CARD ler içerir. Kaspaz 8, CD95 yoluyla aktive olurken, Kaspaz 9 Apaf-1 ile aktive olur ve Bcl-2 proapopitotik üyeleri ile kontrol edilir. TNF-R AİLESİ: TNF-R1 CD95 DR3 CAR1 DR4 DR5 NGFRp75 TNF-R üyelerinin pleotropik etkisi vardır. Hücre tipine ve aldığı sinyallere göre proliferasyon ,canlı kalma, farklılaşma yada ölümü tetikleyebilir. Bu reseptörler, TNF ligant ailesine ait ligantlar tarafından aktive edilir. Bu bağlar memrana bağlanmış trimerler olarak sentezlenir, sinyalleme için çok miktarda çapraz bağlanma gerekir. TRAİL/APO-21(TNF ile ilgili apoptosis başlatıcı ligant), Apoptosisi transforme hücrelerde başlatır ve diğer ligantlara kıyasla dokularda daha yaygındır. TRAİL in 4 reseptörü tanımlanmıştır: DR4 , DR5 , DCR1 ,DCR2 . Fakat sadece DR4 ,DR5 apoptosisi başlatır. Diğerleri, intrasellüler ve transmemran bölgeleri yada DD bölgeleri içermediginden apoptosisi başlatamazlar. Bu reseptörler tuzak vazifesi görür. Akciğer ve kolon kanserinde Fasl (DCR3) ye karşı bir tuzak reseptörün çok fazla olduğu gösterilmiştir. Spesifik kaspaz inhibitörleri ve kaspaz eksikliği olan mice’ların fibroblastlarında yapılan deneylerde, kaspaz 8 in , DR4 , DR5 ve DR3 ile oluşan apoptosis için şart olduğunu göstermiştir. BcL-2 ÜYELERİ: Antiapoptotik Proapoptotik Bcl-2 Bax Bcl-xl Bod Boo Bcl-xs Bcl-w Bid A1 Bim Mcl-1 Blk Bak Antiapoptotik Bcl-2 üyeleri, a.a sıraları en az üç dört bölgede benzerlik gösterir. Bcl-2 ye benzerlik gösterirler. Proapoptotik Bcl-2 lerin hepsinde BH3 bölgesi vardır. Antiapoptotiklerde bu bölge yoktur. Bcl-2 proteinlerinin, transmembran bir C terminali vardır. Bu alan nükleer membran, mitekondri dış membranı, ER membrannın sitozolik tarafında yer alır. Bunlar etkileşim bölgeleridir. Bu bölgeler bazılarında sabit iken bazılarında degişebilir. Örneğin, Bax sitozolik bir proteindir, apoptosisde mitokondrial membrana redistribsiyonu olur. Antiapoptotik Bcl-2 üyeleri kaspaz aktivasyonunu önleyerek antiapoptotik etki gösterirler. Proapoptotik Bcl-2ler sinyalleri adaptör proteinlerde yoğunlaştırır, adaptör proteinler ölüm teşvik edici protein kompleksi Apoptosom un tam bileşimidir. Memelilerde,efektör kaspazlarin aktivasyonu iki farklı mekanizma ile olur; 1-Hücre içinde stresle ortaya çıkan sinyallerle başlar. -Timosit ve embriyonik fibroblastlarda, -DNA hasarında, -Steroid,Strausporin tedavisinde, -Büyüme faktörü yoksunluğunda, oluşan apoptosisler genelde böyledir. Burada Apaf-1 ve Kaspaz 9, Kaspaz 3, gereklidir. Bcl-2 antiapoptotik proteinleriyle bloke edilir. Bu ölümler ihmal ölümleri olarak bilinir. 2-Apoptotik sinyallerle, CD95 ve TNF-R yoluyla apoptosis. FADD ve Kaspaz 8 gereklidir. Bcl-2 apoptotik proteinlerle bloke edilemez. Özellikle lenfositlerdeki apoptosis bu yolla olur. Aynı hücrede TNF-R ve Bcl-2 tarafından kontrol edilen yolların aynı anda bulundugu gösterilmiştir ve muhtemelen aralarında bir bağlantı olduğu tespit edilmiştir. Hücre extraktları ile yapılan çalışmalar, Holocytochrom c, dATP, ATP nin Apaf-1 ile olan Kaspaz 9 aktivasyonunu ilerlettiğini göstrmiştir. Ek larak, Holocytochrom c nin, apoptos altındaki hücrelerde mitekondriden stoplazmaya göç ettiği gösterilmiştir. Apoptosis boyunca hücre ölümü bir çok dokuda, hücre diferansiasyonunun farklı aşamasında meydana gelebilir. Apoptosisdeki anormallikler hastalıkların oluşumunda rol alabilir. Antiapoptotik Bcl-2 ekspresyonu fazla olan miceların tümörogenezise eğilimli olduğu gösterilmiştir. Tek başına Bcl-2 daha az onkojendir fakat l-myc ve pim 1 ile sinerjik etki gösterir. Bcl-2 fazla ekspresyonu neoplastik transformasyonda hücrelerin yaşam süresini uzatmada rol alır ve onkojenik kazanılmış mutasyonları kolaylaştırır. Bcl-2 proapoptotik üyeleri tümör supressör gibi görev yapar. Kemoteropatikler ve radyasyon terapisi tm hücrelerinin apoptosisini teşvik eder. Çalışmalar Kaspaz 8 ve Kaspaz 1 dışındaki kaspazların ilaçla teşvik edilmiş apoptosis için esansiyel uyaranlar olduğunu göstermiştir. Kaspaz 8 i olmayan mice ların kemoterapiye ve radyoterapiye daha duyarlı olduğu Kaspaz 9 u olmayanların da yüksek derecede dirençli olduğu gösterilmiştir. Hücrelerin uygunsuz hayatta kalışları sadece tümörogenezis için geçerli değildir. Bağışıklık sistemi yanıtı hızlı hücre proliferasyonu ile karekterize edilir. Anormal şekilde uzatılmış aktive lenfosit yaşamı, etkin lenfokin üretimi ve bulundukları ortama korkunç zararları ile sonuçlanır. Transgenik mice’ların B lenfositlerinde Bcl-2 nin fazla ekspresyonu veya Bim in olmaması, uzamış humoral yanıt ve plazma hücrelerinin patolojik birikimine yol açar(SLE). Apoptosis viruslara ve intersellüler diğer patojenlere karşı savunma mekanizması olarak kullanılır. Bu patojenlerin bir çoğu yaşadıkları hücre ölümüne karşı engelleyici mekanizmalar geliştirmişlerdir. Örn:Adenovirus Protein E1B55 viral replikasyonu sağlarken, hücreninde apoptosisini aktive eder. Bu Apoptosis de iki Adenovirus proteini E1B55(P53homoloğu), E1B19 (Bcl homoloğu) ile bloke edilebilir. Bcl –2 homologlarına ilaveten virusler daha değişik inhibitörler kazanmıştır. Adenovirus---E3-14.7 Kaspaz 8 i inhibe eder. Compox V.---Crm-A Kaspaz 1 ve 8 inhibe eder. İL-1,İNFg,İNFb üretimini inhibe eder.CD95, TNF-R1 tarafından saglanan apoptosisi engeller. Pox V.---TNF-R homologlarını kodlar , TNF ve lenfotoksinlerin yaptığı olayları nötralize eder. Basulovirus ---P35 , bütün kaspazları inhibe eder. Herpes V.8---Bcl-2 homoloğu ORF-16 ve vFLİP ORF-71(prokaspaz 8 inhibisyonu). Bircok virus hem Bcl-2 hem de reseptör aracılı apoptosisi engelleyebilir.

http://www.biyologlar.com/apoptozis-ve-kaspazlar

İlk plazmid nasıl oluşmuştur

*Plazmidler, çoğu bakteri türünde bulunan,ancak her suşta bulunmayan halkasal veya süper sarmallı DNA molekülleridir. *Plazmitler, küçük moleküllerdir; bu açıdan bir karşılaştırma yapılırsa, bakteriyel kromozomun %20’si ile %4′ü arasında büyüklüklerde olduğu görülür. *Plazmidler, bazı üreme koşullarında konakçı hücre için mutlaka taşınması gereken yapılar değildir. Bununla birlikte, pek çok plazmid, özel koşullara uyum sağlamak için önemli olan genler içerir. Bu genler,çoğu kez bakterinin plazmiti taşıdığına dair temel işaret olurlar. Örneğin R plazmid taşıyıp, çeşitli antibiyotiklere dirençli olan bakteriler, aynı plazmiti taşımayan bakterilerin yaşayamadığı antibiyotikli ortamlarda yaşayarak diğerlerinden ayrılırlar . *Bir çok bakteride plazmid, hücreler arası gen transferinin özel bir tipinden sorumludur. Plazmidlerin bu özellikleri, 1950′lerde ilginç bir çalışma konusu olmalarına sebep olmuştur. Plazmidler, normalde konakçının replikasyon sistemini büyük ölçüde kullanmaları sebebiyle bakteriyel DNA replikasyonunun anlaşılması için iyi modeller olmuşlardır. Ayrıca, mikrobiyal genetikte kısmi diploidlerin yapılmasına yönelik çalışmalarda kullanıldıkları için önemlidirler. ***Başka bir önemleri de, genetik mühendisliğinde klonlama vektörü olarak kullanılmalarıdır. Plazmit Tipleri Farklı tiplerdeki plamitlerle ilgili genel bilgi Plazmitlerin Saptanması Bir bakteri suşunun plazmit taşıyıp taşımadığının, taşıyorsa bu plazmitin ne gibi özelliklerinin olduğunun bakteri genetiği yöntemleri ile belirlenmesi. Plazmitlerin Saflaştırılması Plazmit DNA’nın saflaştırılması: Moleküler biyolojide temel ve vazgeçilmez tekniklerden biri, Alkali lizis yöntemi. Plazmit Transferi Bakterilerde gen aktarımı. Plazmitlerin Replikasyonu Plazmit DNA nasıl çoğalır, yavru hücrelere nasıl dağılır? Önemli Plazmitler Önemli plazmit tipleri hakkında daha ayrıntılı bilgi. F, R, Col; ek olarak Ti ve Degredasyon Plazmitleri Kaynakça PLAZMİD TİPLERİ Çetitli E.coli suşlarında bir çok plazmit tipine rastlanmıştır. Ancak en çok bilinenleri, F, R ve Col plazmidleridir. Bu plazmidler, bazı özellikleri paylaşsalar da, önemli farklılıklara sahiptirler. Bir bakteride F, R ya da Col plazmidinin bulunup bulunmaması aşağıdaki özelliklerden yararlanılarak anlaşılabilir: 1. F ; Fertilite veya Seks Plazmidleri: Bu plazmidler, konakçılarına, kromozomal genlerini F plazmidinden yoksun hücrelere aktarma yeteneği kazandırırlar. F plazmidi, bu gibi durumlarda kendisini de alıcı hücreye transfer edebilir. 2. R ; Direnç Plazmidleri: R plazmidleri, konakçıyı bir veya daha fazla antibiyotiğe karşı dirençli kılar. Bu tip plazmidler, transfer edilerek başka hücrelerin de direnç kazanmasına yol açabilirler. 3. Col; Kolisinojenik Plazmidler: Col plazmidleri, “kolisin” adını alan bir grup proteinin sentezinden sorumlu genleri içerirler.Kolisinler,yakın suşlardan aynı tip Col plazmitini taşımayan bakterileri öldürme özelliğindedirler. Öldürme mekanizmasi, Col plazmidinin tipine göre değişiklik gösterir. Bu plazmit tipleri hakkında daha ayrıntılı bilgi, Önemli Plazmitler bağlantısında bulunabilir. Sonraki Konu: Plazmitlerin Saptanması PLAZMİDLERİN SAPTANMASI Plazmidler,hem genetik,hem de fiziksel yöntemler kullanılarak saptanabilirler.İlk olarak F plazmidi keşfedilmiştir. Met-Bio-Thr+Leu+ fenotipineki bir E.coli sutu (A),Met+Bio+Thr-Leu- fenotipindeki diğer bir suşla karıştırılarak minimal agara ekim yapıldığında minimal agarda yaklaşık 10-7 frekansında koloniler teşekkül etmiştir. Bu koloniler, Met+Bio+Thr+Leu+ fenotipinde; dolayısıyle, rekombinant kolonilerdi. Karıştırma işleminden önce A suşu streptomisinle muamele edilince,rekombinant koloniler yine oluşmuş; ancak ,B suşuna streptomisin uygulanınca koloni gözlenmemiştir. Bu deney, rekombinantların B suşundan türediğini olayın tek yönlü bir genetik bilgi akterımı olduğunu göstermiştir. Başka bir deneyde B’ye genetik bilgi aktaramayan bir suş, “C” suşu, A ile karıştırılıp uzun süre bir arada üretilmiş ve daha sonra karışımdan izole edilen C kolonilerinin B’ye gen aktarımı yaptığı gözlenmiştir.Bu deney sonuçlarından anlaşılmıştır ki, A suşu, B’ye gen transferini sağlayan bir fertilite elementine; “F” faktörüne sahiptir, C suşunda da F faktörü bulunmamaktadır; A ve C suşlarının bir arada üretilmeleri halinde F faktörü, A suşundan C suşuna transfer edilmekte, buna bağlı olarak da, genetik markırları B suşuna aktarabilen yeni bir C suşu ortaya çıkmaktadır. Başlangıç çaprazlaması: F+Met-Bio-Thr+Leu+ X F-Met+Bio+Thr-Leu- şeklindeydi. Transfer tek yönlü olduğu için F faktörü taşıyan hücreye donör (erkek), taşımayan hücreye ise resipient (dişi) adı verilmiştir. F’ adını alan F varyantlerı, plazmid üzerinde kromozomal genler de taşırlar.Bu konudaki ayrıntılı çalışmalardan biri, lac operonu ile ilgilidir ve kısmi diploidlerin elde edilmesimde kullanılmıştır. Bu deneyde, F’ lac bakteriler tasarlanmıştır. F’ ın transferi, bir antibiyotik içeren minimal laktoz katı kültür ortamına duyarlı donör ve dirençli resipient hücrelerin ekilmesiyle kolayca anlaşılabilir. çapraz tekli: F’ lac+ / lac- Strs X lac- Strr Plazmid üzerinde lac+ markırı taşıyan donör hücrelerle kromozomda lac- markırı taşıyan resipient hücreler karıştırılıp streptomisinli minimal laktoz agara ekilince rekombinant koloniler oluşmuştur (F’ lac+ / lac- Strr rekombinantları). Yalnızca donörün ekildiği kontrolde hücreler streptomisine duyarlı oldukları için; yalnız resipientin ekildiği kontrollerde ise hücreler laktozu kullanamadıkları için koloni oluşmamıştır. Burada, streptomisin markırının donör üremesini engelleyici özelliği önemlidir ve böyle markırlara “counterselection” ya da “counterselective” markırlar denir. Counterselective amaçlı olarak antibiyotik resistansı sıklıkla kullanılsa da diğer fenotipler de iyi sonuç verir. Örneğin, F’ transferi, F’ lac+ / met- X lac- met+ çaprazları minimal laktoz katı besiyerine ekilerek kontrol edilebilirler. Donörler, ortamda methionin olmadığı için (methionin eksiklği, counterselectiondur); resipientlerse laktozu karbon kaynağı olarak kullanamadıkları için üreyemezler. Yalnızca, F’ transferi yapan rekombinantlar üreyebilir. Bu durumda seçilmiş markır, lac+ ‘tir. F içeren A ve B suşları arasındaki çaprazlama ve F’ suşlarıyla yapılan deneyler arasında,önemli sayısal farklılıklar gözlenmiştir. Suşlar,ekilmeden önce yarım saat karıştırılırsa A X B deneyinde rekombinantların donör hücreye oranı 10-7; F’ deneyinde ise % 50′dir.Farklılığın sebebi, genetik markırın F’ bakterilerde plazmit üzerinde olmasından kaynaklanır. A X B deneyinde resipientlerin yarısı F faktörünü alsalar da çok az bir kısmı kromozomdaki markırları alabilmiştir. Plazmid Nasıl Transfer Edilir ? F’ lac+ / lac- Strs tsxr X F’ lac- Strr tsxs Eşletmesi gerçeklettirilmit, tsxr taşıyanlara Faj T6′nın absorbe olamadığı gözlenmiştir.Eşleşmeden bir süre sonra, bakteri karışımının bir kısmı streptomisinli laktoz kolorindikatör katı besiyerine ekilmiş ve kolonilerin %90′ından çoğunun lac+ olduğu gözlenmiştir.Bu da, donörlerin büyük kısmının F’ lac+ transferi yaptığını gösterir. F’ lac+ i trensfer eden bakterilerin hala plazmidin bir kopyasını taşıyıp taşımadığını belirlemek için, eşleşme karışımının bir kısmı T6 fajı ile muamele edilmiştir. tsxs bireyler,resipientler gibi viruslar tarafından lizise uğratılmıştır. tsxr donörü olup hayatta kalan hücreler, laktoz indikatör besiyerine ekilince, lac+ koloniler oluşmoştur. Sonuçta, donör hücrenin transferden sonra da plazmidin kopyasını taşıdığı; yani,transferin DNA replikasyonu ile birlikte geçekleştiği görülmüştür. Basit bir fenotip göstermeyen plazmitlerin varlığı ise, başka bir yöntemle saptanır. Hücre kültüründen DNA izole edilerek agaroz jel elektroforezi ile analiz edilir. Bakteri kromozomu büyük olduğu için jele giremez. Oysa plazmid, jelde yürüyecek kadar küçüktür. Eğer plazmid varsa, molekkül ağırlığına göre belirli sınırlar içinde band verir. Band, jelin EtBr ile boyanması durumunda UV ışığında görülür. Plazmid DNA büyüklüğü, molekül ağırlığı bilinen ve aynı jelde yürütülen DNA fragmentleriyle karşılaştırılarak hesaplanabilir. Sonraki Konu: Plazmit DNA’nın Saflaştırılması PLAZMİD DNA’nın SAFLAŞTIRILMASI Plazmid izolasyonu için, bakteriler,deterjan uygulamasıyla parçalanır. Elde edilen solüsyon (hücre lizatı), santrifüj edilir. Protein ve RNA ile kompleks yapmış olarak bulunan bakteri kromozomal DNA’sı, büyük olduğu için, santrifüj tüpünün altındaki tabakada yer alır. Daha küçük olan plazmid DNA ise,temiz süpernatanda (temiz lizat) kalır. Plazmitlerin izolasyonu için kullanılan yöntemler, mini prep ve large scale olmak üzere iki şekilde uygulanır. En çok kullanılanlar, alkali lizis ve boiling lizis yöntemleridir. PLAZMİT DNA İZOLASYONU (ALKALİ LİZİS YÖNTEMİ) 1.Gecelik kültürden bir miktar alınarak 6000rpm.’de 5 dakika santrifüj edilir. 2.Süpernatan atılararak çökeltiye 100 ml.G.T.E.eklenir.(1.çözelti) 1.Çözelti (GTE.): 50 mM Glukoz 25 mM. Tris Cl (pH 10 mM. EDTA (pH 3.Tüpe 200 ml.2. çözelti eklenir. 2. Çözelti: 0.2 N NaOH %1 SDS (2. Çözeltinin taze hazırlanması gerekmektedir.Hazırlandıktan sonra buzda bekletilir.) 0.91 ml. dH2O 0.05 ml. NaOH (5 M stoktan) 0.04 ml. SDS (%20’lik stoktan) 4.Tüpe 150 ml.3. çözelti eklenerek 5 dakika buzda bekletilir. 3.Çözelti: 5M (molar) Potasyum asetat Glecial asetik asit dH2O 5. Tüpler,12000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilerek supernatan yeni tüpe alınır.400 ml.fenol ve 400 ml.kloroform eklenerek 12000 rpm’de 2 dakika sanntrifüj edilir. Üst faz yeni bir tüpe alınarak 2 hacim etanol eklenip düşük hızda vortekslenerek 2 dakika oda sıcaklığında bekletilir. 6.12000 rpm’de 5 dakika santrifüj uygulanır,süpernatan atılarak çökeltiye 1 ml. %70′liketanol eklenir. 7.12000 rpm’de 2 dakika santrifüj edilir. 8.Süpernatan atılarak çökelti vakum altında kurutuldu.Kuruduktan sonra distile suda çözülür. Sonraki Konu: Plazmit DNA’nın Transferi PLAZMİD DNA’nın TRANSFERİ Donör ve resipient Hücreler arasındaki rekombinasyona ilişkin ilk bulgulardan biri, rekombinasyon için hücreler arasındaki bir bağlantının gerekliliğidir. Bu durum,F+ ve F- hücre kültürlerinin porlu filtre ile ayrıldığı deneyde gösterilmiştir. Bu durumda, hücre hücreye bağlantı engellenerek rekombinant oluşumunun engellendiği görülmüş ve olay için bakteriyel konjugasyon ya da çiftleşme terimi kullanılmaya başlanmıştır. Bir dizi deneyle, plazmid transferinin dört adımda gerçekleştiği gösterilmiştir. Bu adımlar: 1.Özel donör-resipient etletmesi (efektif kontakt) 2. DNA transferi için hazırlık (mobilizasyon) 3.DNA transferi 4.Replike olabilen fonksiyonel plazmidin resipient içinde tekillenmesi. F ya da F’ içeren hücreler,bir resipientle kontakt kurdukları zaman bu dört adım gerçekleşir. Bazı plazmit tipleri, bu işlemlerin tamamını gerçeklştirmek için genetik olarak yeterli değildirler. Plazmidler, bu özelliklerine göre dört gruba ayrılırlar: · 1. Nontransmissible Plazmitler:Efektif kontakt ve DNA transferi için gerekli olan genleri içermezler. 2. Konjugatif plazmidler: Efektif kontakt itleminin gerçeklettirilmesi için gerekli genleri içerirler. 3. Mobilisable Plazmidler: Plazmid DNA’ sını transfer için hazırlayan genleri taşır. 4. Self Transmissible Plazmidler: Hem konjugatif, hem de mobilize özellik taşırlar (F plazmitler gibi). Konjugatif fonksiyonlar, çoğu kez, plazmide özel değildir ve bundan dolayı, bir plazmid, ikinci bir plazmidin transferine yardımcı olabilir. Örneğin, bir tek hücre, hem F plazmid, hem de Col E1 plazmid taşıyabilir. F plazmid, hem konjugatif hem de mobilisable’dir. Oysa Col E1, mobilisabledir, fakat konjugatif değildir. Bu nedenle,sadece Col E1 plazmidi taşıyan bir hücre, plazmid transferi yapamaz. Her iki plazmidi içeren bir hücrede, F plazmidi,Col E1′de olmayan konjugatif fonksiyonu sağlayabilir, böylece Col E1 plazmiti, her iki plazmitten de yoksun olan bir hücreye aktarılabilir. Bu şekilde nonkonjugatif bir plazmidin, bir konjugatif plazmit sayesinde kurulan efektif kontakt yoluyla transfer edilmesine “donation” denir. Mobilizasyon fonksiyonları ise, genellikle plazmite özeldir; yani, bir self-transmissable plazmid, nonmobilisable bir plazmiti transfer etme yeteneğine sahip değildir. Bununla birlikte, bazı örneklerde, frekans düşük de olsa transfer gerçekleşebilir. Transferin olması için, iki plazmid arasında rekombinasyon yapılarak transfer edilebilir tek bir DNA molekülünün oluşturulması gerekir.Sonuçta, ortaya nonmobilisable plazmidin tamamını taşıyan bir selftransmissible plazmit çıkar. Bu işleme,”kondüksiyon” adı verilir. F aracılığı ile transfer edilen kromozom, kondüksiyonla mobilize edilir. F’teki dizilerle kromozom arasında bir genetik rekombinasyon meydana gelir ve f faktörü, kromozom boyunca resipient hücreye geçer. EFEKTİF KONTAKT ve PİLİ Efektif kontakt için ilk adım, donör ve resipient hücrelerin çift oluşturmasıdır. Çift oluşumu için, donör üzerinde seks pilus adı verilen kıl benzeri bir protein ilaveye ihtiyaç vardır. F içeren ve R içeren hücrelerde, F piluslar ve R piluslar bulunur. F pilus, izole edilmit ve pilin adı verilen tek bir hidrofobik proteinden oluştuğu saptanmıştır. F piliye bağlanan bazı fajlar bulunmaktadır (male spesific fajlar). Bu fajlar iki tiptir.Bir kısmı pilusun ucuna, bir kısmı da dibine bağlanır. Uca bağlananlar, eşleşmeye engel olurken; dibe bağlananlar olmaz.Eşleşme sistemlerinin tümü piliye bağımlı değildir. Örneğin, Streptococcus fecalis, bir selftransmissible plazmit taşır. Plazmitsiz resipientler, dişi böceklerdeki feromona benzer şekilde bir eşleşme proteini üretirler. Bu protein,plazmit içeren (donör) hücrelerde yapılmaz. Feromon, donör hücrede adhesin denilen bir proteinin sentezlenmesine sebep olur.Adhesin, donör hücreyi çevreleyerek donör-reipient çiftinin oluşmasını sağlar. Plazmid transferi tamamlandıktan sonra feromon sentezi durur. MOBİLİZASYON ve TRANSFER Mobilizasyon, plazmitte kodlanıp muhtemelen rilaksasyon kompleksinde nik oluşturan proteinin özel baz dizisine sahip transfer orijininde (oriT) bir tek zincir (single strand) kırık oluşturmasıyla başlar. nik, dönen halka (rolling circle) replikasyonunu başlatır ve dönen halkanın lineer kolu transfer ediliri. Nik oluşturan protein, 5′ ucuna bağlı kalır ve replikasyon şekli, FX 174 fajının rolling circle mekanizmasına benzer. Burada önemli bir özellik, DNA sentezinin hem donör, hem de resipient hücrede gerçekletmesidir. Donördeki sentez, donör konjugal DNA sentezi adını alır ve transfer edilen tek zincirin yerini doldurur. Resipient hücredeki sentez ise (resipient konjugal DNA sentezi), alınan tek zinciri çift zincire çevirir. Genellikle, transfer edilen zincirin donör konjugal sentezle yer değiştirmesi ve resipient hücrede çift zincir DNA’ya çevrilmesi eş zamanlıdır. F PLAZMİDİNİN tra GENLERİ Genetik madde transferi, fin genlerinin kontrolündedir. Temel transfer (tra) fonksiyonları, bir operonda kodlanmaktadır. tra genlerinin çoğu,pili sentezinde görevlidir. Örneğin. tra A geni, pilin proteinini kodlar ve tra B,C,D,E,F,G,H,K,L,Q,U,V,W genleri ise, fonksiyonel bir pilusun oluşması için gereklidir. Diğer genler, eşleşme, transferin başlaması, transferin gerçekleşmesi, oriT’de nik oluşturulması, normal replikasyon orijini oriV’den DNA replikasyonu, iki f+ hücrenin eşleşmesinin engellenmesi (surface exclusion) ve plazmit uyuşmazlığında gereklidir. TRANSFERDE KONAKÇI KISITLAMASI Bazı durumlarda transfer edilen plazmit,konakçının restriksyon endonükleaz enzimleri tarafından parçalanır. Bu gibi durumları engellemek için, transfer edilen DNA, çift zincire çevrildikten sonra metillenmelidir. Bir zincirden metillenen DNA, restriksiyon endonükleaz enzimlerinden etkilenmez. Sonraki Konu: Plazmit Replikasyonu PLAZMİD REPLİKASYONU Bir plazmid, ancak konakçı hücre içinde replike olabilir. Plazmid, hangi tipte olursa olsun,replikasyonun doğru şekilde gerçekleşmesi için “replikasyon orijini ” adını alan belirli dizilere sahip olması gerekir. Plazmitler, replike olabilmek için, konakçının replikasyon proteinlerine gereksinim duyarlar. DNA polimeraz III, E.coli kromozomal DNA’sı için ana replikasyon proteinidir. Ancak, bazı plazmitler, onun yerine DNA polimeraz I’i kullanırlar. Örneğin, pol A mutantlarında, Pol-I düzeyinin düşüklüğünden F plazmitinin replikasyonu etkilenmezken Col E1 plazmiti, replike olamaz. Bunun sebebi, F plazmiti replikasyonunda pol-III; Col E1 replikasyonunda ise pol-I’in kullanılmasıdır. Bazı plazmitler, yalnızca konakçı genlerinin ürünlerini kullanırlar. Col E1 DNA saflaştırıldıktan sonra Col E1 yada diğer bir plazmid taşıyan hücrelerden elde edilen ekstrakta eklenirse replike olabilir. Diğer plazmidlerse, plazmitte kodlanan gen ürünlerine ihtiyaç duyarlar. Tüm plazmitlerin replikasyonu, semikonservatiftir. Farklı plazmitlerin replikasyon modelleri arasında önemli farklar vardır.Bazıları tek yönlü (unidirectional); bazıları çift yönlü (bidirectional) replike olurlar. RK 6 plazmidi, önce bir yönde, sonra da aynı orijinden ters yönde replike olur. Çift yönlü replike olan plazmidlerde, replikasyon iki şekilde sonlanır. Birinci tipte, terminasyon, büyümekte olan çatallar çakıştığı zaman olur. Diğerlerinde ise sabit bir terminasyon bölgesi vardır. Replikasyon halkası tamamlandığı zaman, halkalardan biri, yeni sentezlenen DNA’ların ayrılması için kırılır. Replikasyon sonucunda, bir nik açılmış molekül, bir de süper koil molekül meydana gelir. KOPYA SAYISININ KONTROLÜ Bir plazmid, hangi tipte olursa olsun, replikasyonun başlangıcını,dolayısıyle hücre içindeki sayısını kontrol eden genlere sahiptir. Plazmidler,hücre içindeki sayılarına göre, stringent yani düşük kopya sayılı (hücrede 1-2 kopya) veya relaxed yani, yüksek kopya sayılı (10- 100 kopya) plazmidler olarak iki gruba ayrılırlar. Plazmidler, replikasyonun başlangıcını negatif kontrol eden bir repressör kodlarlar. Bu, kopya sayını denetleyen bir mekanizmadır. Repressörün aktivitesi, konsantrasyonuna bağlıdır. Hücre gelişirke hacim artar, repressör konsantrasyonu düşer ve replikasyonu inhibe edemez. Bu nedenle plazmid sayısı, repressör gen sayısı ve buna bağlı olarak da repressör protein konsantrasyonu iki katına çıkar. Konsantrasyon belirli düzeye erişinde, replikasyon engellenir. Benzer olaylar zinciri, yüksek kopya sayılı plazmidlerin hücrede tek bulunması halinde de cereyan eder ve repressör konsantrasyonu replikasyonu inhibe edecek seviyeye çıkana dek plazmid, çoğalmaya devam eder. Plazmidlerin farklı kopya sayılarında bulunmalarını açıklamak üzere ileri sürülen bir modele göre, yüksek kopya sayılı plazmitlerin represyonu için gereken repressör konsantrasyonu, düşük kopya sayılıların repressör konsantrasyonuna göre daha yüksektir. PLAZMİD AMPLİFİKASYONU Plazmid içeren bir bakteri kültürüne, kloramfenikol gibi protein sentez inhibitörleri eklenecek olursa, kromozomal DNA replikasyonu inhibe edilir, ancak plazmit DNA, hücredeki sayısı bin, hatta daha fazla oluncaya kadar replike olmaya devam eder. Kromozomal DNA replikasyonun durma sebebi, bu reaksiyonların başlaması için protein sentezine gerek olmasıdır. Eğer plazmit, bakteriyel ya da plazmitte kodlanan dayanıklı proteinleri kullanıyorsa replike olmaya devam edebilir. Bunun yanında, konsantrasyona bağlı etki gösteren regülatör proteinlerin sayıları artamayacağı için plazmit replikasyonu baskılanamayacaktır. Plazmit amplifikasyonundan,genetik mühendisliğinde yararlanılır; kullanılacak plazmid, saflaştırılmadan önce bu yöntemle sayısı arttırılabilir. İNKOMATİBLİTE Birbirine yakın, ilişkili plazmidler, aynı hücre içinde stabil kalamazlar. Böyle plazmidlere “incompetable” denir.Plazmid replikasyonunun başlangıcında işlevi olan repressör modeli de bu durumu açıklar. İki plazmid taşıyan bir hücre düşünelim. Bu plazmidler, farklı repressörlere sahip olan F ve Col E1 plazmidleri olsun. Repressörler farklı olduğu için,bir plazmidin repressörü, diğerini regüle edemez ve plazmidler birbirinden bağımsız olarak replike olurlar. Bu durumda,F ve Col E1 plazmidleri uyumludur (competable); başka bir deyişle, farklı inkompatiblite gruplarına aittirler. Çetitli Enterobacteria’lar, bir çok plazmidi aralarında transfer edebilirler.Bu plazmidler, 25 inkompatiblite grubunda sınıflandırılırlar.Plazmidler, oluşturdukları pilus tipine göre de sınıflandırılırlar. AKRİDİNLERLE REPLİKASYONUN İNHİBE EDİLMESİ Çeşitli ajanlar, DNA’daki bazların aralarına girerler. Özellikle akridinler, kromozomal DNA’yı etkilemeden plazmid replikasyonuna engel olurlar. Bu inhibisyonla hücrenin plazmidi kaybetmesi sağlanabilir (acridin curing). Üreme ortamındaki akridin konsantrasyonu çok yüksek olursa kromozomal; düşük olursa plazmid DNA’nın replikasyonu durur. HÜCRE BÖLÜNMESİNDE PLAZMİDLERİN PAYLAŞILMASI Bir dizi deney,düşük kopya sayılı plazmidlerin bölünme sırasında kardeş hücrelere dağılmasının kontrol altında olduğunu göstermiştir. Şöyle ki, bölünmeye hazır bir hücre, plazmid DNA molekülünün iki kopyasını taşır ve yeni oluşan hücrelere bu kopyalardan biri gider (F plazmitte olduğu gibi). Eğer böyle bir kontrol olmasaydı, yeni hücrelerden bazıları plazmit taşımazdı. Plazmitsiz hücre sayısının artışını engellemek için, düşük kopya sayılı plazmidlerde bulunan paylaşım fonksiyonu, yüksek kopya sayılı plazmidler için gerekli değildir. Sonraki Konu: Önemli Plazmitler ÖNEMLİ BAKTERİYEL PLAZMİTLER ve ÖZELLİKLERİ F PLAZMİDLER F plazmidlerin en büyük özellikleri, bakteri kromozomuna entegre olabilmeleridir. Bu integrasyon sonucunda, Hfr hücreler oluşur. İntegrasyon, l fajının bir bakteride lizojenize olmasına benzer; ancak, F’in E.coli kromozomuna integrasyonu, l DNA’nın integrasyonundan farklıdır. F, kromozomal DNA’da bir çok bölgeye bağlanabilir. Kromozom üzerinde yirmiden fazla mamajör ve yaklaşık yüz minür bölge bilinmektedir. F’in her bir bölgeye affinitesi aynı değildir. F’in kromozomdan ayrılması, nadir de olsa gerçekleşir. Ayrılma frekansı, bazı lokalizasyonlarda, diğerlerine göre yüksektir. Çoğu kez, F’in ayrılması hatasız olmaz. Böyle durumlarda, iki kesimden biri entegre olmuş F’in içinde; ikincisi ise kromozomal DNA’nın F’e bitişik parçasında olur. Bu tip ayrılmalar, F’ plazmidlerin orijinini oluşturur. F faktörünün DNA replikasyonunda defekti olan mutant bakteri kromozomuna entegre olması, integratif süpresyon adı verilenolayda artışa sebep olur. F faktörü,replike olmak için E.coli’nin çeşitli replikasyon proteinlerini kullansa da, kromozomal DNA replikasyonunun başlamasını sağlayan dnaA geninin ürününe ihtiyacı yoktur.Yani, F faktörü,dnaA (Ts) mutantında serbest bir protein olarak bulunuyorsa, sıcaklık 42oC’ye yükseltildiği zaman (yükseltmenin amacı,mutant DnaA proteinini inaktive etmektir) kromozomal replikasyonun gerçekleşmesi, pek olası değildir; ancak, F plazmid, hala replike olabilir. F faktörü, dnaA (Ts) mutant suşta kromozoma entegre olmuşsa (hücre Hfr ise) Kromozomal replikasyon,yüksek sıcaklıkta da olur. Böyle bir durumda replikasyon, E.coli replikasyon orijininden değil, F faktörünün oriV bölgesinden başlar. Sonuçta,F faktörünün entegre olması, dnaA (Ts) fenotipini DnaA-bağımsız replikasyon orijini sayesinde baskılar. İntegratif süpresyonun gözlenmesi, F faktörü kromozoma entegre olmuş bir suşu izole etmek için kullanışlı bir yöntemdir. Örneğin, bir F’ Lac+ / Strs sutu, bir lac- DnaA (Ts) Strrsutuyla çiftlettirilebilir ve Lac+ Strr hücreler, 42oC’de streptomisinli minimal laktoz agara ekilerek seçilebilir. Hayatta kalan kolonilerin tümü, entegre olmut F’ lac içeren Hfr koloniler olacaktır. DİRENÇ (R) PLAZMİDLERİ R plazmitleri, ilk defa Japonya’da bir dizanteri salgını sırasında S.dysenteriae bakterilerinden izole edilmit, daha sonra, E.coli ve bir çok bakteride bulunmuştur. R plazmitler, konakçılarına bir grup fungal antibiyotiğe karşı direnç kazandırırlar ve genellikle self-transmissible özelliktedirler. Çoğu R plazmiti, bitişik iki DNA segmentinden ibarettir. Bu fragmentlerden biri, resistans transfer faktör (RTF) olup, DNA replikasyonunu, kopya sayısını, gen transferini ve kimi zaman tetrasiklin resistans genin regüle eder. R determinant olarak da adlandırılabilen öbür segment ise, antibiyotik resistansı için gereken diğer genleri taşır. R plazmitleri, genellikle, bir grup kombinasyonla, ampsilin (amp), kloramfenikol (Cam), streptomisin (Str), kanamisin (Kan) ve sulfonamid (sul) resistans genlerini taşır. İki bileşenli R plazmitleri, F’ plazmitlerden farklı olarak integrasyondan sonra gelen bir eksidasyonla oluşmazlar. Bu mekanizmanın yerine, transpozonlarla resistans genleri taşınabilir. R plazmitler,tıp alanında da büyük öneme sahiptir. Çünkü, bakteriler arasında transfer edilebilme özelliklerinden dolayı, büyük epidemilere sebep olmuşlardır. KOLİSİNOJENİK PLASMİDLER Col plasmidleri , kolisin üretme yeteneği sağlayan E.coli plasmidleridir.Kolisin, Col plasmidi taşımayan duyarlı bakterilerin çoğalmasını engelleyen bir proteindir. Col plasmidleri çeşitli bakteri türlerinde bulunan ve baktriosin üreten bakteriosinojenik plasmidler gurubundadır. Bakteriosinler, ki kolisinler bunlara bir örnektir; duyarlı bakterilerde etkileşime girerek birçok temel işlevi inhibe ederler. DNA replikasyonu, transkripsiyon, translasyon veya enerji metabolizması, kolisinlerin kötü yönde etkilediği işlevlerdendir.Kolisinlerin birçok tipi vardır. Her tip bir harfle belirtilir ve duyarlı hücrelerde özel şekillerde inhibisyona neden olurlar. Kolisin üretiminin saptanması, faj saptanmasına benzer bir yöntemle yapılır. Kolisin üreten hücre, duyarlı hücre kültürü üzerine konulur; kolisin, etraftaki bakterilerin çoğalmasını engeller.Koyu bakteri tabakasında “lacuna” olarak bilinen temiz bir bölge oluşturur. Col plasmidler, konakcılarının , doğada kolisine duyarlı hücrelere göre avantajlı olmalarını sağlar. Saflaştırılan kolisinlerde yapılan çalışmalar,bu proteinlerin gerçek kolisin ve defektif faj partikülleri olmak üzere iki tipte olduğunu göstermiştir. Bazı kolisinler, basit proteinlerdir. Diğerleri, elektron mikroskobu ile incelendikleri zaman faj kuyruklarına benzedikleri görülmüştür.Böyle plazmidler, eski profaj kalıntılarının gen ürünleri olabilirler; replikasyon ve baş ünitelerinin üretiminden sorumlu genleri kaybetmiş, ancak ve bir represör sistem, lizis enzimi ve kuyruk kodlayan gen bozulmadan kalabilmiştir. Faja benzer şekilde , kolisin hücre duvarı üzerinde özel reseptör bölgelere bağlanır.Ek olarak, bazı kolisinlerin ekspirasyonu normalde represe edilmiş olsa da UV ışığı gibi DNA bozan ajanlarla indüklenebilirler. Genellikle kolisinler, Col ilişkili bir hücreye karşı inaktiftirler.Bu olaya immünite denir. Çoğu kez, immünite, salınan küçük bir proteinin büyük kolisin proteinine bağlanması ile gerçekleşir. İmmünite proteini, yalnızca Col + hücrelere immünite sağlamaz, bunun yanında Col- hücrelerin öldürülmesinde degörev yaparlar. Örneğin, kolisin kloasin DF 13 proteini , üç bölgeden meydana gelir. Bu bölgeler, bir reseptöre bağlanan bölge, bir RNase ve immünite proteinine bağlanan bir segmentir. Reseptöre bağlana uç, hidrofobiktir ve hücre zarı ile interaksiyona girmesi olasıdır. İmmünite bağlayan segment, güçlü bir negatif yüke sahiptir; böylece pozitif yüklü immünite proteini ile nötralize olur. Kolisin bir reseptöre bağlandıktan sonra, parçalanır. N terminal bölgesi hücre dışında kalır, RNase segmenti hücreye girer, hücre yüzeyindeki immünite proteininden ayrılır. RNase, ribosomdaki RNA yı etkiler ve böylece duyarlı hücreyi öldürür. Col plasmidler, çok büyük boydadırlar. En çok çalısılan Col plasmidi, Col E1 dir.6646 baz çiftlik tam sekansı bilinmekte ve rekombinant DNA araştırmalarında çok sık kullanılmaktadır. Büyük self transmissible Col plasmidlerin çoğu, küçük Col plazmidler ile F veya F’ plasmidler arası hibritlerdir. Col E1, mobilize olabilen ancak konjugatif olmayan bir plasmittir. Plasmidde kodlanan bir nükleaz( Col E1 için nükleaz, mob geni tarafından kodlanır) ve bom (basis of mobility) adını alan özel baz dizisi üzerinde aktivite gösterir. Bu dizi kolisin bölgesini içerir. Mob geni transkribe edilir, mob ürünü, bom bölgesinde nik açar (nik gerçek kesim bölgesidir) ve süperkoil Col E1 DNA sı niklenmiş bir halkaya dönüşür.Bu olayları gerçekleştiren hücre F- ise, Col E1 plasmidi, pili yapma yeteneğine sahip olmadığı için konjugasyon çifti olusturamaz, transfer gerçekleşmez. Ancak hücrede hem Col E1 hem de F plasmidi varsa, F plasmidi, pilus ve transfer aparatının sentezini sağlayacağı için Col E1 transfer edilebilir. Mob- mutantı Col E1 ler, F plasmidi varlığında da transfer edilemezler. F+ mob+ bom- mutantlarında da transfer gerçekleşmez. Agrabacterium Ti PLAZMİTİ Bir çok Dictyledonus bitkisinde Agrabacterium tumefaciens bakterisinin sebep olduğu bir crown gall tümör bulunur. Tümörü oluşturan özellik, Ti adı verilen bir plazmite bağlıdır. Bitki enfekte olduğu zaman, bazı bakteriler bitki hücrelerinin içlerine girer,orada büyür ve lizise uğrarlar. Bunun sonucunda DNA’lar, hücre içine salınır. Bu noktadan sonra, tümör oluşumu için bakteriye gerek yoktur. Ti plazmitinin, replikasyonds görevli genler içeren küçük bir fragmenti, bitki hücresinin kromozomuna entegre olur ve hormonların etkisiyle hücre bölünmesini kontrol eden sistemin etkisini azaltır. Böylece hücre, tümör hücresine dönüşür.Bu plazmidler, bitki kültürlerinin geliştirilmesinde önemlidir. Özel genler, rekombinant DNA teknikleriyle bu plazmitlere takılabilir ve bu genler,bazen bitki kromozomuna entegre olabilir. Sonuçta,bitkinin genotip ve fenotipi değiştirilebilir. KONAKÇI SINIRI GENİŞ PLAZMİDLER Bazı plazmidler, sadece sınırlı sayıda, ilişkili bakteride bulunabilir. Bu plazmitlere, konakçı sınırı dar plazmitler denir. E.coli Inc P ve Pseudomonas aeruginosa Inc P1 inkompatiblite gruplarındaki self transmissible R plazmidleri ise, çok sayıda bakteri türüne transfer edilebilirler. Bunlar da, konakçı sınırı geniş plazmidler olarak adlandırılırlar. Neden bazı plazmitlerin konakçı sınırı dar, bazısının geniş olduğu bilinmemektedir. Plazmid: Büyüklük (Kb): Kopya Sayısı: Self-Transmissible Fenotipik Özellikler: Col plazmidler ColE1 6.4 10-15 Colicin E1,enerji gradientini parçalar,konakçyya Colicin E1′e ba?y?yklyk sa?lar. ColE2 7.6 10-15 Colicin E2,bir Dnase’dyr;konakçyya Colicin E2 ba?y?ykly?y. ColE3 7.6 10-15 Colicin E3 bir ribozomal Rnase’dyr;konakçyya ColicinE3 ba?y?ykly?y. F plazmid 94.5 1-2 F-pilus , konjugasyon. R plazmidler R100 106.7 1-2 Camr,Strr,Sulr,Tetr RK2 56.0 5-8 Geni? konakçy siniri pSC101 9.0 <5 Faj plazmidler ldv 6.4 50 l genleri cro,cl,O,P Rekominant plazmidler pBR322 4.4 20 Orta kopya sayysy,ColE1 tipi replikasyon,Ampr pUC18 2.7 200-500 Yüksek kopya sayysy,kopya sayysyny yükselten bir mutasyonla ColE1 tipi replikasyon Ampr pACYC184 4.0 10-12 Camr, Tetr DİĞER PLAZMİDLER Kimi plazmitler,zararsız bakterilere girerek onları patojen hale getirirler.E.coli Ent plazmitler, bu gruptadır ve diareye sebep olan enterotoksinlerin sentezini sağlarlar.Hly adında bir plazmid (hemoliz yapan plazmid), domuzdan izole edilen E.coli’lerde bulunmuştur.Hemolizin, kan örneklerindeki eritrositleri yıksa da Hly plazmitinin herhangi bir patojeniteye sebep olduğu görülmemiştir. Çoğu Pseudomonas türü, yüzlerce çeşit organik bileşiği karbon kaynağı olarak -özellikle, toluen, oktan gibi zehirli olanları- kullanabilmektedir. Bu metabolik yetenek, degredasyon plazmidleri tarafından sağlanır. Her bir plazmid,bu bileşikleri yıkmaya yarayan bir veya daha fazla metabolik yolda görevlidir. Bu tipteki bazı plazmitler,bakteriye sentetik bileşikleri yıkma yeteneği kazandırır. Başka bir plazmit grubunun üyeleri ise, toksik metal iyonlarına karşı direnç sağlar. bu plazmidler, direnç sağladıkları iyonun var olduğu ortamda bulunurlar. Hg++ iyonlarına karşı direncin biyokimyasal mekanizması iyi çalışılmıştır. Olay, plazmitte bulunan ve Hg++ iyonlarını metalik merküriye çeviren redüktaz enzimi sayesinde gerçekleşir. KAYNAKLAR: 1.Microbial Genetics; Stanley R.Maloy; John E. Cronom; David Frefeld 2.Biochemistry; Geoffrey Zubay 3.Concepts of Genetics; William S.Klug; Michael R.Cummings 4. Molecular Cloning; J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis   Plasmid zaten bakteri hücresi içerisinde, bakteri kromozomundan bağımsız genellikle dairesel yapıda, replikasyon yapabilen bir DNA parçası. Yani oluşturulmaktan öte bakterinin kendi doğasında olan bir yapı. Bakteri plasmidlerinden tra genlerini taşıyanlar, bakterinin kromozomuna eklenip, tekrar ayrılabilme özelliğine sahip. Bazıları da fertilizasyon plasmidi olarak, replikasyon sonucu bir kopyasını başka bir bakteriye aktarabiliyorlar. Üzerinde antibiyotik üreten genler( ki bakteriler antibiyotiği diğer bakterilere karşı kendilerini koruma aracı olarak kullanırlar) ya da antibiyotik direnç genleri mevcut. Bu haliyle plasmid bakterinin doğal parçası. Bugün bizim klonlama için kullandığımız yapay plasmidler de, bakterilerdeki doğal plasmidlerden esinlenilerek düşünülmüş. Bakteri plasmidlerinin kendilerini çoğaltabilme özelliği ve antibiyotik direnç genleri klonlama vektörlerinin anahtar kısımlarını oluşturup, bunlar üzerinde çeşitli düzenlemeler ile istenen klonlama plasmidleri elde edilmiş durumda.   Bu konuda plazmidlerin kromozomal DNA'dan koparak oluştuğuna dair bir teori var. bu kopan DNA parçalarının replikasyon orijinleri de mevcut. bazı bakterilerde tekrar kromozom DNA'sına entegre olabilen plazmidler mevcuttur. bunlara epizom denir. umarım sorunuzun cevabı olmuştur.

http://www.biyologlar.com/ilk-plazmid-nasil-olusmustur

ANTİBİYOTİK GRUPLARI

1.SULFANOMİDLER Etki mekanizması, Bakterilerin metabolizması için gerekli olan para amino benzoik asit (PABA)’in ,üreme döneminde kullanılmasını engelleyerek bakteriostatik etki yaparlar. Bu olgunun bakteri türüne göre değişik çeşitleri vardır. Sulfanomidlerden etkilenenler: a. folik asit biyosentezinde PABA‘yı yapıtaşı olarak kullanan ve bunu üremekte olduğu besi çevresinden sağlamak zorunda olanlar. b. Kendileri PABA sentezi yapan ve folik asit sentezinde ara metabolizma ürünlerinden biri olarak hazırlayan bakteriler. c. Folik asit sentezi yapmadığı halde, bunu vitamin halinde beslendikleri çevreden sağlayan bakteriler etkilenirler. 2. LAKTAM GRUBU ANTİBİYOTİKLER a. Penisilinler: Ortak noktaları 6-aminopenisilinatik asit (6-APA) olan geniş bir bakterisid (bakteriyi öldürücü) etkili antibiyotik grubudur. Penisilinler yalnızca aktif çoğalma durumundaki bakterilere karşı etki gösterirler. Penisilinlerin anti bakteriyel etkilerinin bakterilerde hücre duvarı sentezi için yaşamsal öneme sahip metabolizma işlevlerinin inhibisyonu ve hücre duvarına hasar veren enzimleri aktive etme yeteneklerine bağlı olduğu düşünülmektedir. Öncelikle gram pozitif bakteri enfeksiyonlarında yararlıdırlar. Duyarlı türlerde bu ilaçlara karşı rezistans oluşumu yavaştır. Makroorganizmaya primer toksik etkileri yoktur. b. Cefalosporinler: Bakterinin hücre duvarı biosentezini, transpeptidaslarını inaktive ederek, penisilin penisilinlere benzer etki yapan bakterisid antibiyotiklerdir. Enterokok, proteus, psödomanas, aerobakter, pastorilla dışında gram pozitif ve negatif kok ve basiller ile tripanazom enfeksiyonlarında etkilidirler. 3. TETRACYCLİN GRUBU ANTİBİYOTİKLER Bakterilerde protein sentezini bloke ederek,bakterisid etkili antibiyotiklerdirler. Bakterilerin m-RNA ve ribozomlarında oluşan polizomlarında ve interferensle t-RNA ya bağlı aminoasitlerini geliştiren peptitzincirlerinde blokaj oluşur, ikincil olarak mitokondrilerdeki oksidatif fosforilizasyon da bu yoldan etkilenerek bakteri virulansı yok olur ve üremesi durur. Etki alanı oldukça geniştir. Anaerob ve sporluları da içeren gram pozitif kok ve basillerin, spiroket, leptospira, rikettsia, betsoia gruplarının ve yüksek dozda verilirse amip ve aktinomiçet enfeksiyonlarının tedavisinde yararlıdır. Tetrasiklinlere proteus, psödomonas, klepsiella, aerobakter enterokoklar, protozoer ve mantarlarla virüsler dirençlidir. 4. AMİNOGLYCOSİD GRUBU ANTİBİYOTİKLER Bakterilerin ribozom strüktürünün bağlantısını etkileyerek, peptid bileşimini engeller, bu nedenle bakterisid tirler. a. STREPTOMYCİN Antibiyotik, düşük dozlarda bakterinin üremesi sırasında ribozomlara yanıltıcı bilgi transferi ile bakteriostatik , yüksek dozlarda ise hücre protein sentezini inhibe ederek patojenliğe yararsız proteinlerin oluşumu ile bakterisid etki yapar. Ayrıca bakterinin nükleik asid metabolizmasına, RNA sentezine de etkilidir. Sitoplazma membranının permabilitesini bozar, bakteri yaşamı için gerekli bileşimlerin kaybolmasına neden olur. Bakterilerde kromozom veya epizom enzimleriyle streptomisini inaktive eden bir rezistans oluşur, bulaşıcı bir rezistanstır ve üremekte olan diğer bakterilere de hızla geçer,özellikle tüberküloz klinik tedavilerinde önemlidir. b. GENTAMYCİN Gram negatif bakteri ve özellikle diğer antibiyotiklerin yararsız kaldığı enfeksiyonlarda uygulanır. Bakterilere etkisini, streptomisinde olduğu gibi RNA oluşumu ve sitoplazmada protein sentezindeki yetersizlik ile sağlar. c. KANAMYCİN  laktam halkalı antibiyotiklerle sinerjik etkilidir. Lâboratuar denemelerinde düşük dozları bakterilerin ribozomlarını translasyon döneminde etkilemesiyle bakteriostatik, yüksek dozları protein sentezini engellemesiyle bakterisid tirler. Gram negatif bakteri enfeksiyonlarında yararlıdırlar. d. CHOLORAMPENİCOL Bakteri ribozomlarında RNA bağlantılarını etkileyerek, polizom oluşumu ile, intrasellüler protein sentezini engeller. Gram negatif, bazı gram pozitif bakterilere ve rikettsia, bedsonia gruplarına, spiroket ve leptospiralara, aktinomiçeslere normal tedavi dozlarında bakteriostatik etkilidir. 5.MAKLOİD GRUBU ANTİBİYOTİKLER Etki mekanizması tetrasiklin’e benzer. Bakterilerin üremesi sırasında gelişmekte olan peptit zincirlerinin, interferans mekanizması ve aktif aminoasidlerin translasyonu ile,bakteri ribozomlarında protein sentezi inhibe edilir. Bu yolla birincil bakteriostatik etki oluşur. Genellikle gram pozitif koklara, bazı sporlu bakterilere, bazı brusellalara ve aktinomiçetlere etkilidirler. a. ERİTROMYCİN Önerilen tedavi dozlarında birincil bakteriostatik, fakat çok duyarlı bazı streptokok, stafilokok, neisseria ve hemofilus türlerinde yüksek dozlarda bakterisid etkilidir. Bakteri ribozomlarına bağlanarak aktive aminoasidlerin translasyonundaki blokaj protein sentezini inhibe eder. c. LİNKOMYCİN ve CLİNDAMYCİN Genellikle bakteriostatik yüksek dozlarda bakterisid etki yapan antibiyotiklerdir. Enterokoklar dışında gram negatif kok ve basillere, neisseria, mikoplkazma ve anaeroblara etkilidirler.

http://www.biyologlar.com/antibiyotik-gruplari

İnfeksiyonun Mekanizması

Doğada çok yaygın olarak bulunan mikroorganizmalardan ancak çok az bir bölümü insan ve hayvanlar için hastalık yapıcı niteliktedirler (patojenik mikroorganizmalar). Geri kalan büyük bir bölümü ise infeksiyon veya hastalık oluşturamamaktadırlar (apatojenik mikroorganizmalar). Ancak, genellikle hastalık oluşturmadığı bilinen bazı etkenler de, fazla stres nedeniyle konakçının direncinin kırıldığı hallerde veya bazı özel durumlarda, (immun yetmezlik hastalıklarında, immun supresif bireylerde, gizli infeksiyona sahip olanlarda, vs) vücutta ürüyerek ve yayılarak infeksiyonlara ve hastalıklara yol açabilmektedirler (fakültatif patojenler veya oportünist mikroplar). Bunları, yutak, larinks, sindirim, solunum ve ürogenital sistem de, deri ve mukozalarda bulunan mikroorganizmalar örnek olarak gösterilebilir. Bu etkenler, aynı zamanda, bu sistemlerin ve bölgelerin mikroflorasını da oluşturmaktadırlar. Bunların aksine, bazı mikropların patojenitesi (hastalık yapma yeteneği) pasajlarla, mutasyonlarla, doğal seleksiyonlarla veya özel işlemlerle (biyoteknolojik yöntemlerle) azaltılabilmekte ve değiştirilebilmektedir (attenüasyon). İnfeksiyonlar, genellikle, konakçı ile patojenik mikroorganizmaların (patojenler) karşılıklı interaksiyonu sonu ortaya çıkarlar. Eğer bir vücuda patojenik bir mikroorganizma girmiş, lokalize olmuş ve üremişse, o bireyde infeksiyon var demektir. Ancak, bu canlıda her zaman, genel veya özel klinik belirtiler gözlemlenmeyebilir. Eğer, klinik semptomlar ortaya çıkmışsa, o zaman infeksiyona bağlı hastalık meydana gelmiş olur (infeksiyon hastalığı). Mikroorganizmalardan ileri gelen hastalıklara, aynı zamanda, infeksiyöz hastalıklar adı da verilmektedir. Vücudun dış veya iç yüzeyleriyle temasa gelen patojenik etkenler, kendilerinde bulunan çeşitli adhesyon molekülleri ile konakçı hücre yüzeylerinde ki özel reseptörlere (glikoprotein, lipoprotein, glikolipid, vs.) bağlanırlar. Mikroplar, ya sadece yüzeylerde yerleşerek bozukluklar meydana getirebilecekleri gibi (lokalize infeksiyonlar), yüzeylerden daha derinlere, buralardan da kan veya lenf yolu ile bütün vücuda (veya afinitesi olan doku veya organlara) yayılabilir ve tehlikeli infeksiyonlara yol açabilirler (sistemik veya generalize infeksiyonlar). Bazen infeksiyon bir organa (barsak, akciğer, beyin, vs) yerleşmiş de olabilir. Patojenik bir ajan vücuda girdikten hastalık belirtilerinin ortaya çıkıncaya kadar geçen süre (inkubasyon periodu, kuluçka süresi), bazen, çok kısa (birkaç gün), bazen de 1-2 hafta veya daha uzun (aylar, yıllar) olabilir. Bu durum, giren mikroorganizmanın virulensi, miktarı, giriş yolu, yayılış tarzı, konacının duyarlılığı ile çevre koşulları yakından ilişkilidir. Mikroorganizma çok virulent ve yeterli miktarda da vücuda girerse, duyarlı konakcıda inkubasyon süresi kısa olabilir ve hastalık belirtileri (özellikle, genel belirtiler) bir kaç gün içinde ortaya çıkabilir. Böyle hastalıklar, aynı zamanda, kısa seyirli olur (3-6 gün) ve canlının hayatını tehlikeye koyabilir (perakut infeksiyonlar). Perakut seyirli olgulara, genellikle, septisemik infeksiyonlar hallerinde, mikroorganizmaların kana geçmesi, kanda üremesi ve kan yolu ile bütün vücuda yayılması sonunda rastlanılır. Mikroorganizmaların zayıf virulensli ve aynı zamanda az sayıda ve vücudun direnci de orta derecede olduğu durumlarda inkubasyon periodu uzun olduğu gibi, meydana gelen infeksiyon da kronik bir seyir izleyebilir (kronik infeksiyonlar). Perakut ve kronik seyirli infeksiyonlar arasında akut ve subakut seyirli olgulara da rastlanabilir. Perakut seyirli infeksiyonlar, çok kısa süre içinde geliştiklerinden ve aynı zamanda yine kısa sürede sonlandığından, spesifik klinik belirtilerin ortaya çıkması için yeterli bir zamana sahip değildirler. Ancak, genel (belirtiler) arazlar (durgunluk, iştahsızlık, ateş, baş ağrısı, titreme, terleme, bazen ishal vs) görülebilir. Bunlar da hastalığı çoğu zaman tam belirleyemediği için teşhis koymak da oldukça zordur. Bu dönem, aynı zamanda, immun sistemin uyarılması için de yetersiz olduğundan spesifik antikorlar da ya hiç sen¤¤¤lenemez veya oluşsalar da, çoğu zaman, kullanılan serolojik tekniklerle ortaya konulamazlar. Vücutta bir infeksiyonun oluşabilmesinde, mikroorganizmaların virulensleri yanı sıra, belli bir miktardan aşağı olmayan dozda girmesi de gereklidir (minimal infektif doz, MİD). Bu doz, aynı zamanda, %100 infeksiyon oluşturabilecek en az miktarı da ifade eder. Eğer ölümler oluşuyorsa, minimal letal doz (MLD) olarak tanımlanır. Mikroorganizmalar minimal infektif veya minimal letal dozun altında girerlerse infeksiyonlar veya ölümler %100 olarak gerçekleşemez. Bazen, bir hastalık ajanı tarafından başlatılan infeksiyona, sonradan diğer mikroorganizma (lar) da katılabilirler. Böyle durumlarda, hastalığın klinik seyri, semptomlar, prognoz, teşhis ve sağaltımı da değişebilir (sekonder infeksiyonlar). Böyle durumlarda, ikinci etken (sekonder ajan) hakim duruma gelebilir, esas infeksiyonu başlatan primer etken baskılanabilir ve izolasyonu çok zor veya imkansız bir hal alır. Eğer, infeksiyon ilerlemeye devam ederse hayatı tehlikeye sokacak bir sona ulaşabilir. Kesin teşhis de yapılamadığı için, uygun bir sağaltım kürü uygulanamaz. Bazen de infeksiyonun başlaması için bir tür mikroorganizma yeterli olamamakta, birden fazla diğer etkenlerin işbirliği ve sinerjik etkisiyle infeksiyon oluşturulabilmektedir (koinfeksiyon, ortak infeksiyon). İnfeksiyonun bu iki türü, miks infeksiyonlar olarak tanımlanırlar. Koinfeksiyonlar da, aynen sekonder infeksiyonlarda olduğu gibi, bir çok yönü ile teşhiste zorluklar yaratırlar. İnfeksiyonların hepsi, mikroorganizmaların bizzat kendileri tarafından meydana getirilmezler. Toksijenik özellikte olanların salgıladıkları ekzotoksinler ve Gram negatiflerinin endotoksinleri de toksemik infeksiyonlara (toksemi, intoksikasyonlar) yol açarlar ve hatta ölümlere de neden olurlar. Potent ekzotoksinler, ya sporlu bakteriler (C. botulinum, C. tetani, B. anthracis, vs) veya sporsuz bakteriler (C. diphtheriae, stafilokok, vs) ile bazı mantarlar (A. flavus, vs) tarafından sen¤¤¤lenirler. bakteri toksinleri çok iyi antijeniteye sahip olmalarına karşın mikotoksinlerin antikor sen¤¤¤ini uyarma etkinlikleri zayıftır. Bazı infeksiyonlarda, klinik belirtiler ve ortaya çıkan hastalıklar tespit edilemeyebilir görülmeyebilir (subklinik infeksiyonlar, gizli infeksiyonlar). Bazı viral infeksiyonlarda, virus hücrelerde üremelerine ve dışarı çıkmalarına karşın, hücrelerde dejenerasyonlar (CPE, cytopathic effect) oluşturmazlar. Hücreler hem virus üretmelerine ve hücreler de üremelerine devam ederler (persistent infeksiyonlar). Böyle durumlarda klinik belirtiler çok zayıf veya belli-belirsizdir. Bazı durumlarda da virus hücrenin çekirdeği ile birleşir ve onun bir devamı haline gelir, onunla birlikte replike olarak kardeş hücrelere transfer edilir (latent infeksiyon). Böyle infeksiyonlarda da semptomlar meydana gelmez. Bir çok, bakteriyel ve viral kronik infeksiyonlarda da klinik arazlar gözle görülemez ve çoğu zaman da gözden kaçabilir. Bunlarda da klinik belirtiler hastalığı tanımlayacak derecede değildir. İnfeksiyon ajanlarının bir kısmı, vücutta, bazı doku ve/veya organlara karşı özel bir afinitesi bulunmaktadır. Beyin, akciğer, karaciğer, barsaklar, deri, kan dokusu, vs. en fazla hedef teşkil eden organları oluşturmaktadırlar. Örn, kuduz ve menenjitte beyin;kolera ve stafilokokkal enterotoksinlerde barsaklar; S. pneumonia ve K. pneumonia da akciğerler ve N. gonorrhoeae ve bazı mycoplasmalar da da ürogenital sistem hedef organlar arasındadır. İnfeksiyonların ve/veya hastalıkların meydana gelebilmesi için başlıca 3 önemli faktörün işbirliğine gereksinim bulunmaktadır. 1) Mikroorganizmalara ait faktörler 2) Konakçıya ait faktörler 3) Çevresel faktörler 2. Mikroorganizmalara Ait Faktörler İnfeksiyonların oluşmasında mikroorganizmalara ait olan faktörler oldukça önemlidirler. Bu faktörlerden bir veya birkaçı bir arada etkilediklerinde infeksiyonun ilk adımı atılmış veya başlangıcı hazırlanmış olur. Bunlar hakkında aşağıda kısa ve özlü bilgiler verilmektedir. 2.01. Virulens Faktörleri Patojenik mikroorganizmaların (infeksiyon veya hastalık yapma yeteneğine sahip ajanlar, patojenler), insan ve hayvanlarda hastalık yapma şiddetleri, dereceleri veya güçleri oldukça değişiklik göstermektedir (virulens). Duyarlı bireylerde, aynı patojenik etken, bazılarında zayıf ve diğerlerinde de orta veya tehlikeli infeksiyonlara yol açabilir. Bu durum konakçının kondisyon ve konstitüsyonuna bağlı olduğu kadar, mikroorganizmaların virulensi ile de yakından ilişkilidir. Virulens, bakterilerde bir çok faktör tarafından tayin edilmekte ve desteklenmektedir (infektivite+invaziflik+patojenite). Bazı mikroorganizmalar, gerek in vitro ve gerekse in vivo olarak üretildiklerinde birçok türde toksin ve toksik maddeler sen¤¤¤ler. Bunların konakçıyı hastalandırmada etkinlikleri oldukça fazladır. Bu substansların büyük bir bölümü ekstrasellüler bir karakter gösterir. Diğer bir ifade ile, bunlar bakteri hücresinden dışarı çıkarlar (ekzotoksinler). Diğer bir bölümü de yapısal bir özellik taşır ve ancak hücreler eridiklerinde ortama geçerler (endotoksinler). Toksin sen¤¤¤leme yeteneği toksijenite olarak tanımlanmaktadır. Bunlar, hep birlikte etkenlerin patojenik potansiyelini (mikropların hastalık yapma kabiliyetlerini, patojenite) oluştururlar. Etkenlerin vücuda girdikten sonra bir hastalık odağı oluşturabilme yeteneği de infektivitelerini ortaya koyar. Eğer, etken bitişik dokulara veya vücuda yayılma özelliği de (invazyon kabiliyeti) gösteriyorsa infeksiyonlar daha kısa sürede gelişir ve ortaya çıkarlar. 1) Ekzotoksinler: Bu tür toksinler, protein karakterinde, genellikle, ısıya duyarlı ve eriyebilir substanslar olup toksijenik mikroorganizmalar tarafından sen¤¤¤lenirler. Ekzotoksinler, in vivo ve in vitro koşullarda salgılanabilirler. Ekzotoksin sen¤¤¤leyebilen bir çok aerobik, anaerobik, sporlu veya sporsuz bakteriler ve mantarlar bulunmaktadır. B. anthracis, E. coli, C. diphtheriae, S. dysenteriae, S. aureus, V. cholerae, C. botulinum, C. tetani, C. perfringens, A. flavus vs. bunlardan bazılarıdır. Ekzotoksinler ve endotoksinler canlılarda toksemik infeksiyonlara (intoksikasyon, toksemi) neden olurlar. Toksinler, miktarlarına ve etkinliklerine göre canlılarda sadece infeksiyonlara değil aynı zamanda ölümlere de yol açabilirler. Şimdiye dek en etkili bakteriyel toksinler arasında C. botulinum ’un ekzotoksini bildirilmiştir. C. botulinum A ’nın fare için 1 MLD’u (minimum letal doz) 2. 5x10-5 mcg (pürifiye toksin); C. tetani ’nin toksini fare için 1 MLD’u 4x10-5 mcg; difteri toksini kobay için 1 MLD’u 6x10-2 mcg ve S. aureus ’un alfa toksininin tavşan için 1 MLD’u 5 mcg kadar olduğu belirtilmiştir. Ekzotoksinlerin bazı özellikleri kısaca şöyledir: a) Ekzotoksinler, bazı mikroorganizmalarda (B. anthracis, C. tetani) plasmidler; C. diphtheriae ve C. botulinum ’da bakteriyofaj (profaj) ve bazılarında da genomik DNA (kromozom) tarafından spesifiye edilirler. Eğer plasmid veya fajlar bakterilerden çıkarlarsa veya çıkarılırsa, mikroorganizmalar atoksijenik veya apatojenik hale dönüşürler. b) Ekzotoksinler, protein karakterinde olup genellikle ısıya (60-80°C) duyarlıdırlar (termolabil, TL). Buna karşın, S. aureus ’un ve E. coli ‘nin enterotoksinleri, bu derecelerin üstündeki ısıya (100° C) direnç gösterirler (termostabil, TS). c) Ekzotoksinlerin çok az miktarları bile, duyarlı konakcıda hastalık yapıcı güce sahiptirler. Belli bir inkubasyon süresinden sonra, duyarlı deneme hayvanlarında, toksinin etki mekanizmasına göre, spesifik hastalık belirtileri ile karakterize olan intoksikasyonlar meydana gelir. d) Ekzotosinler, aynı zamanda, immunojeniktirler. Vücutta spesifik antikor sen¤¤¤ini uyarırlar (antitoksik antikorlar, antitoksinler). Bu antikorlar in vivo veya in vitro koşullarda toksini nötralize ederek hastalık yapma kabiliyetini giderirler. e) Bazı fiziksel (ısı) ve kimyasal maddeler (formaldehit, iodine, vs) toksini inaktive ederek hastalık oluşturma yeteneğini ortadan kaldırırlar ve toksoid hale gelmesine neden olurlar. Toksoidlerin, hastalık oluşturma güçleri olmamasına karşın, canlılara verildiklerinde antikor sen¤¤¤ini uyarabilirler. Bu nedenle de immunojeniteleri bulunmaktadır ve aşı olarak kullanılırlar. Ekzotoksinler, vücutta etkiledikleri doku ve/veya organlara göre de birkaç kategoriye ayrılmaktadırlar. Nörotoksinler (C. botulinum, C. tetani, S. aureus), Enterotoksinler (S.aureus, E. coli, V. cholerae, S. dysenteriae, C. perfringens, Klebsiella sp, vs) ve Sitotoksinler (bir çok mikroorganizma tarafından sen¤¤¤lenen, hemolizin, leukosidin, dermonekrotoksin, hepatotoksin, vs) gibi. Ancak, bir mikroorganizma birden fazla türde toksin sen¤¤¤lediği gibi, bir toksin birkaç doku veya organa da etkileyebilmektedir. Bu nedenle, bu temel sınıflama zamanla ve gerekli durumlarda değişebilmektedir. Ekzotoksinler birbirlerinden ayrı karakterde ve etkinlikte olmasına karşın bazıları yapı bakımından benzerlik gösterirler. Bu benzerlik, genellikle, “A-B modeli“ olarak tanımlanmaktadır. Bu model aynı zamanda strüktürel dimerik model olarak ta bilinmektedir. Buna göre, bazı toksinler iki alt üniteden oluşmaktadırlar. Bunlardan biri, enzimatik bir özelliğe sahip ve konakçı hücrelerinde toksik etki meydana getiren A fragmenti ve diğeri de, toksinin konakçı hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere bağlanmasını sağlayan B fragmentidir. İzole edilen A alt ünitenin toksik etkisi olmasına karşın hücrelere bağlanma yeteneği bulunmamaktadır. B alt ünitesi ise, hücrelere bağlanabilir, ancak nontoksiktir ve biyolojik olarak inaktiftir. Toksin molekülünün hücre içine girmesinde başlıca iki mekanizma önerilmektedir. Bunlardan biri, toksinin B alt ünitesi, hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere bağlanır. Hücre yüzeyinde bir erime meydana gelerek oluşan spesifik kanallardan, A fragmenti içeri girerek sitoplasmaya ulaşır. B fragmenti ise dışarıda kalır. Diğer görüş ise, toksinin B alt ünitesi hücreye bağlandıktan sonra tüm molekül (A ve B fragmentleri) endositozis ile internalize edilir. Bu tarz giriş bir bakıma pinositozise de benzemektedir. Bu ikinci mekanizmada, tüm molekül vesiküller içinde toplanır ve sonra, B alt ünitesi, A’dan ayrılarak, hücre yüzeyine çıkarılır. A alt ünitesi ise sitoplasmaya girer ve buradan hedef bölgeye giderek etkinliğini gösterir. Her iki mekanizma ile de olsa, önemli olan A fraksiyonunun sitoplasmaya ulaşmasıdır. Burada toksinler moleküler düzeyde başlıca 3 tür etki gösterirler. 1) Hücrelerde protein sen¤¤¤inin inhibisyonu, 2) Sinir snaps fonksiyonunun bozulması, 3) Sitoplasmik membranın parçalanması ve membran transport sisteminin bozulması. Aşağıda bazı önemli A-B modeli, ekzotoksinler ve etki mekanizmaları hakkında kısa özlü bilgiler verilmektedir. Difteri toksini: Bu potent ekzotoksin (MA:62000 A ve 38000 B ), C. diphtheriae ’de bulunan profaj (beta fajı) tarafından spesifiye edilir. Toksin (A-B modeli), hücre içine girdikten sonra A fragmenti hedef bölge olan ribosomlara ve özellikle, zincir uzamasında önemli fonksiyona sahip olan EF2 (elongation factor 2) ile bağlanarak polipeptid zincirinin uzamasını önler ve böylece protein sen¤¤¤ine mani olur. Difteri toksinine karşı oluşan antitoksinler toksini nötralize ederek etkinliğini ortadan kaldırabilir. Eğer hücrelere bağlanma meydana gelmişse nötralizasyon meydana gelememektedir. Toksinin B fraksiyonu hücre yüzeyindeki gangliosid Gml’e bağlanmadan önce antitoksin verilirse, bu alt ünite nötralize edilebilir ve böylece toksinin bağlanması önlenir. Sağaltımda da bu durum dikkate alınarak, mümkün olduğunca erken antitoksik serum verilmesine gayret edilir. Botulinum toksini: C. botulinum tipleri tarafından 7 ayrı tarzda etkinliğe sahip ve hepsinin de konakçı spesifitesi olan ekzotoksinler sen¤¤¤lenir. Bunlardan A, B, E ve F toksinlerine insanlar, C ve D’ye de sığırlar duyarlıdırlar. Bunlardan, C. botulinum C toksini, bakteriyofaj (profaj) tarafından spesifiye edilir. Bu toksinlerin hepsi değişik şiddette paraliz oluştururlar. Toksin, sinirlerle kasların birleştiği bölgelerde, sinirlerden gelen sinyallerin kaslara ulaştıran, kasların kontraksiyonlarında çok önemli rolleri bulunan ve sinir hücrelerince sen¤¤¤lenen asetil kolinin üretimini engellerler. Böylece, sinyaller kaslara ulaşamayınca gerekli reaksiyonları ve kontraksiyonları yapamazlar ve paraliz meydana gelir. Toksin daha ziyade, nöromuskuler bölgeye yakın olan aksonlara bağlanarak bu bölgedeki hücrelerde asetil kolin sen¤¤¤ini önler. Oluşan paraliz göğüs kasları ve diyaframa kadar uzanırsa solunum yetersizliği sonu ölümler meydana gelir. Botulinum ekzotoksini A ve B modeline uyar. Tetanoz toksini: Vücut yüzeyinde bulunan derin kontamine ve içinde yabancı cisim bulunan yaralarda anaerobik koşullarda üreyen C. tetani tarafından sen¤¤¤lenen ekzotoksin bir plasmid tarafından spesifiye edilir. Toksinin başlıca iki etkili komponenti bulunmaktadır. Bunlardan biri sinirlere tesir ederek spasm meydana getirir (tetanospasmin). Diğeri ise alyuvarları parçalayan tetanolizindir. Yaralarda üreyen C. tetani ’nin sen¤¤¤lediği ekzotoksin beyne ulaşınca, hücrelerde, bir amino asit olan glycine sen¤¤¤ine mani olur. Bu durum, vücutta birbirlerine zıt fonksiyonda olan kasların aynı anda kontraksiyonlarına yol açar. Böylece tetanoz spazmları meydana gelir. Bu kasılmalar o kadar şiddetli olur ki kaslar yırtılabilir ve bazen de kemikler kırılabilir. Kas kontraksiyonlarının kontrol edilememesi solunum bozukluklarına da yol açar. Sinire etkileyen toksin, tek bir polipeptid molekül olup 150000 molekül ağırlığına sahiptir. İlk sen¤¤¤lendiğinde inaktif olan molekül, proteolitik enzimlerle iki fraksiyona ayrılır (biri, H zinciri, MA; 100000, ve diğeri L zinciri, MA 50000). Bu iki fraksiyon bir veya iki disulfid bağla birleşmişlerdir. Toksin A-B modeline uyar. Kolera toksini: V. cholerae tarafından sen¤¤¤lenen bu enterotoksinin A fraksiyonu tek molekül olmasına karşın, B fraksiyonu ise 5 molekül halindedir. Toksinin B komponenti barsak epitel hücrelerinin yüzeyindeki gangliosid Gml ile bağlandıktan sonra, A alt bölümü sitoplasmaya girer ve burada ayrışarak A1 formuna dönüşür. Bu fraksiyon hücrelerde adenylate cyclase enzimini aktivitesini kontrol eden regulatör proteinin fonksiyonunu bozarak etkisiz hale getirir ve adenylate cyclase devamlı aktivite gösterir. Fazla sen¤¤¤lenen bu madde, ATP’nin fazla miktarda cyclic AMP (c AMP) haline dönüşmesine neden olur. Bu madde (cAMP) de, barsak epitel hücrelerinden fazla miktarda sıvı ve elektrolitin lumene geçmesine yol açar. Sıvının önemli bir bölümü kandan geldiği için, sıvı ile birlikte bikarbonatın kandan dışarı çıkmasına ve kanın pH’sının düşmesine ve buna bağlı olarak ta asidozun şekillenmesine yol açar. Bu durum ölümlere neden olabilir. Ayrıca, kanın yoğunluğu artar ve dolaşım bozukluğu meydana gelir. Hipovolemik şok ve dolaşım bozukluğu nedeniyle hastanın hayatı tehlikeye girer. Toksin A-B modeline uyar. Anthraks toksini: İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan ve B. anthracis tarafından sen¤¤¤lenen ekzotoksin, plasmid orijinlidir. Toksin protein karakterinde ve zayıf antijenik olup başlıca 3 kısımdan oluşmaktadır (protektif antijen (PA), ödem faktörü (EF) ve letal faktör (LF). Bu üç toksin geni, pX01 plasmidi tarafından kodlanır. Bunlardan, PA 735 amino asit, LF 776 aa ve EF ise 767 aa 'ten oluşmaktadır. Toksin, kan damarlarının permeabilitesini bozarak hemorajilere neden olur. Bu 3 fraksiyon tek başına tam etkili olmayıp en azından iki tanesi (PA + LF) birlikte letal etki gösterir. Toksin, A ve B modeline uyar. B.anthracis 'te bulunan ikinci bir plasmid, (pX02, 60 MDa) kapsül formasyonunun kodlarına sahiptir. 2) Süperantijenler: Süperantijenler, şimdiye kadar tanımlanan immunojenlerden çok daha az yoğunlukta bile (pikomolar düzeyde) T hücrelerini uyarabilme yeteneğine sahip T hücre mitojenleridir. Stafilokok, streptokok, P. aeruginosa ve M. arthritis tarafından sen¤¤¤lenen bazı ekzotoksinler bu grup substanslar içinde kabul edilmektedirler. Bu antijenlerin (süper antijenler), diğer antijenlerden olan önemli farkları, APC (antijen sunan hücreler) tarafından işlenmeden, MHC II molekülü ile birlikte APC 'lerin yüzeylerine çıkarılır ve buradan T hücrelerine (T4 veya T8) sunulur. T hücrelerinin yüzeylerinde bulunan TCR (T hücre reseptörünün beta zincirinin variable bölgesi (VB ) ile direkt bağlantı kurarak birleşirler. Böylece, T4 hücreleri çok kuvvetli olarak uyarılır ve aynı zamanda çeşitli sitokin sen¤¤¤lemeye başlarlar. Süperantijenler orijinlerine göre başlıca 4 kategoriye ayrılmaktadırlar. Bunlar hakkında gerekli bilgiler “Mikrobial antijenler" bölümünde verilmiştir. 3) Endotoksinler: Endotoksinler, Gram negatif bakterilerinin hücre duvarının (dış membranının) Lipopolisakkarid (LPS) karakterindeki yapısal bir komponentidir. LPS, başlıca 3 kısımdan oluşmaktadır.Bunlardan biri, lipid porsiyonu (lipid A) toksik bir karakter taşır. Buna, merkez polisakkaridleri ile O spesifik karbonhidratlar (0 antijeni) bağlanmıştır. LPS, yapısal bir özellik taşıdığından ekzotoksinler gibi dışarı salgılanamazlar. Ancak, bunlar bakteriler lize oldukları zaman ortama geçerler. LPS'ler endotoksin olarak ta bilinirler. Lipid A'nın aktivitesinde, komplementin alternatif yoldan aktivasyonunun ve sitokin sen¤¤¤inin uyarılmasının rolü oldukça fazladır. Endotoksinlerin bazı özellikleri aşağıda kısaca belirtilmiştir. a) Deneme hayvanlarında toksik etki (letal etki) meydana getirebilmeleri için yüksek dozlarda (ekzotoksinlere oranla) verilmesi gerekir. b) Termostabil bir özelliktedirler ve antijeniteleri de zayıftır. c) Vücuda fazla miktarda verildiğinde, nonspesifik klinik belirtiler meydana getirirler (ateş, septik şok, zafiyet, diare, kan koagulasyonu, intestinal hemorajiler, yangısal reaksiyonlar ve fibrinolizis). d) Endotoksinlerin hücre veya dokulara karşı spesifik afiniteleri zayıftır. e) Toksoid hale dönüştürülemezler. f) Endotoksinler, lipopolisakkarid karakterindedirler. g) Vücuda girdiklerinde belli bir inkubasyon süresine sahip değildirler. Gram negatif mikroorganizmaların hepsi aynı kimyasal yapıda LPS oluşturamazlar. Aralarında farklar bulunmaktadır. Örn, bazılarında 0 spesifik karbonhidratlar kısa ve aynı zamanda değişik yapıda bulunur. Bazılarında da (spriroketalarda) dış membranında, LPS yanı sıra lipoproteinde vardır. Endotoksinlerin vücutta oluşturdukları bazı önemli bozukluklar şöyledir. Ateş (pirojenite): Vücutta, endotoksinlerin etkisi ile kan leukositlerinden (özellikle, makrofajlardan) sen¤¤¤lenen ve salgılanan endojenik pirojenler (Örn, İL-1, İL-6, TNF, vs), vücut ısısını kontrol eden beyin hipotalamusuna etkilemesi ve uyarması sonu ateş yükselmesi meydana gelir. Septik şok: Septik şok, vücutta organlarda meydana gelen fonksiyonel bozukluklarla karakterize olan kompleks bir olgudur. Eğer, Gram negatif bakteriler fazla miktarda kanda bulunursa veya damar içi endotoksinler şırınga edilirse tehlikeli septik şok oluşabilir (kan basıncı düşer, nabız zayıflar, solunumda azalma, yüksek dozlar kan dolaşımında bozukluklar, kollaps ve ölümlere yol açar). Kanda değişiklikler: Endotoksinler deneme hayvanlarına verilince, geçici bir süre için kan leukositlerinde azalma (leukopenia) ve sonra artmalar meydana gelir. Endotoksinler trombositleri zedeleyerek intravasküler kan pıhtılaşmasına yol açarlar. Ayrıca, endotoksinler damar permeabilitesini de artırarak hemorajilere sebep olurlar. Endotoksinler, kanda inaktif bir durumda bulunan Hageman faktörü-XII (kan pıhtılaşma faktörü-XII)nü de stimule ederler. LPS'ler leukositleri ve makrofajları uyararak İL-1, İL-6, İL-8, TNF-alfa, İFN, vs gibi sitokinlerin sen¤¤¤lerine de yol açarlar. 2.02. Diğer Virulens Faktörleri Bu başlık altında toplanan virulens faktörleri de, genellikle, ekstrasellüler niteliktedirler. Bunlar mikroorganizmaların yayılma kabiliyetlerine (invazif özellik) ve hastalık oluşturmalarına yardımcı olurlar. Ekzotoksinler kadar potent olmamakla beraber bazıları oldukça önemli ve ekindirler. Çoğu, enzim niteliğindedir. Bu faktörlerden önemli bazıları aşağıda bildirilmiştir. Hemolizinler: Bir çok Gram pozitif ve negatif mikroorganizma tarafından sen¤¤¤lenen bu toksik substansların alyuvarları parçalama özelliği bulunmaktadır. Hemolizinler alyuvarların membranında zedelenmeler yaparak hemoglobinin dışarı çıkmasına yol açarlar. Protein karakterinde, termolabil ve antijenik bir özellik gösteren ekstrasellüler streptokokkal hemolizinler oksijene olan duyarlılıklarına göre iki kısma ayrılmaktadırlar. Bunlardan Streptolizin O (SLO), oksijene karşı duyarlıdır ve okside olarak tahrip olur. Bu nedenle de anaerobik koşullarda üretilen S. pyogenes suşlarında koloni etrafında beta-hemoliz oluştururlar. Diğeri ise, Streptolizin S (SLS), oksijenden etkilenmez ve aerobik koşullarda üreyen S. pyogenes kolonilerinin etrafında beta-hemoliz alanı görülebilir. SLS, aynı zamanda hücrelere bağımlı durumdadır ve lökosidin etkisine de sahiptir. Eğer mikroorganizma fagosite edilirse, makrofajları veya PNL'leri öldürebilir. Hemolizin oluşturma yeteneği pasajlarla azalır ve kaybolabilir. Hemolizinler protein karakterinde olduklarından da antijeniktirler. S. pyogenes dışında bir çok Gram pozitif streptokok, stafilokok, klostridium ve Gram negatif (E. coli, P. aeruginosa, vs) bakteriler, kanlı agar üzerinde koloni etrafında alfa veya beta hemoliz alanları oluşturan koloniler meydana getirirler. Mikroorganizmaların hemolitik aktiviteleri, kullanılan kan türüne, agarın kalınlığına, ve aynı zamanda kültür koşullarına göre değişebilir. Bazıları, alfa hemoliz (koloni etrafında tam açılma yok, yeşilimsi görünüm) bir kısmı ise tam hemoliz (beta hemoliz) oluşturabilirler. Hyaluronidase (yayılma faktörü): Bazı mikroorganizmalar (streptokok, stafilokok, C. perfringens, vs) tarafından sen¤¤¤lenen bu enzim, bağdokuda bulunan ve sement vazifesi gören hyaluronik asidi hidrolize ederek ayrıştırır ve mikroorganizmaların dokularda kolayca yayılmasını sağlar. Bu enzim, indüklenebilen bir özellik taşıdığından, ancak ortamda hyaluronik asit varsa sen¤¤¤lenir. Streptokoklarda bulunan kapsülün bileşiminde de hyaluronik asit bulunmaktadır. Hyaluronik asit mukopolisakkarid yapısında olup antijenik bir özelliğe sahiptir. Streptokinase (fibrinolizin): Bu substans daha ziyade grup A, C ve G streptokoklar ile stafilokoklar (stafilokinase) tarafından sen¤¤¤lenir. Streptokinase, kan plasminogenini plasmine çevirir. Bu ürün de (plasmin) bir protease olup kan pıhtısı fibrini eritir. Kan pıhtısı eriyince, mikroorganizmalar daha kolay yayılma olanağı bulurlar. Koagulase: S. aureus, koagulase olarak adlandırılan enzim sen¤¤¤ler ve bu enzim plazmadaki aktivatöre etkileyerek koagulasyon meydana getirir. Reaksiyonda, kanda bulunan fibrinogeni, erimez (insoluble) fibrin haline dönüştürür (koagulasyon). Fibrin, aynı zamanda, mikroorganizmaların etrafını sararak fagositozdan ve diğer zararlı etkilerden korur. Koagulase enzimi termostabil ve antijeniktir. S. aureus 'ların patojenite kriterlerinin belirlenmesinde dikkate alınmaktadır. Ancak, koagulase sen¤¤¤lemeyen mutant patojenik S. aureus 'ların bulunması, patojenite tayininde bu faktörün tek olarak kriter alınamayacağını da ortaya koymaktadır. Leukosidinler: Bu substanslar, genellikle, streptokok, stafilokok ve pnömokoklar tarafından sen¤¤¤lenmektedir. Etkinlikleri daha ziyade fagositik hücrelerden olan makrofajlar ve polimorfnukleer lökositler üzerine olmaktadır. Mikroorganizmalar fagosite olduktan sonra, bunlara ait leukosidinler, hücre sitoplasmasında, içlerinde değişik karakterde hidrolizan enzimler bulunan granülleri parçalayarak internal degranülasyona yol açarlar. Bu substansların sitosola geçmesi fagositik hücrelerin çeşitli ve önemli fonksiyonlarını bozar ve aynı zamanda ölümlerine de neden olur. Bu durum, bir bakıma fagositik hücrelerin infeksiyonu niteliğini taşır. Leukosidinler antijeniktirler ve kendilerine karşı antikor sen¤¤¤ini uyarırlar. Deoksiribonuklease (DNase): Bu enzim, S. aureus, S. pyogenes, C. perfringens ve diğer bazı etkenler tarafından sen¤¤¤lenir. Zedelenmiş dokularda bulunan hücrelerin DNA (deoksiribonukleik asit) 'sını eriterek tahrip eder. Böylece, patojenler daha kolaylıkla yayılma olanağı bulurlar. Yaralarda bulunan ve yapısının büyük bir bölümünü ölmüş fagositik hücreler oluşturan irindeki hücre DNA'ları eridiğinden içlerinde bulunan mikroorganizmalar daha kolayca ve serbest hareket edebilmektedirler. Lesitinase: Daha ziyade, Clostridium spp'ler tarafından sen¤¤¤lenen bu enzim, hücre plazma membranında bulunan lesitini ayrıştırarak membranın bütünlüğünü ve fonksiyonunu bozar. Böylece hücreler tahrip olur ve patojenlerin etkinliği de artar. Kollagenase: Bazı Clostridium spp'ler tarafından sen¤¤¤lenen bu enzim de kas, kıkırdak ve kemiklerde bulunan kollageni ayrıştırma yeteneğine sahiptir. Patojenlerin invazyon kabiliyetini arttırır. Mikrobial demir kelatörleri: Demir bir çok aerobik ve aerotolerant mikroorganizmaların yaşamaları ve çoğalmaları için çok gerekli bir elementtir. Ayrıca, demir içeren bazı enzimlerin (sitokrom, katalase) sen¤¤¤leri için de demire gereksinim vardır. E. coli 'de de demir bağlayan protein (enterochelin) bulunmaktadır. Bu protein polimerize ferrik demiri solubulize ederek hücre içine girmesine yardımcı olur. Demir bağlayan proteinlere bakterilerde siderofor adı da verilmektedir. Konakçı serumunda bulunan transferrin, süt, sıvı ve mukozalarda bulunan laktoferrin demir içeren birer protein olarak bilinmektedir. Ayrıca, kanda da hemin bulunmaktadır. Ortamlarda demirin bulunması bakterilerin üremesi ve toksin sen¤¤¤leri üzerine olumlu etkide bulunur. Difteri, tetanoz, C. perfringens, vs etkenlerin toksini için demir gereklidir. Hidrojen peroksit (H2O2): Bazı mikoplasmalar ve ureaplasmalar, genellikle, ürogenital sistem mukozalarına yerleşme eğilimi gösterirler. Çoğaldıktan sonra burada hidrojen peroksit ve amonyak (NH3) oluştururlar. Bu maddelerin böbrek ve ürogenital sistem epitel hücrelerinde birikmesi zararlı ve zedeleyici etkiye sahiptir. 2.03. Membran Parçalanmasına Neden Olan Toksinler Listeriolizin: İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan L. monocytogenes, uygun ortamlarda üretildiklerinde, hücrelerin sitoplasmik membranlarında porlar açan ve böylece hücrelerin permeabilitesini bozarak parçalanmasına neden olan listeriolizin adı verilen toksik maddeyi sen¤¤¤ler. Bu substans, aynı zamanda pore forming cytotoxin (delik açan sitotoksin) olarak ta bilinmektedir. Fosfolipase: C. perfringens tarafından sen¤¤¤lenen ve alfa-toksin olarak ta tanımlanan bu sitotoksin, fosfolipase karakterinde olup hücre membranındaki lesitini hidrolize ederek erimesine ve hücrelerin parçalanmasına neden olmaktadır. 2.04. Antifagositik Faktörler Kapsül: Bazı Gram negatif ve pozitif mikroorganizmaların etrafında hem virulensin artmasında, bakterinin korunmasında ve hem de fagositozun önlenmesinde etkili olan kapsül bulunmaktadır. Örn. B. anthracis 'in etrafında protein (D-glutamik asit polimeri) karakterinde ve plasmid tarafından spesifiye edilen zayıf antijeniteye sahip bir kapsül bulunur. C. perfringens, P. multocidae, S. pneumoniae, K. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, vs. etrafında polisakkarid yapısında kapsül bulunur. Kapsül, aynı zamanda, bakteriyi, fajların lizisinden de korur. B. anthracis 'in kapsülü in vivo koşullarda meydana gelir. Kültür ortamlarında pasajı yapıldığında kapsül kaybolabilir. Ancak, serumlu ve CO2 'li besi yerlerinde kapsül formasyonu tekrar meydana gelebilir. Kapsülsüz etkenin hastalık yapma yeteneği de kaybolur. Kapsül aynı zamanda komplementin aktivitesini azaltır ve fagositoza de mani olur. Bazı mikroorganizmaların etrafında bulunan mukoid tabakasının aynı zamanda üredikleri ortama da yayılabilen mukoid maddesinin de antifagositik etkisi bulunmaktadır. Hücre duvarı antijenleri: Hidrofobik yüzeye sahip olan Gram negatif bakteriler, hidrofiliklerden daha fazla, fagositoza dirençlidirler. Streptokoklarda bulunan M proteininin antifagositik aktivitesi (aynı zamanda adherens faktörüdür) vardır. S. aureus 'ların Protein A fraksiyonu, immunglobulinlerin Fc porsiyonu ile bağlanır. Eğer böyle bir antikor, fagositik hücrelerin yüzeylerindeki Fc reseptörleriyle birleşince antifagositik etki meydana getirir. Teikoik asitinin de antifagositik aktivitesi olduğu açıklanmıştır. Böylece mikroorganizmalar fagositozdan korunurlar. 2.05. Adherens Faktörleri Mikrobial infeksiyonların çoğu, genellikle, konakçının solunum, sindirim ve ürogenital sistemlerine ait mukozal membranlarının yüzeylerinden başlar. Bu yüzeylerde oluşan makroskobik veya mikroskobik porantreler patojenik mikroorganizmaların kolayca girmesine, yerleşmesine, üremesine ve vücuda yayılarak infeksiyonlar oluşturmalarına yardımcı olurlar. Ancak, yüzeylerinde böyle hazır giriş kapıları bulunmayan, sağlam hücrelere de etkenler girebilirler. Mikroorganizmalar kendilerinde bulunan adhezyon molekülleri yardımı ile hücrelerin yüzeylerindeki spesifik reseptörlere bağlanarak tutunur ve kolonize olabilirler, daha derinlere ulaşabilir ve vücuda yayılabilirler. Bu adhezyon faktörlerinden bazıları aşağıda bildirilmiştir. Hemaglutinin: Daha ziyade virusların yüzeyinde bulunan hücrelere tutunmada yardımcı olan ve aynı zamanda, eritrositlere de bağlanarak aglütinasyon (hemaglutinasyon) meydana getiren glikoprotein karakterinde moleküllerdir (peplomer). Fimbrial ve afimbrial adhezinler: Bazı bakterilerde bulunan fimbriaların (Tip-I pilus) distal uçlarında bulunan özel adhezyon proteinleri (adhezinler, fimbrial adhezinler) veya bakterilerin hücre duvarlarında lokalize olmuş spesifik adhezyon molekülleri (afimbrial adhezinler), konakçı hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlerle (adhezin/reseptör) interaksiyona girebilir ve bunun sonunda mikroorganizmalar hücre yüzeyine bağlanabilir ve kolonize olabilirler. Bazı bakterilerde bulunan çeşitli adhezinler başlıca iki grup içinde toplanabilirler. 1- Gram negatif mikroorganizmalarda adhezinler a- Fimbrial adhezinler: E. coli (FimH, PapG, SfaS, PrsG), H. influenzae (HifE), K. pneumoniae (MrkD). Bu fimbrial adhezinler, hücre yüzeyinde bulunan, glikolipid, galaktoz, mannoz, sialogangliosid-GMI ve tip V kollagan reseptörleriyle interaksiyona girerler. b- Afimbrial adhezinler: B. pertussis (PHA, Pertactin), H. influenzae (HMV 1/HMV 2, Hia), H. pylori (Leb-bağlayan adhezin). Bu tür adhezinler de, S'li oligosakkarid, integrin, insan epitel hücreleri, fucosile Leb-histokan grubu) reseptörleriyle ilişki kurarlar. 2- Gram pozitif mikroorganizmalarda adhezinler Bunlar daha ziyade afimbrial özellikte olup bağlandıkları reseptörlerin karakterlerine göre gruplara ayrılırlar. a- Antijen I-II grubu: S. mutans (SpaP, Pl, PAc), S. gordonii (SspA, SspB ), S. sobrinus (SpaA, PAg). Bunlar, genellikle, salivar glikoproteinlere ve actinomyces reseptörlerine bağlanırlar. b- Lral grubu: S. parasanguis (FimA), S. pneumoniae (PsaA), S. gordonii (ScaA), S. sanguis (SsaB ), E. faecalis (EfaA). Bu gruptaki adhezinler (S. pneumoniae ve E. faecalis hariç), salivar glikoproteinlerine, fibrin ve actinomyces reseptörlerine bağlanırlar. c- S.gordonii (CshA, CshB ), S. aureus (FnbA, FnbB ), S. pyogenes (SfbI, protein F). Bu adhezinler de hücre yüzeyindeki fibronectin ve actinomyces reseptörleri ile ilişki kurarlar. d- S.pneumoniae (CbpA, SpsA, PbcA, PspC). Bu etkene ait çeşitli adhezinler de, sitokinle aktive olmuş epitelyal ve endotelyal hücreler ve İgA ile ilişki kurarlar. Yukarıda da görüldüğü gibi, bir tür mikroorganizma üzerinde hem fimbrial ve hem de afimbrial adhezinler bulunabiliyor. Ayrıca, farklı mikroorganizmalar farklı karakterdeki reseptörle bağlanabiliyor (veya tersi de olabilmektedir). Mikroorganizmaların sağ tarafındaki parantez içindeki kodlar, adhezin moleküllerini ifade etmektedir. Adhezinlerin bağlandıkları reseptörler de farklı karakter (genellikle) taşımakta ve hiç bir zaman bütün adhezinlerin, yukarıda belirtilen reseptörlerin hepsine bağlanabilir özellikleri yoktur. Diğer bir ifade ile adhezinlerle reseptörler arasında spesifik bir ilişki bulunur. Bakterilerin hücrelere kolonize olmalarını önlemek için, adhezinler ile reseptörler arasındaki ilişkiyi kesmek gerekir. Bu amaçla, adhezinlerle hazırlanan aşıların vücuda verilmesi halinde gerek kanda ve gerekse mukozal yüzeylerde spesifik antikorların varlığı ortaya konulmuş ve bunların, adhezinlerle birleşerek, reseptörlerle interaksiyona girmesinin önlendiği açıklanmıştır. Örn. uropatojenik E. coli 'ye ait FimH adhezinine karşı elde edilen anti adhezin antikorların, farelerde, çok olumlu sonuçlar verdiği bildirilmiştir. Mukoid salgı: Bazı mikroorganizmaların etrafında bulunan amorf bir özellik gösteren mukoid salgı antijenik bir maddedir. Fagositoza mani olur. Glikoprotein veya mukopolisakkarid yapısındadır. S katmanı: Bazı mikroorganizmalarda bulunan ve yüzeylere bakterilerin bağlanmasını kolaylaştıran maddelerdir. Teikoik asit ve lipoteikoik asit: Gram pozitif mikroorganizmaların hücre duvarında bulunan bu maddeler de, yüzeyde yerleştikleri için, adhesyon molekülleri gibi görev yapmaktadırlar. M proteini: S. pyogenes 'lerin hücre duvarındaki M proteini aynı zaman adherens faktörü olarak ta etkindir. 2.06. Mikroorganizmaların Vücuda Adaptasyonları Patojenik etkenler, çeşitli yollardan vücuda girdikten sonra, kendilerini çok değişik olarak buldukları bu yeni ortam koşullarına (ısı, pH, osmotik basınç, oksijen, gıda maddeleri, humoral, sellüler, fiziksel, kimyasal ve biyolojik anti mikrobial, diğer faktörler, vs) adapte etmeye çalışırlar. Bu faktörlerin büyük bir kısmı mikroorganizmaların yerleşme, kolonizasyon ve yayılmasına uygun olmamasına karşın, bazıları da destekleyici bir özellik taşımaktadır. Mikroorganizmaların bu kadar çok ve farklı olumsuz koşullara karşı kendini koruyabilmesi, savunabilmesi ve vücutta yerleşebilmesi için, bu yaşam savaşından galip çıkması (diğer bir ifade ile bu yeni ortama adaptasyon için mücadele vermesi ve bundan da başarılı olması) gerekmektedir. Eğer canlı kalabilirse, o zaman mikroorganizma, kendisinin, konakçının ve diğer faktörlerin etkinlik derecesine göre, yerleşebilir, ürer ve vücuda yayılarak infeksiyonlara ve hastalıklara yol açabilir. İşte, bu süreç, bir adaptasyon dönemidir ve infeksiyon için de ilk adımı oluşturur. Mikroorganizmaların, adaptasyon periodunu aşabilmesinde, genlerinde meydana gelebilecek reorganizasyonların önemli bir rolü bulunmaktadır. Bu genetik düzenleme için bazı mikroorganizmalar yeterli bir zamana sahip olmamasına karşın, bir kısmı da bu süreyi elde edebilir. Bu nedenle de hastalık ajanların bir çoğu vücutta yerleşme fırsatı bulamadan, başta, humoral ve sellüler faktörler olmak üzere diğer savunma faktörlerinin etkisi altında üremeleri sınırlandırılır ve öldürülürler. Bu adaptasyon periodunda, mikroorganizmalarda bulunan virulens faktörlerini kodlayan genlerin önemi oldukça fazladır. Bu period içinde genlerde bir reorganizasyonun meydana gelmesi gerekir ve bu sayede adaptasyon çok daha kolaylaşır ve canlı kalma süreleri de artar. Bu sürenin uzun veya kısa olmasında, bulunduğu ortamın sağladığı olanaklar (çevresel sinyaller, fiziksel ve kimyasal faktörler-Ca, Fe, vs) oldukça fazla etkilidirler. Bu ajanların indükleyici etkileri ile, virulens faktörlerinin kısa bir süre içinde ekspresyonuna yardımcı olurlar. Ancak, bu çevresel sinyaller ve bunların etkinlik dereceleri, mikroorganizmalara göre değişebilmektedir. Besi yerlerinde yavaş üreme gösteren mikroorganizmalar (veya generasyon süresi uzun olanlar) uzun bir adaptasyon dönemi geçirmiş olanlardır. Bu süre de kendini iyi reorganize edenler, üremenin latent periodunu geçerek üreme dönemine ve böylece daha hızlı çoğalmaya başlarlar. Eğer, mikroorganizmaların latent dönemi (adaptasyon dönemi) çok kısa sürmüşse, o zaman, etkenler çok daha hızlı çoğalabilir ve kısa bir sürede üreme dönemine geçerler. Latent periodun uzun veya kısalığı, mikroorganizmaların yeni girdikleri ortamının koşulları ile çok yakından ilgili olduğu kadar mikropların reorganizasyonu ile de alakadardır. Vücuda giren mikroorganizmaların genetik düzeydeki reorganizasyon ve regulasyon mekanizmaları oldukça önemlidir ve bunlar birkaç tarzda gerçekleştirebilmektedir. 1) gen reorganizasyonları (gen amplifikasyonu, genlerin yer değiştirmeleri, rekombinasyonlar, ve bunun gibi genetik düzeydeki değişiklikler). 2) Bazı özel genlerden yapılan transkript (mRNA) sayısının arttırılması, 3) Her transkriptten elde edilecek özel ürün (protein) miktarının artırılması, 4) Bazı silent genlerin indüklenerek stimule edilmesi ve böylece aktif gen haline getirilmesi, 5) Virulens faktörlerini kodlayan genlerin ve diğer önemli genlerin aktive edilmesi, Genetik yönden reorganizasyonda, çevresel faktörlerin uyarıcı etkileri yanı sıra, bakterilerde bulunan plasmidlerin, fajların, profajların İS-elementleri, Transposonların aktivitelerinin de rolleri oldukça fazladır. Bunların yanı sıra, kromozomun replikasyonu sırasında, yan yana gelen iki DNA iplikçiğinde homolog bölgeler arasında çok azda olsa, homolog rekombinasyonların meydana gelebileceğini belirten araştırıcılar bulunmaktadır. Yukarıdaki ekstrakromozomal genetik elementler, hem kendi aralarında ve hem de bakteri kromozomu ile çeşitli tarzda rekombinasyonlar meydana getirerek kromozoma integre olabilirler. Bazı bakterilerde virulens faktörlerinin bir kısmı plasmidler tarafından kodlanmasına karşın (Örn, B. anthracis ve C. tetani 'nin toksin sen¤¤¤i), bir kısım bakteride de faj tarafından spesifiye edilir (C. diphtheriae ve C. botulinum toksin geni). E. coli başta olmak üzere, bir çok Gram pozitif ve Gram negatif mikroorganizmalarda virulens faktörlerinin en önemlilerinden birisi olan pilusların ve diğer virulens faktörlerinin bazıları yine plasmid, Transposon, ve fajlar tarafından kodlanmaktadırlar. Promotorların kuvvetinin artırılması transkript ve gen ürününün de artmasına yol açar. Bu nedenle kuvvetli promotorlardan rekombinant DNA teknolojisinde fazla yararlanılır. RNA veya DNA polimerase genlerindeki mutasyonlar da replikasyona ve genlerin ekspresyonlarına olumsuz yönde etkilerler. Ayrıca, virulens genlerinin ekspresyonuna, promotor bölgesinde oluşan mutasyonlar da tesir ederler. 2.07. Mikroorganizmaların Giriş Yolları ve Miktarı 1) Mikropların vücuda girmesi: Mikroorganizmaların hastalık yapabilmesindeki ilk basamak, vücuda girmekle başlar. Bunun için bazı giriş kapılarına (porantre) ihtiyaç vardır. Vücutta bulunan en önemli giriş kapıları ağız, yutak ve sindirim sistemi, burun, larinks ve trachea ve akciğerler, genital organlar, göz konjunktivası ve deridir. Salmonella, shigella, vibriolar, brusella ve tüberküloz etkenleri sindirim sisteminden girerek; Corynebacterium diphtheriae insanlarda boğazda yerleşerek toksin meydana getirir ve bu zehir vücuda yayılarak hastalık yapar. Hayvanlarda septisemik hemorajik karakterde seyreden pastörellozisin etkeni ekseriya yutak ve larinkste yerleşmiştir. Bünyede bir zayıflamanın olduğu hallerde hastalık meydana getirirler. Tüberküloz ve anthraks etkenleri solunum yolu ile bulaştıkları gibi deriden de geçebilir. Deriden, ayrıca, leptospira, brusella, anaeroblar, anthraks mikroorganizmaları da girebilirler. Çiftleşme ile, genital yolla, sifilis, N. gonorrhoea, brusella ve C. fetus bulaşabilir. Göz yolu ile leptospiralar, listerialar ve diğer mikroorganizmalar girerek hastalık yapabilirler. Yukarıda yapılan ayrım kesin bir durum göstermez. Yani bir mikrop birçok yollardan vücuda girerek hastalık yapabilir. Örn, brusella sindirim, deri ve çiftleşme ile; tüberküloz, deri, sindirim ve solunum; antraks basilleri deri, sindirim ve solunum yolu ile bulaşabilir. Çeşitli yollardan infeksiyon meydana getirebilen mikroorganizmaların yaptığı hastalığın klinik tablosu girdiği yere göre değişebilir. Örn, B. anthracis sporları solunum yolu ile alınmışsa, akciğer antraksı, deriden alınmışsa girdiği yerde püstül ve ödem (kasap çıbanı), tüberküloz mikrobu deriden girerse deri tüberkülozu, barsaktan girerse barsak ve solunum yolu ile alınırsa akciğer tüberkülozunu meydana getirir. C. tetani, deride bulunan derin ve kirli yaralarda yerleşerek ürer ve toksin meydana getirir. Bu toksin kana karışarak hastalık yapar. Botulismde ise, toksin ihtiva eden gıdaların alınması sonu barsak yolu ile zehirlenme olur. Mantarların çoğu da, deri, solunum ve sindirim sisteminden girerek mikozeslere neden olurlar. Mikroorganizmaların hastalık yapabilmeleri için, bunların uygun yolla girmeleri de gereklidir. Örn, S. typhi sindirim yolu ile alınırsa vücudu istila edebilir ve hastalık meydana getirebilir. Deriden girerse çok nadiren vücuda yayılabilir. Buna karşın grup A hemolitik streptokoklar deriden girerek yayılma kabiliyetine sahiptirler: F. tularensis, derideki yaralardan girerse lenf yumrularında lokalize olur. Kana geçip istila edemez. Bu durumda ölüm oranı %5 kadardır. Halbuki, aynı etken sokucu sinek veya keneler aracılığı ile dokulara kadar iletilirse septisemi meydana getirir ve %95 ölüme sebep olabilir. Aynı şekilde, tetanoz toksinleri sindirim sisteminden girerse hastalandıramaz. Neisseria gonorrhoea ağızdan bulaşamaz. Beyin, damar ve periton içine verilen mikroorganizmalar, diğer yollardan, daha çabuk hastalık meydana getirirler. Vücudu mikroplardan koruyan sistemlerden biri de deri ve mukozaların mikroplar üzerine olan inhibitör ve öldürücü etkileri çok önemlidir. Deri dokusu salgılarıyla birçok mikroorganizmaların ölmesine sebep olmasına rağmen, derideki kıl ve yağ folliküllerinden ve çok küçük yaralardan mikroplar girerek infeksiyonlar yapabilirler (S. aureus, streptokoklar ve korinebakteriler, leptospiralar, vs.). Solunum ve genital organlarda bulunan mukus salgılayan hücreler de mikropların mukoza hücrelerine yerleşmesine mani olur. Bazı mikroplar lizozim enziminin etkisiyle öldürebilirler. Fakat, buna rağmen yine buralardan mikroplar girebilirler. Göz yaşının da aynı şekilde, mikroplar üzerine olumsuz etkisi vardır. Fakat, göz konjonktivası yolu ile de mikroplar hastalık yapabilirler. Mide asiditesi bazı salmonellaları inhibe eder. Fakat, bu asiditenin bozulduğu zamanlarda mikroplar mideyi kolayca geçebilirler. Bazı mikroplar normal deri ve mukozadan geçemezler. Ancak, deride ve mukozada meydana gelecek çok ufak mikroskobik yaralar mikropların giriş kapısı vazifesini görürler. Deri üzerinde sokucu insektlerin açtığı yaralardan mikroplar kolayca girebilirler. Su ile fazla yumuşamış deriden leptospiralar ve brucellalar kolaylıkla geçebilirler. 2- Mikrobun dozu (miktarı): Vücuda porantrelerden giren mikroorganizmalar, bir infeksiyonu başlatabilecek miktarda, olmalıdırlar (MİD minimum infektif doz). Bu limitin altında girenler, vücudun hücresel ve humoral savunma sistemleri ile kolayca yok edilirler. Mikrop sayısı ne kadar fazla olursa, konakçının hastalanma şansı o derece artar. Hastalık yapma veya başlatma limiti mikropların virulensine ve konakçının duyarlılığına göre de değişir. Virulensi fazla olan mikroorganizmalar çok hassas konakçıya az sayıda girseler bile, bir infeksiyonu başlatabilirler. Pasteurella multocidae için güvercinler, antraks basilleri için fareler örnek verilebilir. Mikroplar girdiği yerde yerleşmesine, üremesine ve buradan çeşitli yollarla (kan, lenf ve sinir sistemi) dokulara yayılmasına invazyon kabiliyeti adı verilir. Enterobakterilerin invazyon kabiliyeti, fazladır. Buna karşılık, deride yerleşen streptokok veya stafilokoklar, genellikle, burada lokalize olurlar. Bazen bitişik dokulara yayılırlar. 3. Konakçıya Ait Faktörler 3.01. Bağışıklık Mikroorganizmalar ne kadar virulent olurlarsa olsunlar konakçı duyarlı değilse ve savunma mekanizmaları tarafından önleniyorsa infeksiyon meydana gelemez. Konakçının direncine etkileyen bir çok faktörler vardır. Bunlar yerine göre işbirliği içinde, konakçıyı korumaya çalışırlar. Ancak, bu savunma mekanizmaları bazen yetersiz kalmakta ve canlılar hastalanmaktadırlar. Bir hastalıktan iyileşen şahsın, aynı infeksiyona, genellikle, ikinci kez yakalanmadığı veya en azından, uzun bir süre direnç gösterdiği eskiden beri bilinmektedir. On birinci asırda Çinliler, çiçek hastalığı geçirenlerin hayat boyu bu infeksiyona tutulmadıklarını bilmekteydiler. Bu nedenle, iyileşmiş kişilerin, hastalarla ilgilenmelerinin ve onlara yardım etmelerinin bir sakınca yaratmayacağını belirtmektedirler. Bu görüşler hastalıkların nedeni üzerinde durulmaksızın ve bilinmeksizin, Edward Jenner’e kadar muhafaza edilmiştir. Bağışıklığın kurucusu olarak kabul edilen bu bilim adamı, sığır çiçeği alan bir şahsın, insan çiçeğine karşı bağışık olacağını ve hastalanmayacağını deneysel olarak göstermiş ve böylece aşılama ile immunitenin elde edilebileceğini kanıtlamıştır (1798). Bağışıklık genel anlamda, vücuda giren veya verilen yabancı substanslara (mikroorganizma, toksin, toksoid, protein, polisakkarid, kompleks yapıdaki moleküller, vs.) karşı vücudun bütün genel ve özel savunma mekanizmaları ile karşı koyması, direnç göstermesi, kendini koruması ve zararlı maddeyi elimine etmesi olarak tanımlanabilir. Bağışıklık, bu genel tarifi içinde vücutta, birbirlerini tamamlayan ve çok yakın ilişkide bulunan başlıca iki temel korunma mekanizması tarafından sağlanmaktadır. DoğaI Bağışıklık 1)Genetik faktörler 2)Fizyolojik faktörler 3)Primer savunma mekanizması 4)Sekonder savunma mekanizması Edinsel Bağışıklık 1)Aktif bağışıklık a)Doğal aktif bağışıklık b) Suni aktif bağışıklık 2) Pasif bağışıklık a)Doğal pasif bağışıklık b) Suni pasif bağışıklık 3) Adoptif bağışıklık 3.02. Doğal Direnç (Yapısal direnç, Kalıtsal direnç, Nonspesifik direnç, Doğal Bağışıklık) Canlıların yapısal (anatomik, fizyolojik, fiziksel, kimyasal, vs) ve kalıtsal karakterleri ile ilişkili olarak, dışardan giren patojenik, apatojenik etkenlere ve diğer substanslara yönelik olarak genel savunma mekanizması yardımı ile karşı koyması ve kendini koruması doğal direnç (doğal bağışıklık) kapsamı içinde bulunmaktadır. Genetik olarak kontrol edilen ve kalıtımla nesillere aktarılabilen bu tür direnci, ayrıca, destekleyen ve yardımcı olan bir çok sekonder faktörler de vardır. Doğal dirençte etkinliği olan başlıca faktörler aşağıda gösterilmiştir. Genetik Faktörler Doğal direnci oluşturan faktörlerin başında genetik nitelikte olanları bulunmaktadır. Yavrulara kalıtsal olarak aktarılan bu karakter türler, ırklar ve bireyler arasında bazı değişiklikler göstermektedir. 1) Türlere ait direnç: İnsanlarda rastlanılan kızıl, kızamık, boğmaca, kolera, kabakulak, tifo, gibi bir kısım hastalığa ait bakteriyel ve viral etkenler hayvanlarda hastalık oluşturmazlar. Kanatlıların bir çok viral hastalığı da (AE, LL, Marek, IB, ILT, EDS, gibi) insan ve diğer memeli hayvanlarda bozukluklar meydana getirmezler. Hayvan türleri arasında da türlere özgü hastalıklar vardır. Şöyle ki, At vebası hastalığı tek tırnaklılarda, sığır vebası hastalığı da çift tırnaklılarda görülür. 2) Irklara (soy) ait direnç: Aynı tür içinde bazı ırklar (soylar), türün, genelde duyarlı bulunduğu infeksiyonlara, değişik derecede hassasiyet gösterirler. Örn, koyunlar, genel olarak, B. anthracis ’e duyarlıdırlar. Ancak, Cezayir koyunları, bu infeksiyona daha fazla doğal bir direnç gösterir ve hastalığı almazlar. Merinos koyunları, Piroplasmosis ve deri hastalıklarına daha fazla yakalanırlar. İnsanlar arasında, Negrolar Tüberkulozis ve mantar hastalıklarına, Anglosaksonlar solunum sistemi infeksiyonlarına daha duyarlıdırlar. Tavuk yumurta lizozimi, strain B10 farelerinde supresyon oluşturmasına karşın, B10 A ırklarında ise antikor sen¤¤¤ini uyarmaktadır. Poli-L-lizin, strain 2 kobaylarda hücresel bir yanıt meydana getirmesine karşın, strain 13’lerde hiç bir immunolojik cevap oluşturmamaktadır. Leghorn ırkı yumurtacı tavuklar, S. gallinarum infeksiyonlarına dirençli oldukları halde, Newhampshireler ise çok duyarlıdırlar. 3) Bireylere ait direnç: Bireyler arasında da hastalıklara yakalanma yönünden bazı farklar vardır. Ancak, bu durum genetik faktörler kadar, diğer nedenlerin etkisi (şahısların konstitüsyonel özellikleri yanı sıra, kondisyonel durumları, beslenme, kendini koruma ve diğer faktörler) altında da oluşmaktadır. İnsanlar arasında bir hastalığa (Örn, Grip), erken veya geç yakalananlar, hiç hastalanmayanlar, çok hafif veya çok şiddetli geçirenler bulunmaktadır. Hayvanlar için de benzer durumlar vardır. 4)Hücrelere ait direnç: Canlılar arasında türlere ve ırklara ait dirençte, hücrelerin yüzeyindeki özel reseptörlerin rolleri fazladır. Eğer, hastalık, ajanları, hücrelere kendinin bağlanmasına yardımcı olan reseptörleri bulamazsa tutunamaz, kolonize olamaz ve üreyemezler. Bunun sonunda da hastalık oluşturamazlar. Bir vücutta bazı doku ve organlar, mikroorganizmalarını yerleşmesine çok daha fazla duyarlı olabilmektedir. Fizyolojik Faktörler Doğal direnci destekleyen yan faktörler arasında bazı fizyolojik özellikler de bulunmaktadır. Bunlar da, 1) Vücut ısısı: Normal koşullarda, ısısı yüksek (41-42°C) olan kanatlıların hastalıkları (bakteriyel veya viral), ısısı 37-38°C arası olan memelilerde görülmemektedir. Bunun tersi de mümkündür. Ancak, kanatlılar normal koşullarda B. anthracis ’ten ileri gelen infeksiyonlara yakalanmamalarına karşın, bu hayvanların tüyleri yolunduktan sonra belli bir süre 37°C de tutulurlarsa deneysel olarak infekte olabilirler. Soğuk kanlılardan olan balıkların ve diğer hayvanların hastalıkları da, sıcak kanlılara bulaşmamaktadır. 2) Yaş durumu: Yeni doğanlar ile çok yaşlılar, immun sistem fonksiyonlarının yeterince aktif olmamaları ve hücresel aktivite noksanlığı nedenleriyle, gençlere veya erginlere oranla, bir çok infeksiyonlara daha duyarlıdırlar. Ancak, maternal antikorlar yeni doğanlarda önemli koruyucu etkiye sahiptir. Bazı hastalıklar da gençler arasında, erginlerden daha fazladır. 3) Hormonlar: Hormonları normal çalışan bireyler, hastalıklara daha dirençli olmasına karşın, hormonal bozukluk hallerinde vücut duyarlı hale gelmektedir. Ayrıca, hormon tedavileri de, doz ve süre iyi ayarlanmazsa, vücut direncinde azalmalara yol açmaktadırlar. 4) Beslenme: Yeni doğanlar için çok gerekli olan kolostrum ve spesifik antikorlar yanı sıra vitamin, karbonhidrat, yağ, protein, mineraller ve bazı sitokinler (TNF-a, TGF-b, IL-1b, vs) yönünden oldukça zengindir. Bu nedenle, neonatallar için çok gerekli bir besini oluşturur ve hayatın ilk günlerinde çeşitli bakteriyel, viral ve mantar infeksiyonlarına karşı koruma sağladığı gibi direnci de arttırır. Dengeli beslenmenin çeşitli infeksiyonlara karşı korumada çok önemli rolü vardır. Yetersiz gıda ve iyi beslenememe vücudun direncini zayıflattığı gibi antikor yapımına da olumsuz yönde etkiler. 5) Diğer fizyolojik faktörler: Öksürük, tıksırık, barsak peristaltiği, urinasyon, defekasyon, burun akıntısı, deskuamasyon, solunum sistemindeki siliar aktivite vs. gibi fizyolojik olgular mikroorganizmaların dışarı atılmasında önemli rollere sahiptirler. Primer Savunma Mekanizması Bir çok önemli ve nonspesifik komponentin işbirliği ile gerçekleştirilen bu savunma sisteminin, dışardan girebilecek her türlü hastalık yapıcı ajanlara karşı vücudu korumada önemli rolü vardır. Konakçı duyarlı, çevresel koşullar uygun ve mikroorganizmalar da virulent olsalar bile, yine bu sistem bütün elementleri ile direnç göstererek etkenlerin girmesine, kolonize olmasına ve yayılmasına mani olmaya çalışır. Primer savunma mekanizması, genelde, vücut yüzeyinde ve mukoz membranlarda aktivite gösterdiğinden, buna aynı zamanda tam karşılığı olmasa bile, dış savunma sistemi de denilmektedir. Bu savunmada rolleri olan başlıca faktörler aşağıda bildirilmiştir. 1) Tüyler: Hayvanların derisi üzerinde bulunan yapağı, tüy, yün veya kıl örtüsü bir çok tehlikeli mikroorganizmanın vücuda girmesine mani olduğu gibi, derinin yaralanmasına ve bütünlüğünün bozulmasına da karşı koymaktadır. Bu örtü, ayrıca, deri ve vücudu, aşırı soğuk ve sıcaktan, mekanik, fiziksel, kimyasal diğer faktörlerin zararlı etkisinde de korumaktadır. 2) Deri: Sağlam derinin epitel örtüsü mikroorganizmaların girişini önleyen önemli ve iyi bir bariyerdir. Bu epitel katmanının yaralanmaması ve bütünlüğünün bozulmaması gereklidir. Birçok patojenik mikroorganizma sağlam deriden geçememektedir. Ancak, bazıları (leptospiralar, brucellalar, vs) su ile yumuşamış sağlam deriden girerek infeksiyon meydana getirebilmektedir. Deride oluşan her türlü mikroskobik veya makroskobik lezyonlar mikroplar için uygun birer porantredirler. Fakat, her mikroorganizmanın infeksiyon oluşturabilmesi için virulensi yanı sıra, vücuda uygun bir yoldan ve yeterli miktarda da girmesi gerekmektedir. Örn, Mycobacterium tuberculosis ve B. anthracis insanlara deriden girerse, burada lokalize olabilir ve generalizasyon meydana gelmeyebilir. Stafilokok ve streptokoklar için de benzer durum söz konusudur. Deride bulunan ter ve yağ bezlerinin salgıları, bir çok patojenik mikroorganizmanın deride lokalize olmasına ve deriden içeri girmesine mani olurlar. Bu salgılar, mikroorganizmalar üzerine inhibitör veya öldürücü etkiye sahiptirler.Yağ bezi salgısının içinde bulunan doymamış uzun zincirli yağ asitleri (oleik asit gibi) hem deri yüzey pH’sını (3.5-5.5) düşürür ve hem de mikroplar üzerine antibakteriyel bir etki yapar. Sebumda bulunan kaproik ve kaprilik asitler bakterisidal bir etkiye sahiptirler. Terdeki laktik asit ve lizozim de benzer tarzda etkide bulunurlar. Terin içinde bulunan tuz konsantrasyonu da yüzeyde yüksek bir ozmotik basınç meydana getirir. Deri üzerindeki yerleşik mikrofloranın antagonist etkisi birçok patojenik etkenin kolonize olmasını önler. Deride komensal olarak bulunan C. acnea ’nin, özellikle S. aureus ve S. pyogenes gibi mikroorganizmalar üzerine bakteriostatik etkisi vardır. Deskuamasyon da deri üzerinde yerleşik mikroorganizmanın bir kısmının atılmasında büyük bir etkinlik gösterir. Derinin yıkanması veya dezenfekte edilmesi, folliküllere ve yağ bezlerine kadar girmiş olan etkenleri tam olarak elimine edemez. Derinin yukarıda belirtilen koruyucu etkinliği yanı sıra, immunolojik yönden de savunmaya katkısı olmaktadır. Özellikle, antijen işleyen ve sunan dendritik karakterdeki makrofajların (Langerhans hücreleri), T-hücrelerine (Th-lenfositleri) antijen sunmada ve salgıladıkları İL-1 ile de B- ve T- hücrelerini uyarmada önemli rolleri bulunmaktadır. 3) Mukoz membranlar ve salgıları: Sağlam mukozal yüzeyler, genellikle, bazı mikroorganizmalar için uygun giriş kapıları olarak düşünülmemektedir. Mikroorganizmaların içeri girmeleri için, önce mukus bariyerini geçmesi ve sonra da epitel hücrelere temas ederek onlara tutunması gerekmektedir. Eğer mukozal yüzeylerde, çeşitli nedenlerden ileri gelen porantreler varsa, mikropların girişi çok daha kolay olur. Vücutta bazı bölgelerdeki mukoz membranlar (ağız, yemek borusu, mide) çok katlı epitel hücrelerden oluştuğundan hastalık ajanlarına girişlerine karşı daha fazla direnç gösterirler. Solunum, sindirim ve ürogenital sistemlerin mukozaları üzerinde mukoid salgı daha fazla bulunmaktadır. Bunların koruyucu etkisi oldukça fazladır. Mukoz membranların yüzeyini örten mukoid tabaka (Mukus, MA: 530000) ve bunun devamlı hareket halinde olması mikropların hücrelerle direk temasını zorlaştırır. Birbirlerine disülfid bağlarla birleşmiş bir glikoprotein yapısında olan mukus, ayrıca, siliar aktivite nedeniyle de bir hareket hali gösterir. Ancak, piluslara sahip olan etkenler ile hareketli patojenik mikroorganizmalar bu mukoid tabakayı bazı noktalardan kolayca geçerek epitel hücrelerine ulaşabilirler. Ayrıca, mukoid katmanın zayıf olduğu yerler de bulunduğundan, buralardan hareketli veya hareketsiz bir çok mikroorganizma epitel hücrelerine tutunabilirler. Bu salgı tabakasının içinde bulunan bazı antibakteriyel substanslar (lizozim, sİgA, enzimler, mikrobial flora, fibronektin, vs) birçok etkenin kolonize olmasını önleyecek bir karakter gösterir. Bu aktivitede sİgA’ların özel bir yeri ve önemi vardır. Bazı mikroorganizmalar (N. meningitidis, N. gonorrhoea, H. influenzae, S. pneumonia, vs) salgıladıkları bazı maddelerle (sİgA protease), özellikle, sİgAl’in yapısını bozarak etkisiz hale getirir. Bu enzim, immunglobulini Fab- ve Fc-porsiyonlarına ayırır. Bazı bakteriler de (Bacterioides asaccharolyticus, B. melaninogeniscus) sİgAl, sİgA2 ve İgG yi ayrıştıracak enzim sen¤¤¤lerler. Barsaklarda yerleşik bulunan anaerobik mikroorganizmalardan kaynaklanan yağ asitleri, bazı salmonella ve shigella türlerinin üremelerini inhibe ettiği belirtilmiştir. Glisin ve taurin bileşikleri halinde sen¤¤¤lenen safra tuzlarının, barsakta anaerobik mikroorganizmalar tarafından kompleks safra kompozitlerine dönüştürülmesi, Bacteroides fragilis ve C. perfringens, laktobasil ve enterobakterilerin üzerine inhibitör etkisi bulunmaktadır. 4) Mikrofloranın etkinliği: Vücutta mukozal yüzeylerden (solunum sistemi, sindirim sistemi, ürogenital sistemlerin mukozaları ve göz konjunktivası yerleşik olarak bulunan ve bu yüzeylere daimi mikroflorasını oluşturan çeşitli tür ve sayıda mikroorganizmalar bulunmaktadır. Bunlar birbirleriyle kompetasyon (rekabet) halinde yaşayarak bir denge kurmuşlardır. Bu duyarlı denge, mikroorganizmaların salgıladıkları çeşitli türden antimikrobial substanslarla (bakteriyolisinler, lizozim, diğer enzimler, sIgA'lar, yağ asitleri, safra tuzları, vs) birbirlerinin üremelerinin belli limitler içinde kalmasını sağlarlar. Ayrıca dışardan gelen patojenik ve apatojenik etkenlerin de yerleşmesine mani olurlar. Bu dengenin bozulduğu durumlarda bazıları üreyerek konakçısını hastalandırabilirler.

http://www.biyologlar.com/infeksiyonun-mekanizmasi

Hamilelikte antidepresan kullanımı, çocukta otizm riskini arttırıyor

Hamilelikte antidepresan kullanımı, çocukta otizm riskini arttırıyor

JAMA Pediatrics dergisinde yeni yayımlanan bir araştırmanın sonuçlarına göre, hamilelik sırasında antidepresan kullanılmasının otizm riskini büyük ölçüde arttırdığı saptandı. Prof. Dr. Anick Bérard, tarafından yürütülen çalışmada, hamilelikte ilaç kullanan 145 bin gebe değerlendirildi. Montreal Üniversitesi ve CHU Sainte-Justine Çocuk Hastanesi’nde yapılan bir araştırmanın sonuçlarını değerlendiren Prof. Dr. Bérard, “Otizme sebep olan etkenlerin çeşitliliği halen belli olmamasına rağmen, bu problemde hem genetik hem de çevre faktörü rol oynamaktadır. Çalışmamızda hamileliğin ikinci veya üçüncü trimesterinde alınan antidepresanların, çocuklara otizm riskin iki katına çıkarttığını gözledik” diyor Quebec Hamilelik Kohort çalışmasında alınan veriler on yaşına kadar 145,456 çocuktan alınan veriler incelendi. Annelik ve depresyonun otizmle ilişkilendirildiği biliniyor. Ayrıca sosyo ekonomik durum da değerlendirildi. Prof. Berard sonuçlarla ilgili olarak, “Antidepresan maruziyetini anneden gelen (genetik)  veya artan antidepresan kullanımı hamileliğin ikinci–üçüncü trimesteri boyunca incelendi. Bu periyotta kritik beyin gelişimi gerçekleştiği için seçildi” diyor .Annelik ve depresyonun otizmle ilişkilendirildiği biliniyor. Ayrıca sosyo ekonomik durum da değerlendirildi. Bütün çocuklar arasında yapılan araştırmada, sonradan otizm teşhisi konulan çocuklar atipik otizm, Asperger sendromu ve yayılmış gelişimsel bozukluklara bakıldı. Sonuç olarak bu iki grubun istatiksel ilişkisi incelendi ve riskin % 87 arttığı gözlendi. Bu sonuçlar uzmanlar tarafından teşhis edilen çocuklarda değişmeden kaldı.Elde edilen bulgular çalışmada, otizm teşhisi konulan 1,054 çocuğun annelerinin hamilelikte antidepresanla tedavi edildiği görüldü. Ayrıca 1966’da 10,000’de 4 olan otizm riskinin, bugün 10,000’de 100’e çıktığı tespit edildi. Tabi bu artışta daha iyi teşhis ve otizm çeşitlerinin artışı da rol oynasa da, araştırmacılar çevresel faktörlerin de rol oynadığını belirtiyor. Serotonin rahimde hücre bölünmesi, nöron göçü, hücre farklılaşması ve sinaptogenesis gibi pek çok prosesi etkiliyor. Bazı depresanlar serotoninin inhibisyonu üzerinden işlediğinden, rahim içinde fetüsün beyin gelişimine negatif etki gösterebilir . Bu uzun süreli çalışma sayesinde gebelikte antidepresan kullanımının çocuklar üzerindeki uzun süreli nörogelişimsel etkilerini aydınlatıyor. Yazının Türkçe orijinali için; Gerçek BilimReferans: Takoua Boukhris, Odile Sheehy, Laurent Mottron, Anick Bérard.Antidepressant Use During Pregnancy and the Risk of Autism Spectrum Disorder in Children. JAMA Pediatrics, 2015; 1 DOI:10.1001/jamapediatrics.2015.3356

http://www.biyologlar.com/hamilelikte-antidepresan-kullanimi-cocukta-otizm-riskini-arttiriyor

Sosis Ve Kanser ilişkisi

Sosis Ve Kanser ilişkisi

Çocukluğumda sosisli sandviçe bayılırdık! Okuldan sonra sadece mikrodalgaya atılıp sandviçin arasına biraz sos koyarak hazırlanan ve hazırlaması gerçekten çok pratik ve çabuk bir yiyecektir. Ayrıca gerçekten de lezzetlidir!Tabii pikniklerde de mangalların vazgeçilmezidir. Evet, sosis bu kadar lezzetli bir üründür. Fakat madalyonun diğer yüzünü bilmek de çok önemli. Sağlık boyutunu!Amerika’’da bir gazetede yayınlanan bir makalede, kanser araştırma enstitüsünde yapılan bir araştırma da ayda 12’’den fazla sosisli sandviç tüketen çocuklarda lösemiye yakalanma riski 9 kat daha fazla olduğu bildirilmiştir. Kanserden korunma ve kanser sebeplerini araştıran aynı enstitüde ayrıca; haftada en az 1 sosisli sandviç tüketen annelerin ve anne hamile kalmadan önce sosisli sandviç tüketen babaların çocuklarında beyin tümörü oluşma riskinin iki kat arttığı bildirilmiştir.Peter ve arkadaşları; tüketilen bazı gıdalarla lösemi arasındaki bağlantıyı araştırmışlar ve 10 yaşındaki çocuklarda sosisi sıklıkla tüketen çocuklarda lösemiye yakalanma risklerinin arttığını belirlemişlerdir.Ayrıca yukarıda da belirttiğim gibi sosis tüketen hamile kadınların çocuklarında ve haftada 1 yada daha fazla sosis tüketen çocuklarda beyin tümörü riskinin iki kat arttığı belirlenmiştir.•Sosisler Kansere Nasıl Sebep Olur?Sosilerde bulunan Nitrit ve Nitrat katkıları sosis ve salam gibi işlenmiş et ürünlerinde etteki pembe rengin stabilitesini sağlamak için konulmaktadır. Ayrıca botulinum bakterisinin gelişmesini engelleyerek botulizmle savaşmaktadır. Ancak mevzuatta belirlenen limitler aşıldığında gıda ürününde ve vücuda alındığında kanserojenik bileşenlere dönüşmektedir. Pişirme işlemi boyunca nitritler, ette doğal olarak bulunan aminlerle birleşerek karsinojenik N-nitrozo bileşenleri oluştururlar. Ayrıca pişirme prosesinin yanında nitrit ve aminlerin midede de N-nitrozo bileşenlere dönüşebildiği düşünülmektedir. Bu bileşenlerin karsinojen olduğu ve ağız boşluğu, mesane, yemek borusu, yutak, mide ve beyin kanseri ile ilişkili olduğu bilinmektedir.•Bazı Yeşil Bitkilerde De Nitrit Bulunmaktadır. Peki Onlar Da Kanseri Tetikler Mi?Özellikle ıspanak, kereviz ve marul gibi pek çok yeşil yapraklı sebzede de nitrit bulunduğu bilinmektedir. Fakat buna rağmen bu bitkiler tüketildiğinde tam tersine kanser riskini ve etkilerini azaltmaktadırlar. Bu nasıl mümkün olabilmektedir? Bu durum şöyle açıklanabilir; nitritler, N-nitrozo amin formuna sadece ette doğal olarak bulunan aminlerle reaksiyona girdiğinde dönüşürler. Ayrıca sebzelerde bulunan C ve D vitaminleri N-nitrozoamin formlarının inhibisyonuna yardımcı olmaktadırlar. Sonuç olarak doğal olarak nitrit içeren sebzeler tamamen sağlıklıdır ve tüketildiklerinde kanser riskini azaltmaktadırlar.•Nitrit İçeren Başka Gıda Ürünleri De Bulunmakta Mı?Kürlenmiş bütün etler, balık, kırmızı et vb. nitrit içermektedir.•Bütün Sosisler Nitrit İçermekte Midir?Hayır. Bütün sosisler nitrit içermek. Gelişen soğutma teknolojileriyle birlikte nitrit katkı maddesinin ilavesi artık mikrobiyel gelişimi önlemek için kullanılmamaktadır. Mikrobiyel gelişim, artık farklı soğutma teknikleri ile önlenebilmektedir. Günümüzde sosiste nitrit katkısının sebebi ette tazeliğin sembolü olan pembe rengin stabilitesini sağlamak içindir. Nitrit içermeyen sosisler, lezzet olarak nitrit içeren sosislerle tamamen aynıdır. Yalnızca renkleri pembe değil, kahverengiye dönüktür rengi yüzünden tercih edilmemekte ve tüketicinin pembe renkli sosislere yönelmesine neden olmaktadır. Ancak pembe renkli albenili ve göze hoş gelen bu sosislerin aslında sağlığımızı nasıl tehlikeye attığını bilen biri artık bu sosisleri tüketmeyecektir. Çünkü artık bilinçli tüketici bilir ki nitrit içermeyen kahverengi sosisler pişirme sırasında çok daha güvenli ve sağlıklıdır.Yapmanız Gerekenler 1. Nitrit içeren sosisleri artık satın almayın. Bu özellikle küçük çocuklar ve hamile kadınlar için çok önemlidir. 2. Gittiğiniz markete özellikle nitrit içermeyen sosis varmı diye sorun -ya da kahverengi sosis olup olmadığını sorun- eğer yoksa satın almayın.Kaynakça: Kaynaklar: 1, Peters J, et al ” Processed meats and risk of childhood leukemia (California, USA)” Cancer Causes & Control 5: 195-202, 1994. 2 Sarasua S, Savitz D. ” Cured and broiled meat consumption in relation to childhood cancer: Denver, Colorado (United States),” Cancer Causes & Control 5:141-8, 1994. 3 Bunin GR, et al. “Maternal diet and risk of astrocytic glioma in children: a report from the children’s cancer group (United States and Canada),” Cancer Causes & Control 5:177-87, 1994. 4. Lijinsky W, Epstein, S. “Nitrosamines as environmental carcinogens,” Nature 225 (5227): 2112, 1970.Yazar: Buket Sağbasan http://www.bilgiustam.com

http://www.biyologlar.com/sosis-ve-kanser-iliskisi

METABOLİZMANIN REGULASYONU

Mikroorganizmaların yaşamaları ve üremeleri için beslenmeleri gereklidir. Mikroplar, çevrelerindeki gıdaları, kendileri tarafından sentezlenen ve çeşitli etkilere sahip olan enzimleri yardımı ile yaralanabilecek duruma getirirler. Bu nedenle, enzimlerin aktivitesi mikroorganizmaların hayatları için zorunludur. Ancak, bunların da zamanında ve yeterince sentezlenmeleri ve koordine bir şekilde görev yapmaları önemlidir. Bu işlem bir regülasyon veya kontrollerle gerçekleştirilir. Enzim sistemlerinin sentezlenmeleri yönünden kontrolleri canlıların en önemli bir özelliğini oluşturmakta ve değişen çevre koşullarına çok yakından bağımlı bulunmaktadır. Enzimlerin sentezlenme hızı ve miktarı ortamdaki gıda maddelerinin miktarı ve çeşidi ile ilişkilidir. Çok gereksinme duyulan enzimler yeterince ve devamlı olarak sentezlenirler ve bu devamlılık özel mekanizmalar tarafından kontrol edilirler. Bir bakteri hücresindeki bütün proteinleri sentezlemek için sayıları 600/800 'e kadar değişebilen enzime ihtiyaç vardır. En fazla gereksinim duyulan enzimler arasında proteinleri, karbonhidratları ve nükleotidlerin ayrıştırılmasında görev alanlarla, hücre duvarı, sitoplazmik membran ve ribozomların sentezlerinde vazife gören enzimlerdir. E. coli hücresinde, 20 tane amino asit sentezinde lüzumlu olan bütün enzimler bulunur. Eğer ortama amino asitler katılırsa, bakteri hücresi, bu amino asitleri sentez için, kendisi özel enzim yapma işine girişmez. Bu durum, amino asitlerin sentezlenme işinde görev alacak enzimlerin imalinde bir gerileme veya duraklama meydana getirir. Fazla ihtiyaç duyularak her zaman sentezlenen enzimler, bakteri yapısının bir parçasını oluştururlar (yapısal enzimler). Bazıları da ortamda kendi sentezlerini uyaran özel substratlar (indüktörler) bulundukları zaman sentezlenirler (indüklenebilen enzimler). Bu maddeler ayrıştıktan veya bittikten sonra enzim sentezi de sona erer. Örn. E. coli 'deki laktozu ayrıştıran betagalaktosidase enzimi (M.A. 5x105) bu türdendir. E. coli biyokimyasal olayları incelemede kullanılan çok uygun bir mikroorganizma olup, dubleks karakterindeki kromozomunda 3000'den fazla proteini şifreleyebilecek kodlara sahiptir. Proteinlerin sentezi DNA üzerinde yerleşmiş olan gen veya genler tarafından yönetilir. Normal koşullar altında, yaşam için gerekli olan enzimlerin sentezlerini yöneten genler görev yaparlar. Diğerleri ise, genellikle inaktif durumda bulunurlar. Bunlar hayat için her zaman lüzumlu olmayabilirler. Gerçekten de, kromozom üzerindeki bütün genler aktif olsaydı veya aynı anda görev yapmış olsalardı, hücre lüzumsuz ve çok sayıda enzim ve proteinlerle dolmuş olurdu. Besi yerlerindeki gıdaların ve çevresel koşulların değişmesi ile bazı genler aktive edilir, diğer bir kısmı da baskı altında tutulur. Hücre bu şekilde, kendini, değişen çevre koşullarına uydurur ve yaşamını sürdürür. Örn; E. coli gliserinli besi yerinde üretilirse, hücrede, bu substratın ayrışmasını katalize eden enzimlerde bir artma meydana gelir. Buna karşılık, diğer bir kısım enzimler ise minimal düzeyde tutulurlar. Aynı şekilde, E. coli karbon ve enerji kaynağı olarak laktozlu bir ortamda üretilirse, bu substratın ayrışmasında görev alan beta-galaktosidase enzimin (indüklenebilen enzim) sentezinde 1000 misli artma olur. Ortama katılan gliserin ve laktoz bir indüktör olup kendilerinin ayrışmasında görev alan enzimlerin sentezlerini uyarırlar. Ancak, bütün indüktörler her zaman substrat olmayabilirler: Örn, isopropylthiogalactosid (IPTG) iyi bir indüktör olmasına karşın substrat değildir. Aksine, phenyl-B-D galaktosid de bir substrat olup indüktör değildir. Bakterilerde enzim regulasyonu, DNA'dan mRNA'nın sentezi (transkripsiyon) ile başlamaktadır. Bakterilerde mRNA kısa ömürlü olup transkripsiyon bitince enzim sentezi de durmaktadır. Buna karşın sentezlenen enzim molekülleri uzun ömürlüdürler. Ancak bu proteinler de, hücrenin büyüme, gelişme, bölünme ve diğer biyokimyasal aktivitesi sonu giderek azalır ve tükenirler. Enzim indüksiyonu Mikroorganizmaların büyük bir kısmı enerji ve karbon kaynağı olarak birçok organik maddelerden yararlanırlar. Bunlardan faydalanılabilmesi ve enzim sentezi otomasyonunu çalıştırabilmesi için ortamdan bir sinyal bekler ve bunu da indüktörler sağlarlar. Örn, E. coli besi yerleri içinde bulunsun veya bulunmasın, her zaman glukozu ayrıştıracak enzimleri sentezlemesine karşın, laktoz için böyle hazırlıklı değildir. Laktozu hemen metabolize edemez veya ayrıştıramaz. Aradan belli bir sürenin geçmesi gerekmektedir. Laktozlu bir ortamda üreyen bir bakteri (E. coli), buradan alınıp tekrar laktozlu bir ortama konursa, latent dönem oluşmaz ve bakteri laktozu hemen ayrıştırmaya başlar (aradan zaman geçmemiş ise). Glukoz ve laktozlu ortamlarda ayrı ayrı üretilmiş E. coli hücresindeki enzim miktarları yönünden yapılan incelemelerde, laktozlu besi yerinde üretilmişlerde daha fazla enzimin sentezlendiği saptanmıştır. Bu enzimler arasında, beta-galaktosidase (laktozun, glukoz ve galaktoza ayrışmasını katalize eden enzim) ve galaktosid permease (laktozun hücre duvarından içeri girmesine yardımcı olan taşıyıcı enzim) önemli miktarlara ulaşmaktadır. Bundan sonra, E.coli 'nin laktoz metabolizması ile ilgili diğer bir enzim gelmektedir (transasetilase). Beta-galaktosidase ile birlikte bu enzimlerin düzeyinde de bir artma olur. Beta-galaktosidase sentezi durursa diğerlerinin üretimleri de sona erer. Bu nedenle, bu üç enzim birbirleri ile çok yakın ilişkili olup, bunların sentezlerini idare eden genler DNA üzerinde birbirine bitişik olarak sıralanmışlardır. Bu üçlü gruba (üniteye) laktoz operon (lac-operon) adı verilir. Bu enzimlerin sentezini, yapıca laktoza benzeyen suni indüktörler (thiomethylgalactosid ve isopropylthiogalactosid) kullanılarak da uyarmak mümkündür. Katabolik Represyon Katabolik aktivitede görev alan birçok enzimler bazı represyonlara maruz kalabilirler. Bir bakteri, çabuk metabolize olabilen bir karbon ve enerji kaynağı içinde üretilirse hücrede artan bir ATP birikmesi meydana gelir ve enzimlerin represyonuna yol açar. Enzimlerin baskılanması, enerji kaynaklarının daha yavaş metabolize olmasına neden olur. E. coli, laktoz ve glukozlu ortamda üretilirse ilk önce glukoz metabolize olur ve bu nedenle de beta-galaktosidase sentezi azalır. Glukoz varken, laktoz, indüktör olarak pek iş göremez. Bakteri enzimleri tarafından kolayca metabolize olan diğer substanslar da aynı tarzda etkiler ve indüklenen enzimler üzerine baskılayıcı etki yaparlar. Bu baskılamayı kaldırmak için ortama 3,5-cyclic AMP'nin ilâvesi gereklidir. Bu madde birçok bakteri hücresinde bulunur ve katabolik enzimlerin sentezi için aktivatör olarak görev yapar. Glukozun çok çabuk ayrışması hücrede ATP'nin fazla birikmesine ve cAMP'nin azalmasına yol açar. Bu da katabolik represör olarak çalışır. Örn. P. putida, glukozlu ortamda suksinat içinde olduğundan, daha yavaş ürer. Suksinat glukozdan daha etkili represördür. Son Ürün İnhibisyonu (Feedback inhibisyon) Reaksiyonları katalize eden ilk enzimlerin, metabolik yollarda oluşan son ürünler tarafından baskılanması ve sentez olayının durması, enzim regulasyon mekanizmasının diğer önemli bir türüdür. Buna enzim sentezinin represyonu da denebilir. Örn. E. coli 'de, triptofan sentetase enzimi, triptofan ve bazı analogları tarafından inhibe edilerek aktivitesine son verilir. Histidin ve leusin sentezleri de aynı mekanizma ile regule edilirler. Ortamdaki son ürünler, herhangi bir şekilde, diğer biyosentetik reaksiyonlarda kullanılmazsa, hücre içi miktarı azalır ve sentez olayları durur. Eğer sarf edilirse, sentez yine başlar. Bu baskılama genetik bir karakter taşımaz. Mutasyonlarla değiştirilebilir ve baskılama işlemi kaldırılabilir. Son ürün inhibisyonu, birçok şekilde meydana gelebilir. Lisin ve metionin sentezi ile aspartik asitten treoninin sentezi buna örnek olarak verilebilir. Bu biyokimyasal yolda, ilk enzimatik reaksiyon, aspartokinase tarafından katalize edilir. Bu enzim, bildirilen 3 son üründen (lisin, metionin ve treonin) biri tarafından inhibe edilerek sentez durdurulur. Bazı mikroorganizmalarda, bu işi 2 son ürün birlikte yapabilir (multivalent inhibisyon). İndüktöre maruz kalan hücrelerde sentez edilen enzimin maksimal bir düzeye ulaşabilmesi ve aynı şekilde represyonun da tam etkileyebilmesi için birkaç neslin geçmesi gereklidir.

http://www.biyologlar.com/metabolizmanin-regulasyonu

Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu

Bir mikroorganizmanın gelişmesini en az düzeyde engelleyecek konsantrasyon. Genel olarak antimikrobik etki yapan kimyasallar için kullanılmakla beraber, gelişmenin minimum düzeyde etkilendiği yüksek ya da düşük inkübasyon sıcaklığı gibi fiziksel +faktörler için de kullanılır. MİK sunum umarım işinize yarar www.tmc-online.org/userfiles/file/konya_..._adts_sunumlar/6.pdf

http://www.biyologlar.com/minimum-inhibisyon-konsantrasyonu

ANTİBİYOTİK KULLANIMINDA GENEL PRENSİPLER

Antibiyotikler tedavide en çok kullanılan ve kullanımında en çok hata yapılan bir ilaç grubudur. İnsan vücudunun her organında enfeksiyon gelişebileceğinden her daldaki hekimin antibiyotik kullanımını iyi bilmesi gerekir. Antibiyotiklere direnç gelişimi ve tedaviye yeni antibiyotiklerin girmesi gibi nedenlerle de bilgilerin devamlı yenilenmesi zorunludur. Antibiyotik kullanımında dikkat edilmesi gereken kuralları şöyle sıralayabiliriz.1. Antibiyotik kullanma gerekliliğinin saptanmasıHastanın bir bakteriyel enfeksiyonu olmalıdır ya da profilaktik antibiyotik kullanımının gerekli olduğu bir durum olmalıdır ( cerrahi profilaksi, romatizmal ateş profilaksisi, kalp kapak hastasında invazif girişimler öncesi profilaksi gibi). Bakteriyel enfeksiyon olduğunu kanıtlayabilmek için mikroorganizmanın kültürde üretilmesi, değişik boyama yöntemleri ile bakterinin mikroskopik inceleme ile gösterilmesi, antijen ve antikor saptayan serolojik testler kullanılabilir. Klinik bulgular bazı bakteriyel enfeksiyonlar için tipik olmakla birlikte güvenilir değildir. Aynı klinik bulguları başka mikroorganizma enfeksiyonları veya enfeksiyon dışındaki hastalıklar da verebilir.Antibiyotiklerin etken izole edilip, duyarlılık testine göre ya da diğer laboratuvar testleri ile kanıtlanarak kullanılmasına kanıtlanmış bakteriyel enfeksiyon tedavisi denir.Ampirik antibiyotik tedavisi ise olası enfeksiyon etkenleri ve duyarlılık durumuna göre verilen tedavidir. Ampirik tedavi toplum kökenli ciddi enfeksiyonlar ( menenjit, sepsis), nozokomiyal ve nötropenik hastadaki enfeksiyonlarda erken antibiyotik verilmesinin yaşamsal önemi nedeniyle yapılmalıdır.Rutin kültür alınması, invazif girişim gerektirdiğinden önerilmeyen ve olası etkenleri bilinen enfeksiyonlarda( akut otit, akut sinüzit, beyin apsesi, osteomyelit) da ampirik tedavi tercih edilir. 2. Uygun antibiyotiğin seçilmesiBu aşamada mikroorganizma, hasta ve antibiyotikle ilgili faktörler gözden geçirilmelidir.Mikroorganizma ile ilgili faktörler.Hastalık etkeni nedir? İlk yanıtlanması gereken soru budur. Etkenin belirlenmesi için çeşitli yöntemler vardır. Gram boyası bunların en basiti olup, halen enfeksiyon tanısında altın standarttır. Örneğin pnömonide balgamın Gram boyasında PNL ve gram pozitif diplokokların görülmesi, pnömokoksik pnömoni tanısı için çok değerlidir. Akut bakteriyel menenjitte BOS un Gram boya ile incelenmesi yine etkenin erken tanımlanması açısından yararlıdır. Dışkıda PNL bulunması invazif bir ishal etkenini düşündürür. PNL yoksa toksik veya viral bir gastroenterit olabilir.Etkeni belirlemede esas yöntem kültürdür. Antibiyotik başlamadan önce mutlaka yapılmalıdır. Kültür ve başka bir laboratuvar incelemesi yapma olanağı yok ise o zaman genel bilgilerden yararlanılır. Erişkin akut bakteriyel menenjitli bir hastada olası etkenlere ( meningokok, pnömokok) yönelik tedavinin başlanması örnek olarak verilebilir.Mikroorganizma ile ilgili değerlendirilmesi gereken diğer faktörler virulansı ve nozokomiyal ya da toplum kökenli bir mikroorganizma oluşudur. Çünkü nozokomiyal patojenler antibiyotiklere daha dirençlidir. Etken bakterinin antibiyotik duyarlılık durumu nedir? Yanıtlanacak ikinci sorudur.Etken izole edilmişse antibiyotik duyarlılık testi yapılarak uygun antibiyotik belirlenebilir.Bu amaçla aşağıdaki yöntemler kullanılır.Disk difüzyon yöntemi; hızlı üreyen aerob ve fakültatif anaerob bakteriler için önerilen, kolay, pratik, standartlara uygun yapılırsa halen tüm dünyada rutin laboratuvarlar için seçilen bir testtir.Antibiyotiğin inhibisyon etkisini ölçen kalitatif bir testtir.Minimal inhibitör konsantrasyon ( MIC ) ölçümü, Özel durumlarda (yeni antibiyotiklerin etkinlik araştırması, penisiline dirençli pnömokokların belirlenmesi gibi) yapılır Bu test te inhibisyonu ölçer, ancak kantitatif bir testtir.Minimal bakterisidal konsantrasyon (MBC) ise kantitatif ve bakterisidal etkiyi saptayan bir testtir. Rutinde kullanılmaz. Ancak nötropenik hasta gibi özel konakta, menenjit ve endokarditte tedavi başarısızlığında yapılması gerekebilir.Antibiyotik duyarlılık testi yapılamıyorsa etkenin veya olası etkenin duyarlılık durumuna göre antibiyotik başlanabilir. Bu durumda genel bilgilerden, ülkemizde yapılan çalışmalardan ve hastane enfeksiyonları için hastanede saptanan mikroorganizmaların duyarlılık durumunu içeren yerel verilerden yararlanılabilir. Hasta ile ilgili faktörlerYaş Böbrek fonksiyonları yaşla ilgili farklılıklar gösterir. Atılımı böbrekten olan antibiyotiklerin serumdaki yarı ömürleri yenidoğanlarda daha fazladır. Çünkü böbrek fonksiyonları yetersizdir. İlacın dozu buna göre ayarlanmalıdır.Yaşlılarda böbrek fonksiyonları dahil fizyolojik olaylarda gerileme vardır. BUN ve kreatinin değerleri normal olsa bile kreatinin klirensi düşüktür. Antibiyotiklere bağlı böbrek toksisitesi ( aminoglikozid toksisitesi gibi) bu nedenle daha sık görülür.Yaşlılarda izoniazid hepatotoksisitesi daha sıktır. Hipersensitivite reaksiyonları da daha sık görülür.Yeni doğanda hepatik fonksiyonlar yetersizdir. Glukronil transferaz enziminin yetersizliği nedeni ile kloramfenikol kullanılması halinde Gray sendromu adı verilen şok ve kardiyovasküler kollapsla seyreden bir tablo gelişebilir. Yeni doğanda sulfonamid ve seftriakson kullanılması kern ikterus tablosuna yol açar. Çünkü bu antibiyotikler proteine bağlanmakta bilirubinle yarışır. Sonuçta bağlanmamış bilirubin düzeyi artar.Tetrasiklinler gelişmekte olan kemik ve diş dokusunda biriktiği için 8 yaşından küçük çocuklarda kullanılmamalıdır. Kinolonlar kıkırdak toksisitesi ve artropati riski nedeniyle 16 yaşından küçüklerde önemli bir endikasyon olmadıkça kullanılmamalıdır.Çocuklarda mide asiditesi düşüktür. Bu nedenle 3 yaşından küçük çocuklarda ve aklorhidrik hastalarda antibiyotik absorbsionu artar.Genetik ve metabolik bozukluklarGlikoz 6 fosfat dehidrogenaz ( G6PD) eksikliği olanlarda sülfonamidler ve kloramfenikol hemolize yol açar. Bazı hemoglobinopatilerde de sülfonamid kullanımı hemoliz riski nedeniyle sakıncalıdır.Diyabetli hastalarda antibiyotiklerin IM absorbsiyonu azalabilir.İdrarda yalancı şeker pozitıfliği görülebilir.Gebelik ve laktasyon Gebelikte penisilinler ( tikarsilin dışında ), sefalosporinler ve makrolidler kullanılabilecek antibiyotiklerdir. Tetrasiklinler teratojen etkisi yanı sıra gebede karaciğer nekrozu, böbrek yetmezliği ve pankreatitle seyreden ağır bir tabloya yol açabildiğinden kontrendikedir. Emziren anneden çocuğa geçen antibiyotik yan etkilere yol açabilir. Bu durum özellikle yenidoğanda sakıncalı antibiyotiklerin kullanımı ve bebeğin prematüre olması halinde çok önemlidir. İmmünsüpresyonİmmün süpresyonun durumuna göre olası etkenler farklıdır. Normal konakta hastalık oluşturmayan mikroorganizmalar etken olabilir. İmmün süpresif hastada ilaç toksisitesi daha çok görülür. Antibiyotikleri daha yüksek dozda, parenteral yoldan ve uzun süre vermek gerekebilir. Aşırı duyarlılıkKullanılacak antibiyotikle ilgili daha önce bir allerjik reaksiyon olup olmadığı sorgulanmalı ve seçim buna göre yapılmalıdır. Karaciğer ve böbrek fonksiyonları Antibiyotiklerin başlıca atılım yolları böbrek ve karaciğerdir. Antibiyotik kulllanılan  hastada ilacın atılım yolları dikkate alınarak , hastanın karaciğer ve böbrek fonksiyonları  araştırıldıktan sonra antibiyotik seçilmeli ve hasta toksisite açısından yakından izlenmelidir. Karaciğerde metabolize olan ilaçlar ( eritromisin, klindamisin,doksisiklin, nafsilin, seftriakson) böbrek yetmezliğinde doz ayarlamadan kullanılabilir. Bazı  antibiyotikler böbrek yetmezliğinde kreatinin klirensine göre dozları ayarlanarak kullanılabilir ( penisilinler, sefalosporinler, aminoglikozidler, glikopeptidler).Bazıları ise  kontrendikedir( tetrasiklin ).Karaciğer patolojisi olan hastalarda makrolidler, klindamisin,  kloramfenikol, doksisiklin dikkatle kullanılmalıdır. Antibiyotikle ilgili faktörler Antibiyotik seçiminde ilk dikkat edilecek konu seçilen antibiyotiğin kanıtlanmış veya olası bakteri için invitro etkin olmasıdır. Diğer bir konu ise klinik çalışmalarda seçilen antibiyotiğin bu enfeksiyon için etkinliği kanıtlanmış olmalıdır. Antibiyotiğin farmakokinetik özellikleri iyi bilinmelidir. Farmakokinetik ilacın absorbsiyonu, vücut kompartmanlarına dağılımı ve eliminasyonunu içerir. Kısaca invitro ideal koşullarda test ettiğimiz antibiyotiğin invivo koşullarda ne derece etkin olabileceğini tahmin etmemiz için farmakokinetik özelliklerini dikkate almamız gerekir.Diğer önemli bir konu ise antibiyotiklerin farmakodinamik özellikleridir. Etki mekanizması ve toksisite konularını içerir. Antibiyotiklerin bazıları bakteriyostatiktir, başka bir deyişle bakterinin çoğalmasını inhibe ederler ( klindamisin, kloramfenikol gibi). Bazıları ise bakterisidaldir. Bakterileri öldürürler. Bakterisidal etki antibiyotiklerde farklı özellikler gösterir. Konsantrasyona bağlı bakterisidal etki gösteren antibiyotiklerin dozları arttırılınca bakterisidal etkileri artar. Aminoglikozidler ve kinolonlar bu özellikleri nedeniyle günde tek doz kullanılabilirler. Süreye bağlı bakterisidal etki gösteren antibiyotiklerde, MBC üzerindeki düzeyin sürdürülmesi bakterisidal etki için gereklidir. Dozu arttırmanın bir yararı yoktur. Betalaktam antibiyotikler ve glikopeptidler böyledir.Postantibiyotik etki ( PAE) ilaç düzeyi MBC altına düştükten sonra da bir süre etkinliğin korunmasıdır. Kinolon ve aminoglikozidler 1-6 saat süre PAE etki gösterebilirler.İlaç konsantrasyonu arttıkça PAE artar. Karbapenemler de gram negatif bakterilere 2 saat süre PAE göstermektedir.Antibakteriyel ilaçlar mikroorganizma miktarının az olduğu erken dönemlerde daha etkilidir.Betalaktam ilaçlar bakterilerin hızlı üreme evresinde daha etkilidir.Oysa kinolonlar stasyoner evrede de etkilidir. Antibiyotik yan etkileri çok farklı organlarda görülebilir ( böbrek, karaciğer, kemik iliği, santral sinir sistemi gastrointestinal sistem) Bazı antibiyotiklerin birlikte kullanılan ilaçlarla etkileşerek toksisiteleri artar ve emilimleri bozulabilir.Antibiyotiklere direnç sorunuDirenç bir bakterinin antimikrobiyal ilacın öldürme veya üremeyi durdurucu etkisine karşı koyabilme yeteneğidir.Bakteriler antibiyotiklere doğal dirençli olabilirler ya da kazanılmış direnç gelişebilir.Bakterilerin antibiyotiklere direnç geliştirme mekanizmalarıHedef Değişikliği Bu mekanizma ile ilacın bağlandığı reseptör veya bağlanma bölgesinde değişiklikler sonucu direnç gelişmektedir.Hedef değişikliği , beta laktamlar ( Penisilin bağlayan proteinler (PBP) de değişiklik sonucu ilaca afinite azalması S. aureus, S. pneumoniae, N. meningitidis, E. faecium da penisilin direnci görülebilir.), kinolon, glikopeptid, makrolid, tetrasiklin ve rifampisine direnç gelişmesinde önemlidir. Enzimatik inaktivasyon Başta beta laktam ilaçları inaktive eden beta laktamazlar pek çok gram pozitif ve gram negatif bakterilerde direnç gelişiminde önemli rol oynar. Aminoglikozidleri inaktive eden asetilaz, adenilaz ve fosforilaz enzimleri, kloramfenikolü inaktive eden asetil transferaz ve eritromisini inaktive eden esteraz enzimleri de enzimatik dirençte önemli rol oynar.Bakteriyel membran değişiklikleriİç ve dış membran permeabilitesindeki değişikliklere bağlı olarak ya ilacın hücre içine alımındaki azalmadan ya da ilacın hızla dışarı atılmasını sağlayan aktif pompa sistemlerinden kaynaklanan dirençtir.Gram negatif bakterilerin dış membranlarındaki porin kanallarındaki değişiklikler özellikle P. aeruginosa nın beta laktam ilaçlara direnç kazanmasında önemli bir mekanizmadır. Dış zar geçirgenliğinin azalması kinolon ve aminoglikozid direncinde de önemlidir.İç membran ya da sitoplazmik membran geçirgenliğinin azalması aminoglikozidlere direç gelişmesinde önemli bir mekanizmadır.Aktif pompa sisteminden kaynaklanan direnç tetrasiklinler, kinolonlar,makrolidler, kloramfenikol ve beta laktamlara dirençte etkilidir ve pek çok bakteride bulunur. Antibiyotiklerin uygunsuz ve gelişigüzel kullanımı ile gerek toplum kökenli gerekse de hastane kökenli enfeksiyonların tedavisinde önemli sorunlar yaşanmaktadır.Gelişigüzel antibiyotik kullanımının sakıncaları:• Direnç gelişimi• Toksik ve allerjik etkiler• Hastalık tanısının maskelenmesi• Yüksek maliyet• Sonuç alınmada gecikme. Hekime ve ilaca güvensizlik• Süper enfeksiyon ( Dirençli bakterilere bağlı yeni enfeksiyon gelişimi)Antibiyotik tedavisinde başarısızlık. Bu sonuca ulaşmak için hastada klinik düzelme görülmemesi veya hastanın klinik olarak kötüleşmesi gerekir. Bu durumda aşağıdaki durumlar düşünülmelidir.• Hastalık tanısı doğru değildir. ( Hastanın bakteriyel enfeksiyonu yoktur, ya da enfeksiyon dışında bir hastalığı vardır.)• Mikroorganizma doğru tanımlanmamıştır.• Polimikrobiyal ( aerob- anaerob) enfeksiyon vardır.• Bakteri tedavi sırasında direnç geliştirmiştir.• Süper enfeksiyon gelişmiştir.• Antibiyotik enfeksiyon yerine ulaşamamaktadır.• Yetersiz doz, yetersiz süre veya uygun olmayan veriliş yolu kullanılmıştır.Antibiyotik kombinasyonlarıBirden fazla antibiyotiğin birlikte kullanılmasıdır. Antibiyotik kombinasyonları; aditif ( İlaçların etkisi tek başına kullanıldıklarında elde edilen etkilerinin toplamı kadardır.), sinerjik (İlaçların toplam etki üzerinde bir antibakteriyel etkinlik göstermesidir) antagonistik( İlaçların toplamlarından daha düşük bir etkinlik göstermesidir) etki ile sonuçlanabilir.İdeali sinerjik etki sağlamak ve antagonistik etkiden kaçınmaktır. İmmün sistemi normal konakta birçok enfeksiyon tek bir antibiyotikle tedavi edilebilir. Antibiyotik kombinasyonları ancak gerekli olduğu durumlarda yapılmalıdır. Bu durumlar aşağıda belirtilmiştir.• Sinerjik etki sağlamakKlinik olarak sinerjik etkisi kanıtlanmış kombinasyonlar kullanılmalıdır. Beta laktam ve aminoglikozid kombinasyonları, beta laktam ve beta laktamaz inhibitörü kombinasyonları, trimetoprim ve sulfametoksazol kombinasyonları sinerjik kombinasyonlardır.• Ciddi enfeksiyonların başlangıç tedavisi olarak daha geniş bir spektrum elde etmek• Direnç gelişimini önlemek Tüberküloz ilaçları direnç gelişimini önlemek ve sinerjik etkileri nedeni ile kombine kullanılır.• İlaçları daha düşük dozda kombine ederek toksisiteyi azaltmak Cryptococcus neoformans menenjitinde amfoterisin B ve 5-flusitozinin düşük dozlarda kombinasyonu klinik olarak etkinliği kanıtlanmış bir uygulamadır.• Polimikrobiyal enfeksiyonların tedavisiAspirasyon pnömonisi, akciğer ve beyin apseleri, abdominal enfeksiyonlar ve diyabetik ayak enfeksiyonları aerob ve anaerob bakterilerin etken olduğu enfeksiyonlardır. Tek bir antibiyotikle bu spektrum kavranamazsa aerob-anaerob etkili iki ilaç kombine edilir. Antibiyotik kombinasyonları yaparken antagonistik etkiden kaçınılmalıdır.Penisilin tetrasiklin kombinasyonu antagonistiktir. Eritromisin, kloramfenikol, linkomisin ve klindamisin kendi aralarında antagonistiktir. Penisilin ve kloramfenikol kombinasyonu invitro antagonistik iken invivo,örneğin menenjit tedavisinde yüksek dozlarda bu etki görülmez. ANTİBİYOTİKLERİN KLİNİK KULLANIMLARI Bu başlık altında klinik kullanımda olan bazı antibiyotiklerin etki spektrumları, seçildiği enfeksiyon hastalıkları, önemli yan etkileri ve mikroorganizmaların bu antibiyotiklere geliştirdikleri direnç şekilleri ele alınacaktır. BETA LAKTAM ANTİBİYOTİKLER Beta laktam antibiyotiklerin hepsi 4 üyeli β- laktam halkasına sahiptir. Bakterilerin hücre duvarı sentezini inhibe ederek etki ederler. Bu grupta penisilinler, sefalosporinler, karbapenemler ve monobaktamlar yer almaktadır. PENİSİLİNLER Penisilin grubu aşağıdaki başlıklar altında ele alınacaktır. Doğal penisilinler Penisilin G Penisilin VPenisilinaza dirençli penisilinler (oksasilin, dikloksasilin, nafsilin, metisilin)Aminopenisilinler ( ampisilin, amoksilin)Karboksi penisilinler Karbenisilin TikarsilinGeniş spektrumlu penisilinler Azlosilin Mezlosilin PiperasilinBeta laktam-betalaktamaz inhibitörü kombinasyonları(Ampisilin-sulbaktam, amoksisilin- klavulanik asit, tikarsilin-klavulanik asit, piperasilin-tazobaktam) Doğal penisilinlerEtki spektrumuGram pozitif koklar A grubu streptokoklar,viridans streptokoklar, Streptococcus pneumoniae (dirençli suşlar coğrafi farklılıklar gösterir)Gram negatif koklar Neisseria meningitidisGram pozitif aerob basiller Pasteurella multocida, Bacillus anthracisGram pozitif anaerob bakteriler Clostridium, Fusobacterium, Actinomyces türleriSpiroketler Treponema pallidum, Borrelia türleri Leptospira türleri, Listeria monocytogenesKlinik kullanımı Streptokokların neden olduğu farenjit, erizipel, pnömoni, sepsis, menenjit, endokardit, kemik ve yumuşak doku enfeksiyonları Meningokoksik menenjit, tetanoz, gazlı gangren, aktinomikoz, şarbon, leptospiroz, Listeria enfeksiyonları, sifilizKlinik sunumu Penisilin G, parenteral, IV yolla, 4-6 saatte bir uygulanır. Prokain penisilin G , sadece IM olarak kullanılır. Penisilin V, mide asidinden etkilenmeyen tek penisilin olup oral yoldan kullanılır.Streptokoksik farenjitte ve ağır olmayan infeksiyonlarda verilebilir.Farenjitte 10 günden az kullanımı etkili değildir. Benzatin penisilin G , IM yoldan 3 haftada bir uygulanan bir depo penisilindir. Streptokokal farenjit , romatizmal ateş profilaksisi ve sifilizde kullanılır. Penisilinaza dirençli penisilinlerEtki spektrumu Metisiline duyarlı stafilokoklar (MSS) Doğal penisilinlerin etki spektrumuKlinik kullanımı MSS un etken olduğu veya şüphelenildiği enfeksiyonlar (endokardit, sepsis, osteomyelit, yumuşak doku infeksiyonları ,menenjit vs) Aminopenisilinler Ampisilin, amoksisilin Etki spektrumu Enterokoklar, Haemophilus influenzae (beta laktamaz yapmayan) Moraxella catarrhalis (beta laktamaz yapmayan) Salmonella typhi, Shigella türleri (duyarlılığı coğrafi farklılık gösterir) E. coli ve Proteus türleri Doğal penisilinlerin etki spektrumu Klinik kullanımı Akut otitis media, akut sinüzit, kronik bronşit alevlenmesi (beta laktamaz yapan suşlar ve penisiline dirençli pnömokoklar etkense uygun değil), enterokok enfeksiyonları ve özellikle  gebelerin üriner infeksiyonlarında kullanılabilir. Karboksi penisilinler ve üreidopenisilinlerKarbenisllin,tikarsilin(karboksi penisilinler)Azlosilin,mezlosilin,piperasilin(üreidopenisilinler) Geçmişte pek çok gram negatif çomağa ve Pseudomonas türlerine etkin olan bu ajanlar hastanelerde gelişen yaygın direnç nedeni ile duyarlı olduğu kanıtlanmadıkça ampirik olarak önerilemez Betalaktam ve betalaktamaz inhibitörü kombinasyonları Ampisilin sulbaktam , amoksisilin klavulanik asit Etki spektrumu Metisiline duyarlı stafilokoklarH.influenzae M.catarrhalisStreptokok ve enterokok türleriE. coli, Klebsiella ve Proteus türleriNeisseria türleri ( N. gonorrhoea dahil)Anaeroblar ( Bacteroides fragilis dahil)Aminopenisilinlerin etki spektrumuKlinik kullanımı Otitis media ,sinüzit, kronik bronşit alevlenmesi , hayvan ısırmaları, yumuşak doku  enfeksiyonları(diyabetik ayak enfeksiyonları), osteomyelit, septik artrit, abdominal ve pelvik enfeksiyonlar (hafif, hastane dışında gelişen), üriner infeksiyonlar (duyarlı suşlara)ve gonorede kullanılabilir. Klinik sunumu Her iki kombinasyonun da oral ve parenteral formları bulunmaktadır. Tikarsilin klavulanik asit Etki spektrumu Beta laktamaz yapan S. aureus, gram negatif çomaklar,bazı Pseudomonas aeruginosa türleri, anaeroblar (Bacteroides türleri dahil), amino penisilinlerin etki spektrumuKlinik kullanımı Polimikrobiyal infeksiyonlar İntraabdominal ve pelvik infeksiyonlar,polimikrobial yumuşak doku infeksiyonları Piperasilin – tazobaktam Etki spektrumu Tikarsilin klavulanik aside benzer,ancak etkinliği daha fazla olup, karbapenemlerle karşılaştırılabilirKlinik kullanımı İntraabdominal ve pelvik infeksiyonlar,ciddi yumuşak doku infeksiyonları, baş boyun  enfeksiyonları , nozokomiyal enfeksiyonlar ve başka polimikrobiyal enfeksiyonlardır. Penisilinlerin yan etkileri • Aşırı duyarlılık ( basit deri reaksiyonu, anafilaksi)• Diğer beta laktam ilaçlarla çarpraz aşırı duyarlılık görülebilir.• Nötropeni, trombositopeni• Renal toksisite• Transaminaz yüksekliği• Gastrointestinal yan etkiler ( bulantı, kusma, pseudomembranöz enterokolit)• Nörotoksisite ( Yüksek doz penisilin G ile konvülzüyon ) SEFALOSPORİNLER Etki spektrumları farklı birinci, ikinci , üçüncü ve dördüncü kuşak sefalosporinler klinik kullanımdadır.Birinci kuşak sefalosporinler ( Sefazolin)Etki spektrumu Streptokoklar, metisiline duyarlı stafilokoklar, E. coli ve Klebsiella türleri Klinik kullanımıMetisiline duyarlı stafilokok enfeksiyonları ve streptokokal enfeksiyonlarda ( deri ve yumuşak doku enfeksiyonları , endokardit, septik artrit, osteomyelit ) ve kolorektal cerrahi dışında cerrahi profilakside kullanılabilir. İkinci kuşak sefalosporinler ( Sefuroksim, sefoksitin)Sefuroksimin oral ( sefuroksim aksetil) ve parenteral formları mevcuttur. Sefoksitin sadece parenteral uygulanır.Etki spektrumu Metisiline duyarlı stafilokoklar, streptokoklar, Haemophilus influenzae , Neisseria gonorrhoae ye etkilidir. Gram negatif enterik bakterilere etkinliği birinci kuşak sefalosporinlerden daha yüksektir.Sefoksitin sefamisin grubundan bir sefalosporin olup gram pozitif ve negatif anaerob bakterilere etkindir.Klinik Kullanımı Sefuroksim, üst ve alt solunum yolu enfeksiyonları ( otit, sinüzit, kronik bronşit alevlenmeleri, pnömoni ), üriner enfeksiyonlarda kullanılabilir.Sefoksitin, çok ağır seyirli olmayan intraabdominal ve pelvik enfeksiyonlarda tercih edilebilir. Üçüncü kuşak sefalosporinler Seftriakson, sefotaksim, seftizoksim, sefodizim, anti pseudomonal etkili sefoperazon sulbaktam ve seftazidim parenteral olarak kullanılır. Sefiksim oral kullanılabilen bir sefalosporindir.Etki spektrumuSeftriakson, sefotaksim, seftizoksim, sefodizim etkinliği birbirine benzer. Gram negatif enterik bakterilere, H. influenzae, Streptococcus pneumoniae, Nesseria meningitidis, N. gonorrhoae ye etkilidir. Antistafilokokal etkinliği yeterli değildir.Seftazidim ve sefoperazon- sulbaktam , Pseudomonas aeruginosa ya etkili sefalosporinlerdir.Son yıllarda ,özellikle hastane kökenli enterik bakterilerin çoğu üçüncü kuşak sefalosporinleri inaktive eden geniş spektrumlu beta laktamaz enzimleri sentezlemektedir ve bu nedenle etkinliklerinde önemli azalma görülmektedir.Klinik kullanımı•Gram negatif çomakların neden olduğu enfeksiyonlar ( bakteriyemi, sepsis, üriner enfeksiyon, nozokomiyal pnömoni) , abdominal ve pelvik enfeksiyonlar ( antianaerob bir ilaçla kombine edilmelidir, safra yolları enfeksiyonlarında safraya yüksek oranda geçen sefaperazon ve seftriakson tercih edilmelidir )• Nötropenik ateş ( hastanedeki direnç durumu dikkate alınarak antipseudomonal sefalosporinler, aminoglikozidlerle birlikte veya tek başına kullanılabilir. )• Yeni doğan menenjiti ( sefotaksim tercih edilmeli, Listeria monocytogenes olasılığı için ampisilinle kombine edilmelidir.)• Çocuk ve erişkin yaş grubunda akut bakteriyel menenjit• 50 yaşın üzerinde akut bakteriyel menenjit ampirik tedavisinde ( ampisilinle kombine edilmelidir. )• Gonore ve şankroid ( tek doz seftriakson )• Lyme hastalığı santral sinir sistemik tutulumunda ( seftriakson ) Dördüncü kuşak sefalosporinler (sefepim)Sefepim, üçünçü kuşak sefalosporinlerin çoğunu inaktive eden geniş spektrumlu betalaktamazların çoğuna stabil olduğundan, bu enzimleri sentezleyen gram negatif enterik bakterilerin çoğuna etkindir. Nozokomiyal enfeksiyonlarda, nötropenik ateşte tercih edilir. P. aeruginosa ya etkindir. Anti stafilokokal etkinliği üçüncü kuşak sefalosporinlerden daha iyidir. Anaerob bakteri enfeksiyonları için uygun bir seçim değildir. Sefalosporinlerin yan etkileri• Aşırı duyarlık reaksiyonları Anafilaksi, anjioödem nadirdir. Makülopapüler döküntü, ürtiker ve eozinofili görülebilir. İlaç ateşi sıktır.• Kanama metiltiotetrazol yan zinciri taşıyan (sefoperazon) sefalosporinler K vitamini sentezini inhibe ederek protrombin zamanını uzatırlar. Kanama komplikasyonu K vitamini ile önlenebilir.• Disülfiram benzeri reaksiyon Alkolle birlikte kullanımında taşikardi, terleme, bulantı, kusma, dispne ,hipotansiyon ve kofüzyon görülebilir. Sefoperazon gibi metiltiotetrazol yan zinciri taşıyan sefalosporinlerin kullanımında saptanır.• Trombositopeni, nötropeni , Coombs testi pozitifliği• Renal toksisite• Transaminaz, alkalen fosfotaz yüksekliği ( sefoperazon, seftriakson)• Gastrointestinal yakınmalar• Kolesistit benzeri tablo ( seftriaksona bağlı safra çamuru oluşması ile ilişkili bulunmuştur.)• Yeni doğanda kern ikterus ( seftriakson)• Tromboflebit ve enjeksiyon yerinde ağrı• Süper enfeksiyonlar ( enterokok, pseudomonas ve kandida enfeksiyonları ) MONOBAKTAMLAR Bu gruptaki tek antibiyotik sentetik bir monobaktam olan aztreonamdır.AztreonamEtki spektrumu Dar spektrumlu olup sadece gram negatif bakterilere etkilidir.Beta laktamaz yapımını indüklemediğinden başka bir beta laktamla kombine edilebilir.Klinik kullanımı Aztreonamın duyarlı olduğu gram negatif bakteri enfeksiyonları  ( bakteriyemi, sepsis, pnömoni, üriner enfeksiyon ), intraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar ( antianaerobik bir antibiyotikle kombine edilmelidir) .Yan etkileri Aztreonam yan etki oranı düşük, emniyetli bir antibiyotiktir. Başka bir beta laktam ilaca aşırı duyarlılığı olanlarda, çarpraz reaksiyon olasılığı çok düşük olduğundan aztreonam kullanılabilir.   GLİKOPEPTİDLER MAKROLİDLER Eritromisin, makrolidlerin en eski üyesidir.Yeni makrolidlerden ülkemizde klaritromisin, roksitromisin, azitromisin ve diritromisin klinik kullanımdadır.Spiramisin toksoplazmozda tercih edilen bir makroliddir Sadece klaritromisinin parenteral formu bulunmaktadır.Bakteri hücresinde protein sentezini inhibe ederek etki gösterirler. Bakteriyostatik olup yüksek konsantrasyonları bakterisidal etki gösterir.İntraselüler ve solunum salgılarında yüksek konsantrasyonlara ulaşır, kan düzeyleri düşüktür. Makrolidlerin ilk seçim olduğu durumlar• Mycoplasma pneumoniae pnömonisi• Chlamydia pneumonia pnömonisi• Legionella pnömonisi• Boğmaca, difteri• Penisiline allerjik hastalarda; GAS infeksiyonları, romatizmal ateş profilaksisi, yumuşak doku infeksiyonları, sifiliz• Toplum kökenli pnömoniler(riskli olmayan genç hastalarda)• Genital Chlamydia enfeksiyonları• Ureaplasma urealyticum enfeksiyonları,• Campylobacter jejuni enfeksiyonları Azitromisin, günde tek doz kullanılır.Gastrointestinal yan etkileri eritromisinden daha azdır.Kısa süreli tedavileri elverişlidir. Atipik Mycobacterium türlerine ve Toxoplasma  gondii ye etkilidir. Klaritromisin, günde iki kez kullanılır, yan etkileri azdır Farenjit, akut maksiller sinüzit, kronik bronşit alevlenmeleri, toplum kökenli pnömoniler, Mycobacterium avium kompleksi (MAC) ve Helicobacter pylori enfeksiyonlarında (FDA onaylı) tercih edilebilir.Yan etkileriEritromisinin gastrointestinal yan etkileri oldukça fazladır.Bulantı, karın ağrısı ve ishal görülebilir. Yeni makrolidlerde bu yan etki daha azdır.Emniyetli bir antibiyotik olup gebede ve çocuklarda kullanılır. Kolestatik hepatit ve ototoksisite diğer yan etkileridir. LİNKOZAMİDLER Linkozamid grubunda linkomisin ve klindamisin yer alır. Klindamisin absorbsiyonu daha iyi ve antibakteriyel etkinliği daha güçlü olması nedeniyle tercih edilir. Bakteri hücresinde protein sentezini inhibe eder. Makrofaj ve PNL içinde yüksek konsantrasyonlara ulaşır. BOS a geçmez. Oral ve parenteral preparatları mevcuttur.Antibakteriyel spektrumu ve klinik kullanımı Gram pozitif ve negatif anaerob bakterilere, Propionobacterium türlerine, streptokok ve stafilokoklara etkilidir. Başlıca anaerob enfeksiyonlarda, intraabdominal, pelvik enfeksiyonlarda gram negatif enterik bakterilere etkili antibiyotiklerle kombine olarak kullanılabilir. Stafilokokal ve streptokokal enfeksiyonlarda alternatif ilaçtır. Aspirasyon pnömonisi ve akciğer apsesinde anaerob etkinliği nedeniyle seçilebilir. Diyabetik ayak enfeksiyonları ve osteomyelitlerinde kombine tedavide kullanılabilir. Aknede topik preparatları etkin bulunmuştur.Klindamisin ayrıca antiparaziter bir ilaçtır. Bu alanda en önemli kullanımı toksoplazmoz ve babezyozdur.Yan etkileriEn önemli yan etkileri bulantı , kusma, ishal gibi gastrointestinal yan etkileridir. Pseudomembranöz enterokolitin en önemli nedenlerinden biridir.Diğer yan etkileri, hepatotoksisite ve kemik iliği inhibisyonudur. AMİNOGLİKOZİDLER Bu gruptan ülkemizde bulunanlar; streptomisin, kanamisin, neomisin, streptomisin, gentamisin, tobramisin, netilmisin, amikasin ve izepamisindir. Aminoglikozidler bakterilerin protein sentezini inhibe ederek etkili olan bakterisidal antibiyotiklerdir.Beta laktam ilaçlarla kombinasyonu sinerjiktir.Ancak aynı solusyon içinde verildiğinde inaktive olabilirler. BOS a geçmezler, bu nedenle menenjitte intratekal veya intraventriküler verildiğinde etkili olabilirler. Asit ortamda inhibe olduğundan apse ve itihaplı bronş sekresyonlarında aktivitesi azalır. Klinik kullanımı Neomisin, barsak bakterilerinin inhibisyonu gereken hepatik koma ve abdominal cerrahi öncesi barsak temizliği amacı ile oral olarak kullanılan bir aminoglikoziddir.Kanamisin dirençli tüberküloz olgularında tercih edilir.Streptomisin brusellozda tetrasiklinle birlikte, tüberkülozda, enterokok ve viridans streptokoklara bağlı endokarditte penisilin veya vankomisinle kombine olarak kullanılır. Veba ve tularemide ilk seçenektir.Diğer aminoglikozidler, daha çok gram negatif enterik bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlarda ,genellikle kombinasyon tedavisi olarak kullanılırlar. Bu enfeksiyonların başında nozokomiyal enfeksiyonlar ( pnömoni, sepsis, üriner enfeksiyonlar, osteomyelit, septik artrit) gelmektedir.Nötropenik ateşte antipseudomonal beta laktam bir ilaçla kombinasyonu önerilir. Abdominal , pelvik enfeksiyonlarda, diyabetik ayak enfeksiyonlarında anaerob etkili bir antibiyotikle kombine edilmelidir.Aminglikozidlerin günde tek doz kullanımları.Aminoglikozidler konsantrasyona bağlı bakterisidal etki ( doz arttıkça öldürme gücü artar) ve post antibiyotik etki ( PAE)( doz arttıkça PAE artar)leri nedeniyle günde tek doz kullanım için uygundur. Günlük doz bir seferde uygulanır. Bu durumda toksik etkilerin artmadığı saptanmıştır. Yan etkileriEn önemli yan etkileri nefrotoksisite ( doza bağlı; doz arttıkça toksisite artar) ve ototoksisite ( işitme kaybı, vestibüler toksisite) dir.Nefrotoksisite genellikle ilacı kesince düzelmesine karşın ototoksisite irreverzibldir. Netilmisin en az toksiktir. TETRASİKLİNLER Tetrasiklinler protein sentezi inhibitörü bakteriyostatik antibiyotiklerdir. Ülkemizde sadece oral formları bulunmaktadır. Doksisiklin uzun etkili bir tetrasiklin türevi olup günde iki kez kullanılma avantajına sahiptir. Klortetrasiklin ve oksitetrasiklin türevleri altı saatte bir kullanılırlarKlinik kullanımıBrusellozda streptomisin ve rifampisinle kombine olarak, Chlamydial pelvik inflamatuar hastalıkta, kolera, leptospiroz, Lyme hastalığı, psittakoz, trahom, veba, Rickettsia enfeksiyonları ve nongonokoksik üretritte ilk seçenek olarak kullanılır.Mycoplasma pnömonisi, sifiliz , gonore, şarbon, tularemi, akne ve kronik bronşit alevlenmelerinde alternatif ilaçtır.Yan etkileriTetrasiklin çocuklarda dişlerde lekelenme ve iskelet gelişiminde duraklamaya yol açtığından 8 yaş altında kullanılmaması önerilmektedir. Gebede akut karaciğer yetmezliğine yol açabilir.Ayrıca deri döküntüleri, fotosensitivite ve böbrek yetmezliğine yol açabilir.Gastrointestinal yan etkileri, özofagusta ülserasyonlar görülebilir. Doksisiklin böbrek hastalarında doz ayarlanmadan kullanılabilir. Tetrasiklinlerin absorbsiyonu süt ürünleri , demir, kalsiyum ve magnezyum içeren antiasitlerle ve simetidinle azalır. TRİMETOPRİM SÜLFAMETOKSAZOL ( TMP-SMZ) TMP- SMZ, bakteri nukleik asit sentezi için gerekli folik asit sentezini iki farklı basamakta inhibe eden kombine bir antibiyotiktir. Oral ve parenteral formları bulunmaktadır. Klinik kullanımı Toplum kökenli üriner sistem enfeksiyonlarda etken mikroorganizmalar başta E. coli olmak üzere gram negatif bakterilerdir. Ülkemizde bu bakterilerde TMP-SMZ a önemli oranda direnç olduğundan duyarlı olduğu kanıtlanmadıkça seçilmemelidir. Aynı nedenle prostatit tedavisinde yerini kinolonlara bırakmıştır.Akut sinüzit, otit ve kronik bronşit alevlenmelerinde alternatif bir antibiyotiktir.Salmonella ve Shigella enfeksiyonlarının ampirik tedavisinde ülkemizdeki direnç sorunu nedeniyle kullanılmamalıdır. Tifo tedavisinde alternatif olarak, kolera tedavisinde ampirik olarak seçilebilir.Ayrıca Pneumocystis carinii pnömonisi, Nocardia enfeksiyonları ve Toxoplasma gondii enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılır. Organ transplantasyonu yapılan ve HIV enfeksiyonu olan hastalarda yukarıda belirtilen enfeksiyonların profilaksisi amacıyla tercih edilir. Brusellozda kombine tedavide yer alabilir.Yan etkileriKern ikterus riski nedeniyle gebelikte, iki aydan küçük bebeklerde ve süt veren annelerde kullanılmamalıdır. Gastrointestinal semptomlar, deri döküntüleri ( Steven Johnson sendromu ) kemik iliği süpresyonu, karaciğer ve böbrek toksisitesi başlıca yan etkileridir. KLORAMFENİKOL ve FFENİKOLLER Bakterilerin protein sentezini inhibe ederek etki gösterir. Oral ve parenteral formları klinik kullanımdadır.Klinik kullanımıKloramfenikol lipofilik olduğundan BOS a iyi geçer. Bakteriyel menenjit etkenlerine bakterisidal etki gösterir. Beta laktam allerjisi olan hastalarda menenjit tedavisinde kullanılabilir.Tifo tedavisinde yerini kinolonlara bırakmıştır.Tifoda alternatif olarak kullanılabilir. Anaerob etkinliği nedeniyle abdominal enfeksiyonlarda ve beyin apsesinde penisilinle kombine olarak kullanılabilir. Ayrıca epidemik tifüs, Q ateşi, veba , tularemi, listeria ve melioidoz tedavisinde kullanılabilir. Göz tabakalarına ve aköz hümöre geçişi iyi olduğundan göz enfeksiyonlarında lokal olarak kullanılabilir. Kloramfenikol günümüzde ancak alternatif tedavilerde kullanılabilecek bir antibiyotiktir.Yan etkileriEn önemli yan etkileri doza bağlı olarak gelişen anemi, lökopeni ve trombositopeni ve dozla ilişkisiz idiosenkrazik bir reaksiyon olan aplastik anemi gibi hematolojik yan etkileridir. Yeni doğanda kloramfenikolü detoksifiye eden glukronil transferaz enzimi yetersiz olduğundan gri bebek sendromu ( kardiyovasküler kollaps) gelişebilir. Gastrointestinal semptomlara yol açabilir. Tifo tedavisinde parçalanan bakterilerden açığa çıkan endotoksinin dolaşım yetmezliğine yol açmasıyla Herxheimer reaksiyonu adı verilen tablo nadiren gelişebilir. Diğer bildirilen yan etkiler başağrısı, konfüzyon, optik nörit ve periferik nörit gibi nörotoksik bulgulardır. KİNOLONLAR Bu grubun ilk üyesi olan ve birinci kuşak kinolon olarak adlandırılan nalidiksik asit üriner enfeksiyonlar ve bakteriyel ishallerde kullanılmış dar spektrumlu bir antibiyotiktir.İkinci kuşak kinolonlar daha geniş spektrumlu olup gram negatif çomaklar dışında, stafilokoklara, Haemophilus ve Moraxella türlerine, atipik pnömoni etkenlerine ( Mycoplasma, Legionella, Chylamydia türleri ), genital enfeksiyon etkenlerine ( Mycoplasma, Ureoplasma, Chylamidia , Neisseria türleri) , Mycobacterium tuberculosis ve Brucella gibi pek çok bakteriye etkindir.Bu grupta en çok klinik deneyim olan kinolonlar; siprofloksasin ve ofloksasindir.Bu gruptan diğer kinolonlar ise pefloksasin, enoksasin ve norfloksasin dir. Pefloksasin ve ofloksasin BOS a geçişi en iyi olan kinolonlardır. Siprofloksasin P. aeruginosa ya en etkin kinolondur.M. tuberculosis e en etkili kinolon ofloksasindir.İkinci kuşak kinolonların streptokoklara ve anaerob bakterilere etkinliği azdır. Üçüncü kuşak kinolonlar ın spektrumu streptokoklar ( S. pneumoniae dahil) lehine genişlemiş olup bu grup kinolonlar toplum kökenli solunum sistemi enfeksiyonlarında kullanılabilirler. Bu gruptan ülkemizde bir ofloksasin türevi olan levofloksasin bulunmaktadır. Dördüncü kuşak kinolonlar ( bazı kaynaklarda üçüncü kuşak kinolonların ikinci grubu) ise üçüncü kuşak kinolonların etki spektrumuna ek olarak anaerob bakterilere olan etkinlikleri nedeniyle dikkati çekmektedirler. Bu gruptan ülkemizde moksifloksasin bulunmaktadır. Günümüzde pek çok yeni kinolon ile ilgili araştırmalar devam etmektedir. Klinik kullanıma sunulan pek çok kinolonun ise yan etkileri nedeniyle imali durdurulmuştur. ( Grepafloksasin, trovafloksasin, temafloksasin vb.)Klinik kullanımıGastrointestinal enfeksiyonlar : Tifo,paratifo gibi salmonella enfeksiyonlarında, , invazif bakteriyel gastroenteritlerde, kolerada seçilecek antibiyotikler ikinci kuşak kinolonlardır. Ayrıca anaerob antibiyotiklerle kombine edilerek abdominal ve pelvik enfeksiyonlarda kullanılabilirler.Üriner sistem enfeksiyonları: Basit sistitler, komplike üriner sistem enfeksiyonları ve akut prostatitlerin tedavisinde ve profilaksisinde seçilecek antibiyotiklerdir.Genital enfeksiyonlar: Gonokoksik ve nongonokoksik üretritlerde uygun alternatif ilaçlardır.Solunum sistemi enfeksiyonları:Toplum kökenli pnömonilerde ve kronik bronşit akut alevlenmelerinde pnömokoklara etkili olan levofloksasin ve moksifloksasin kullanılabilir. Nozokomiyal pnömonilerde siprofloksasin özellikle Pseudomonas türlerine en etkili olması nedeniyle tercih edilir.Kemik ve eklem enfeksiyonları:Kronik osteomyelitin uzun süreli tedavisinde kinolonlar iyi bir oral tedavi seçeneğidir. Kemik dokusuna geçişlerinin iyi olması da seçilmeleri için önemli bir nedendir. Diğer klinik kullanım alanları tüberküloz, bruselloz ve meningokoksik menenjit profilaksisidir. Diyabetik ayak ve dekübit yara enfeksiyonlarında anaeroblara etkili ilaçlarla kombine edilerek kullanılabilir.Yan etkileriEn sık gastrointestinal yan etkiler görülür. Baş ağrısı , baş dönmesi, konfüzyon gibi nörolojik bulgulara yol açabilir. Nonsteroid antiinflamatuar ilaçlarla birlikte konvülziyon gelişebilir. Hayvan deneylerinde artropatiye yol açması nedeniyle 16 yaşından küçüklerde önemli bir endikasyonu olmadıkça kullanımı kontrendikedir. Tendinit ve tendon rüptürü de nadir yan etkileri arasındadır. Allerjik yan etkiler ve fotosensitiviteye yol açabilir. Kinolonların emilimi antiasitler, sükralfat ve diğer metal içeren ilaçlarla azalır. Bu nedenle ilaçların en az iki saatlik aralıkla alınması önerilir. Teofilin ve kafeinle birlikte kinolonlar alınırsa belirtilen ilaçların kan düzeyi artarak toksisite bulguları ortaya çıkabilir.Ofloksasin ve levofloksasin belirtilen etkileşimin en az görüldüğü kinolonlardır.  

http://www.biyologlar.com/antibiyotik-kullaniminda-genel-prensipler

Aminoglikozidler

Duyarlı organizmalara karşı konsantrasyona bağlı bakterisidal aktivite gösterirler.Bazısı P.aeriginosa ve diğer Gr(-) basillere,bazısı Mycobakterilere etkilidir.Paramomisin kolonun protozea enfeksiyonlarında,Spektinomisin N.gonorhae tedavisinde kullanılmıştır.Aerob Gr(-) basil ve Gr(+) koklara etkisi Penisilinler veya Sefalosporinlerle additif veya sinerjistik olabilir.Rezistans az düzeydedir ve tedavi sırasında ortaya çıkışı nadirdir. Nefrotoksisite,ototoksisite ve nöromuskuler blokaj potansiyelleri vardır.Alerjik reaksiyonlar nadirdir. İsimler ve kaynaklar:Kimyaya giriş Neomycin,Kanamycin,Gentamisin fermentasyon ürünüdür.Amikacin,Netilmicin,Dibekacin, İsepamisin doğal ürünün semisentetik deriveleridir. Yapı Aminosiklitol denen amino grubu taşıyan 6 üyeli halka vardır.Spektinomisin aminosiklitol halkasına karşın amino şeker veya glikozitik bağı olmamasıyla farklıdır. Neomycin,Paramomycin ve Kanamycin ailesi(Kanamycin,Tobramycin,Amikasin,Dibekacin) Streptomycesten,Gentamisin Microspora türünden elde edilmiştir. Amikacin kanamisin A nın,Netilmisin sisomicinin semisentetik türevleridir. Amino veya hidroksil gruplarının uzaklaştırılması antibakteriyel ve toksik potansiyellerinin kaybına yol açar. Kimyasal karakterleri Suda iyi çözünür,organik solventlerde çözünmezler.Bu lipit içeren hücre membranlarından sınırlı geçişlerini açıklar. Yapıları dondurma,4 saat 100°C ye kadar ısıtma veya çözücü pH sını birkaç saat 3 ten 12 ye kadar değişmesiyle bozulmaz.pH 7.4 te fazlaca (+) tirler veya katyoniktirler. (+) yük antimikrobial aktivite ve toksisiteye sebep olur.Antimikrobial aktivite alkalin pH lı ortamda artar,asidik pH da azalır;birçok enfekte dokunun asidik ortamı aminoglikozid monoterapisinin zayıf etkinliğinden sorumlu olabilir. b-laktam antibiyotiklerle kimyasal etkileşirler,antibakteriyal etkileri kaybolur.İnfüzyondan önce aynı solüsyonda karıştırılmamalıdır. Antimikrobial etki mekanizması Bakteri dış membrana bağlanmaları pasiftir ve enerji gerektirmez.Sonuçta hücre duvarında delikler açılır ve geçirgenliği değişir.Hücre duvarından uptakei ve penetrasyonu aerobik ve enerji bağımlı aktif transport mekanizmasıyla olmaktadır.Bu yüzden aktiviteleri anaerobik ortamda çok azalır. Membranı geçtikten sonra ilaçlar irreversible olarak bakteri stoplazmasına hapsolur. Enerji bağımlı faz İyonik bağlanmadan sonra uptake enerji bağımlı yavaş başlangıç fazı ve takip eden hızlı faz olarak ikiye ayrılabilir.İkiside enerji bağımlıdır.EDP-1;Ca ve Mg gibi divalan katyonlarla, hiperosmolarite ile,düşük pHta,anaerob ortamda inhibe olabilir.Apselerin anaerob ortamında, idrarın hiperozmolar asidik olması durumunda etkileri azalır. Birçok bakteri EDP-2nin %25ten fazlasının tamamlanmasıyla ölümcül yara alır.External aminoglikozid konsantrasyonu arttıkça ilacın içerde EDP-2yi tetikleyecek konsantrasyonu daha çabuklaşır. Aminoglikozid-Ribozom birleşimi Bakterial ribozomun 30sdeki 16s bölümüne irreversible bağlanarak protein sentezinin başlangıcını bloklayıp bakterisidal etki gösterir.Bu açıklama Makrolidler,Linkozamidler, Kloramfenikol,Tetrasiklin gibi diğer protein sentezi inhibitörlerinin bakteriostatik olmasından dolayı yetersiz olabileceğinden bakteri ölümü multifaktoriyaldir. Streptomycin 30s alt birimine bağlanırken diğer aminoglikozidler hem 30s hemde 50s alt birimlerine bağlanır. Rezistans Bakteriler Aminoglikozidlere karşı kendilerini uptake azaltımı,modifiye edici enzimlerin sentezi veya ribozomal bağlanma yerindeki değişiklik mekanizmalarıın kombinasyonuyla korur.En yaygın ve önemli olanı antibiyotiğin inaktivasyonudur. Enzimatik modifikasyon Bu direnç stafilokoklarda ve enterokoklarda görülmekle birlikte esas olarak Gr(-) aerob basillerde en fazladır.Hem Gr(+) hemde Gr(-)lerce 3 sınıf enzimle inaktive olurlar; 1-Fosfotransferaz;hidroksil grubunun ATP bağımlı fosforilasyonu, 2-Nükleotidiltransferaz(Adeniltransferaz);hidroksil grubunun ATP bağımlı adenilasyonu, 3-Asetil transferaz;bir amino grubunun AsCoA bağımlı asetilasyonu. Stafilokok ve enterokoklardaki bir enzim asetilleyici ve fosforilleyici enzimlerin bileşimidir ve bu kombinasyon Streptomycin ve Spektinomycin dışındaki bütün aminoglikozidleri inaktive eder. Modifiye edilen aminoglikozid ribozomlara zayıf bağlanır,EDP-2 uptake oluşamaz ve rezistans ortaya çıkar. Aminoglikozid rezistansını kodlayan genler genellikle ekstrakromozomal bakteri plasmidleri ve transposonlarda bulunmaktadır.Bu genler Gr(+) ten Gr(-) e aktarılabilir.Hem konjugatif hemde non-konjugatif plasmidlerde bulunmuştur.Plazmide bağımlı inaktivasyon enzimleri ile gelişen direnç kanamisinin ve son zamanlarda tobramisinin klinik uygulamadaki yerini kısıtlamıştır.Amikasin bu enzimlere en az duyarlı olan aminoglikoziddir. Aminoglikozdleri modifiye edici enzimler periplasmik aralıkta yerleşmiştir. Ribozom bağlanma yerlerinin değiştirilmesi 16s rRNA bağlanma yeri enzimatik aktivite veya mutasyonel modifikasyon sonucu değişebilir.Ribozomal direnç daha çok Streptomycine karşı gösterilmiştir. Azalmış aminoglikozid alımı Azalmış aminoglikozid alımlı mutant aerob Gr(-) basil ve stafilokok identifiye edilmiştir.P. aeroginosa da da bulunmuştur.Bütün aminoglikozidlere çapraz direnç görülür ama rezistansın derecesi enzimatik modifikasyonun sonucuyla olandan daha azdır. Aminoglikozidlerle monoterapi esnasında Staf. küçük koloni varyantları ortaya çıkabilir. Küçük koloniler genelde daha az virulandır,aminoglikozid tedavisi sırasında bakterial persistansın bir mekanizmasıdır,tedavi kesildikten sonra orijinal virulan fenotipe dönebilir ve klinik relapsa sebep olur.Eş zamanlı b-laktam tedavisi problemi önler. Hızlı,erken konsantrasyon bağımlı duyarlı bakteri öldürümünü takiben geçici aminoglikozid direnci gözlenmiştir.Refraktör period PAE periodu sonrasında sonuçlanıp yeniden gelişme zamanına geçebilir.Bu adaptif rezistans olarak adlandırılır.Aminoglikozid uptake inin enerji bağımlı fazının geçici bozulmasının sonucu olduğuna inanılmaktadır. Uptakein enerji bağımsız fazları azalmış permeabiliteye dayanan rezistansa yol açabilir.P. aeroginosa için hücre duvarı lipopolisakkaritlerinde değişiklik tanımlanmıştır. Aminoglikozid rezistan enterokoklar Enterokoklar aminoglikozidlerin düşük konsantrasyonlarına rezistandır.Aminoglikozid uptakeinin aerobik oksidatif metabolizma gerektirmesinden dolayı bu rezistansın zayıf aktif ilaç transportuyla sonuçlanan düşük derece hücre membran oksidatif metabolizmasını yansıttığına inanılmaktadır. Enterokokların aminoglikozid direnci belirtilen 3 mekanizmanın biri veya fazlasının sonucu olabilir.Hedef bölgede değişiklik ve ilaç permeabilitesine müdehale hücre kromozomunda mutasyonun sonucu iken enzimatik inaktivasyon plazmidler ve transpozonlar aracılığıyla olur. Hücre duvarı etkin b-laktam veya glikopeptid antibiyotikle aminoglikozid kombinasyonu sinerjistik bakterisidal aktivite ile sonuçlanır. Hücre duvarı etkin ilaç aminoglikozidin ribozomun 16s bölümüne ulaşmasını arttırır.Klinik rezistans ilacın uptakei ve ribozomal hedefe bağlanmasıyla aminoglikozidin enzimatik modifikasyonu arasındaki dengenin sonucuna bağlıdır. Enzim-Substrat spesifitesindeki farklılıktan dolayı yüksek düzey rezistansı için hem gentamisin hem de streptomisini test etmek önerlmektedir. Aminoglikozid rezistansının klinik epidemiyolojisi Aerobik Gr(-) basillere etkili penisilinlerden farklı olarak rezistans aminoglikozid tedavisi kürü esnasında nadiren çıkar.Aminoglikozid rezistansı incelendiğinde bunun ya uzun süre maruz kalmayı yada yanıklı ve kistik fibrozlu hastalardaki gibi organizmanın fazlaca inoküle olması gerektiği gözlenmektedir. İn-vitro antimikrobial aktivite Aminoglikozidler aerobik ve fakültatif Gr(-) basillerden oluşan geniş spektruma konsantrasyon bağımlı bakterisidal aktivite gösterir.Gr(+) bakterilere etkinlikleri kısıtlıdır. Spektrumundaki organizmalar Enterobakterlerden Pseudomonas ve Haemophilus türlerine kadar değişir.Metisilin duyarlı Staf. aureus inhibe edilir.Staf.lara genellikle etkiliyken piyojen Strep.lar nadiren duyarlıdır.Gr(+) koklara bağlı enfeksiyonlarda b-laktam ve vankomisin gibi antibiyotiklerle sinerjik etkilerinden yararlanmak amcıyla kombine tedavide kullanılırlar. Streptomycin M.tbc.e en etkili iken Amikasin M.avium intrasellulare ve atipik mikobakterilere daha etkilidir.Amikasin ve kanamisininde anti-Tbc. etkinliği vardır.Yersinia pestis için streptomycin seçilebilecek bir ilaçtır ve Francuella tularensis için hem streptomycin hem gentamisin başarılı bulunmuştur. Kanamisinin spektrumu P.aeroginosaya önemli etkisinin olmaması ve rezistan enterobakter gelişiminden dolayı sınırlanmıştır. Aminoglikozidlerin önemli etkisi oladığı diğer bakteriler: Strep. pnömonia, Strep.maltophila, Burkholderia (Pseudomonas) cepacia,Bacterioides, Clostridium ve diğer anaerobik organizmalardır.Richetsia,Mantarlar,Mikoplazma ve viruslarada klinik önemli etkisi yoktur. Listeria ve diğer Gr(+) basillerin çoğu aminoglikozidlere dirençlidir,Hemophilus ve Neisseria duyarlıdır.Duyarlı bakterilerde plasmide bağımlı inaktivasyon enzimlerine bağlı dirençte klinik kullanımı etkilemektedir.Gr(-) aerob basillerdeki aminoglikozid direnci en az amikasine karşı saptanmıştır. Haemophilus ve Leigonella ya in vitro etkisi olmakla birlikte klinikte bu enfeksiyonlar için kullanılmazlar.Leigonella intrasellülerdir ve aminoglikozidlerin intrasellüler penetrasyonu azdır.Buna karşın Brucella,Tbc.,Tularemi,Yersinyoz gibi başka intrasellüler hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır.Streptomycin,gentamisin ve daha az derecede netilmisin terapötik konsantrasyonlarda intrasellüler E.coli ye bakterisidal etki gösterir. Gonore enfeksiyonları için sadece Spektinomisin kullanılmıştır.Aminoglikozidler diğer ilaçlarla kombine olarak Staf.,Strep.,Enterokok,Listerya ve Mycobacteria enfeksiyonlarını tedavide kullanılmıştır. Paramomisin intestinal parazitlere karşı aktiftir.GIS ten emilmediği için Enteomoeba hystolitica tedavisinde alternatif kullanılabilir.AIDS lilerin Cryptosporidium parvum enfeksiyonlarında yararlı olabilir. Üre aminoglikozidlerin GÜS patojenlerine etkisini inhibe eder.Bu düşük pH ve yüksek osmolaliteye bağlıdır. Anaeroblar,Fakültetif anaeroblar,Funguslar,Listeria,Nocardia,Spiroketler İn vitro antimikrobial aktivitenin zaman içinde gidişatı Aminoglikozidler hızlı bakterisidaldir ve bakteri öldürmeleri antibiyotik konsantrasyonu arttıkça artar. Post antibiyotik etki Aminoglikozidler gibi bazı ilaçlar için PAE ile tüm doz arası boyunca serum konsantrasyonlarının MIC değerinin üstünde olması şart değildir.Aminoglikozid konsantrasyonu ve oksijen gerilimi arttıkça PAE uzar,test ortamının pH sı azaldıkça kısalır.İmipenemle aminoglikozid kullanımı hariç;ki bu aminoglikozidin tek başına olduğundan daha uzun süre PAE sağlar,herhangi bir b-laktamla kombinasyonda PAE aminoglikozidinkidir. Antimikrobial sinerji Aminoglikozidle hücre duvarı aktif antimikrobial (Penisilin,Sefalosporin,Monobaktam, Karbapenem,Glikopeptid) sinerjisi (+) bir etkileşimdir.Etki additiften fazladır. MRSA suşları için aminoglikozid + hücre duvarı aktif ilaç kombinasyonu endike değildir. Aminoglikozidlerin bakterisidal etkisi Kloramfenikol veya Tetrasiklin gibi bakteriostatik ajanlarca antagonize edilebilir.Burda aminoglikozidin enerji bağımlı uptake inin inhibisyonu ve ribozomun mRNA üzerinde hareketine müdehale postulatları vardır. Hayvan modellerindeki enfeksiyonlarda antibakterial etkinlik Doz rejiminin önemi Tahmin edileceği üzere aminoglikozid uptake ini kolaylaştırmak için hem penisilinin hemde aminoglikozidin aynı anda var olması gerekmektedir.Tersine penisilin duyarlı Strep. endokarditi için penisilin ve tobramisin kombinasyonlarının total günlük doz veya dozlama rejimlerinden bağımsız olarak eşit etkili olduğu bildirilmiştir. Aerob Gr(-) basiller için günlük tek doz aminoglikozidin aynı dozun bölünerek uygulanmasıyla aynı etkide olduğu bildirilmiştir.Sonuçlar aminoglikozidlerin konsantrasyon bağımlı öldürme ve PAE sinden ibarettir.Nötropenik hayvanlarda aminoglikozidlerin PAE leri daha kısadır.Ek olarak b-laktamın etkili kan seviyesi devamlı sağlanmalıdır. İlaç rezistansının önlenmesi Aminoglikozidin kombinasyonun parçası olarak kullanımı aminoglikozide veya birlikteki ilaca rezistan bakteri çıkışını önliyebilir veya geciktirebilir. Farmakoloji Uygulanım Aminoglikozidler 15-30 dakikalık iv. Periodda uygulanır.Yüksek tek doz kullanımda infüzyon süresi nöromuskuler blokaj yapabilecek hızlı serum konsantrasyonunu önlemek için 30-60 dakikaya uzatılabilir.İm. aminoglikozid hızla tamamen emilir.Emilim hipotansif ve yetersiz doku perfüzyonlu hastalarda gecikebilir. Çok az lipofilik olduklarından GIS ten minimal emilir.Terapötik indeksleri dardır.Hepatik ensefalopati ve bozuk renal fonksiyonlu hastalarda oral neomisin kullanımından sonra sağırlık oluşabilir.İnflame deriye topikal uygulanım minimum emilime neden olur.Buna karşın yaygın yanıklı veya başka ciddi deri yaralanmalı hastalarda ilaç emilimi olabilir ve toksisite riski vardır.Plevral boşluk veya peritoneal kaviteye damla damla verilebilir.Emilim hızlıdır. Aminoglikozidlerin hızlı emilim ve nöromusküler blokajı bildirildiğinden abdominal irrigasyon solusyonlarında kullanımı önerilmez.Buna karşın mesane temizleyici ve aerosol olarak kanda ölçülebilir konsantrasyonları olmadan kullanılmşlardır. Dağılım Streptomycin hariç plazma proteinlerine çok az bağlanırlar.Düşük derece proteine bağlanan ve suda yüksek derecede çözünen diğer ilaçlar gibi vasküler alana ve birçok dokunun interstisyel alanına serbestçe yayılırlar.Büyük ölçüde ekstrasellüler sıvıya yayılırlar.Asit,yanık ve bazı ağır enfeksiyonlardaki ödematöz durumlarda yayılım hacmi artar,şişmanlarda azalır. Transport mekanizmaları olan renal tübüler hücreler ve iç kulak hücreleri hariç biyolojik membranlardan az geçerler. Parenteral uygulama bronş sekresyonlarında düşük konsantrasyona yol açar.Daha yüksek konsantrasyonlar aerosol şekliyle sağlanabilir. Kan-BOS,Kan-Beyin bariyerini az geçerler.Penetrasyon yenidoğanda daha iyidir.İntratekal uygulamayla BOS ta yüksek düzey sağlanırken intraventriküler düzeyi düşüktür, intraventriküler uygulamada ise ikisindede yüksek konsantrasyon sağlanır.Yetişkinde Gr(-) basillere bağlı menenjitte intraventriküler yol önerilir.Yenidoğanda intraventriküler yol iv. yoldan fazla etkili değildir ve daha toksiktir. Renal tübüler hücre absorbsiyonu ve salınımından dolayı tek dozdan sonra idrar seviyeleri birkaç gün terapötik dozdan yüksek kalır. Sinovial sıvıya kolay geçerler.Streptomycin hariç safra içine giremezler,çeşitli salgı ve dokularda,hücre içinde düşük düzeyde bulunurlar.Kan-Göz engelinide çok az geçerler; endoftalmit tedavisinde direkt intravitreal enjeksiyon önerilir. İnflamasyon varsa peritoneal ve perikardial boşluklara penetrasyonları artar.Fötal dolaşıma az da olsa geçerler.Azitromisin,Klindamisin,İmipenem,Metranidazol,TMP,Vankomisin gibi hamilelikte sınırlı kullanılabilecek ilaçlardandırlar. Metabolizma Vücutta metabolize edilmezler. Atılım Parenteral dozun %99 u değişmeden böbrekten glomerüler filtrasyonla kalanda feçes ve tükrükle atılır. Farmakokinetik 3 fazlıdır;1.(a):İlacın vasküler alandan ekstravasküler alana yayılımının sonucudur. 2.(b):İlacın plazmadan ekstravasküler alana atılımının sonucudur.GFR ile ilişkilidir ve doz rejiminde en önemli fazdır.1 haftadan ufaklarda ve DDA lılarda yarı ömür uzar.Yarı ömür febril hastalıklarda kısalırken renal fonksiyonu azaltan durumlarda uzar.Yaşlılarda yarı ömür uzaması yaşa bağlı renal fonksiyon bozulmasındandır. 3.(g):Böbrekte biriken ilacın uzamış ve yavaş eliminasyonudur.Doz hesaplamalarında göz önüne alınmaz. Uygulanan dozla serum düzeyleri ararsında iyi bir korelasyon yoktur. Toksisite Spektinomisin dışında ranal prox. kıvrımlı tubul hasarı,kohlea veya vestibular apparata hasar ve nöromuskuler blokaj potansiyelleri vardır.En sık ve en önemli yan etkileri bunlardır. Hipersensitivite,iv. infüzyon yerinde flebit nadirdir.Plevral boşluğa,abdominal kaviteye, BOS a verilmeleri irritasyon yapmaz.Hepatotoksisite,fotosensitivite yapmazlar.Hematopoeze, koagülasyon kaskadına yan etkileri yoktur. Klinik nefrotoksisite Nefrotoksisite insidansı %0-50 arasında değişir.En fazla Gentamisinde gözlenir. GFR de azalmaya neden olan prox.tübülde hasarla peritübüler aralıkta aminoglikozid birikimine bağlıdır.Tübüler hasar reversible dır ve az sayıda hastada tedavinin devamına rağmen iyileşme bildirilmiştir. Sıklığını arttıran kofaktörler;yüksek yaş (çocuklarda sık değildir),furasemid gibi diüretiklerle (Volüm ve elektrolit konsantrasyonunu azaltarak indirekt etkili olurlar), sikloserin, amfoterisin B (Kendisinin nefrotoksisite potansiyeli vardır.),vankomisin(Çocuklarda değil), sefalotin,Foskarnet ve iv. radyokontrast ajanlar (Teorik olarak kendi toksisite potansiyelleri vardır.),Klindamisin (İstatistiki olarak risk faktörüdür.) gibi ilaçlarla birlikte kullanım, böbrek ve karaciğer yetmezliği, dehidratasyon, aminoglikozidin serum düzeylerinin yüksekliği ve tedavi süresinin 10 günü aşması şeklinde hastaya,birlikteki ilaca ve aminoglikozide bağlı olan faktörler olarak sınıflanabilir. Özellikle septik şok veya sepsiste olanlar olmak üzere hipotansif hastalarda renal yetmezlik riski artar.Bu durumda enfeksiyona bağlı düşük perfüzyon,koagülopati,sitokin aracılı endotel hasarı ve başka faktöler GFR azalımında etyolojik faktör olabileceğinden aminoglikozidlerin rolü belirsizdir. Nefrotoksisite tedavinin birkaç gününden sonra serum kreatininde artmayla belli olur.Tersine 1 günde veya daha kısa sürede kazara çok yüksek doz verimi ATN ile sonlanmamıştır. Streptomycin nadiren nefrotoksisiteye sebep olur.Tobramisinin gentamisinden daha az, Amikasin gentamisinle eşit,Netilmisin tobramisinden daha az nefrotoksisite riski taşır. Nefrotoksisite doz azaltımı veya tedavi kesimiyle reversable dır.Çalışmalarda günlük tek doz aminoglikozid güvenli ve etkili tedavi metodu olarak görünmektedir.Günlük tek doz ilaç toksisitesini önlemez ama riski azaltır. Birlikte kullanılan ilaçların GFR yi azaltmasının riski arttırdığı belirtilmektedir.Çift kör prospektif bir çalışmada Cephalotin + Aminoglikozidin bir Penisilin + aminoglikozidden daha nefrotoksik olduğu bildirilmiştir.Ceftazidimin gentamisinin enzimürisini arttırdığı görülmüştür. Febril nötropenik hastalarda Gentamisin veya Tobramisin + Karbenisilin veya Tikarsilinin aminoglikozidin başka b-laktamla kombinasyonundan daha az nefrotoksik olduğu görülmüştür.Eş zamanlı Piperasilin kullanımıylaysa risk artımı görülür.Piperasilinin daha az Na içeriğinin farkı açıklıyabileceği söylenmiştir. Deneysel olarak aminoglikozid nefrotoksisitesini arttıran Siklosporin ve Sisplatinin klinik olarak nefrotoksisiteyi arttırmadığı belirtilmelidir. Renal fonksiyonlarda bozulma olursa tedaviyi kesmek önerilir.Birkaç gün içinde başka nefrotoksinlerin,hipotansiyonun,başka etyolojiye bağlı renal kortikal nekrozun ve başka klinik faktörlerin yokluğunda spontan iyileşme olur.Anürik renal yetmezliğe ilerleyiş nadirdir. Pseudomonas endokarditi gibi tedaviyi kesmenin önerilmediği durumlarda aminoglikozid dozu ayarlanır ve tedaviye devam edilir.Aminoglikozid tedavisine devam ederken renal fonksiyonların düzeldiği bildirilmiştir. Doz ayarlaması; 1-Bir defada uygulanacak doz hastanın kreatinin değerine bölünerek bulunan miktar doz olarak uygulanır, 2-Doz azaltılmadan doz aralığı açılarak ayarlama yapılabilir. KLİNİK AMİNOGLİKOZİD NEFROTOKSİSİTESİ İÇİN RİSK FAKTÖRLERİ ARTTIRANLAR AZALTANLAR HASTAYA AİT Yaşlı Genç Önceden böbrek hastalığı olan Normal böbrek fonksiyonlu Hipovolemik,Hipotansif Normotensif Hepatik disfonksiyon Karaciğer fonksiyonları normal AMİNOGLİKOZİDE AİT Yakın zamanda aminoglikozid tedavisi Yakın zamanda aminoglikozid kullanmama Yüksek doz Düşük doz 3 gün veya daha uzun süre kullanma 3 günden az kullanma Gentamisin gibi ilaç seçimi Tobramisin gibi ilaç seçimi Sık doz arası Günlük tek doz EŞ ZAMANLI KULLANILAN İLAÇLARA AIT Vancomycin Geniş spektrumlu penisilin Amfoterisin B Furosemid Clindamycin Piperasilin Metoksifluoran İv. kontrast maddeler Serum düzeyleri ve nefrotoksisite Hayvan deneylerinde aminoglikozid dozu arttıkça serum düzeylerinin ve toksisite riskinin arttığı gözlenmiştir.Antibakterial etkinlik için yeterli düzeyin olduğundan emin olmak ve çok yüksek dozdan kaçınmak için serum zirve seviyesi ölçülmelidir.Serum kreatinini 3-5 günde bir izlenmelidir. Ototoksisite Aminoglikozidler irreversible vestibülotoksik ve kohleotoksiktir.Nadiren ikisi birlikte olabilir.Tedaviyi sonlandırdıktan sonra tekrarlayan karşılaşmalarla ortaya çıkabilir.En fazla Streptomycinde görülür. Streptomycine bağlı işitme kaybı ve baş dönmesi bildirilmiştir.İlginç olarak aynı hastada hem nefrotoksisite hem ototoksisite görülmesi alışılmış değildir. Kohlear toksisite İnsidans:Az sayıda aminoglikozid kullanıcısı işitme kaybından yakınır,asemptomatiklerde yüksek frekans audigramlar tekrarlandığında insidans %62 olarak bildirilmiştir. Kohleanın dış tüylü hücreleri aminoglikozidlere en duyarlı hücrelerdir,bunlar yüksek frekanslı seslerin duyulduğu yerdedir.Konuşma sesinde kaybın anlaşılması için 25-30 dB kayıp olması gerekir.Bu yüzden hasta anlamadan bile kohlear hasar oluşabilir. Patofizyoloji:Aminoglikozid toksisitesinin yeri iç kulaktaki corti organının dış tüylü hücreleridir.Toksinin intrasellüler hedefi bilinmemektedir.Bir postulata göre Gentamisin Fe’le birleşir ve toksik serbest radikaller üretir.2. hipoteze göre Aminoglikozidler kohlear sinapslardaki glutamat reseptörlerini aşırı aktive ederler. Tüylü hücre kaybı irreversibledır. Kalıtsal risk:En büyük risk genetik predispozisyon olabilir. Mutant rRNA aminoglikozidlere bağlanır.İlginçtir ki;daha toksik ilaçlara bağlanma (paramomisin,neomisin) diğerlerinden (gentamisin,tobramisin) daha sıkıdır. Diğer risk faktörleri:Risk uzun tedavi,özelllikle böbrek yetmezlikli hastalardaki gibi yüksek serum konsantrasyonları,hipovolemi,özellikle Etakrinik asit gibi ototoksinlerle eş zamanlı kullanım ile artar.Toksik potansiyelin sırası;Neomisin>Gentamisin>Tobramisin> Amikasin>Netilmisin. Eş zamanlı loop diüretikler ve Vankomisin kullanımındada risk artar. Klinik özellikler:Ototoksisite azalmış işitme ve vestibüler imbalansla belli olur. Kohlear hasar ilaç kullanımını bıraktıktan günler veya haftalar sonra olabilir.Kümülatif doz ve tedavi süresi serum konsantrasyonlarından daha önemlidir. Hem kohlear hem de vestibüler toksisite riski renal yetmezlikli hastalarda daha yüksektir. Asemptomatik yüksek ton işitme kaybı daha sık bildirilmiştir;ki öncelikle bu olur. Bazı hastalar erken hasarı gösterebilecek tinnitus veya kulakta dolgunluk hissinden yakınabilirler. Vestibüler toksisite İlaç toksisitesinin hedefi ampulla kristanın tip I tüylü hücreleridir.Bulantı,kusma,vertigo ile kuşkulanılır.Nistagmus olabilir.Tüylü hücre rejenarasyonu olasıdır. Korunma Tedaviyi uygun olduğu kadar kısa tutarak ve peryodik olarak renal fonksiyonları değerlendirerek ototoksisite riski minimalize edilebilir.Tedavi 4 günden fazla sürecekse hastanın odyometri ile yüksek frekans sesleri işitmesi kontrol edilebilir. Nöromuskuler blokaj Nadir ama ölümcül olabilen bir etkidir.Genellikle nöromuskuler iletimi etkileyen bir hastalık durumunda veya eş zamanlı ilaç kullanımında ortaya çıkar.Serum ilaç konsantrasyonunun hızlı artımıda risk faktörüdür. Klinik belirtileri;solunum kaslarında güçsüzlük,flask paralizi,dilate pupil olabilir.DTR ler (-), azalmış veya (+) olabilir.İlaçla karşılaşma intraperitoneal,İv.,İm.,intrapleural,oral,topikal veya retroperitoneal olabilir.Neomisin en potent olanıdır.Streptomisin kullanımında da sık bildirilmiştir. Risk D-tubakürarin,süksinilkolin veya benzer ilaç kullanımıyla artar.Hipomagnesemi, hipokalsemi,Ca kanal blokerleri riski arttırabilir.İnfant botulizmli hastalar risk altındadırDaha önceden var olan solunum depresyonuda risk yaratır.Myastenia gravis ve Parkinson hastalığı olan kişilerde,anestezi sonrası görülebilir. Blokaj presinaptik asetil kolin salınımının inhibisyonu ve post sinaptik asetilkolin reseptörlerinin blokajının sonucudur.Aminoglikozidler Ca un presinaptik bölgeye girişini engeller.Bu asetil kolin salınımından önce gereklidir.Neomisin presinaptik salınımı bozmada en etkili iken, Streptomisin ve Netilmisin post sinaptik en etkilidirler.Blokaj iv. Ca-glukonat uygulanımıyla hızla düzeltilebilir.İnfüzyonu 20-30 dakikada veya daha uzun sürede yapmayla önlenebilir Klinik indikasyonlar Ampirik tedavi Gentamisin,Tobramisin,Amikasin P.auroginosa yıda içerecek şekilde Gr(-),aerob basillere bağlı olduğu düşünülen enfeksiyonların ampirik tedavisinde etkilidir.Aminoglikozidler in vitro S.aureus a etkilidir ama eş zamanlı anti-stafilokoksik ß-laktam veya Vankomisin kullanılmaması halinde 24 saat içinde rezistan küçük koloniler oluşabilir.Enterokok türlerine etki eş zamanlı penisilin veya Vankomisin kullanımını gerektirir.Pnömokok veya anaeroblara etkileri yoktur.Additif veya sinerjistik etki için ß-laktam,Vankomisin veya anaeroblara etkili bir antibiyotikle kombine edilirler.Bazı mycobakteriel enfeksiyonlar hariç bir aminoglikozidi bir fluorokinolonla kombine etmeye gerek yoktur. Belirtilen enfeksiyonların ampirik tedavisinde başka antimikrobiklerde eşit etkiyi sağlıyabilir. Febril nötropenik hastalarda aminoglikozid monoterapisiyle yüksek oranda yetersizlik olduğundan aerob Gr(-) basillere etkili bir ß-laktamla kombine kullanılır. Klinik deneyler geniş spektrumlu penisilin ve sefalosporinlerin, ß-laktamazsız ß-laktam ve fluorokinolonların aminoglikozidlerin Gr(-) basillere etkisinin yerini alabileceğini göstermektedir. AMİNOGLİKOZİDLER İÇİN AMPİRİK İNDİKASYON ÖRNEKLERİ(Diğer antibiyotiklerle kombine başlangıç kullanımı) Enfeksiyon tipi Örnek Olası bakteriyemi Kaynak bulunamayan ateş Yanık yarası Yanık yarası enfeksiyonu Enfektif endokardit Strep.,Enterokok,Staf. Intra-abdominal Apendisit,Divertikülit,Kolesistit,Peritonit Menenjit Post-travmatik,Post-operatif Nötropeni ve ateş Kemoterapi sonrası Okuler Endoftalmit Osteomyelit/Septik artrit Post-op. Veya Post-travmatik Otit Diabetik hastada maligne external otit Pnömoni Respiratuara bağlı pnömoni Pyelonefrit Kronik Foley kateter enfeksiyonlu hastalar Seksüel geçişli hastalık PID Deri-Subkutanöz doku Enfekte diabetik ayak Spesifik tedavi Eğer P.auroginosa izole edilirse bir aminoglikozid bir antipseudomonal penisilin (Tikarsilin) veya sefalosporinle (Seftazidim) kombine edilir,Rifampisinde eklenebilir.Non-nötropenik orta ciddiyette GÜSE unda aminoglikozidle monoterapi yeterli olabilir. P.auroginosa için Tobramisin daha etkili olduğunda tercih edilebilir.Gentamisin Serratia ya daha etkilidir.Diğer aerob Gr(-) basiller için Amikasin,Gentamisin,Netilmisin ve Tobramisin eşit etkinlikte görünmektedir. Bruselloz tedavisinde Gentamisin + Doksisiklinin,Tularemide Streptomycin ve Gentamisinin etkinliği kanıtlanmıştır. Aminoglikozidler görüldüğü gibi genelde kombinasyon tedavilerinde kullanılır.Değişik sınıflardan aerob Gr(-) basillere etkili ilaçların artmasıyla aminoglikozid tedavisine 2-3 günden sonra devam etmemek hem olası hemde önerilendir.Böylece hem aminoglikozidlerin etkinliğinden yararlanılır hemde toksisite riskinden kaçınılır. AMİNOGLİKOZİDLER İÇİN SPESİFİK ENDİKASYONLAR PATOJEN AMİNOGLİKOZİD KOMBİNASYONDA KULLANILAN İLAÇLAR Aerob Gr(-) basil Klebsiella Amikasin,Gentamisin,Netilmisin,Tobramisin Antipseudomonal Pen.,Geniş spektrumlu Sef. Enterobakter aerogenes Amikasin,Gentamisin,Netilmisin,Tobramisin Antipseudomonal Pen.,Geniş spektrumlu Sef. Serratia marcescens Gentamisin Antipseudomonal Pen.,Geniş spektrumlu Sef. Francisella tularensis Streptomycin,Gentamisin Brucella abortus Gentamisin veya Streptomycin Doksisiklin Yersinia pestis Streptomycin,Gentamisin Vibrio vulnifikus Amikasin,Gentamisin,Netilmisin,Tobramisin Geniş spektrumlu Sef. Aerob Gr(+) kok Viridans strep. Gentamisin Pen. G Enterococcus faecalis Gentamisin Pen. G Staf. aureus Gentamisin Nafsilin Staf. epidermidis Gentamisin Vancomisin (Rifampin) N.gonorrhoeae Spektinomisin M.avium-intracellulare Amikasin Çoklu M.tbc. Streptomycin Çoklu Entamoeba histolytica Paromomycin Cryptosporidium parvum Paromomycin Profilaksi GIS,GÜS cerrahileri hastaya enterokok bakteriyemisi riski yaratır.Valvüler kalp hastalığı varsa Ampisilin + Gentamisin profilaksisi önerilir.Penisilin alerjik hastalarda ampisilin yerine Vankomisin kullanılabilir. Özetle; Streptomisin; 1-Tbc. tedavisinde genellikle INH ve Etambutolle birlikte, 2-Bakteriyel endokarditte penisilinle kombine, 3-Brusellozda tetrasiklinlerle birlikte, 4-Tularemi ve vebada ilk ilaç olarak kullanılır. Neomisin;topikal veya barsak sterilasyonu amacıyla oral kullanılır. Kanamisin;yedek bir antitüberkülostatiktir. Yalnızca İYE da tek başlarına kullanılırlar,bunun dışında genelde bir ß-laktamla kombine kullanılır. Başlıca indikasyonları; 1-Hastanede gelişen pnömonilerden genellikle Gr(-) basiller sorumlu olduğundan tedavide bir antipseudomonal penisilin veya sefalosporinle kombine bir aminoglikozid kullanılır. 2-Nasokomial bakteriyemilerin ampirik tedavisinde bir aminoglikozidle bir ß-laktam kombine kullanılır. 3-Hatanede yatan hastalarda ürolojik cerrahi bir işlem sonucu veya ürogenital anomolisi olanlarda çoklu dirençli bakterilerin etken olduğu ağır ürogenital enfeksiyonlarda genellikle bir 3. kuşak sefalosporinle kombine kullanılır. 4-Bakteriyel endokarditlerin ampirik tedavisinde sinerjik etkilerinden yararlanmak amacıyla genellikle penisilinle kombine kullanılır.Etken üretilebilirse antibiyograma göre bir ß-laktamla Streptomisin veya Gentamisin kombine edilir. 5-İntraabdominal infeksiyonların tedavisinde;bir aminoglikozid,Klindamisin,bir 5-nitroimidazol türeviyle veya Sefoksitinle kombine kullanılır. 6-Nötropenik hastada ateş durumunda bir anti-pseudomonal ß-laktamla bir aminoglikozid birlikte kullanılır. 7-Hastanede gelişen infeksiyöz artrit ve osteomiyelit tedavisinde kombine tedavide aminoglikozidler yer alır. 8-Pseudomonaslara bağlı maligne otit ekstarna tedavisinde aminoglikozidler, bir anti-pseudomonal penisilin veya anti- pseudomonal sefalosporinlerle birlikte kullanılır. 9-Pseudomonas ve enterobakter gibi dirençli Gr(-) basillere bağlı menenjitlerde,3. kuşak sefalosporinlerle kombine olarak kullanılırlar.Aminoglikozidler BOS a tedavi edici dozlarda geçemezlersede menenjit tedavisinde sinerjik etkilerinden yararlanmak amacıyla veya intratekal ya da intraventrüküler uygulanırlar. KLİNİK KULLANIMLARI:TEK BAŞLARINA;Gr(-) bakteriyal enfeksiyonlar Üriner sistem enfeksiyonları Nosokomial pnömoni Menenjit Bakteriyemi Diğer(Osteomyelit,Peritonit vb.) KOMBİNE TEDAVİDE:Pseudomonal enfeksiyonlar İnfektif endokardit Nötropenik konakçıda ciddi enf. Intraabdominal ve pelvik enf. Brusellozis Tbc. Aminoglikozidlerin doz ayarı Normal renal fonksiyonlu hastalar için aminoglikozidler multiple dozda uygulanabilir,bu Streptomycin ve Amikasin için 2×1,Gentamisin,Tobramisin;netilmisin için 3×1 dir. Multiple günlük doz Yükleme dozu:Bu doz renal fonksiyonlardan bağımsızdır. Ciddi yanıklı,asitli,ödematöz durumlarda dağılım hacmi artar.Tersine dehidratasyon veya kas yıkımı dağılım hacmini azaltır. İv. tedavi edilen hastalar için yükleme dozu 15-30 dakika içinde verilmelidir. İdame dozu:Hesaplanması böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesini gerektirir.GF yaşla ve bazı hastalıklarla azalır.GFR ını endojen keratinin klirensi yansıtır. Kas kitlesinde ciddi kayıplı hastalıklar düşük serum kreatinine yol açar. Normal böbrek fonksiyonu:Serum zirve ve daimi seviyelerinin idame dozunun 2.-3. dozlarından sonra ölçümü önerilir.3-5 günde bir serum kreatinine bakılır.Kreatinin değeri stabilse aminoglikozid ölçümü şart değildir.Böbrek fonksiyonları değişirse doz yeniden hesaplanır. Renal fonksiyon yetmezliği:Doz ayarlamasında 2 metod vardır; 1-Aynı dozda araları açmak, 2-Dozu azaltıp Gentamisin ve Tobramisin için 8,Amikasin için 12 saatte birle devam etmek. Dializ hastalarında dozlama:Hemodializ,peritoneal dailiz aminoglikozid klirensini arttırır. Hemodialize alınan hastalarda kabaca dolaşan aminoglikozidin 2/3 ü alınır.Aminoglikozid klirensi dializ membranın yapısına,dializ süresine,hastanın kan basıncına bağlı olarak değişir. Aminoglikozidin post dializ dozundan sonra serum zirve seviyesinin ölçümü önerilir. Günde tek doz uygulama Günde tek doz aminoglikozid tedavisi konsepti 3 farklı ama ilişkili gözlemden kaynaklanmıştır; 1-Hayvanlarda deneysel nefrotoksisite ve ototoksisitenin günlük tek doz uygulamayla aynı dozun 2-3 doza bölünerek uygulanmasından daha az ciddi olması;Günlük tek doz verilen hayvanlar renal kortexte daha az ilaç biriktirirler.Aynı sonuç elektif nefrektomiden önce aminoglikozid almayı kabul eden hastalarda da gözlenmiştir. 2-Aminoglikozidlerin in vivo ve in vitro aerob Gr(-) basillere PAE göstermesi;PAE nin süresi arttıkça aminoglikozid zirve konsantrasyonu artar.Normal hayvanlarda PAE nötropenik olanlardan uzundur. 3-Aminoglikozidlerin antibakteriyal etkinliğinin yüksek zirve konsantrasyonuyla artımı. Günlük tek doz uygulama enfekte hayvan modellerinde güvenli ve etkili bulunmuştur. Klinik çalışmalar:Özet olarak günlük tek aminoglikozid uygulaması; 1-Geleneksel multiple doz metodu kadar etkilidir. 2-İlaca bağlı nefrotoksisite ve ototoksisite riskini azaltır. 3-Daha ucuz ve kolaydır. 4-Enterokok endokarditli hastalarda kullanılmamalıdır. 5-Hamilelik,Kistik fibroz,aerob Gr(-) basil menenjitlerive osteomiyelitte kullanımı için daha ileri çalışmalar gerekmektedir. 6-Çok ağır,ventile edilen hastalarda bile nöromusküler fonksiyonu kötüleştirmemektedir.Buna karşın hızlı iv. infüzyondan sakınılmalıdır. Total günlük doz-Normal böbrek fonksiyonlu:Normal böbrek fonksiyonu CrCl 80 ml/dk olarak tanımlanır.Bu hesaplama serum kreatininin 0.5 mg/dl olduğu az kas kütlelilerde yetrsiz kalabilir. Bir yaklaşım FDA nın kanıtlanmış multi doz rejimleri için olanın toplamını kullanır; Gentamisin,Tobramisin için 3×1.7 mg/kg dan 5.1 mg/kg/g,Netilmisin için 6 mg/kg/g, Amikasin için 15 mg/kg/g.Bu metodun avantajı dozdan 12-18 saat sonra serum düzeyinin 1 µg/ml nin altına düşeceğinden ve nefrotoksisite riskini azaltacağından emin olmaktır. Disavantajı;ödematöz durumda (KKY,asit)artan volümden veya bakteriyeminin sonucu olarak kapillerlerden sızıntı yüzüden artmış ilaç dağılım hacmine bağlı olarak Gentamisin ve Tobramisin için hedflenen serum konsantrasyonu 16-24 µg/ml nin sağlanmasının yetersizliğidir. 2. bir metod ortalama serum konsantrasyonunu ve bakterisidal aktiviteyi arttırmak için Gentamisin veya Tobramisinin günlük dozunu 7 mg/kg/g e arttırmaktır.Yüksek doz artmış volümlü hastalarda avantajlıdır ve nöromusküler blokaj bildirilmemiştir.Multiple günlük dozda olduğu gibi obesite söz konusuysa ayarlama yapılmalıdır. Çok ağır hastalar için Gentamisin ve Tobramisin 7 mg/kg/g den başlanıp sonradan birkaç gün içinde 5.1 mg/kg/ge inilebilir. Total günlük doz-Bozuk böbrek fonksiyonlu:Bir metod günlük dozu CrCl indeki düşmeyle orantılı olarak azaltır. CrCl i 30-80 ml/dk olanlar için doz aralığı 24 saat,30 ml/dk dan azlar için 48 saate uzatılabilir. CrCl i 40 ml/dk dan az olanlar için günlük tek dozun teorik avantajı ortadan kalkar. 2. metod total günlük dozu azaltmadan dozların arasını açar. Günlük tek doz rejimlerinde serum düzeyinin izlenmesi:Kürün başında serum düzeylerine bakmak şarttır.Serum zirve seviyesi etkili olmalı ve devamlı düzey toksisite riskini azaltmalıdır. Stabil renal fonksiyonlu 3 günden fazla tedavi alan hastalarda ek serum düzeyleri gereksizdir. CrCl si haftada 1-2 kez ölçülmelidir,değişiklik dozu değiştirmeyi gerektirir. Özel durumlar Çocuklar Yenidoğan ve infantlarda Aminoglikozidlerin farmakokinetiği yetişkinlerden farklıdır;renal klirensleri azalmıştır;yarı ömürleri uzar,doz azaltılmalıdır.Normal doğum ağırlıklı infantlarda 7 günden sonra yarı ömür yetişkinlerinkine yaklaşır. Yenidoğanlarda yetişkinlere kıyasla aminoglikozid dağılım hacmi vücut ağırlığı yüzdesine göre daha fazladır. Günlük tek doz deneyimi sınırlıdır,ama etkili bulunmuştur. Kitik fibroz İlerlemiş KF lu hastalar P.aeroginosa nın hava yolu kolonizasyonuna mağdurdurlar.Hastalılk ilerledikçe trakeobronşit ve pnömoni episotlarının sıklığı artar ve bu anti-pseudomonal ß laktam ve aminoglikozid kombinasyon tedavisini kaçınılmaz kılar. KF lularda kronik tedavi ihtiyacından dolayı aminoglikozid tedavisi azalmış farmakokinetik (glomerüler filtrasyonda artma,kısa yarı ömür ve artmış dağılım hacmi nedeniyle), azalmış antibakteriyel etkinlik (mukusa gömülmüş organizmalara ulaşmada güçlük ve bakterinin olası azalmış replikasyonundan dolayı) ve ototoksisite riski (özellikle kohlear) yüzünden komplikedir.End-stage KF lu ve aylarca kontinüe aminoglikozid tedavisi ihtiyacı olan hastaların çoğu kohlear hasar vae sağırlıktan yakınır.Nefrotoksisite ve vestibüler toksisite nadirdir. Parenteral tedavi:İlacın dozu arttırılmalıdır.Genellikle P.aeroginosa ya karşı düşük MIC i olduğundan dolayı Tobramisin seçilir. Günlük tek doz tedavisi alternatif bir yaklaşımdır. Aerosol tedavi:Avantajları:Balgamda yüksek ilaç seviyesi sağlaması,daha az sistemik ilaca maruz kalma,hastanın evde kendi uygulıyabilmesi ve akciğer fonksiyonlarında artmadır. Yetişkinler ve 6 yaş üstü çocuklar için FDA nın onayladığı doz 28 gün nebülazatörle 2×1 300 mg.dır.Sonra 28 gün ara verilip tekrarlanır. Seruma emilim azdır.Ototoksisite bildirilmemiştir ama geçici tinnitus olabilir.Nefrotoksisite gözlenmemiştir.Pahalıdır. İnfektif endokardit Aminoglikozidlerin enterokoklara etkisi için hem bir hücre duvarı etkin bir antibiyotiğin (Ampisilin) hemde aminoglikozidin devamlı varlığı gerekmektedir.Viridans Sterp. ve enterokok endokarditi için Pen. G + Gentamisin (Normal böbrek fonksiyonlularda;3 mg/kg/g 3×1) önerilmektedir. Devamlı ambulatuar peritoneal dializ sırasında peritonit Aminoglikozidler duyarlı organizmaların yapacağı dialize bağlı peritoniti tedavi için peritoneal dializ sıvılarında kullanılırlar.Bu şekilde ilaç kullanımı sistemik hastalığı olanlar için önerilmez. Spektinomisin ve gonore Spektinomisin gonokok enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılır.T.pallidium ve Cl.trachomatis te etkili değildir.Tükrükte terapötik konsantrasyona ulaşmadığından faringeal gonokoku elimine etmez.Nefrotoksik ototoksik değildir.Komplike olmayan üretral,servikal ve dissemine gonore tedavisinde kullanılır.Penisiline alerjik veya gonokokun penisilinaz üreten türleriyle hasta olanlarda alternetiftir.Cervix veya üretra enfeksiyonunda 2 gr. tek sefer im. uygulanır.Gonokoksemi için 3 gün 12 saatte bir 2 gr. im. önerilir.İv. formu yoktur. PREPARATLAR:Amikasin sulfat;Amikaver Netilmycin;Netromycine Amiklin Streptomycin sülfat;Enteristin Amikozit Guanamisin Mikasin Strep-Deva Gentamisin sülfat;Garamycin Otomygen Tobramycin sülfat;Nebcin Gensif Thilomaxine Genta Tobel Gentaderm Tobrased Gentagut Tobrex Gentamin Tobsin Gentasol Genthaver Gentreks Getamisin

http://www.biyologlar.com/aminoglikozidler

Bakterilerin Üremelerine Etkili Faktörler

Mikroorganizmalar bulundukları ortamlarda (kültürler de dahil), optimal koşullar altında, cins ve türlerinin genetik karakterine göre, iyi bir üreme ve gelişme gösterirler. Ancak, bu uygun şartlar, aynı durumda uzun bir süre devam etmez ve belli bir zaman sonra, mikroorganizmaların üremeleri sınırlanır ve durur. Eğer, olumsuz koşullar değiştirilmezse veya iyileştirilmezse, mikroorganizma populasyonunda ölümler başlar, giderek artar ve canlı mikroorganizma sayısında azalmalar meydana gelir. Ancak, canlı kalmayı başarabilen mikroplarda da, morfolojik bazı değişiklikler (şekillerinde bozukluklar: flamentöz, branşlı, pleomorfik ve diğer aberent formlar) ortaya çıkar. Yukarıda bahsedilen durumlar, genellikle, doğal koşullar altında meydana gelen bazı olumsuz faktörlerin mikroorganizmaların üremeleri üzerine olan etkilerini kapsamaktadır. 1 "Temel Mikrobiyoloji; Genişletilmiş İkinci Baskı. Prof. Dr. Mustafa Arda. Medisan Yayın Serisi no 46. 2000. Medisan Yayınevi, Ankara" adlı kitabın 09. bölümüdür. Böyle etkiye sahip faktörleri başlıca 4 grupta toplamak mümkündür. Bunlar da, 1) Fiziksel faktörler 2) Kimyasal faktörler 3) Biyolojik faktörler 4) Mekanik faktörler 02. Fiziksel Faktörler Yeryüzünde (toprakta, sularda, göllerde, denizlerde, havada, evlerde, barınaklarda, vs.) ve canlıların vücudunda, değişik fiziksel, kimyasal biyolojik ve doğal koşullara adapte olmuş, yaşayan ve üreyen mikroorganizmalar bulunmaktadır. Bakteriler, 20° Güney paralelinden 90° Kuzey paraleline kadar, okyanus sularında, değişik derinliklerde ve ortamlarda oldukça farklı hidrostatik basınç altında kolayca yaşayabilecek tarzda bir adaptasyon göstermektedirler. Bazıları da sıcak su kaynaklarındaki 100°C civarındaki sıcaklıkta ve bir kısmı da donma derecesindeki çevrede kolayca yaşayabildikleri belirlenmiştir. Doğada bu kadar değişken, fazla ve olumsuz koşullara direnç gösteren ve adapte olan mikroorganizmalardan ancak çok azı canlılarda hastalık oluşturabilmektedir. Çünkü, ekseri patogenlerin üreyebildiği sınırlar, üzerinde veya içinde yaşadıkları canlılarınki ile bir uyum göstermektedirler. Maksimal veya minimal sıcaklık sınırlarına yaklaşıldıkça veya geçildikçe, mikroorganizmalar üreseler bile virulens faktörlerinin etkinliğinde inhibisyon veya zayıflamalar oluşmaktadır. Kapsüllü mikroplar, bakteri ve mantar sporları çevre koşullarına çok dayanıklıdırlar ve uzun süre (yıllar) canlı kalabilir ve infeksiyöz yeteneklerini koruyabilirler. Mikroorganizmaların üremeleri üzerine etkileyen önemli fiziksel faktörler aşağıda özet olarak belirtilmiştir. 02.01. Isının Etkisi Mikroorganizmalar üzerine ısı başlıca iki tarzda etkilemektedir. A) Sıcağın etkisi: Ortamın sıcaklığı, mikroorganizmaların üremeleri üzerine büyük ölçüde etkiler. Mikroplar, genellikle, kendi türlerine özel sıcaklık limitleri (minimal ve maksimal) içinde gelişebilir ve üreyebilirler. Bu sınırlar arasında, üremenin en iyi meydana geldiği optimal sıcaklık bulunur. Bu uygun sıcaklıktan minimal veya maksimal hudutlara doğru gidildikçe üremenin yavaşladığı ve bu sınırları geçince üremenin durduğu görülür. Optimal sıcaklık maksimalden 5-10 derece daha düşük olmasına karşın, minimal sıcaklıktan genellikle 20-30 derece daha yüksektir. Maksimal limitin aşılması halinde yalnız üremede durma meydana gelmez, sıcaklığın yüksekliğine göre, mikroplarda az veya çok oranda ölümler de başlar. Buna karşılık minimal sıcaklık sınırının geçilmesi halinde üremede duraklama meydana gelir. Ölümler, sıcaklığın düşme hızına ve sıcaklık derecesine göre çok az olur. Mikroorganizmalar arasında sıcaklık limitleri bakımından bazı ayrılıklar vardır. Bu durum, mikropların doğal adaptasyon ve seleksiyonları sonu oluşmuştur. Patogenik mikroplar, en iyi gelişme ısısını (optimal sıcaklık), adapte oldukları konakçının içinde bulurlar. Diğer bir deyimle, bu tür mikroorganizmalar en iyi, konakçı sıcaklığında ürerler. Bu nedenle de, hastalık yapıcı karakterde olan mikropların üreme sıcaklığı varyasyonları çok geniş olmayıp, belli ve dar limitler arasında bulunmaktadır. Buna karşın, saprofitikler ve doğada serbest yaşayan diğer mikroorganizmaların, sıcaklık genişlik limitleri arası daha geniştir. Optimal sıcaklık, mikropların gelişmesi ve üremeleri için genellikle iyi olmasına karşın, bazı yan ürünlerin (çeşitli metabolitlerin, enzim, toksin, endüstride değeri olan ürünlerin, vs.) sentez edilebilmesi için her zaman uygun olmayabilir. Optimal sıcaklık, hücre içinde enzimlerin aktivitesi için de genellikle, uygun kabul edilir. Sıcaklık arttıkça veya azaldıkça, enzim aktivitesinde de değişiklik oluşacağından, metabolizma üzerine olumsuz yönde etkiler. Mikroorganizmalar üreme sıcaklığı derecelerine göre başlıca 3 bölüme ayrılırlar: a) Soğuk seven (psikrofil) mikroplar: Toprak, su, deniz ve göllerde yaşayan bazı mikroplar ile balıklarda ve soğuk kanlı hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmalar bu bölüme girerler. Balıklarda hastalık meydana getiren gerek Gram negatif (A. salmonicida, C. psychrophila, H. piscium, V. anguillarum, vs.) ve gerekse Gram pozitif (korinebakteri, mikobakteri türleri, vs.) mikroplar 15-20°C arasında iyi gelişme olanaklarına sahiptirler. Soğuk seven bazı mikroplar ve mantarlar buzdolabı sıcaklığında (+4 °C' de) kolaylıkla üreyebilir ve gıdaları bozabilirler. Bu nedenle psikrofilik mikroorganizmaların enzimleri -5°C ile +20 °C' ler arasında aktivite gösterebilirler. b) Ilık seven (mezofil) mikroplar: Bu mikroplar, genellikle 20-45 °C' ler arasında gelişme ve üreme kabiliyetlerine sahiptirler. İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmaların büyük bir kısmı, bu gruba dahildirler. Bu nedenle optimal sıcaklıkları 35 °C ile 42 °C' ler arasıdır. Mezofil mikroorganizmalar, 65 °C' de 20 dakikada ve pastörizasyon sıcaklığında (70 °C' de bir dakikada) ölürler. c) Sıcak seven (termofil) mikroplar: Termofilik mikropların gelişme ve üreme sıcaklıkları, mezofillerin çok üstündedir (50-60 °C). Mezofiller bu sıcaklıkta yaşayamazlar. Bu tür mikroplara, sıcak su kaynaklarında, gübrelerde ve tropikal ülkelerde rastlamak mümkündür. Termofil mikroplar ve sporlar pastörizasyon ısısına dayanıklıdırlar. Sütlerin pastörizasyonundan sonra da ısıya dayanıklı birçok mikroplar canlı kalırlar. Konserve gıdaların sterilizasyonu bu nedenle önem kazanmaktadır. T. aquaticus, B. stearothermophilus, bu tür mikroplara örnek verilebilir. Mikroplar yüksek sıcaklıkta ölürler. Ancak, sıcaklık yardımı ile ölme üzerine, sıcaklıktan başka, birçok faktörlerin de etkisi bulunmaktadır. Bunlar da kısaca şöyledir: 1- Yüksek sıcaklık: Maksimal limiti aşan sıcaklık, mikropların karakterine göre kısa ve uzun bir süre içinde ölümlere neden olur. Psikrofilik mikropların çoğu 30-35 °C' de, mezofillerin ekserisi 65 °C' de 20-30 dakikada, termofiller ise 80-90 °C' de tahrip olurlar. Sporlar 100-110 °C' de ve bütün mikroorganizmalar da rutubetli sıcaklıkta 120 °C' de 15-20 dakika içinde ölürler (sterilizasyon). 2- Mikrop türü: Mikroorganizmaların vegetatif formları, kapsüllü ve sporlu olanlardan daha erken ölürler. B. anthracis 'in sporları 100-110 °C' de 10-15 dakika canlı kalabilir. Buna karşın doğa koşulları altında 40-50 sene yaşayabilir ve hastalık yapma kabiliyetini muhafaza edebilir. Tüberküloz mikroorganizmalarının etrafında bulunan balmumu tabakası, bunları çevresel koşullarının her türlü olumsuz etkisinden koruduğu gibi ısıya da dayanıklı hale  getirir. Isıya direnç bakımından mikroplar arasında farklar bulunmaktadır. 3- Mikrop sayısı: Bir ortamdaki ve kültürdeki mikrop sayısı arttıkça, bunları öldürmek için geçen süre de, artar. Bu artış, mikrop sayısındaki her logaritmik azalış için, bir sıcaklık birimi kadardır. Çünkü, belli zaman dilimleri içinde populasyonda belli oranda logaritmik azalmalar olur. Örn. başlangıçta kültür içinde 24 milyon mikrop varsa, 100 °C' de ilk dakika sonunda 24x 105, ikinci dakikada 24 x 105, üçüncü dakikada 24 x 103, dördüncü dakikada 24 x 102,.... ve böylece mikroorganizma miktarı ile orantılı olarak süre de uzayacaktır. Ancak, bu rakamlar yaklaşık olup tam kesin değildir. 4- Ortamın bileşimi: İçinde yağ, protein, mukoid sıvılar, organik maddeler, vs. bulunan ortamlardaki mikroplar daha yavaş ve geç ölürler. Bazı durumlarda da, eğer süre ve sıcaklığınderecesi uygun değilse, ölmeyebilirler. Besiyerlerinin viskozitesi arttığında  sıcaklık iletme kabiliyetinde azalma meydana gelir. Bu durumun, göz önünde tutulması gerekir. 5- Ortamın pH 'sı: Mikroorganizmalar, optimal pH derecelerinde ısıya karşı dayanıklı, maksimal ve minimal pH limitlerine doğru dirençlerinde azalmalar meydana gelir. 6- Mikropların üreme durumları: Sıvı kültürlerde üreme döneminde olan mikroplar, ısıya durma veya ölme periyodlarından daha duyarlıdırlar. 7- Rutubet: Rutubetli sıcaklık, kuru sıcaklıktan daha etkilidir. Otoklavda (rutubetli sıcaklık) 115 °C' de 15 dakikada ölen sporlar, Pasteur fırınında (kuru sıcaklıkta) 150 °C' de bir saatte ölürler. 8- Süre: Süre ne kadar uzun olursa, sıcaklığın mikroplar üzerinde olan etkisi de artar. 9-Soğuğun etkisi: Mikroorganizmalar soğuğa sıcaktan, daha fazla dayanırlar. Minimal sıcaklığı geçince üremeleri duran mikroplar, bu limit çok aşılsa bile ölmedikleri görülür. Soğukluk –80 °C veya –190 °C olunca canlılıklarını ve infeksiyöz kabiliyetlerini uzun süre (yıllarca) koruyabilmektedirler. Bu nedenle, mikroorganizmalar (bakteri, mantar, virus) ve çeşitli hücreler (doku hücreleri, sperma, vs.) sıfırın çok altında (-190 °C' de) muhafaza edilmektedirler. Ancak, bazı mikropların özel duyarlılığını da göz önünde tutmak gereklidir. Ayrıca, donarken ve çözülürken populasyonda canlılık miktarında ve hastalık oluşturma yeteneğinde de azalmalar meydana gelir. Bakterilerin hücre duvarı, donma ve çözülme sırasında parçalanabilir. Eğer mikroorganizmalar çok kısa süre içinde dondurulur, kurutulur ve havası alınmış ampuller içinde saklanırsa uzun yıllar canlılıklarını ve aktivitesini koruyabilir (liyofilizasyon). Mikropların ve hücrelerin liyofilizasyonunda, steril yağsız süt, serum, gliserin, laktalbumin, sodyum glutamat, vs. gibi ara maddelerden yararlanılır. Çeşitli sıvılar ve serumlar aynı şekilde, ya çok soğuk derecelerde veya liyofilizasyon suretiyle uzun yıllar muhafaza edilmektedirler. Mikroorganizmaların sıcaklık ile ilişkili fizyolojik karakterlerini saptamada bazı özel kriterler konulmuştur. Bunlardan biri, termal ölüm noktasıdır. Bu nokta, belli bir yoğunluk ve ortamda üretilen mikropların, 10 dakika içinde ölebildikleri en düşük sıcaklık derecesidir. Bu limit mikroplar arasında değişiklik gösterir. İyi bir kontrol sağlandığı takdirde, konservecilikte, süt ve gıda maddelerinin muhafazasında yararlar sağlayabilir. Diğer bir nokta da, termal ölüm süresidir. Bu süre, belli sıcaklık derecesinde veya sabit bir sıcaklık derecesinde bütün mikropların ölmesi için geçen zamanı kapsar. Bu süreye, ortamın viskozitesi, pH' sı, mikroorganizmaların tür ve yaşı, mikrop sayısı ve çevresel koşullar fazlasıyla etkiler. Aynı etkenler, termal ölüm noktasına da tesir ederler. 02.02. Radyasyonun Etkisi Radyasyon, boşlukta veya materyal bir ortamda enerjinin dalgalar halinde yayılması olayıdır. Pratikte mikrobiyoloji alanında radyasyonlardan başlıca iki amaçla yararlanılır. 1- Sterilizasyon ve dezenfeksiyon, 2- Mutasyonlar oluşturmak için Radyasyonlar karakterlerine göre başlıca iki türdür A) İyonizan olmayan radyasyonlar 1- Ultraviolet (mor ötesi) ışınları, 2- İnfrared (kızıl altı) ışınları, 3- Ultrasonik (ses ötesi) dalgalar. B) İyonizan radyasyonlar I). Elektromagnetik radyasyonlar 1- İks (X) ışınları, 2- Gama ışınları. II).Partiküler radyasyonlar 1- Alfa ışınları, 2- Beta ışınları, 3- Katot ışınları Mikrobiyolojide en çok kullanılan radyasyonlar ultraviolet ışınları, X ışınları, gama ışınları, katot ışınları ve ultrasonik vibrasyonlardır. 02.02.01. İyonizan Olmayan Radyasyonlar Ultraviolet (UV-) ışınları: Bunların dalga uzunlukları, diğer ışınlardan daha büyüktür. UV- ışınlarının kuvantum enerjisi düşük olduğundan iyonizasyon oluşturamaz ve ancak moleküllerde ekzitasyonlar meydana getirirler. Ultraviolet ışınlarının dalga boyları 10 nm ile 380 nm (100 A°-3800 A°) arasında değişmektedir. Bu ışınların bakteri, mantar, virus, spor ve hücreler üzerine letal etkileri vardır. Pratikte UV-ışınları, cıva buharlı lambalardan elde edilir. Derinlere girememeleri nedeniyle, hastanelerde operasyon odalarının ve bazı özel yerlerin havasını ve burada bulunan eşyaların yüzeyini sterilize etmekte kullanılır. UV-ışınlarının mikroplar üzerine, letal etkilerinden başka, mutagenik olarak ta tesir eder. Proteinlerin, özellikle, nukleik asitlerin, bu ışınlara karşı olan özel affiniteleri nedeniyle kolayca absorbe edilirler. Bunun sonucu olarak ta, DNA iplikçiklerinde yan yana bulunan timinler arasında bağların kurulması (timin dimerleri) olayı meydana gelir (dimerizasyon). Oluşan bu dimerizasyon, DNA'nın normal yapısını çarpıtır. Bu durum DNA replikasyonuna, transkripsiyona ve dolayısıyla da translasyona etkileyerek bakteride protein sentezin ve diğer mekanizmaları bozar ve ölümlere neden olur. UV-ışınlarının dozajı artarsa bu sefer timin dimerleri yanı sıra, sitozin dimerleri de oluşmaya başlar ve ölümler çoğalır. Absorbe edilemeyen ışınların DNA üzerinde etkileri çok zayıf veya yoktur. Dalga uzunlukları 300 nm.'den aşağı olanlar daha fazla absorbe edilirler. Cam, su ve organik maddeler, UV-ışınlarını absorbe ederek etkisini azaltırlar. Oksijensiz ortamlarda daha etkili olabilen UV-ışınları, gözün retinası üzerinde bozukluk yaptığından, UV-ışınları bulunan bir odaya özel gözlük takarak veya UV-ışığı söndürülerek girilir. Absorbe edilen UV-ışınları ve görülebilen ışınların, kuvantum enerjileri fazla olmadığından maddelerin atomlarından elektronların çıkmasına neden olacak güçte değildirler. Bu nedenlerle iyonizasyon yapamayıp, ancak elektronlar arasındaki aktivasyonu artırarak yüksek enerji oluştururlar (ekzitasyon). Bu da fotokimyasal olaylara neden olur ve bazı bozukluklar meydana getirir. Atomlardan elektronların çıkabilmesi için radyasyon enerjisinin 10 elektrovolttan daha yüksek olması gereklidir. Bu yüksek enerji, atomları iyonize ederek bazı elektronların çıkmasına sebep olur (iyonizasyon). Bu tür enerjiye X ve gama ışınları sahiptirler. Kuvantum enerjinin (elektromagnetik dalgaları oluşturan en küçük enerji demetleri) derecesi,dalga uzunluğu ile ters orantılıdır.  Buna karşılık bir biyolojik sistem tarafından absorbe edilen kuvanta miktarı, radyasyonun süresi ve yoğunluğu ile doğrusal orantılıdır. Bir atomdaki elektronların kuvantum absorbsiyonu, molekülün aktivasyonuna yol açar. Bu da, kimyasal reaksiyonlarda ekstra enerji olarak kullanılır veya kaybedilir (fluoresens, sıcaklık, vs). Fotoreaktivasyon: Eğer bakteri hücreleri UV-ışınlamasından sonra hemen, görülebilen ışınlara (300-400 nm. dalga boyu) tutulursa, UV-ışınlarının letal etkileri azalır. Bu olay, UV- ışınlaması sonu oluşan primidin dimerlerinin görülebilen ışınlarca aktive edilen özel enzimler tarafından, hidrolize edilerek giderilmesi sonu meydana gelir. Böylece, dimerler ortadan kaldırılarak bozukluk tamir edilir. Işıkta yapılan bu tamir mekanizması yan ısıra bakterilerde, karanlıkla iş görebilen ve dimerizasyonu gideren diğer bir tamir sistemi daha bulunmaktadır (karanlıkta tamir). Bu mekanizmada 4 enzim (endonuklease, ekzonuklease, DNA polimerase, polinukleotid ligase) görev alır ve bozulan bölgeyi tamir ederler. 02.02.02. Güneş Işınları Güneş ışınları dünya için iyi bir radyasyon kaynağıdır. Güneş ışınlarını, görülebilen ışınlar, UV-ışınları, infrared ışınları ve radyo dalgalar oluşturur. Özellikle ısınmayı da infrared ışınları sağlar. Görülebilen ışınların, dünyadaki yaşam için önemi çok fazladır. Fotosentetik organizmalar ışık enerjisinden yararlanırlar. Güneş ışınlarının %60'ını infrared ışınları teşkil eder. Dünya yüzeyine ulaşan UV-ışınlarından 290-300 nm dalga boyunun altında olanları çok azdır. UV-ışınlarının 287 nm' nin altında dalga boyuna sahip olanlar atmosferdeki oksijen tarafından absorbe edilir. Bu işlemi, dünyadan 35-55 km. yukarda bulunan ozon (O3) tabakası yapar. Ozon tabakası, daha uzun dalga boyundakileri de absorbe ederek tekrar oksijen oluşturur. Güneş ışınları (UV-ışınları), mikroorganizmalar üzerine, hem mutasyonlar oluşturarak ve hem de sıcaklığı ile etkiler. 02.02.03. İnfrared Işınlar Biyolojik materyallerde kimyasal değişikliğe neden olabilecek kuvantum enerjisine sahip olmadıklarından pratikte değerleri azdır. Dalga uzunlukları çok büyüktür. 02.02.04. Ultrasonik Vibrasyonlar Ses dalgalarının 20-1000 Kc. olanları bakteri hücrelerini parçalayabilecek niteliktedirler. Bu durumdan yararlanılarak, enzimatik çalışmalar ve bakterilerin iç yapı karakterlerini incelemek mümkün olabilmektedir. Ultrasonik dalgalarının frekansı arttıkça, parçalayıcı etkisi de artar. Sıvı içinden geçen ses dalgaları 10 mikrometre çapında boşluklar meydana getirir. Bunlar birbirleriyle birleşir ve sonra da kollapse olurlar. Bu kollaps sırasında oluşan yüksek basınçlı enerji bakterilerde hücre duvarını parçalayabilecek kudrettedir. Bunun yanı sıra sıvı içinde bazı fiziksel ve kimyasal değişmeler de meydana gelir. Bunlar da bakteriler üzerine olumsuz yönde etkileyerek parçalanmayı hızlandırırlar. Ultrasonik vibrasyonlar, hücre içindeki makromoleküllerin ve intramoleküler organizasyonların depolimerizasyonuna yol açar. Ultrasonik vibrasyonlara stafilokoklar dirençli olmasına karşın, diğer Gram pozitif ve negatif mikroorganizmalar daha duyarlıdırlar. Hücreleri parçalayarak içindeki virusları dışarı çıkarmada ultrasonik vibrasyonlardan yararlanıldığı gibi suların sterilizasyonunda da aynı amaçla kullanılmaktadırlar. 02.02.05. İyonizan Radiyasyonlar İyonizan ışınlar, fiziksel özelliklerine göre iki kısma ayrılırlar. 1- Elektromagnetik olanlar ve 2- Partüküler olanlar. Bu ışınların dalga boyları çok kısadır ve derinlere girme kabiliyeti fazladır. Bu özelliklerinden yararlanarak pratikte sterilizasyon amacıyla kullanılırlar. Çok fazla enerjiye sahip olduklarından atomlardan elektronların çıkmasına neden olurlar (iyonizasyon) ve letal etkileri de çok fazladır.Bu etkileri, absorbe edilen enerji miktarı ile bağıntılıdır. İyonizan ışınların hücrelerde bulunan ve çok önemli görevlere sahip olan makro ve mikromoleküller üzerine olan olumsuz etkileri de çok fazladır. Biyolojik sistemlerde suyun fazla olması ve böyle ortamlardan iyonizan ışınların geçmesi suyun iyonizasyonuna da neden olur. enerji (1) H2O ›H2O +e- kuvantum Bu reaksiyonda oluşan pozitif yüklü su iyonu, iyonize olmamış su molekülü ile reaksiyon vererek serbest hidroksil radikalleri oluşturur. (2) H2O + H3O ›H3O + OH (serbest radikal) Birinci reaksiyonda açığa çıkan elektron, iyonize olmamış su ile reaksiyon vererek serbest hidroksil radikallerine yol açar. Hidroksil radikallerinin çok kuvvetli oksidan etkisi olduğundan, DNA üzerinde zedelenmelere sebep olur. Hücrede, irradyasyon sırasında, oksijenin bulunması ışınların etkisini daha da arttırır. Serbest radikallerin oksijenle birleşmesi sonu bir seri otooksidatif reaksiyonlara ve ayrıca da peroksidase oluşumuna neden olur. Bunlar ışınların etkisini artırırlar. Buna karşılık hücre içinde bulunan sülfidril grupları da, biyolojik sistemlerin koruyucu olarak, irradyasyonun zararlarını hafifletirler. İyonizan ışınlardan pratikte, sterilizasyon amacı ile yararlanılır. Gram pozitif ve negatif mikroorganizmalar üzerine letal etkileri fazladır ve bu tesir logaritmik bir kural içinde meydana gelir (belli zaman aralıklarında belli veya sabit düzeyde mikroorganizmalar ölürler). Öldürme olayı, ışınların dalga uzunluğu ve total radyasyon dozu ile bağıntılıdır. İyonizan ışınlarla genellikle soğuk sterilizasyon meydana gelir. Sıcaklık oluşumu ya çok az veya yoktur. Gıdaların sterilizasyonu esnasında, bu maddelere özel tat ve koku verebilir. Bu nedenle de çok tercih edilmemektedirler. 02.02.06. Elektromagnetik İyonizan Radyasyonlar X-ışınları: Bu elektromagnetik ışınlar elektrik jeneratörleri tarafından oluşturulur. Dalga uzunlukları 10 Ao ile 10-4 A° arasında değişir ve yüksek enerjiye sahiptirler. Bu nedenle mikroorganizmalara ve yüksek organizmalara etkilidirler. Elde edilmesi güç ve pahalı olduğu gibi çıkış yerinden her tarafa yayılma özelliğine de sahiptirler. Derinlere girebilme özellikleri bunların letal etkilerini artırır. Bu ışınlardan pratikte, mutasyonlar meydana getirmekte ve paketlenmiş gıdaları sterilize etmede yararlanmaktadır. Gama ışınları: Bu da elektromagnetik bir ışınım olup doğal veya yapay radyoaktif elementlerden elde edilirler. Bu amaç için kobalt-60 fazla kullanılır. Yüksek enerjili olup dalga boyu, X-ışınlarından daha kısadır ve bu nedenle letal etkisi de daha fazladır. Her tarafa yayılma özelliği gösteren bu ışınlardan gıdaların sterilizasyonunda yararlanılır. 02.02.07. Partiküler Radyasyonlar 1- Alfa ışınları: Radyoaktif elementlerden elde edilen çok hızlı ve yüksek enerjili bir helyum çekirdeğidir. 2- Beta ışınları: Aynı tarzda, radyoaktif elementlerden elde edilen hızlı ve yüksek enerjili negatif yüklü bir ışınımdır. 3- Katot ışınları: Elektrik akseleratörleri tarafından oluşturulan ve elektron demetleri halinde ışınlardır. Yüksek voltajlı ve vakumlu tüplerde katottan çıkarak anoda doğru hızla hareket ederler. Bu ışınlardan pratikte, sterilizasyon amacı ile sınırlı olarak yararlanılır. 02.03. Yüzey Geriliminin Etkisi Besiyerlerinde bulunan gıda maddelerinin mikroorganizmalara girebilmesi, bakteri içinde sentezlenen enzimlerin ve oluşan metabolitlerin dışarı çıkabilmesi için, hücre duvarının yarı geçirgen özelliğinin önemi çok fazladır. Metabolizma olaylarının normal meydana gelebilmelerinde mikropların bulunduğu sıvı ile bakteri yüzeyi arasındaki moleküler gerilimin dengede bulunması gereklidir. Bu denge, bakteriye giriş-çıkışı büyük ölçüde kolaylaştırır. Bakteriye temas eden sıvı yüzeyindeki moleküllerin oluşturduğu gerilim çok fazla olursa, oluşan kuvvetli moleküler membran nedeniyle, sıvı ortamdan bakteriye gıda maddelerinin girişi çok güç olur ve bakteri beslenemez. Aksine, bu moleküler gerilim zayıf olursa, sıvı ile bakteri yüzeyi birbirine çok sıkı temas ederek sıvı içindeki maddelerin bakteri yüzeyinde toplanmasına sebep olur. Buna bağlı olarak bakteri içinden dışarı ve dışardan içeri gıdaların akışı güçleşir ve bakteri yine beslenemez. Yukarıda bildirilen nedenlerle, bakteri yüzeyi ile buna temas eden sıvı ortamın yüzeysel moleküler gerilimin dengede bulunması zorunludur. Eğer bir bakteri, kendi türüne göre, yüzey gerilimi fazla olan bir sıvı içinde kültürü yapılırsa, üstte üreme gösterir ve tüpün geri kalan kısmında üreme zayıf olur (B. subtilis gibi). Eğer bu besi yerinin yüzey gerilimi düşürülürse, B. subtilis homogen bir tarzda üreme gösterir. S. aureus buyyonda genellikle homojen bir tarzda ürer. Eğer bu besi yerinin yüzey gerilimi artırılırsa (%0.05 sodium ricionaleate veya lipoid madde ilavesi ile), etken bu sefer üstte üremeye başlar. Yüzey gerilimini düşüren maddeler arasında sabunlar, deterjanlar, safra, fenol vs. ajanlar vardır. Bu nedenle böyle maddelerin ıslatma özellikleri bulunmaktadır. Yüzey gerilimi (interfascial gerilim) iki sıvı veya sıvı ile katı (sıvı besi yeri ile bakteri yüzeyi gibi) arasında olabileceği gibi sıvı ile hava arasında da olabilir. 02.04. Osmotik Basıncın Etkisi Bir ortamın osmotik basıncı, içinde eriyen maddelerin konsantrasyonu ile ilişkilidir. Mikroorganizmalar, içinde üredikleri sıvı besi yerinin osmotik basıncı ile kendi hücre içindeki osmotik basınç arasında bir denge kurmuşlardır. Bu denge yarı geçirici olan hücre membranları yardımı ile regule edilir ve devam ettirilir. Mikropların en iyi üreyebildikleri ortamın osmotik basıncı, bakteri içindeki ile aynı veya çok az farklıdır (isotonik, isoosmotik). Böyle ortamlarda bakteri zarlarından giriş ve çıkış kolaylıkla olur ve bakteri gelişmesine ve üremesine devam eder. Eğer ortamın osmotik basıncı azalmış ise (hipotonik, hipoosmatik), böyle durumlarda dışardan bakteri içine fazla sıvı girerek bakteriyi şişirir ve olay devam ederse bakteriyi patlatır (plasmoptiz). Hipertonik, hiperosmotik ortamlarda ise, bakterinin içinden dışarı fazla sıvının çıkması sitoplasmik membranın hücre duvarından ayrılarak büzülmesine ve ortada toplanmasına neden olur (plasmoliz). Osmosis, yarı geçirgen bir membranla ayrılan konsantrasyonları farklı olan iki sıvının bu zardan birbirine doğru geçişini ifade eder. Bu geçiş olayı her iki tarafın osmotik basıncı veya yoğunluğu birbirine eşit olancaya kadar devam eder. Eğer bakteri, %20 tuz konsantrasyonu içinde suspansiyon yapılırsa, hipertonik bir ortam oluşacağından, plasmoliz olayı meydana gelir. Bunun aksine, bazı bakteriler, %1 oranındaki tuz konsantrasyonu içinde suspansiyon yapılırlarsa, su akışı bu sefer dışardan içeri doğru olur ve bakteri şişerek parçalanır (plasmoptiz). Bakteri içindeki osmotik basınç, bakteri türlerine göre değişmek üzere, 5-20 atmosfer arasında bulunmaktadır. Bu basınca mikroplar hücre duvarı ile karşı koymaktadır. Bakteri içindeki bu fazla osmotik basınç, içte bulunan organik maddeler (protein, amino asit, karbonhidrat, vs.) ve inorganik tuzlar tarafından oluşturulur. Gram pozitif mikroorganizmaların iç osmotik basıncı genellikle 15-20 atmosfer ve Gram negatiflerin ki ise bundan daha azdır (5-10). Mikroorganizmalar normal sınırlar içindeki osmotik basınç değişmelerine kolayca adapte olabilirler ve bu değişmeleri yarı geçirgen membranları ile kolayca regule edebilirler (osmofilik mikroplar). Bu sınırların dışına çıkıldığında bakterilerde gelişme de ve üremede noksanlıklar, plasmoliz ve plasmoptiz olayları görülebilir. Ancak, denizlerde, tuzlu göl ve sularda, salamuralarda, reçellerde, vs. yerlerde bulunan yüksek orandaki tuz veya şeker konsantrasyonlarına alışarak üreyebilen ve bunların bozulmalarına neden olan mikroorganizmalar da vardır (halofilik ve sakkarofilik). Pratikte, et ve balık muhafazaları için %10-20 tuz ve reçellerde de %50-70 oranında şeker kullanılarak osmotik basınç yükseltilir ve mikropların üremesine mani olunur. Ancak böyle hipertonik ortamlarda da, küf, maya, alg ve bazı bakteriler az da olsa üreyebilirler. 02.05. Hidrostatik Basıncın Etkisi Mikroorganizmalar hücre duvarının sert ve dayanıklı olması nedeniyle mekanik ve hidrostatik basınçlara karşı oldukça fazla direnç gösterirler. Çelik bir silindire konan ve suspansiyon halindeki mikroplar, burada oluşturulan fazla basınca, kendilerinde görülebilir önemli zararlı etkiler olmadan dayanabilirler. Okyanusların, denizlerin ve göllerin diplerinde bulunan barofilik mikroplar (B. submarineus, B. thalassokiotes) 10000 libre/inc2 (psu)'lik bir basınca kolayca dayanırlar ve bu basınç altında yaşamlarını sürdürürler. Ancak yüksek basınç altında mikroplarda, az da olsa, bazı değişmeler meydana gelebilmektedir. Örn. flagellalı mikroplar hareketlerini ve bazıları da bölünme kabiliyetini kaybedebilirler. Hidrostatik basınç 15000 psu olunca proteinlerde denatürasyon ve enzimlerde inaktivasyon görülebilir. Serratia marcescens ve S. lactis 85000-100000 psu basınç altında 10 dakika içinde ölürler. 02.06. Rutubetin ve Kurumanın Etkisi Su, mikropların üremesinde, gıda maddelerinin içeri girişinde ve içeride biriken metabolitlerin ve diğer maddelerin dışarı çıkışında ve metabolik olaylarda çok önemli göreve sahiptir. Üreme ortamlarında bulunan gıda maddelerinin bakteriler tarafından alınabilmesi ancak bunların suda eriyebilir olmaları ile mümkündür ve su aracılığı ile de bakteriye girerler. Aynı şekilde, bakteri içindeki enzim veya metabolitlerin dışarı çıkabilmesinde de su önemli rol oynar. İçinde su oranı yüksek katı besi yerlerinde mikropların gelişmesi daha kolay olur ve oluşan koloniler daha iridirler. Mikropları üretmek için kullanılan etüvlerin havasının relatif rutubetinin de yukarıda bildirilen nedenlerle uygun olması gereklidir. Rutubetli etüvlerde, böylece, besiyerlerinin suyunun uçması ve besi yerlerinin kuruması önlenir ve mikroplar için gerekli nem sağlanmış olur. Sıvı besi yerlerinden suyun buharlaşması, bu besi yerinde bulunan kimyasal maddelerin konsantrasyonunu arttırır. Bu durum üreme üzerine olumsuz yönde etkiler. Katı besiyerlerinde üreyen mikropların beslenebilmesi için de agardan gıda maddelerinin diffusyonla bakterilere ulaşması lâzımdır. Bu görevi de yine su yapar. Katı besi yerlerindeki suyun ve bunların konulduğu etüvlerin havasındaki rutubetin çok önemli olduğu bunun azlığı durumlarında bakteri üremesinin yavaşladığı ve durduğu görülür. Bu rutubet, katı besi yerlerinde beslenme üzerine etkili olduğu gibi mikroorganizmalardan suyun çıkması bakımından da önemlidir. Mikroorganizmalar içinde %70-90 kadar su bulunmaktadır. Bunun azalması birçok biyokimyasal olayların durmasına ve mikropların ölümüne sebep olur. Ancak, mikropların kurumaya karşı dirençleri değişiktir. Bazılarının (gonokok, meningokok, leptospira, pastörella. vs.) çok çabuk ölmesine karşın, bir kısım mikroorganizmalar da (stafilokoklar, E. coli, mikobakteriler, sporlar, mantarlar, vs.) daha dayanıklıdırlar. Sporların içinde %5-20 kadar suyun bulunması ve etraflarında kalın membranların oluşu bunları çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı çok dirençli hale getirmiştir. Liyofilize edilen mikroorganizmalar uzun süre canlılıklarını korurlar. Liyofilizasyon sırasında uygulanan dondurma, kurutma ve havasını alma işlemleri sırasında bazı mikroplar ölebilirlerse de çoğu, uzun zaman canlı kalır ve infektivitesini korurlar. Hasta bir vücuttan çeşitli yollarla dışarı çıkan mikroplar, eğer direk olarak güneş ışınlarına maruz kalmazlarsa, kuruyarak uzun bir süre canlı kalabilirler ve tozlarla havaya karışarak infeksiyon oluşturabilirler. Mikropların etraflarında vücut sıvılarından (mukoid, organik madde, serum, kan, vs.) bir muhafaza varsa veya dışardan diğer organik veya inorganik maddelerle örtülürse yine uzun bir zaman canlı kalabilirler. Gölge, mikroorganizmaların yaşamını uzatıcı bir faktördür. 02.07. Elektriğin Etkisi Sıvı ortamlarda suspansiyon halinde bulunan mikroorganizmalardan direk veya alternatif elektrik cereyanı geçirilirse, mikroplar zarar görebilirler. Cereyanın şiddetli ve geçme süresi fazla olursa daha zararlı ve öldürücü olurlar. Elektrik nedeniyle sıvı ortamda bazı kimyasal değişmeler de meydana gelebilir. Oluşan sıcaklık ve elektroliz olayı sonu meydana gelen ara maddeler (klor, ozon, vs.) mikroplar üzerine zararlı etkide bulunurlar. Elektroforezis: Protein moleküllerinin veya mikroorganizmaların sıvı ortam içinde suspansiyonları yapılırsa, yüzeyleri pozitif (+) veya negatif (-) elektrikle yüklenirler. Böyle bir ortamdan uygun bir süre ve şiddette elektrik geçirilirse, pozitif yüklü olanlar katoda, negatif elektrikle yüklenmiş olanlar da anoda doğru hareket ederler (elektroforezis). Elektroforezisin birçok yöntemleri vardır. Bunların arasında kâğıt elektroforezis özellikle, pratikte, anormal serum proteinlerinin saptanmasında, serum ve sıvılardaki gama globülinlerin düzeylerini ölçülmesinde kullanılır. Jel elektroforezis yöntemi de daha ziyade proteinlerin nukleikasitlerin sütrüktürel durumlarını ortaya koymada veya analitik amaçlarla kullanılmaktadırlar. 03. Kimyasal Faktörler Doğada serbest olarak yaşayan veya laboratuvarlarda üretilen mikroorganizmalar üzerine etkileyen birçok kimyasal faktör bulunmaktadır. Bunların bazıları optimal koşullarda olduğunda üremeyi artırıcı etkilemesine karşın bu sınırların dışında ise üremeyi kısıtlayıcı, durdurucu ve hatta öldürücü etkide bulunurlar. Doğaldır ki, bu tarzdaki etkinlik dereceleri, kimyasal maddelerin yoğunluğu, yapısı ve etkileme süresi ile direkt ilişkili olduğu kadar mikroorganizmalara da bağımlıdır. Mikropların üremelerinde etkili olan kimyasal faktörler arasında oksijen (O2), karbon dioksit (CO2), hidrojen iyon konsantrasyonu (pH), redoks potansiyel, ortama katılan bufferler yanı sıra hastalık oluşturan mikroorganizmaların üremelerini önlemek (stasis) veya öldürmek (sidal) amacı ile kullanılan antibiyotik, kemoterapötik maddeler ile çeşitli dezenfektanlar da bulunmaktadır. Bu son maddeler, özellikle, mikroorganizmaları kontrol altına almada kullanılırlar. 03.01. Oksijenin Etkisi Mikroorganizmaların, üremeleri için oksijene olan ihtiyaçları, çok değişiklik göstermektedir. Bu gereksinmeye göre mikroplar 5 temel bölüme ayrılarak incelenebilirler. Yandaki şekilde sırasıyla aerobik, anaerobik, fakültatif, mikroaerofil, aerotolerant üreme şekilleri görülmektedir. 1- Aerobik mikroorganizmalar: Üremeleri ve yaşamaları için havadaki oksijene ihtiyaç gösteren mikroplar, doğada diğerlerinden daha fazla bulunurlar. Bunlar havasız koşullar altında gelişemezler. Çünkü oksijensiz ortamlarda enerji elde edebilecek mekanizmaya sahip değillerdir. Dik agar besiyerlerinde üretildikleri zaman genellikle üst kısımda koloni oluştururlar. Tam aerobik mikroorganizmalar, havadaki moleküler oksijeni elektron alıcısı olarak kullanırlar. Bu tür mikropların enzim sistemleri, hidrojeni (H+), serbest oksijene (O2) transfer ederek hidrojen peroksit (H2O2) oluştururlar. Bu madde toksik olduğundan katalase enzimi tarafından hemen H2O ve O2 'ye ayrıştırılır (H2O2 ›.H2O + O2). Bazı mikroplar da H2O2 'yi hidrojen (H) alıcısı olarak ta kullanılabilirler (H2O2 + 2 (H) ›2H2O). Aerobik mikroorganizmaların üremeleri esnasında kültürlerin aerasyonu üreme üzerine olumlu yönde etki yapar. Aerobik mikroorganizmalar arasında, M. tuberculosis, B.anthracis, B. subtilis, sarcina, vs. sayılabilir. 2- Fakültatif mikroorganizmalar: Bu gruba giren mikroplar hem aerobik ve hem de anaerobik koşullarda üreyebilme mekanizmasına (enzimatik sisteme) sahiptirler. Bunlar, oksijen içeren koşullarda aynı aerobik mikroplar gibi üremelerine devam ederler. Anaerobik şartlarda da redükte olabilen maddeleri (sülfür, karbon, sodyum nitrat, vs.) hidrojen alıcısı olarak kullanabilirler. Ancak, bu mikroorganizmalar daha fazla enerji sağlayan aerobik koşullarda daha iyi gelişirler. Anaerobik durumlarda, fakültatif mikroplar az bir fermantatif metabolizma gösterirler. Diğer bir deyimle, substratları tam olarak okside edemezler. Bu tür mikroplar (enterobakteriler, stafilokoklar, vs.) dik agarın her tarafında üreme yeteneğine sahiptirler. 3- Anaerobik mikroorganizmalar: Anaerobik mikroplar oksijenin bulunmadığı ortamlarda gelişebilirler. Oksijen bunlar için zehirleyici tesir yapar. Bunlarda bulunan enzimler oksijen tarafından bloke edildiği gibi, enzim sistemleri, hidrojeni (H+), oksijene transfer edemez ve başka oksijen alıcısı (nitrat, sulfat, karbonat, vs) kullanırlar. Bu nedenle, hücre içinde H2O2 oluşmaz. Bu maddeyi ayrıştıramadıklarından, kendileri için toksik etki yapar. Bu tür mikroplar dik agar besiyerinin dip tarafında ürerler. Anaerobik mikroplar arasında, klostridiumlar, aktinomyces, Sphaerophorus necrophorus, v.s. sayılabilir. 4- Mikroaerofilik mikroorganizmalar: Bu mikroplar havada bulunan orandaki kadar oksijen içeren ortamlarda gelişemeyip, oksijen oranı %1-2 kadar düşürülmüş veya havasına %5-10 CO2 katılmış yerlerde üreme olanağına sahiptirler. Bunlar anaerobik olmayıp böyle koşullarda da gelişemezler. Mikroaerofilik mikroorganizmalardan B. abortus, C. fetus, bazı mikoplasma türleri vs. sayılabilir. Bu tür mikroplar katı besiyerlerinin yüzeyinden 1-1.5 cm kadar aşağıda ürerler. 5- Aerotolerant mikroorganizmalar: Bu mikroorganizmalar daha fazla yüzeyde olmak üzere, hem aerobik ve hem de anaerobik ortamlarda üreme yeteneğine sahiptirler. 03.02. Redoks Potansiyelin Etkisi (Oksidasyon-Redüksiyon Potansiyeli) Oksidasyon-redüksiyon (O-R) elektriksel bir olaydır ve elektron transferi üzerine dayanır. Oksidasyon (elektron kaybı) ve redüksiyon (elektron kazanma) fenomenleri genellikle birlikte cereyan ederler. Bir madde okside olurken diğeri redükte olur. Elektron alıcısı okside eden, elektron vericisi de redükte eden ajandır. Elektronun bir maddeden diğerine geçişi iki madde (reaktant) arasında potansiyel farkını yaratır. Bu farkın şiddeti, kazanılan ve kaybedilen elektronlara bağlıdır. Bu da, maddenin oksidan veya redüktan oluşuyla ilgilidir. Eğer, madde çok fazla oksidan ise elektriksel potansiyeli (veya O-R potansiyeli) o oranda büyük olur ve pozitif değer taşır. Eğer redüktan madde ise, bu değer düşüktür ve negatiftir. Okside olan ile redükte olan maddelerin konsantrasyonu birbirine eşitse, O-R potansiyeli sıfır olur. Anaerobikler düşük bir O-R potansiyeline gereksinme duyarlar (0.2 volt). Aerobiklerde ise durum + 0.2-0.4 volt'dur. O-R potansiyeli Eh sembolü ile gösterilir ve milivolt (mV) olarak ölçülür. Bu potansiyelin ölçülmesi, ekilen mikropların üreyip - üremediklerini de ifade etmesi bakımından önem taşır. Kuvvetli oksidan maddeler pozitif potansiyel (+ 200 mV) ve kuvvetli redüktanlar da negatif potansiyel (-200 mV) meydana getirirler. Hidrojenin bir atmosfer altındaki potansiyeli -400 mV 'dur. Kültürlerin aerasyonu, pozitif potansiyel yaratır. Mikroplar üremeye başlayınca potansiyel düşmeye başlar. O-R potansiyeli, elektrometrik veya kolorimetrik yollarla ölçülebilir. 03.03. Hidrojen İyon Konsantrasyonunun Etkisi (pH, Potansiyel Hidrojen) Mikroorganizmaların üremeleri için, besiyerinin pH 'sının optimal sınırlar içinde bulunması gereklidir. Minimal ve maksimal pH limitlerine yanaştıkça üreme azalır ve durur. Bakterilerin optimal pH limitleri oldukça değişiktir. Asit ortamı seven mikroorganizmalar (maya, küf, laktobasil, asetobakter, vs) yanı sıra, alkali besiyerlerinde üreyenler de (mikoplasma, toprak bakterileri, V. cholera, vs.) vardır. İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturanlar genellikle, konakçının sıvı ve dokularının pH derecesinde (pH. 7.0-7.4) ürerler. Patogenik mikroorganizmaların besi yerlerinde üreme pH limitleri, apatogenlerden daha dardır. Ortamın pH 'sının değişmesinde besiyerine katılan ve fermente olabilir karbonhidratların ayrışması sonu oluşan organik asitlerin, nitrogenli veya proteinli maddelerin dekompoze olması neticesinde meydana gelen amonyak veya alkalen maddelerinin önemi fazladır. Ayrıca, hücrede oluşan ve dışarı çıkan diğer metabolizma artıkları da pH 'nın değişmesine büyük ölçüde etkilerler. Bazı mikroplar da reaksiyonu dönüştürebilirler. E. aerogenes glukozu ayrıştırarak asit yapar ve ortamın pH 'sı düşer. Glukoz sarf edildikten sonra, bu sefer teşekkül eden, asit ürünler mikrop tarafından ayrıştırılır. Bu durumda besiyerinin pH 'sı normaline doğru çıkış gösterir. Üremeyi olumsuz yönde etkileyen pH değişmesini önlemek için, besiyerine buffer'ler katılır. Bu amaçla, genellikle, ayrı ayrı veya birlikte K2HPO4 veya KH2PO4 kullanılır. Bunlar meydana getiren hidrojen (H) ve hidroksil (OH) iyonlarının serbest kalmasının önüne geçer ve onlarla birleşikler oluşturur. Bu nedenle de, ortamın pH 'sı hemen asit veya alkali olmaz bir süre optimal limitler arasında kalır. Bir besiyeri hazırlanırken pH'sı da mikroorganizmanın fizyolojik karakterine uygun olarak (optimal pH) ve genellikle %10-20 NaOH 'la ayarlanır. Otoklavdan sonra 1-2 diziyem düşeceği hesap edilerek pH iyice saptanır. Bir sıvı ortamın pH 'sını ölçmede ya elektrikle çalışan pH metreler veya daha az duyarlı olan kolorimetrik yöntemler kullanılır. Bir ortamın pH'sı, içinde bulunan hidrojen iyonların konsantrasyonu ile ölçülür. Saf suyun litresinde, + 22 °C' de 10-7 gram hidrojen iyonu (H+) ile yine aynı miktarda (10-7 gram hidroksil iyonu (OH-) bulunur. Her iki iyon aynı konsantrasyonda bulunması nedeniyle saf suyun reaksiyonu nötrdür ve pH 'sı 7.0 olarak kabul edilir. Bir sıvının pH 'sı 1 ile 14 arasında değişir. Eğer pH = 1-6 arası ise asit, pH = 7.0 nötr ve pH = 8 ile 14 arası ise alkalidir. Asitlik 1'den 6 aya doğru azalır ve alkalilik ise 8'den 14'e doğru gittikçe artar. Diğer bir ifade ile bir sıvının pH' sı 7'den küçükse asit, büyükse alkalidir. Her pH birimi azaldıkça, hidrojen iyon konsantrasyon artar, buna karşılık, hidroksil iyon konsantrasyonu azalır. Bir sıvıdaki hidrojen (H+) ve hidroksil (OH-) iyon konsantrasyon çarpımları sabittir. (H+) x (OH) = K = 10-7 x 10-7 = 10-14). Bir solusyonun pH 'sı sıfır ise, hidrojen iyon konsantrasyonu 10° veya 1 normaldir. Bu solusyon çok asittir. Kuvvetli asitler suda fazla dissosiye olurlar (HCl, H2SO4, vs). Buna karşılık asetik asit, sitrik asit, vs. zayıf asitlerdir ve suda az dissosiye olurlar. 04. Biyolojik Faktörler Canlıların vücudunda özellikle, sindirim, solunum, urogenital sistemleri ile derilerinde değişik cinslere ait sayısız mikroorganizma (yerleşik devamlı mikroflora) bulunmaktadır. Bunlar birbirleri ile ekolojik bir denge içinde, birbirlerinin üremelerini sınırlayarak yaşamaktadırlar. Sentezledikleri veya salgıladıkları substanlar karşılıklı etkileyerek birbirlerinin üremelerine ve hatta ölmelerine de yol açarlar. Aynı zamanda, bu yerleşik flora bazı patojenik mikroorganizmaların kolonizasyonuna da mani olur. Eğer bu metabolitleri sentezleyen mikroorganizmalardan biri veya ikisi ortadan kaldırılırsa, diğerinin fazla üremelerine ve bazı durumlarda hastalık yapmalarına da neden olur. Özellikle antibiyotiklere duyarlı olmayan mikroorganizmalar C. albicans veya C. difficile infeksiyonlar oluşturabilirler. Sindirim sistemi florasında bulunan, E. coli 'nin sentezlediği colicin (bakteriyosinler), bu maddeyi sentezlemeyen E. coli 'ler üzerine öldürücü etkide bulunur. Eğer bakteriyosin sentezleyen E. coli 'ler antibiyotik tedavileri sonunda çok azalırlarsa, diğer E. coli 'ler çoğalma fırsatı bulurlar. Böylece, sindirim, solunum, urogenital ve deride bulunan mikroflora birbirleri ile çok hassas bir denge içinde bulunurlar ve sentezledikleri antagonist etkiye sahip metabolitlerle birbirlerinin üremelerini kontrol altında tutarlar. Vücudun çeşitli sistemlerinde (sindirim, solunum, urogenital) ve diğer bölgelerin de (oral ve deri de) bulunan yerleşik mikroflora aynı zamanda karşılıklı bir ortak yaşam içinde de bulunurlar. 05. Mekanik Faktörler 05.01. Çalkalamanın Etkisi Bu faktörler laboratuvarlarda mikroorganizmaların, özellikle, hareketsiz olanlarının veya zayıf üreme gösterenlerin üremelerini ajite etmek ve bulunduğu ortamlardan daha elverişli yerlere ulaşmasını sağlamak amacı ile uygulanmaktadır. Laboratuvarlarda kültürlerin çalkalanması genellikle çok hafif olmakta (dakikada 10-20 devir) ve üreme üzerine olumlu etkide bulunmaktadır. Eğer çalkalama çok hızlı veya sert olursa mikroorganizmalarda ölümler meydana gelebilir. 05.02. Filtrasyon Sıvı kültürlerde, sıvı besiyerinde, patolojik sıvılarda, serumlardaki, bakterileri ve partikülleri gidermede filtrelerden fazla yararlanılır. Bu amaçla, bakterileri tutan ve delik çapları belli olan özel filtreler kullanılır. Bakteri geçirmeyen filtrelerin delik çapı 1 mikrometreyi (µm) aşmamalıdır. Bakteri alıkoyan filtreler yapısını oluşturan maddelere göre başlıca 5 kısma ayrılırlar. 1- Seitz filtreleri: Bu tür filtreler asbestden yapılmış diskler halindedirler. Delik çaplarına göre birçok türleri vardır. Bakterileri tutan EK (entkeimung) ve sıvıları berraklaştıran (K) gibi fitrelerden mikrobiyoloji laboratuvarında, gereğine göre, önce (K) sonra da (EK) tipleri kullanılabilir. Seitz filtreleri komple olarak etrafı gümüşle kaplı veya paslanmaz çelikten yapılmış özel metal parçadan ve bir de metal elekten oluşur. Otoklavda sterilize edildikten sonra kullanılır. Asbest filtre de bu metal parçalardaki elek üzerine monte edilir. Seitz filtrelerin sıvıları absorbe özelliği yanı sıra bazı toksik maddeleri de sıvıya verme durumları da vardır. Bu nedenle, filtrasyondan önce, filtreden steril distile su geçirilerek yıkanır ve olumsuz etkileri giderilir. Sonra, bu süzüntü çekilerek alınır ve sonra süzülmek istenen sıvı süzülür. Kullanıldıktan sonra asbest diskler atılır. Seitz filtrelerinin çok eski bir tarihi olmasına karşın bu günde hala kullanan yerler vardır. 2- Berkefeld filtreleri: Bu tür filtreler fosil diatome toprağından yapılmıştır. Sıvıları emme kabiliyeti fazladır. Delik çapları çok değişik olarak imal edilir. Başlıca 3 tür porositeye sahiptir, kaba (V), normal (N) ve ince (W). Bu nedenle, en çok (W) tipi kullanılır ve bu mikropları geçirmez. Bu tür filtreler kullanmadan önce sterilize edilirler. Kullanıldıktan sonra çok ince fırça ile temizlenir ve suda kaynatılırlar. Sonra, dıştan içeri su geçirmek suretiyle temizlenirler. Filtreler, kurutulur ve tekrar sterilize edilerek kullanılırlar. Eğer organik madde ile tıkanıklık, meydana gelmişse filtre fırında yakılarak bu tıkanıklık giderilir. Tarihsel değeri vardır. Bugün kullanılmamaktadır. 3- Chamberland filtreleri: Bu filtre türü sırsız porselenden yapılmıştır ve çeşitli porositeye sahiptir. Bu özelliğine göre L1a, L2 ve L3 tipleri, Berkefeld filtrelerinin (V) (N) ve (W) bujilerinin eşdeğerdedir. Kullanıldıktan sonra temizlenir, kurutulur ve otoklavda sterilize edilir. Tarihsel değeri vardır. 4- Cam tozu filtreleri: Cam tozlarının bir araya getirilip birleştirilmesinden oluşan cam filtreler de porositelerine göre E (çok kaba), C (kaba), M (orta) F (ince), UF (çok ince) olarak yapılmıştır. Laboratuvarlarda çeşitli amaçlar için kullanılır. Ancak, özel bir filtrasyon aparatına monte edilerek otoklavda sterilize edilirler. Kullanıldıktan sonra akan su ile ters yönde yıkanır. Lüzum halinde, KNO3 ihtiva eden sıcak H2SO4 solusyonu, filtreyi temizlemek için kullanılır. Sülfirik asit + bikromat karışımı kullanılmaz. Bugün çok nadiren kullanılmaktadır. 5- Sellüloz membran filtreler: Başlıca iki tür sellüloz membran filtre vardır. Biri eski tip olan sellüloz nitrat (gradokol membran) diğeri de yeni veya modern tip olan sellüloz asetat filtreleridir. Gradokol membranlar, çeşitli porositede (3 nm-10 nm) yapılabilir. Genellikle virusların büyüklüğünü ölçmede kullanılırlar. Milipor filtreler de aynı şekilde delik çapları değişik büyüklükte (8µm-0.01 µ) hazırlanmaktadırlar. Sellüloz asetat filtreler de iki tabaka vardır. Basal tabakada 3-5 µm ve üst tabakada 0.1-1.0 µm çapında porosite bulunur. Bu nedenle bakteriler üst tabakada tutulurlar. Otoklava (121 °C.) 35-45 dakika dayanabilirler. Filtre disklerinin çapları 1.7-14 cm kadar olabilir. Özel metal veya cam tutucularda muhafaza edilirler. Sellüloz filtrelerin, absorbsiyon kabiliyetinin daha az olması nedeniyle, Seitz filtrelerine tercih edilirler. Ayrıca daha hızlı süzme kapasitesi de vardır. Bakteri üst yüzeyde tutulduğu için de, bir agarın üzerine yatırılarak ekilebilirler. Filtrasyonda, filtrelerin özelliğine göre, negatif veya pozitif basınç kullanılır. 05.03. Santrifugasyon Normal laboratuvar santrifüjleri ile bir sıvı içindeki mikropları gidermek pratik olarak mümkün değildir. Yüksek devirli santrifüjlerle hem bakteriler ve hem de viruslar çökebilirler. Ancak, bu çökme işlemi viruslar ve bakteriler için %100 kabul edilemez. Özellikle, sıvı içinde fazlaca virus kalabilir. Bu sebeple santrifüj yardımıyla bütün mikroorganizmalar giderilemezler veya sıvı steril hale getirilemez. 05.04. Ezmek Santrifüj yardımıyla çöktürülen mikroplar bir havana veya ezme aletine konur burada ezilerek parçalanabilir. Bu yöntemle de bütün mikroplar ölmezler. 05.05. Basınç Uygulamak Devamlı ve yüksek basınç altında bazı mikroplar ölebilirler. Ancak hepsi ölmez. 05.06. Çalkalamak Mikropların sertçe ve devamlı çalkalanması bazılarının ölümüne neden olabilir. Fakat büyük bir kısmı canlı kalabilir. 05.07. Vibrasyon Suspansiyon halindeki mikroplar ultrasonik vibrasyonlara maruz bırakılırsa ölebilirler. Bu, tam anlamıyla sterilizasyon sağlamaz. Prof. Dr. Mustafa ARDA

http://www.biyologlar.com/bakterilerin-uremelerine-etkili-faktorler-1

EPİFİZ (KORPUS PİNEALİS)

Korpus pinealis, diğer adıyla epifizis serebri 5-8 mm boyunda, 5mm çapında ve 100-200mg ağırlığında küçük, koni şekilli bir cisimcik olup bir sap ile 3. ventrikül tavanına bağlanmıştır. Bağlantı yeri dışında bez pia mater ile sarılmıştır. Pia mater’den oluşan kapsül bol damarlıdır. İnce bir kapsül şeklini almış olan pia materden ayrılan septumlar organ içerisine girer ve organı tam olmayan lobüllere ayırır. Lobüller Pinealosit (ya da epiteloid hücrelerden) ve glial interstisyal hücreler olmak üzere 2 tip parankimal hücrelerden oluşmuştur. Rutin preparatlarda epiteloid hücreleri ayırt etmek oldukça zordur, fakat gümüşleme tekniği ile çok iyi şekilde görülebilirler. Bu metodla incelenen hücrelerin düzensiz şekilli olduğu, bulböz uçlar şeklinde sonlanan uzun, dallanma gösteren uzantılara sahip olduğu görülür. Sitoplazmalarının hacmi farklılık gösterir. Sitoplazmalarında dens özlü membranla çevrili granüller, lizozomlar ve lipid damlacıklarını içerebilirler. Ayrıca sitoplazmaları çoğunluğu agranüler olan yaygın endoplazmik retikülüm ve çok sayıda mikrotübüllerin bulunuşu ile karakterizedir. Komşu pineolositler arasında sıklıkla geçit bağlantıları, desmozomlar ve ara bağlantılar oluşur. Büyük ve yuvarlağımsı olan çekirdek derin yarıklarla düzensiz, loblu bir görünüm kazanmıştır. Daha çok çekirdek membranının iç yüzünde toplanmış kromatin kitleleri ve iri bir çekirdekçik içerir. Glial hücreler pinealosit kümeleri veya kordonları arasında bir ağ oluşturarak destek elemanları olarak fonksiyon görürler. Glia hücrelerinin sayıları pineolositlerin sayısından daha azdır (bez hücrelerinin %5’i), çekirdekleri uzamıştır ve koyu boyanır. Sitoplazmik çıkıntıları 5-6 nm çapında çok sayıda ince filamanlar içerir. Bu uzantılar glial hücrelerden dışarı doğru uzanarak onlara astrosit görüntüsü verir. Epifiz maksimum gelişmesine yaklaşık 7. yaş civarında ulaşır. Sonradan başlıca destek elemanları ile ilgili olmak üzere retrogressive değişiklikler gösterir. Bağ dokusu miktarında artma görülür ve lobüller kesin sınıra sahip olur. Katı sert bir şekilde bir araya gelmiş cisimcikler olar Acervuli (corpora arenacea veya beyin kumu) başlıca kapsül ve septumlarda görülür. Lamelli bir görünüme sahip olan bu cisimciklerin sayıları ve büyüklükleri oldukça farklıdır. Bu yapılar pirimer olarak organik bir matriks içerisinde kalsiyum karbonat ve kalsiyum fosfattan oluşmuştur. Fonksiyonel önemi henüz bilinmemektedir. Çocuklukta ortaya çıkar ve yaşla birlikte sayıları artar. Kan Damarları ve Sinirleri Birkaç kan damarları ile hem miyelinli ve hem de miyelinsiz sinir lifleri beze girer. Bez içerisinideki kapillerler ince, pencereli tiptir. Sinir lifleri superior servikal ganglionlardan köken alan otonomik sinir sisteminin sempatik kısmına aittir. Elektron mikroskobide sinir terminallerinin direkt olarak pineal hücreler üzerinde sonlandıkları görülür (Çoğu organlardaki gibi kan damarları veya düz kas hücreleri üzerinde değil). Epifizin Fonksiyonları Memelilerde epifiz, düşük vertebralılardaki fotoreseptive pineal sistem kalıntısıdır. Memelilerde epifizin salgılayıcı endokrin fonksiyona sahip olduğu görülür. İnsan dahil çoğu memelilerde epifizin değişik maddeleri salgıladığı görülmüştür. Bunlardan en iyi bilineni melatonin’dir. Sıçanlarda epifiz melatoninin prekürsörü olan bir serotonini salgılar. Hormon miktarı bezde ve kanda sirkadian ritim gösterir. Hormon düzeyleri gün ışığında en düşük karanlıkta ise en yüksek seviyede olur. Epifiz retinadan retinohipotalamik yol aracılığıyla ışık ve karanlık siklus hakkında bilgi alır. Retinohipotalamik yol suprakiazmatik nukleus ile epifizdeki sempatik nöral yol arasında bağlantıyı sağlar. Böylelikle melatonin salgısı inhibe edildiğinde bez bir nöroendokrin iletim sistemi görevini görerek nöral bir uyarıyı (sempatik nöronlardan salınan nöroepinefrin) hormonal bir ürüne (melatonin) çevirir ki bu da diğer endokrin organların fonksiyonel aktivitesini değiştirir ve endojenöz ritimleri senkronize eder. Melatoninin salınımı gece artar ve gonadlarda sterodiogenik aktiviteyi inhibe ederek memelilerde üreme fonksiyonlarını regüle eder. Hipotalamusa yerleşmiş olan nörosekretuvar hücrelerde melantonin inhibitör aktivitesi sonucu gonadal steroid üretimi artar. Hipotalamustan salınan GnRH’un inhibisyonu hipofizin anterior lobundan FSH ve LH salınımında artışa neden olur. Melatonin, sıçanlara enjekte edildiğinde, östroz siklusu yavaşlatır ve ovaryumlarda ağırlık kaybına sebep olur. Melatoninin gonadal fonksiyonları değiştirebilmesi onun salgısının menstrüel ve östrus (estrous) siklusların ayarlanması ile ilgili olduğuna işaret olabilir. Üremenin mevsime bağlı olduğu canlılarda, sonbaharda günlerin kısalması melatonin sekresyonunun artmasına ve gonadlarda atrofiye neden olmaktadır. Melatoninin gonadları hipofiziyal gonadotropinlerin salınımını baskılayarak mı yoksa direkt olarak mı etkilediği tam olarak açık değildir. Epifizin insanlarda, özellikle seksüel olgunluktan önceki devrede, gonadal gelişme üzerine etkili olduğu düşünülmektedir. Epifizin etkilendiği beyin tümörüne sahip erkek çocuklarda gonadlarda hipertrofi gözlenmekte ve erken puberte gelişmektedir. Öte yandan, epifizin tümörlerinde çocuklarda epifiz aktivitesinin artmasına bağlı olarak puberte gecikmesi meydana gelmektedir. Melatonin dışında epifiz serotonin, norepinefrin, dopamin, histamin, somatostatin ve TRH gibi sayısız nörotransmitter içermektedir. Ayrıca epifizin jet lag gibi gün uzunluğunda ani meydana gelen değişikliklerde ve mevsimsel değişikliklere verilen duygusal cevaplarda ayarlayıcı role sahip olduğu son çalışmalarda gösterilmiştir.

http://www.biyologlar.com/epifiz-korpus-pinealis

DNA'nın Yapısı ve Özellikleri

Bütün tek ve çok hücreli organizma ile bir kısım virüslerde genetik materyal DNAdır. DNA yapı ve özellikleri başlığı altında, DNAnın moleküler yapısı, deoksiriboz, fosfat ve pürin ve primidin bazlarının yapıları ve birbirleri ile verdikleri reaksiyonlardan başlanarak anlatılmaktadır.nükleozid, nükleozit fosfat, nükleotid ve nükleozid-tri-fosfatlar hakkında bilgi verilmekte, nükleozit-tri-fosfatların DNA polimerini oluşturma reaksiyonları, purin pirimidin eşleşme özellikleri anlatılmaktadır. DNA çift sarmalının özellikleri, çeşitli ortam koşullarında biarbirine dönüşebilen DNA formları hakkında bilgi verilmektedir. DNA replikasyonunun yarı koruyucu (semikonservatif) özelliği deneysel örnek verilerek; ökaryotik ve prokaryotik DNA replikasyonu basamakları karşılaştırmalı olarak ve görev alan proteinlerle ilgili bilgileri de kapsamak üzere açıklanmaktadır. Ayrıca bu başlık altında DNA hasar tipleri, bunlara neden olan etkenler ve tamir mekanizmaları açıklanmakta; genom DNAsının farklı bölgeleri (tekrar dizinleri, gen aileleri, satellit DNA, gen kontrol bölgeleri, sessiz bölgeler gibi terimlere de açıklık getirilerek) ayrıntılı bir sınıflandırma yapılarak anlatılmaktadır. Gen aktivitelerinin ayarlanması (Genetik kontrol mekanizmaları) Dr.N. Cücer Çok hücreli bir organizmdeki bütün hücreler aynı genoma sahiptirler. Ancak, bu hücrelerdeki gen ürünleri ve bu ürünlerin düzeyleri hücreden hücreye, ya da aynı bir hücrede bir andan diğerine farklılık göstermektedirler Hücrelerin özelleştikleri fonksiyonlara ve o andaki gereksinimlere uygun ürünleri, uygun düzeylerde bulundurdukları gözlenmektedir.çok ya da tek hücreli organizmalarda her bir hücredeki gen ifadesi çeşitli mekanizmalarla ayarlanmaktadır.Bu kontrol mekanizmaları. Tek hücrelilerin çevre koşullarına; çok hücrelilerde ise hücrelerin birbirlerine uyumunu sağlamaktadır. Konunun kapsadığı alt başlıklar şunlardır: Bakteride enzim (protein) sentezinin ayarlanması, 1)Laktoz operonu örneğiyle anabolik/katabolik operon; konstitutif (zorunlu)/fakültatif (seçimli) enzim; katabolit aktivator proteini; indüktör; regülatör bölge; triptofan operonu örneğiyle, repressör; korepressör; son ürün inhibisyonu, genetik polarite terimleri ve mRNA düzeyinde genetik kontrol mekanizması, 2) arabinoz operonu örneği üzerinden ise gen aktivitesinin, gen ürünü tarafından negatif /pozitif kontrolu; RNA yapısına bağlı; küçük RNAlar ya da ribozomal proteinler veya alarmonlar aracılığı ile translasyon düzeyindeki kontrol ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Ökaryotlarda gen aktivitesinin ayarlanması ise, 1)Duplikasyon ya da amplifikasyon, 2)Metilasyon/demetilasyon v.b yollarla selektif gen inaktivasyonu/aktivasyonu, 3)Gen yeni düzenlenmeleri (rearrangement) ile kontrol, 4)Arttırıcı (enhancer) ve susturucu (silencer) DNA bölgeleri ile aktivite ayarlanması, 5)Posttranskripsiyonel kontrol ve 6)Hormonal kontrol ikincil başlıkları ile anlatılmaktadır.

http://www.biyologlar.com/dnanin-yapisi-ve-ozellikleri

PARAGANGLİONLAR (KROMAFFİN SİSTEM)

Paraganglionlar terimi pek çok yönden suprarenal bezlerin medullar hücrelerine benzeyen ve dağınık vaziyette bulunan hücre gruplarını kapsar. Hücre grupları çoğunlukla retroperitoneal yerleşmiştir ve sıklıkla sempatetik ganglionlar ile ilişkilidir. En büyük paraganglion hücre grubu çift veya birleşmiş halde bulunan Zuckerkandl’ın paraaortik cisimcikleridir. Bu cisimcik abdominal aortanın bifurkasyon yaptığı bölgede yerleşmiştir. Buna benzer hücre toplulukları ayrıca böbrek, ovaryum, testis ve kalpte de (aorta ve pulmoner arter arasındaki bağ dokusu içinde) görülür. Paraganglionlar kalın bağ dokusundan oluşmuş bir kapsüle ve zengin vaskülarizasyona sahiplerdir. İki tip hücre içerirler: Esas hücreler ve destek hücreleri. Esas hücreler suprarenal medulla hücrelerindekine benzeyen çok sayıda membranla çevrili elektron dens granüller içerirler. Hücreler kromaffin reaksiyonu gösterirler ve esas olarak norepinefrin olan katoşelaminleri içerirler. Destek hücreleri salgı granüllerinden yoksundur ve kısmen veya tamamen esas hücrelerce çevrelenmişlerdir fonksiyonları bilinmemektedir. Kemoreseptörler olan karotid ve aortik cisimler, kromaffin hücre adacıkları ile ilişkilidirler. Henüz paranganglionların endokrin bir fonksiyona sahip olup olmadığı, kateşolaminleri vasküler sistem içerisine salgılayıp salgılamadığı veya komponent hücrelerin sempatik ganglionlarda iletimin inhibisyonu için bir internöron olarak fonksiyon görüp, görmediği açık değildir. Paraganglionlar aşırı miktarda kateşolaminleri salgılarlarsa klinik olarak önemli olabilirler.

http://www.biyologlar.com/paraganglionlar-kromaffin-sistem

LANGERHANS ADACIKLARI (PANKREASIN ENDOKRİN KISMI)

Büyük, yassı bir organ olan pankreas duedonumun konkavitesi içerisinde yerleşmiştir. Posterior abdominal duvar peritonu arkasında sola doğru dalağın hilumuna ulaşacak şekilde uzanır. Pankreas hem ekzokrin ve hem de endokrin bir organdır. Bu iki fonksiyon farklı hücreler tarafından üstlenilmiştir. Organ taze halde soluk pembe veya beyaz renktedir. Belirgin bir fibröz kapsüle sahip olmayıp ince, areolar bir doku ile sarılmıştır. Buradan köken alan ince septumlar organı belirgin lobüllere ayırır. Ekzokrin kısmını oluşturan asinusların her biri ince retiküler doku ile çevrilmiştir. Ekzokrin kısımdan sindirim sisteminde geniş şekilde bahsedilmiştir. Endokrin Kısım Pankreasın endokrin kısmı olan Langerhans adacıkları bütün organ içerisine dağılmış multihormonal mikroorganlardır ve ekzokrin pankreas içine gömülmüş yuvarlak hücre topluluklarını oluştururlar. İnsan pankreasında, kuyruk bölgesinde biraz daha fazla olmak üzere bir milyondan fazla adacık bulunabilir. Çoğu adacık 100-200 mikrometre çapında olup birkaç yüz hücre içerir. Zengin kan akımına sahip, soluk renkli hücrelerden meydana gelmiş, düzensiz sferoidal kümeler şeklindedir. Adacıklar, retiküler liflerden yapılı ince bir kapsül ile çevre asinuslardan ayrılmıştır, fakat bu ayrılma belirgin değildir. Hematoksilen-Eozin ile hazırlanmış preparatlarda adacık hücreleri soluk renkte görülür. Bu hücreler poligonal şekle sahiptir. Düzensiz kordonlar şeklinde dizilmişlerdir ve aralarında kan kapillerleri bulunur. Adacık hücrelerinin içerdikleri salgı granüllerini belirlemek için özel boyama metodları uygulanır, bu özel boyalarla çeşitli tipte hücrelerin bulunduğu görülür; 1- Alfa ( A ) Hücreleri: Granülleri alkolde çözülmez, 2- Beta ( B ) Hücreleri: Alkolde çözünür granüllere sahiptir, 3- Delta ( D ) Hücreleri: Granülleri Mallory azan ile maviye boyanır, 4- C Hücreleri: Az sayıda olan C hücreleri granül yönünden fakirdir. Ayrıca PP (F) (Pankreatik Polipeptid) hücreleri, G hücreleri, Delta1 (D1) hücreleri ve Enterokramaffin (EC) hücreleri de Langerhans adacıklarında yer almaktadır. Mikroskobide bütün adacık hücrelerinin düzensiz poligonal şekilli oldukları görülür. Merkezi yerde bulunan sferikal çekirdekleri belirgin kromatine sahiptir, sitoplazmalardaki mitokondriyonlar çubuk şeklindedir ve Golgi apparatus küçüktür. Elektron mikroskopide ise sitoplazmik granüler yönünden hücreler arasında belirgin farklılıkların olduğu izlenir. Alfa (A) Hücreleri: Glukagon salgılayan alfa hücreleri genellikle adacığın periferinde yerleşim gösterir ve adacık hücrelerinin % 20’sini oluşturur. Granülleri oldukça fazladır ve uniform büyüklüğe sahiptir (250 nm çapında). Bir membran ile çevrili olan bu granüllerin merkezi oldukça denstir, periferinin ise daha az dens olduğu görülür. Çekirdek sıklıkla düzensiz şekillidir. Mallory azan tekniği ile granüller parlak kırmızı, Gomori aldehit fuchsinve poncean teknikleri ile de koyu kırmızı-pembe boyanırlar. Sekresyon devresine bağlı olarak granül sayısı hücreden hücreye farklılık gösterir. Beta ( B ) Hücreleri: İnsülini salgılayan beta hücreleri adacıkta merkezi yerleşim gösterir ve bütün hücrelerin çoğunluğunu oluştururlar (adacık hücrelerinin % 70’ini oluştururlar). Mitokondriyonları çok sayıda küçük ve sferikal şekillidir. Granülleri oldukça fazladır ve yaklaşık 300 nm çapa sahiptir. Granüller gevşek bir membran ile çevrelenmişlerdir. Granüllerin dens kristallin merkezleri sıklıkla dörtgen şeklindedir. Kristallin olan merkezi bölgenin şekli değişik hayvan türlerinde farklıdır. Beta hücreleri granülleri Mallory-azan boyası ile portakal renginde, Gomori Aldehyde Fuchsin ve Poncean teknikleri ile de koyu mavi-mor boyanırlar. Delta (D) Hücreleri: Adacığın periferinde yerleşirler ve tüm hücre populasyonunun % 5’ini oluştururlar. Somatostatin salgılayan delta hücreleri A hücreleri arasında yer alırlar; fakat granülleri A (alfa) hücreleri granüllerinden daha az homojen ve daha az denstir. Çapları 350 nm’dir. Buradaki granüller daha büyüktür, bağımsız hücreler olabilirlerse de araştırıcılar bu hücrelerin alfa hücrelerinin varyasyonlarını simgelediklerine inanırlar. C Hücreleri: Yedek ya da dinlenme evresi hücreleri olabilen C hücreleri alfa veya beta hücrelerine differansiye olabilirler. C hücreleri sayıca az olup, beta hücreleri arasında merkezi olarak bulunurlar. Soluk boyanan bu hücreler ya çok az granül içerirler ya da hiç içermezler. Fonksiyonları bilinmemektedir fakat rezerv hücre olabilecekleri düşünülmektedir. D1 hücreleri: D hücrelerinin bir varyantı olan bu hücreler 150-200 nm çapında homojen granüllere sahiptir. F (PP) hücreleri: Pankreas başı adacıklarında yaygındır ve 180 nm çapta küçük, homojen veziküllere sahiptir. Bu hücre tipi adacıkların dışında, asinar hücreler arasında ve pankreatik duktusun epiteli içerisinde de bulunabilir. G hücreleri: Langerhans adacıklarında dağılmış ve 300 nm çapta granüllere sahiptir. Enterokromaffin (EC) hücreleri: Adacıklarda da yer almasına karşın daha çok ekzokrin asinus ve duktular komponentlere dağılmışlardır. Bütün endokrin hücre tipleri genellikle kapillerlerle yakın yerleşim gösterirler. Granüllerinin çoğunluğu kapillerlere komşu bölgede yerleşmiştir. Bazal laminanın kalınlaşmasına sebep olan hastalıklar hücreleri kolaylıkla inaktive etmektedirler. Her bir hücre tipi farklı bir hormon salgılar. B hücreleri insülin salgılar. Bu hormon özellikle kas ve karaciğer hücreleri başta olmak üzere hücre membranlarına etki ederek hücre içerisine glukoz girişini sağlar ve böylece kan şeker seviyesinde azalma meydana gelir. B hücreleri gerçekte preproinsülin sentezlerler. Preproinsülin C terminal kısmından 23 amino asit kopması ile proinsüline çevrilir. Proinsülin 35 amino asitten meydana gelmiştir. Dolayısı ile amino asit sayısı insülinden daha fazladır. Birbirine peptid bağları ile bağlı 35 amino asit Golgi apparatusta immatür veziküllere parçalanır ve insülin ile C peptid meydana gelir. İnsülin 21 amino asitten oluşan bir A zinciri ve 30 amino asitten oluşan bir B zinciri içerir. Bu zincirler birbirlerine iki disülfit bağları ile çinko kompleksi şeklinde bağlanmıştır. Granül içerisindeki insülin konsantrasyonu çinko kompleksi ve protein presipitatları ile birlikte bulunmasından dolayı osmotik aktivitesinde azalmaya sebep olur. Uzun süre yeterli miktarda insülin üretilmediğinde diabetes mellitus (şeker hastalığı) denilen hastalık meydana gelir. Bu hastalıkta B hücrelerinin sayılarında da belirgin bir azalma görülür. B hücrelerinde gözlenen tümörlerde (insülinoma) çok sayıda B hücresi oluşur. Bunun sonucunda da insülin seviyesi normalden daha fazla olur. İnsülin salınımı kan şeker düzeyinin artması ile uyarılır. Kan şeker seviyesindeki yükselme kısmen, duodenum ve jejunumdaki bezlerin orta katlarında yerleşen hücreler tarafından salgılanan gastro inhibitör polipeptid (GIP) ve A hücreleri ile ilişkilidir. İnsülin stimülasyonunu takiben gastrik asit ve pepsin sekresyonunun inhibisyonu gözlenir. A hücreleri glukagon sentezlerler. Glukagon esas olar karaciğer hücrelerinden olmak üzere, hücrelerden glikojenolizis sonucunda glukoz salınmasına neden olur. Böylece kan şeker seviyesi yükselir. A hücrelerinin aynı zamanda Adrenokortikotrophic hormon (ACTH), endorfin ve endorfin prekürsörleri gibi diğer aktif peptidleri de salgıladıkları düşünülmektedir. D Hücreleri somatostatin hormonunu salgılarlar. Somatostatin insülin, glukagon ve pankreatik polipeptid (PP) hormonlarının salınımını inhibe eder ve muptemelen bu hormonun etkisi parakrin tarzda oluşmaktadır. D1 hücreleri vazoaktif intestinal peptid (VIP) hormonunu salgılarlar. Bu hormon glukagon hormonu gibi glikojen yıkımına sebep olur. VIP aynı zamanda mide asit sekresyonunu inhibe ederek barsağın hareket ve salgılama aktivitelerini etkiler. VIP barsak mukozasından elektrolit ve su sekresyonunu uyarır ve kan damarlarının genişlemesine sebep olur. PP hücreleri Pankreatik polipeptid hormonu üretir ve midede enzim sekresyonunu uyarır. G hücreleri gastrin salgılarlar. Gastrik motiliteyi ve HCl yapımını stimüle eder. EC hücreleri sekretin, motilin ve substans P salgılarlar. Sekretin; pankreatik sıvı ve enzim sekresyonunu stimüle eder. Motilin; gastrik ve intestinal motiliteyi arttırır. Substans P’nin fonksiyonu ise hala anlaşılamamıştır. Kan Damarları ve Sinirleri Pankreas zengin arteryel kan akımını çölyak ve superior mezenterik arterlerin dallarından alır. Venöz geri dönüş portal sistem yolu ile olur. İnterlobüller bağ dokusunda bulunan ana damarlardan ayrılan ince dallar lobüllerin içerisine geçer. İntralobüler damarlardan ayrılan arterioller adacıklara geçerler ve burada yaygın bir kapiller ağ oluştururlar. Bu sistem ilk olarak, periferal olarak yerleşen A ve D hücrelerini besler daha sonra merkezi olarak yerleşen B hücrelerini besler. Kan adacıklardan ekzokrin kısma geçer. Bu düzenlenmeye göre pankreatik kan akımının büyük bir kısmı önce adacıklara geçerek adacık hücrelerinin birbirleri arasında ve adacık hücreleri ile asinar doku arasında etkileşime izin verir. Adacığın peptid hormonları asinar fonksiyonu etkiler. İnsülin pankreatik sıvı akışını artırır. Glukagon enzim salgılamasını stimüle eder. Somatostatin ve pankreatik peptid enzim sekresyonunu inhibe eder. Pankreasın otonomik sinirleri çölyak ganglion (sempatatik) dan ve vagus (para sempatetik) dan köken alır. Birkaç ganglion hücresi de interlobular bağ dokusunda bulunur.

http://www.biyologlar.com/langerhans-adaciklari-pankreasin-endokrin-kismi

DNA YAPISI VE ÖZELLİKLERİ

Bütün tek ve çok hücreli organizma ile bir kısım virüslerde genetik materyal DNAdır. DNA yapı ve özellikleri başlığı altında, DNAnın moleküler yapısı, deoksiriboz, fosfat ve pürin ve primidin bazlarının yapıları ve birbirleri ile verdikleri reaksiyonlardan başlanarak anlatılmaktadır.nükleozid, nükleozit fosfat, nükleotid ve nükleozid-tri-fosfatlar hakkında bilgi verilmekte, nükleozit-tri-fosfatların DNA polimerini oluşturma reaksiyonları, purin pirimidin eşleşme özellikleri anlatılmaktadır. DNA çift sarmalının özellikleri, çeşitli ortam koşullarında biarbirine dönüşebilen DNA formları hakkında bilgi verilmektedir. DNA replikasyonunun yarı koruyucu (semikonservatif) özelliği deneysel örnek verilerek; ökaryotik ve prokaryotik DNA replikasyonu basamakları karşılaştırmalı olarak ve görev alan proteinlerle ilgili bilgileri de kapsamak üzere açıklanmaktadır. Ayrıca bu başlık altında DNA hasar tipleri, bunlara neden olan etkenler ve tamir mekanizmaları açıklanmakta; genom DNAsının farklı bölgeleri (tekrar dizinleri, gen aileleri, satellit DNA, gen kontrol bölgeleri, sessiz bölgeler gibi terimlere de açıklık getirilerek) ayrıntılı bir sınıflandırma yapılarak anlatılmaktadır. Gen aktivitelerinin ayarlanması (Genetik kontrol mekanizmaları) Çok hücreli bir organizmdeki bütün hücreler aynı genoma sahiptirler. Ancak, bu hücrelerdeki gen ürünleri ve bu ürünlerin düzeyleri hücreden hücreye, ya da aynı bir hücrede bir andan diğerine farklılık göstermektedirler Hücrelerin özelleştikleri fonksiyonlara ve o andaki gereksinimlere uygun ürünleri, uygun düzeylerde bulundurdukları gözlenmektedir.çok ya da tek hücreli organizmalarda her bir hücredeki gen ifadesi çeşitli mekanizmalarla ayarlanmaktadır.Bu kontrol mekanizmaları. Tek hücrelilerin çevre koşullarına; çok hücrelilerde ise hücrelerin birbirlerine uyumunu sağlamaktadır. Konunun kapsadığı alt başlıklar şunlardır: Bakteride enzim (protein) sentezinin ayarlanması, 1)Laktoz operonu örneğiyle anabolik/katabolik operon; konstitutif (zorunlu)/fakültatif (seçimli) enzim; katabolit aktivator proteini; indüktör; regülatör bölge; triptofan operonu örneğiyle, repressör; korepressör; son ürün inhibisyonu, genetik polarite terimleri ve mRNA düzeyinde genetik kontrol mekanizması, 2) arabinoz operonu örneği üzerinden ise gen aktivitesinin, gen ürünü tarafından negatif /pozitif kontrolu; RNA yapısına bağlı; küçük RNAlar ya da ribozomal proteinler veya alarmonlar aracılığı ile translasyon düzeyindeki kontrol ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Ökaryotlarda gen aktivitesinin ayarlanması ise, 1)Duplikasyon ya da amplifikasyon, 2)Metilasyon/demetilasyon v.b yollarla selektif gen inaktivasyonu/aktivasyonu, 3)Gen yeni düzenlenmeleri (rearrangement) ile kontrol, 4)Arttırıcı (enhancer) ve susturucu (silencer) DNA bölgeleri ile aktivite ayarlanması, 5)Posttranskripsiyonel kontrol ve 6)Hormonal kontrol ikincil başlıkları ile anlatılmaktadır. Mitoz ve amitoz bölünmeler Girişte, bilinen hücre bölünmesi tiplerinin genel sınıflandırması ve tanımları yapıldıktan sonra, insan dahil çok hücrelilerin kimi hücrelerinde normal olarak, kimi hücrelerinde ise kanser ya da çevre koşulları nedeniyle normal dışı gerçekleşen amitoz bölünme kısaca anlatılmaktadır. Konunun devamında ayrıntılı olarak, hücre döngüsü,ve bu döngünün G1, G0, G2, S (DNA biyosentezi) ve M (mitoz) bölümleri; mitoz bölünme fazların ve bu fazlar sırasında hücrede gerçekleşen moleküler olaylar, çekirdek ve hücreye ait hareket ve değişimler, ayrıca mikrotübüllerin yapımı, moleküler yapıları, S ve M fazlarına geçişleri kontrol eden moleküller ve çalışma prensipleri anlatılmakta; hücre döngüsü sırasında her bir basamakta hücrenin DNA düzeyi (n, 2n, 4n), çeşitli proteinlerin düzeylerindeki değişiklikler; kromozom, kromatid, sentromer, kinetokor, metafaz ve interfaz kromozomu ile kardeş kromatid değişimleri üzerinde durulmaktadır... Mayoz bölünme, ovogenez ve spermatogenez Mayotik bölünme, ovogonyal ve spermatogonyal kök hücrelerin ard arda geçirdikleri mitoz bölünmeler sonucunda oluşan ve özel moleküler sinyallerle uyarılan hücrelerin bir S fazı sonrasında geçirdikleri ard arda iki bölünmeyi (mayotik I. Ve Mayotik II. Bölünmeler) kapsar, birinci bölünme daha uzun sürmekte ve kendine özgü alt fazları, tamir mekanizmaları, sinaps, kiazma, krossing/over ve gen dönüşümü (gene conversion), sentromer bölünmesinin olmaması gibi olay ve özelliklerle mitoz bölünmeden ayrılır. İkinci bölünme ise mitoz bölünmenin aynıdır. Mayotik bölünmenin en önemli sonuçları, türe özgü kromozom sayısının korunması ve rekombinantların orta çıkmasıdır... Konu, birbirine paralel çizilmiş mitoz bölünme, mayoz bölünme, ovojenez ve spermatojenez şemaları üzerinden karşılaştırmalı ve ayrıntılı olarak sunulmakta, bu olaylar sırasında gerçekleşen hücre ve kromozom hareketleri, kromozom ve gen hareketlerinin ilişkileri, bu hareketlerin ovojenez ve spermatojenezdeki zamanlamaları ve farklılıkları üzerinde durulmaktadır... Mozaiklik ve şimerizm Bu başlık altında, aynı bir organizmde, farklı kromozom kuruluşlu hücrelerin birlikte bulundukları mozaiklik (mikzoploidi) ve şimerizm (freemartinizm) karşılaştırmalı olarak ele alınmakta, oluşum mekanizmaları, oluştukları düzeyler (gametik, zigotik, somatik gibi) ve bunlara göre etkileri, ayrıca mozaikliğin özel bir tipi olan Lyonizasyon ve kromozom sapmalarının saf formlarının oluşturdukları etkilerle karşılaştırmalar yapılmaktadır. Mendel Genetiği Konunun girişinde, Genetiğin babası olarak adlandırılan Mendel’in yaptığı deneyler, elde ettiği sonuçlar, başarılı olmasını sağlayan etkenler ve Mendel’in sonuçlarından, günümüzdeki DNA; gen; hücre bölünmeleri; kromozom hareketleri ve kalıtım arasındaki ilişkiler anlayışına ulaşılana kadar yapılanlar kısaca özetlenmektedir. Daha sonra, mayotik kromozom hareketleri ile allellerin ve farklı genlerin hareketleri karşılaştırılarak Mendel’in birinci ve ikinci kuralları verilmektedir... gen, allel, hibrit, parental döl, filial döl, çaprazlama, genotip, fenotip gibi terimler konunun akışı içerisinde açıklanmakta, genotiplerden gametlerin saptanması, mono-, di- ve trihibrit çaprazlama, kendileştirme, test çaprazlaması, çaprazlama tablolarının hazırlanıp, sonuçların değerlendirilmesi örnek problem çözümleri ile anlatılmaktadır. Alleller arasındaki ilişkiler (dominantlık, intermedier kalıtım, multipl allelizm gibi alt başlıklarla), farklı genler arasındaki ilişkiler (epistasi, modifikatör,süpressor genler letal genler gibi alt başlıklarla) ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca bağlı (linked) genler ile krossing/over ilişkisinden yararlanılarak, incelenen genlerin kromozom üzerinde birbirlerine göre yerleşimlerinin bulunması, örnek problemlerle anlatılmaktadır. DNA metilasyonu Çoğu ökaryotik organizmanın DNAsı, replikasyon sonrasında bir takım değişikliklere uğrar. Bu değişikliklerden biri de baz metilasyonudur. Metilasyona uğrayan baz genellikle CG (sitozin_guanin) ikililerindeki C bazıdır. DNA metilasyonundan sorumlu enzimlerin genel adı, metil transferazlardır. C metilasyonu gen ifadesinin kontrolunda rol oynayan mekanizmalardan biridir. Bu konu başlığı altında, gen aktivitesinin kontroluyla ilgili metilasyonun DNA daki yerleşimi, nasıl rol oynadığı, DNA metilasyonu ile sınırlayıcı (restriction)enzimlerinin ilişkilerinden yola çıkılarak DNA metilasyonunun incelenmesinin temel prensipleri, bu inceleme metodlarının, onkogenlerin demetilasyonları ya da tümör supressör genleri metilasyonu ile ortaya çıkabilen kanser tiplerinin ve başka hastalıkların tanı ve sınırlı da olsa tedavisinde yararlı olabileceğini gösteren bulgular tartışılmaktadır... Hücreler arası haberleşme Tek hücrelilerde gözlenen fototaksi, kemotaksi gibi hücre-çevre ya da feromenler aracılığı ile olduğu gibi hücre-hücre haberleşmesi, çok hücrelilerde daha da gelişmiş ve karmaşıklaşmış bir organizma içi sosyal kontrol mekanizması şeklinde karşımıza çıkmaktadır. Hücreler arası haberleşme, büyüme; yaşama; çoğalma; ölüm v.b. olayların düzenlenmesini ve hücreler arasındaki koordinasyonu sağlar. Konunun akışı içerisinde, sinyal molekülleri (ligandlar), alıcı moleküller (reseptörler)in çeşitler, özellikleri ve çalışma mekanizmaları, hücreler arası haberleşmenin genel prensipleri, sinyal kaynağı ve hedef hücrelerin özelliğine göre haberleşme tipleri (parakrin, sinaptik, endokrin ve otkrin haberleşme gibi), hücre içerisindeki sinyal akışı ve enerji kullanımı modelleri ile hücresel aktivitelerin, diğer hücrelerin aktiviteleri ile uyumluluğunun nasıl sağlandığını gösteren örnekler konu kapsamına alınmıştır.      

http://www.biyologlar.com/dna-yapisi-ve-ozellikleri

Başlıca Plasmidler ve Özellikleri

Bakterilerde, karakterleri çok değişik olan doğal plasmidler bulunmaktadır. Taşıdıkları özel genlere dayalı olarak bunları 6 grup altında incelemek mümkündür. 1) F plasmidi (fertilite faktörü, F faktörü, seks faktörü) 2) Rezistenslik plasmidleri (R plasmidleri, R faktörleri) 3) Virulens plasmidleri 4) Bakteriyosin plasmidleri 5) Metabolik plasmidler 6) Büyük plasmidler F plasmid (F Faktörü, Seks Faktörü) F faktörü (fertilite faktörü) en iyi E. coli K 12 suşlarında incelenmiştir. Bir plasmid olan F faktörü, sirküler, sarmal ve çift iplikçikli otonom bir DNA molekülüdür (MA: 63x106 dalton, 95 kbp uzunlukta ve hücre de 1-3 tane kadar). Konak bakterisinin yaklaşık %2'si kadar uzunlukta olan bu plasmid, yapısında replikasyon orijininden (RO)'dan ayrı olarak kendisinin transferini sağlayabilecek ve pilus formasyonunu kodlayan bilgilere sahiptir (Tra operonda 21 gen). Bu plasmid hangi hücreye aktarılırsa, o bakteride hücre membranında pilus sentezi (pilus formasyonu) meydana gelir. Bu pilus (seks pilusu), bu faktörü taşımayan alıcı hücrenin (F- hücre), verici hücre ile (F+ hücre) bağlantı kurmasına ve bir konjugasyon köprüsü oluşturmasına yardımcı olur. F faktörü konjugatif (transmissible) bir plasmiddir. F faktörü bakterinin sitoplasmasında bulunabileceği gibi, konakçının genomuna da integre olabilir ve Hfr (high frequency recombination) hücre meydana gelir. F plasmidi ile başlıca 3 tür konjugasyon oluşabilmektedir. Bunlar da, 1) F+ hücre x F- hücre konjugasyonu: F faktörünü sitoplasmasında taşıyan bir F+ hücre ile buna sahip olmayan F- hücre arasında gerçekleşen F faktörü aktarılmasında seks pilusu önemli fonksiyona sahiptir. Ancak, böyle iki hücrenin direkt teması da genetik madde aktarımına yardımcı olabilmektedir. F+ hücre x F¯ hücre birleşmelerinde genin aktarımı tek yönlüdür. Yani vericiden alıcıya doğrudur. İki yönlü olmamaktadır. Ayrıca, F+ hücre ile F- hücre birleşmelerinde de alıcı hücre her zaman F+ hücre şekline dönüşmeyebilir. Konjugasyon sırasında, F faktörünün bir iplikçiğinde oluşan kopma (ori T bölgesi) ve buradan ayrılan 5' ucu, seks pilusunun oluşturduğu köprüden geçerek F- hücreye transfer edilir. Aktarılan tek iplikçiğin karşısında 5' ¬ 3' yönünde ikinci bir iplikçik sentezlenerek alıcı hücrede çift iplikçikli ve sonra da sirküler forma dönüştürülür. Böylece başlangıçta F- olan alıcı hücre F+ hale dönüşmüş olur. Vericide bulunan tek kopya da rolling circle replicationla çift iplikçikli forma getirilir. Böylece verici hücre de yine plasmid kalmış ve bu hücre F+ karakterini korumuş olur. Alıcı hücreye aktarılan F plasmidi, burada sitoplasmada kalır. Nadiren bakterinin genomuna da integre olabilir ve hücreyi Hfr haline getirebilir veya bazen de hücreden ayrılabilir. Genetik materyalin, vericiden alıcıya aktarılmasında seks pilusunun çok önemli fonksiyonu olmasına karşın, aktarım bazen, direkt temas sonunda da meydana gelebilmektedir. 2) Hfr hücre x F-hücre konjugasyonu: F faktörünün alıcı hücrenin kromozomu ile birleştiği durumlarda, bakteride seks pilus formasyonu çok daha fazla sıklıkta meydana gelir ve buna bağlı olarak ta gen transferi çok daha yüksek oranda gerçekleşir. Hfr hücrelerde, kromozom üzerinde lokalize olan F faktöründe iplikçikte oluşan kopma sonu ayrılan 5'-ucu konjugasyon köprüsüne girerek buradan alıcı (F- hücre) hücreye transfer edilir. Ancak, bağlı bulunduğu konakçı genomundan da bir segmentin veya nadiren tüm kromozomun da, tek iplikçik halinde, alıcıya aktarılmasını sağlayabilir. Alıcıya geçen tek iplik F faktörü ve/veya kromozom segmenti burada çift iplikçikli ve sirküler forma dönüştürülür. Vericide kalan tek iplikçik F faktörü rolling circle replication ile çift iplikçik haline getirilir. Eğer genomdan bir segment (tek iplikçik) gitmişse, bu da karşı iplikçik kalıp olarak kullanılarak yeni iplikçik sentezlenerek çift iplikçikli hale getirilir. Alıcı hücreye aktarılan F faktörü veya F faktörü + kromozom segmenti, ya alıcı hücrenin genomuna integre olur ve bu hücreyi de Hfr haline getirir veya F plasmidi, hücre sitoplasmasında da kalabilir. F+ hücrelerden F- hücrelere aktarılan F plasmidinin alıcı hücrenin kromozomu ile integre olma olasılığı 10-5-10-6 arasındadır. Kromozomla birleşme geriye dönüşlü de olabilir. Yani F faktörü genomdan ayrılabilir. DNA transferi belli bir hız ve belli bir yerden başlayarak devam eder. Bu hız 37°C 'de bir saat içinde yaklaşık 105 nukleotid çifti kadar olduğu belirlenmiştir. F+ hücrelerden alıcıya F faktörünün transferi oranı genellikle düşüktür. Çünkü, pilus formasyonu, Hfr hücrelere göre daha azdır, Ayrıca direkt  kontakla yapılan transferlerde de, sıvı ortamda bakteriler serbest olarak bulunduklarından ve aralarında az da olsa bir mesafe olduğundan direkt temas oldukça sınırlı kalmaktadır. Bazı durumlarda mikroorganizmalar sıvı ortamda kümeler tarzında veya birbirlerine bağlı olarak da üreme gösterebilirler. Ancak, böyle kümeler tek bir mikroorganizmadan oluşması nedeniyle hepsi aynı karakteri yani hepsi F- olabilirler. Katı ortamlarda da üreyen koloniler, aynı şekilde, tek bir mikroorganizmadan kaynaklandığı için aynı sorun burada da bulunmaktadır. F faktörü, sadece E. coli suşları arasında transfer edilmez. Aynı zamanda, salmonella, shigella, pseudomonas, proteus, vs cinslerine ait türlerde de meydana gelebilir. F+ E. coli suşları diğer  Gram negatif mikroorganizmalarla da konjugasyon yapabilir. Ancak; daha az sıklıkta bir gerçekleşme elde edilir. Örn, E. coli ile salmonella arasındaki konjugasyon oranı 10-6-10-8 kadardır. Salmonella ile shigella arasında da buna benzer bir oran bulunmaktadır. F faktörü bazı indükleyicilerin (akridin boyaları, ethidium bromide, mitomycin C, vs) etkisinde veya spontan olarak bakteriden çıkabilir (eliminasyon, plasmid eksklusiyonu). Böylece, F+ hücreler F-  hücre haline gelebilirler. 3) F' hücre x F- hücre konjugasyonu: Bazı indükleyicilerin etkisi altında, Hfr hücrelerinde kromozomda yerleşik bulunan F plasmidi buradan ayrılabilir. Bu ayrılma tam veya kısmi olabildiği gibi bazı durumlarda da kromozomdan da bir segmentin veya genin birlikte çıkmasına neden olabilir. Kısmi ayrılmalarda ise, plasmidin bir bölümü bakteri kromozomu üzerinde kalır. Bakteri genomundan bir segmentin F plasmidi ile birlikte çıkması (F' plasmidi) durumunda oluşan F' hücre ile F- hücre konjugasyonlarında, bakteri genomu da alıcı hücreye çok nadiren transfer edilebilir ve bu bakteriyi, aktarılan faktör yönünden pozitif hale getirebilir. Ancak, çoğu kez bakteri segmenti transfer edilmez veya aktarılsa bile kromozomla birleşmeyebilir. Konjugasyonun önemli olan yanlarından biri de, kesintili konjugasyon denemeleri ile bakterinin zamana karşı kromozom lokalizasyonlarının haritasını yapmak mümkündür. Böylece hazırlanan kromozom haritalarında hem genlerin yerleri ve hem de aktarılma süresi içinde zamanları da belirlenmektedir. F faktörünün bakteri kromozomuna integrasyonunda her ikisinde bulunan İS-elementlerinin rolü olduğu bildirilmektedir. Bakterideki İS-elementi ile F plasmidinde bulunan İS-elementi karşılıklı gelerek çapraz integrasyonla F faktörü kromozoma integre olur. Rezistenslik Plasmidleri (R Plasmidleri) Enterobakteriler arasında çeşitli ilaçlara karşı dirençlilik, hem in vitro ve hem in vivo olarak saptanmıştır. İlk defa bu özellik, 1951 yılında Japonya'da seyreden bir dizanteri olgusundan izole edilen S. flexneri suşunun 4 antimikrobial maddeye (kloramfenikol, tetrasiklin, streptomisin ve sulfonamid) karşı dirençli olduğu belirlendikten sonra anlaşılmıştır. Bu etkenin dışında, birçok ilaca karşı çoğul dirençlilik E. coli, salmonella, shigella, Klebsiella, proteus ve bazı enterobakterilerde de rastlanmıştır. Daha sonraları antibiyotik sayısında, dirençlilik yönünden artmalar olmuş ve yukardakilere ilaveten ampisilin, kanamisin, neomisin, vs gibi antibiyotiklere çoğul dirençlilik gösteren suşların sayısında artmalar meydana gelmiştir. R plasmidleri çift iplikçikli sarmal, sirküler  ve yapıda DNA karakterinde genetik elementlerdir. Molekül ağırlıkları >50x106 kadar olup genellikle konjugatif bir özelliktedirler  Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler. R faktörleri iki bölümden oluşurlar. Biri konjugasyonu ve aktarılmayı yöneten transfer faktörü (TF) ve diğeri de çeşitli ilaçlara karşı dirençliliği tayin eden rezistenslik faktörü (RF) veya R determinanttır. E. coli 'de bu iki faktör tek bir ünite halinde bulunmasına karşılık salmonella ve proteuslarda bunlar ayrı sekanslar halindedirler. Bu faktörler birbirlerinden bağımsız olarak aktarılabilirler ve akridin boyalarından da ayrı ayrı etkilenirler. Eğer, RF transfer edilirse alıcı hücre ilaçlara karşı dirençli hale gelir. Ancak, RF'nin, TF olmadan tek başına aktarılması olanaksızdır. Bu nedenle RF'nin aktarılması diğer mekanizmalar tarafından yönetilir. Patojenik bakteriler, kendilerinde bulunan R faktörlerini nonpatojenik olanlara transfer edebilir. R plasmidleri, aynı zamanda, bazı faktörleri, diğer plasmidlerle birleşerek veya transpozonlardan alabilirler. Bazıları da R faktörlerini amplifiye edebilir veya plasmid sayısı (kopya sayısı) artırılabilir. Böylece bakteriler arasında rezistenslik konsantrasyonu çoğalmış olur. RF ve TF'yi ayrı üniteler halinde bulunduran suşlarda ya biri veya ikisi birlikte transfer edilebilir. R faktörleri, etkilerine göre karakterize edilebilirler. Bazıları fertiliteye mani olur ve F pilus oluşumunu baskılar (fi+, fertilite inhibisyon pozitif), bazıları da etkilemez (fi-, fertilite inhibisyon negatif). Ancak, fi+ faktörü, F faktörünün aktivitesini sınırlandırır. Buna karşın, fi-, F faktörünün etkinliğine tesir etmez. Bazen de bir hücrede fi+ ve fi- faktörleri bir arada bulunabilirler. Bu durum, aynı hücrede her iki faktörün replikasyon için aynı bağlanma yerine sahip olmadıklarını göstermektedir. R faktörü taşıyan hücrelerde, F piluslarına benzeyen piluslar (R pilusu) oluşmaktadır(R-plus formasyonu). Bu pilus da R faktörünü transferde bir konjugasyon köprüsü oluşturur ve genetik materyalin aktarılmasında önemli rol oynar. R faktörü, çeşitli antibiyotiklere karşı dirençliliği tayinde rol alan genlere sahiptir. Şimdiye kadar, 7-8 antibakteriyel maddeye karşı rezistenslik tespit edilmiş olup bunların da tek bir R faktöründe toplanabileceği belirlenmiştir. Bir bakteride, ilaç dirençliliği oluşursa, bu zamanla çok yönlü R faktörüne dönüşebilir ve diğer Gram negatiflere de aktarılabilir. Antibiyotikler alındığında, bunlara duyarlı olan mikroorganizmalarda azalmalar meydana gelirken, dirençliler de ise bunların yerini alma ve çoğalma gözlenir. Bu arada, R faktörünün de hem patojenik ve hem de nonpatojenik Gram negatiflere transferi artar. Böylece, barsakta, R faktörünü taşıyan hücre sayısı çok fazla bir düzeye ulaşır, komensal ve patojenikler arasında yaygın bir hale gelir ve hastalığın nüksüne yol açar. Bu tarz infeksiyonlara, Gram negatif etkenlerden ileri gelen infeksiyonların sağaltımında kullanılan streptomisin uygulamasından sonra rastlanmaktadır. R faktörünün bir kısmı, zamanla, spontan olarak veya antibiyotik baskısının kalkması sonu, konakçı bakteriden ayrılabilir. Spontan kaybolmalarda R faktörünün, kromozomla aynı anda bölünerek kardeş hücrelere aktarılması da rol oynar. P. multocida, S. aureus, Salmonella, Shigella, genellikle, ilaçlara duyarlı, buna karşın Pseudomonaslar ise dirençlidirler. Mutasyonlar sonu da, antibiyotiklere karşı dirençlilik oluşabilmektedir. Ancak, bu tarz rezistenslik, yukarıda açıklandığının aksine, ekstrakromozomal değil kromozomaldir. Bakterilerde bulunan restriksiyon endonuklease enzimleri yabancı orijinli genetik materyallerin invazyonuna mani olur. Ancak, bu koruma işlevi her zaman başarılı olmaz ve yabancı DNA segmentleri hücrelere girer ve kromozomla da birleşebilir ve mutasyonlara da yol açabilir. R faktörü, R+ hücrelerden R- hücrelere genellikle, konjugasyonla transfer olmasına karşın Gram pozitiflerde (stafilokoklarda) genel transdüksiyonla aktarma meydana gelir. R faktöründeki çoğul dirençlilik, bunda bulunan transpozon (Tn) ve/veya İS-elementlerinden kaynaklanmaktadır. Çeşitli antimikrobial ilaçlara ve metallere karşı dirençliliği sağlayan ve R plasmidlerince kodlanan özellikler ve bunların mekanizmaları hakkında ayrı bir bölüm halinde, bu kısmın  sonunda, bilgi verilmektedir. Bakteriyosin Plasmidleri Bakteriyosinler, bazı bakteriler tarafından sentezlenen dar spektrumlu ve letal etkili proteinlerdir. Bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal olmasına karşın, bazıları da plasmid orijinlidirler. Bakteriyosinler, ancak, kendini sentezleyen türden veya konakçısına çok yakın olan mikroorganizmalara etkilidirler. Örn., E. coli tarafından sentezlenen colicin (kolisin, bakteriyosin), bunu sentezleyemeyen E. coli 'ler ile S. sonnei  için letaldir. Ancak, diğer bazı enterobakterilere de etkili olabilmektedir. Bu etki çok sınırlıdır. İnsan ve hayvanlardan izole edilen E. coli suşlarının yaklaşık %40 kadarının kolisinojenik olduğu belirtilmektedir. Şimdiye kadar 20'den fazla ve ayrı özellikte kolisin izole edilmiş olup bunlar A'dan V'ye kadar, büyük harflerle bir sıralamaya tabi tutulmuştur. Bunların her biri, E. coli 'lerin bazılarına etkili olmakta ve böylece bir konakçı spektrumu ve spesifitesi meydana gelmektedir. Kolisin sentezleyen suşlar (kolisinojenik suşlar) kendi  oluşturdukları kolisinlere dirençlidirler. Ancak, kolisin sentezlenmeyenler etkilenirler. Bakteriyosinler, Gram negatif mikroorganizmaların yanı sıra bazı Gram pozitiflerce de (stafilokok, streptokok, listeria, basiller vs) sentezlenebildikleri açıklanmıştır. Bakteriyosin formasyonu için, bakterilerde, özel, bakteriyosinogenlerin bulunması gereklidir. Bunlar, bakteriyosin sentezini spesifiye eden özel genler olup bir kısmı ekstrakromozomal bir karakter taşırlar. Bir çok bakteride böyle genler bulunmasına karşın, genellikle, baskı altında tutulurlar ve bakteriyosin oluşturmazlar. Bu nedenle de hücre filtratlarında bakteriyosinlere çok az rastlanır ve bazen de hiç bulunmayabilirler. Ayrıca, bazı bakteriyosinojenik suşlar da, aynen bakteriyofajlarda olduğu gibi (lizojenik suşlar), bakteriyosin sentezi için indüklenmeleri gerekmektedir. Bakteriyosin sentezleyen hücrelerde, özel bir pilus formasyonuna rastlanmamaktadır. Bunları kodlayan genler, ancak F veya R faktörlerinin oluşturdukları pilusların konjugasyon köprülerinden yararlanarak diğer bakteriye aktarılabilirler. Fakat, Col E1 pilus formasyonunu tayin edebilir ve kendinin transferini sağlayabilir. Bunun yanı sıra, çok az oranda da bakteri kromozomundan bir segmenti de mobilize edebilir ve aktarıldığı hücreye taşıyabilir. Ancak, kromozoma integre olmazlar. Bazı kolisinler (Col E1), bazı E. coli suşlarında bulunan özel bir plasmid (Col plasmidi) tarafından spesifiye edilirler. E. coli 'lerin genomunda doğal olarak kolisin sentezleyen bir gene rastlanamamıştır. Ancak,  kendilerine kolisin geni transfer edilirse böyle E. coli 'ler kolisin genini eksprese edebilirler. Col plasmidi kendi konakçı bakterisini, aynı kolisine karşı dirençli hale getirmesine karşın, diğer kolisinlere duyarlı olabilirler. Örn., Col1 A plasmidi E. coli 'yi colicin A 'ya karşı dirençli yapmasına karşın, colicin B ve diğer kolisin türlerine duyarlıdır. Kolisinler, etkilerine göre, E. coli 'ler, Fredericq tarafından 20 farklı tipe ayrılmış ve bunlara A'dan V'ye kadar bir isim verilmiştir (Freedericq klasifikasyonu). Bu sistematikte, E. coli 'lerin dirençlilikleri esas alınmıştır. Ancak, bu sistematik pratiğe pek uymamaktadır. Şöyle ki, bir E. coli suşu, birden fazla türden kolisin sentezlediği gibi, birden fazla türden kolisini kodlayabilmektedir. Bakteriyosinler düşük molekül ağırlığında ve protein karakterinde substanslar olup her birinin amino asit sıraları ile bazılarının bunları kodlayan genlerin bazılarının baz sıraları saptanmıştır. Yapıları oldukça basit, karbonhidrat ve lipid molekülleri yönünden de bazıları yoksundurlar. Bu nedenle bakteriyosinlerin plasmidler tarafından spesifiye edilip-edilmediklerini saptamak oldukça kolay olmaktadır. Gram pozitiflerce sentezlenen bazı bakteriyosinler, ayrı cinsten mikroorganizmalara da az da olsa etkili oldukları açıklanmıştır. Ancak, bu özellikteki bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal orijinlidirler. Şöyle ki, P. aeruginosa 'nın aeruginocini (pyocin) kromozomal genler tarafından spesifiye edilirler. Bakteriyosinler proteazlar tarafından inaktive edilirler. Bazılarının morfolojileri de, elektron mikroskopla yapılan muayenelerde, faj kuyruklarına benzediği açıklanmıştır. Kolisinlerin ve diğer bakteriyosinlerin molekül ağrılıkları 12000-90000 arasında değişmektedir. Kolisinlerin bazıları iki asimetrik protein molekülü olarak sentezlenir. Bunlardan büyük olanı, duyarlı bakteriyi öldürür ve küçük alt ünite ise kolisin immunite proteini aktivitesi gösterir. Bu alt ünite, kolisinin, in vitro, etkisini inhibe etmesine karşın, büyük alt ünitenin bakteriyi öldürmesine mani olacak etkinlikte değildir. İmmunite proteini kolisine sıkıca bağlanır. Gram pozitif mikroorganizmaların plasmid orijinli bakteriyosinlerinin (streptococcin, staphylococcin, lactocin, vs) molekül ağırlıkları 10000-25000 arasındadır ve yapılarında lipid ve karbonhidratlar bulunmaktadır. Bu duruma göre lipoprotein veya glikoprotein özelliği taşımaktadırlar. Kolisinler bazı antibiyotiklerden (Streptomycin, chloramphenicol) daha büyük molekül ağarlığına sahiptirler. Böyle büyük moleküllerin bakterilerin hücre duvarından içeri girmeleri oldukça zordur. Ancak, bakteriyosinler bir çok tarzda hedef bakteriyi etkileyerek lize ederler. Kolisinlerin hücre membranına bağlı enzimleri aktive ederek veya bazıları da hücre membranından içeri girerek, DNA ve RNA'ların fonksiyonlarını bozarlar. Kolisinler, daha ziyade, RNase ve DNase gibi etkinlik gösterirler. Bazıları da hücre membranının permeabilitesini artırır ve böylece kolisinlerin geçişini kolaylaştırır. Buna bağlı olarak diğer moleküllerin içeri ve dışarı akışı hızlanır ve hücrenin ortamdaki metabolik dengesi bozulur. Kolisinler, aynı zamanda, bakteri hücre membranında bulunan kolisin reseptörlerine tutunarak etkili olabilmektedirler. Colicin-B, E, K ve -M reseptörleri, ferri enterocholin, Vit B12, nukleosid ve ferrichrome (sıra ile) moleküllerinin hücreye girişinde rol oynarlar. Kolisin reseptörleri kolisinin aktivitesi için önemlidir. Eğer hücre duvarı ve buna bağlı reseptörler giderilirse, orijinal hücre kolisine rezistans olsa bile, elde edilen sferoplastlar duyarlılık gösterirler. Ekseri kolisinler (Colicin A, -E1, Ia, Ib, -K) hücre duvarını kanallar oluşturarak, iyonların kolayca girip-çıkışına permeable hale getirir. Kolisinle muamele edilmiş hücrelerden genellikle potasyum (K+) iyonları fazla miktarda dışarı çıkar. Colicin E1 ve -K, hücrelerdeki ATP'ye bağlı reaksiyonları inhibe ederler (protein ve nukleik asit sentezleri de dahil). Katyonların hücreden çıkışı, bunların kofaktör olarak rollerine de mani olduğundan enzimlerin aktivitesini de inhibe eder. Colicin E2 ile muamele edilen hücrelerin DNA'ları parçalanır. Ayrıca, Colicin E2 ile temas eden hücrelerde (bakterilerde) 16SrRNA'nın 3-terminusundan 50 nukleotidin çıkmasına neden olur ve bu RNA etkisiz hale gelir. Cloacid DF13'de (E. cloacae DF13 tarafından sentez edilir) benzer tarzda etkiye sahiptir. Bu kolisinlerin pürifiye formları in vitro olarak nuklease aktivitesi gösterirler. Col El, -A, Ia, ve Ib, hücre membranında depolarizasyon meydana getirerek bakteriyi öldürürler. Col E2 ve -E3'ün de DNase aktivitesi bulunmaktadır. Col -M ve Pesticin (Y. pestis tarafından sentezlenir), hücre duvarında ayrışmalar oluşturarak mikroorganizmaları lize eder. Pesticin, hücre duvarındaki NAGA ve NAMA molekülleri arasındaki beta-1,4 bağlarını koparır. Kolisinleri spesifiye eden plasmidler başlıca iki gruba ayrılmaktadırlar. Grup I Col plasmidleri nonkonjugatif bir karakter taşımakta ve MA. 5x106 kadardır (Col El-K30, ve Clo DF13, vs). Grup II Col plasmidleri ise konjugatif olup MA: 50-80 x 106 civarındadır. Bazıları birden fazla kolisin sentezi için genetik informasyonlara sahiptir. Bunlar aynı zamanda ilaçlara dirençlilik genleri de taşımaktadırlar (Col V, ve Col B, F pilusu oluştururlar). E. coli kültürlerinde, yaklaşık %0.1 bakteri Col+ bir özellik taşımaktadır. Kolisin sentezi ancak bir kaç saat sürer. Bazı kolisinlerin de kendi bakterisine etkiledikleri açıklanmıştır. Bakterilerde, konjugasyon için pilus formasyonunu kodlamayan nonkonjugatif karakterdeki kolisin plasmidleri, eğer konakçı bakteri Col I gibi I pilus oluşturan bir plasmidle super infekte olduklarında, konjugatif plasmid kendi DNA'sı yanı sıra, diğer plasmidlerin de transferini ve hatta, kendi konakçısının DNA'sını da aktarabilir. F piluslarını adsorbe eden fajlarla, I piluslarına bağlanan fajlar (Ifl) farklıdırlar. I pilusları, Col+ bakteri ile Col I- E. coli 'ler arasındaki konjugasyonlarda Col I faktörü alıcıya aktarabilir. Kolisinojenik plasmidler, bakteri içinde bağımsız olarak replike olabilir ve konakçısı için de zararlı bir etkiye sahip değildir. Yani sentezlediği kolisinden konakçısı genellikle etkilenmez. UV-ışınları ve mitomycin C ile bazı kolisinojenik faktörler (plasmidler), indüklenebilirler. Başlangıçta (orijinalinde) Col plasmidi taşımayan ve nonkolisinojenik olan bir bakteri, bu faktörü sonradan alarak Col+ hale gelebilir. E. coli 'lerin kolisinojenik olup-olmadıklarını belirlemek için pratikte kullanılan bazı teknikler bulunmaktadır. Bunlardan birisi de "makrokoloni" yöntemidir. Bu teknik kısaca şöyledir: Taze E. coli buyyon kültürü, agar besi yerinin ortasına, 1 cm çapında yer kaplayacak tarzda ekilir. Uygun bir ısıda (37°C) 48 saat inkube edildikten sonra, kültürün kapağına 1 ml kloroform konarak petri kutusu tersine çevrilir ve böylece 30 dakika kadar bekletilir. Petri kutusunun kapağı açılarak kloroformun uçması beklenir (15. dakika). Bundan sonra, bütün kolisinlere duyarlı olan E. coli K suşunun 24 saatlik buyyon kültüründen 1/100 sulandırılarak bundan petri kutusunu ortasındaki kültüre kadar gelmemek kaydıyla ekim yapılır ve 37°C 'de 24 saat inkube edilir. Ekilen suşun ürememesi kolisinin varlığını ortaya koyar. Ekilen suşun, daha ziyade ortadaki büyük koloniye yakın bölgelerinde inhibisyon oluşur. Aşağıda bazı önemli bakteriyosinler ve bunları sentezleyen mikroorganizmalar gösterilmiştir. Ancak bunların hepsi plasmid orijinli olmayıp bazıları kromozomaldır. A) Gram negatif mikroorganizmalar Aerosin (A. aerogenes), Alveisin (B. alvei), Kloasin (E. cloacae), Kolisin (E. coli) Pestisin (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis) Piyoin (P. aeruginosa) B) Gram pozitif mikroorganizmalar Stafilokoksin (Staphylococcus), Streptokoksin (Streptococcus), Subtilisin (B. subtilis), Seresin (B. cereus), Monosin (L. monocytogenes), Megasin (B. megaterium) Kolisin grupları ve bazı kolisinler Grup A(I): E, E1, E2, E3, K, L, N, S4, X Grup B (II): B, D, G, H, I, M,S, V,Q Virulens Plasmidleri Patojenik mikroorganizmalar, kendilerinde bulunan bazı virulens faktörleri (bunlardan biri veya birkaçı ile birlikte) ile konakçıyı hastalandırırlar ve hatta ölümlerine neden olabilirler. Ancak, bu etkinlikleri, virulent bakterinin konakçıya yeterince ve uygun yoldan girmesi ve konakçının genetik ve/veya immunolojik yönden (spesifik antikor taşımaması) duyarlı olması ile yakından ilişkilidir. Bakteri, ne kadar virulent olursa olsun, eğer konakçı buna direnç gösteriyorsa, mikroorganizma üreyemez, infeksiyon veya hastalık oluşturamaz. Bakterilerin sahip oldukları virulens faktörlerinin bir kısmı da kromozomlarında kodlanmasına karşın bazıları da plasmid orijinlidir. Plasmidlerce kodlanan başlıca virulens faktörleri hakkında aşağıda kısa özlü bilgiler verilmektedir. C. tetani (nörotoksin), B. anthracis (pOX1 letal toksin ve pOX2 kapsül formasyonu), B. thuringiensis (kristal toksin, insekt larvaları için toksik) A. tumefaciens (Ti plasmidi, dikotiledon bitkilerde tümör formasyonu), L. lactis (nisin), S. aureus (eksfoliatif toksin), Y. pestis, Y. psedotuberculosis, Y. enterocolitica (membran proteinlerini kodlayan plasmidler). S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae (dizanteri oluşturan toksinlerin kodlarını taşıyan plasmidler), insanlardan izole edilen E. coli 'lerde LT ve ST-toksinlerin sentezlerini spesifiye eden plasmidler (CFA-1, -2, E8775), buzağı ve kuzularda hastalık oluşturan E. coli 'lere ait K99 antijenleri ile domuz ishallerinden ayrılan E. coli 'ler de bulunan K88 ve 987 antijenleri plasmidler tarafından kodlanmaktadırlar. Bazı virulens faktörleri de kromozomal orijinli oldukları gibi bir kısmı da fajlarla spesifiye edilirler. Örn, C. diphtheriae 'ye ait beta fajının kodladığı difteri toksini veya C. botulinum C 'de bulunan fajda aynı tarzda toksin sentezini spesifiye eder. Metabolik Plasmidler Metabolik aktivite bir çok bakteride kromozomlarda bulunan özel genler tarafından yönetilirler. Ancak, bazı bakterilerde de metabolizma ile ilgili reaksiyonlar hem kromozomal ve/veya hem de plasmid orijinli olabilmektedir. 1) Degradatif plasmidler: P. putida ve diğer pseudomonaslarda bir çok kimyasal maddeyi ayrıştırabilecek plasmid kaynaklı enzimlere sahiptirler. Böyle enzimlerin sayısı 10'dan fazlayı bulmaktadır. Örn., SAL, NAH, ASL ve TOL plasmidleri, sıra ile salycylate, naphtalene, alkyl benzen sulphonate ve tolueni ayrıştırarak catechola çevrilir ve sonra da plasmidlerce kodlanan enzimler tarafından acetaldehyde ve piruvatlara dönüştürülür. Degradatif plasmidler konjugatif bir özellikte olup molekül ağırlıkları oldukça yüksektir (50-200 x 106). Bu plasmidler, genellikle, kompatible bir karaktere sahiptirler ve büyük plasmidler arasındadırlar. TOL, SAL, OCT ve NIC plasmidleri de iki veya daha fazla farklı küçük plasmide ayrılabilirler ve bunlar bağımsız replikasyon orijinine sahip olduklarından da, transfer edildiklerinde hücre içinde serbest replike olabilirler. Ancak, bunlar, nonkonjugatif bir özellik gösterirler. TOL ve NAH gibi plasmidler de geniş bir konakçı spektrumuna sahiptirler ve E. coli 'lere ve pseudomonaslara transfer edilebilirler. 2) Diğer metabolik plasmidler: Salmonellalar, genellikle, Lac-'dirler. Bazen Lac+ fenotipe dönüşebilirler (S. typhi). Bunları, Lac+ plasmidler gerçekleştirirler. Lac+ plasmidlere, salmonellalar dışında, serratia, S. lactis ve proteuslarda da tesadüf edilmiştir. Plasmidler, aynı zamanda, salmonellalarda, sukroz fermentasyonuna da neden olabilirler. E. coli 'lerde K88 antijenlerini kodlayan plasmidler, aynı zamanda, rafinozun fermentasyonuna da sebep olurlar. Bazı raf + plasmidler de H2S üretimini de bakterilere kazandırabilirler. Plasmid SCP1 (Streptomyces coelicolor), methylenomycin sentezini kodlayabilmektedir. Kasugamycin ve chloramphenicol da plasmidler tarafından spesifiye edilirler. Rizobiumlarda bulunan plasmidler de legumine bitki köklerine nitrojen fikzasyonunda etkin fonksiyonlara sahiptirler. Büyük Plasmidler Patojenik ve nonpatojenik bakterilerde molekül ağırlıkları 1-600 magadalton (Md) arasında değişebilen plasmidlerin varlığı belirlenmiş, bunların bir kısmının da moleküler yapıları ve kodladıkları spesifik proteinlerin karakterleri saptanmıştır. Genel bir kural olmamakla beraber, molekül ağırlığı 50 Md'den fazla olanlar "büyük plasmidler" olarak dikkate alınmaktadırlar. Taşıdıkları çok değişik ve spesifik markerler yanı sıra, rekombinant DNA teknolojisinde de, özellikle, gen aktarmalarında önemli fonksiyonları olan plasmidlere, daha ziyade kirli ve organik materyallerden zengin sularda yaşayan bakterilerde rastlanılmaktadır. Bakterilerin tek ve aynı zamanda küçük kromozoma sahip olmaları bunların genetik potansiyellerini ve diğer bazı fonksiyonlarını, ökaryotiklere oranla, daha kısıtlamaktadır. Ancak, bakteri genomlarında meydana gelen çeşitli mutasyonlar ve buna ilaveten, bakterilerde bulunan ve çok değişik karakterler taşıyan büyük plasmidler, fajlar, transposon ve İs elementleri, bakterilere yeni sekanslar, genler ve bunlara bağlı olarak yeni özellikler kazandırmaktadırlar. Fakat, bu genlerin bazıları, fazla sayıda meydana gelen replikasyonlar sırasında veya indüktörlerin etkisi altında, bakterilerden ayrılmakta ve mikroorganizmalar orijinal parental fenotipik karakterlerine tekrar dönmektedirler. Bakteri kromozomunun %3-5'i uzunluğuna kadar ulaşabilen büyük plasmidler, hücre içinde, genellikle, küçük plasmidlere oranla daha az sayıdadırlar (1-5 adet). Kointegrasyon sonunda  sayıları daha da azalmaktadır. Plasmidler, hücre içinde ya bağımsız replikonlar halinde bulunurlar veya birbirleriyle birleşerek (kointegrasyon) büyük plasmidleri meydana getirirler. Ancak, bunun anlamı, her zaman böyle olur manasını taşımaz. Bazen de, tersi olabilmektedir. Yani, büyük plasmidler, daha küçük replikonlara ayrılmaktadırlar. Kointegrasyon sonucu oluşan multimerik plasmidler etkinlik bakımından diğerlerine oranla daha fazla avantajlıdırlar. Hatta, bazılarında da, birden fazla replikasyon orijini bulunmaktadır. Ancak, replikasyonda sadece bunlardan biri fonksiyonel olmaktadır. Bakteri sitoplasmasında bağımsız bir replikon olarak bulunan plasmidler, genomla da birleşebilirler ve bunun bir devamı haline gelebilirler. Bazı durumlarda da plasmidlerle kromozom arasında biyokimyasal yönden bir işbirliği de gelişmektedir. Şöyle ki, bir kimyasal maddenin metabolize olmasında önce kromozom (veya plasmid) etkinlik göstermekte ve oluşan ürünler de plasmid (veya kromozom) tarafından son ürünlere kadar ayrıştırılmaktadır. Örn, P. putida da bulanan CAM (campher) plasmidi (200 Md), campherin ayrışmasının bir bölümünü, bakteri kromozomu da geri kalan kısmını tamamlar. P. oleovorans 'da bulunan OCT (octane) plasmidi (200 Md), alkanları kullanma kapasitesini spesifiye eder. Ancak, tam olarak, alkanları yağ asitlerine kadar ayrıştıramaz. İlk basamakta, alkane oksidasyonu plasmid tarafından yönetilir. İkinci aşamada ise, alkol dehidrasyonu, bağımsız olarak hem plasmid ve hem de kromozom tarafından spesifiye edilir. Agrobacterium tumefaciens, ornitini iki ayrı basamakta ayrıştırır. Bunlardan biri pTiC58 plasmidinde kodlanmıştır ve diğeri ise kromozomal orijinlidir. Kromozom-plasmid işbirliğine (interaksiyon) TOL (toluene) plasmidinde de rastlanılmıştır. Bazı durumlarda da işbirliği ters veya olumsuz bir yönde gelişebilmektedir. Şöyle ki, Rhizobium leguminosarum (sym plasmidi, pRIJI) ve R. trifoli 'de (pRtr5a) bulunan plasmidler, bakterilerin bakteriosin sentezlerini inhibe ederler. Aynı fonksiyona sahip plasmidlerin molekül ağırlıkları, değişik bakterilerde, farklı ölçülerde olabilmektedir. Örn, E. coli 'de laktoz fermantasyonu 58.5 Md'luk plasmid tarafından yönetilmesine karşın, K. pneumoniae 'de 163 Md'luk plasmid aynı fonksiyonu yapar. R. leguminosarum 'da bulunan 100 Md'luk plasmid, hidrogenase aktivitesini spesifiye etmesine karşın A. eutrophus 'da 300 Md'luk plasmid aynı aktiviteyi iki enzimle yapar. Bezende, aynı aktivite, aynı tür içindeki suşlar arasında değişik molekül ağırlığındaki plasmidler tarafından, spesifiye edilebilmektedir. Örn, B. thuringiensis suşlarında insektisidal delta tonsinini kodlayan plasmidlerin molekül ağırlıkları 44;50 ve 75 Md arasında bulunmaktadır. Halobacterium suşları arasında da gaz vakuollerini kodlayan plasmidlerin molekül ağırlıkları 44 ve 100 Md' arasıdır. Kromozomla birleşen plasmidler bazı nedenlerle genomdan ayrılabilir ve ayrılırken de kromozomdan bir segment alabilirler. Böyle plasmidler de sitoplasmada sirküler forma dönüştürülerek bağımsız olarak kalabilecekleri gibi konakçıdan da çıkabilirler. Bazı plasmidler de bir bakteride tek bir ünite halinde bulunduğu halde, diğer bir bakteri de iki plasmid halinde olabilmektedir. Örn, E. coli 'deki RI ve NR1 plasmidleri, P. mirabilis'e transfer edilirse küçük replikonlara ayrılmaktadır. P. rettgeri 'den izole edilen R plasmidi 'R 394, 115 Md) iki plasmide ayrılabilmektedir (11 ve 102 Md). Bunlardan her biri ayrı bir rezistanslık genini kodlarlar. E. coli 'de bulunan R plasmidi tek bir ünite halinde ancak  iki kısımdan oluşmakta (RF ve TF).  Proteus veya salmonellalar da iki replikona ayrılabilmektedir. P. mirabilis 'teki rezistenslik plasmidi (NRI) kloramfenikollu ortamda üretilirse, NR1'in büyüklüğünde ve r-determinant sayısında artmalar meydana gelmektedir. Benzer olguya, tetrasiklin plasmidine sahip olan S. faecalis 'te de rastlanılmıştır. Bakteri içinde iken inkompatible olan iki plasmid, birleştiklerinde (kointegrasyon)  bir arada uzun sürü bulunabilmektedirler. Örn, UV-ışınları ve uygun seleksiyon yöntemleri CAM ve OCT plasmidlerini kointegre hale getirebilmektedir. Kointegrasyon aynı zamanda, nontransmissible (nonkonjugatif) olan plasmidlerin mobilizasyonuna yardımcı olduğu gibi, bazılarının da kromozomla birleşmesine veya genomdan ayrılmasına da yol açabilmektedir. İn vitro hazırlanan plasmidler, (suni plasmidler) bakterilere aktarıldıktan sonra hücre içinde bazı yapısal değişikliklere maruz kalmaktadırlar.

http://www.biyologlar.com/baslica-plasmidler-ve-ozellikleri

İnkompatibilite

Bakteriler, genellikle, aynı tür plasmidin bir veya daha fazla kopyasına sahip olabilmektedirler. Büyük plasmidler 1-2 kopyadan fazla olmamalarına karşın, küçük plasmidler hücrede daha fazla (> 20) sayıda bulunabilmektedirler. Bir arada olabilen ve çoğalabilen bu plasmidler birbirleri ile uyum içinde bulunurlar (kompatibilite). Ancak, bazı plasmidler aynı bakteride bulunamazlar, birbirlerinin üremelerini kısıtlarlar veya eliminasyonlarına neden olurlar (inkompatibilite). Örn. E. coli 'ye ait olan F plasmidi ya sitoplasmada serbest olarak veya bakteri kromozomu ile birleşik olarak (Hfr hücre) bulunur. İki tarz birlikte E. coli 'de bulunamaz. Bir bakteriye inkompatibl iki plasmid transfekte edildiğinde, 2-3 generasyon sonra bunlardan biri çıkarılır ve tek tür plasmid haline gelir. Böylece biri elimine edilir. Genellikle, aynı tür plasmidler birbirleri için inkompatibil bir karakter taşırlar. Ancak, gen klonlanmalarında bazen gen amplifikasyonunu sağlamak amacıyla aynı plasmidin çok sayıda kopyası elde edilebilmekte    (kloramfenikollu bezi yerinde üretilerek) veya küçük plasmidlerin bir bakteride çok sayıda kopyası bulunabilmektedir.  Böyle durumlara, bir bakteri de aynı plasmid için birçok replikasyon yerinin olmasının rolü yanı sıra diğer bazı faktörlerinde etkinliği vardır. İnkompatibilite olgusu, hücrelerde plasmid replikasyonu ve plasmidin bölünen iki hücreye taksimini kontrol eden mekanizma ve ayrıca, plasmidlerin kopya sayısı ile yakından ilişkilidir. Bir bakteride bulunan replikasyon mekanizması bir plasmid tarafından kullanılıyor ve bloke ediliyorsa, aynı mekanizmadan yararlanan ikinci plasmid bu olanağa sahip olamadığı için replike olamaz (kompetatif inhibisyon). Bu durum aynı zamanda, aynı plasmid ile ikinci infeksiyona da mani olur (immunite). ColE1 plasmidinde inkompatibilite, RNA I olarak tanımlanan moleküllerle ilişkili bulunmaktadır. Bu molekülün RNAII ile interaksiyonu, DNA'nın replikasyonunu önler. Böylece, plasmidin replikasyonu sınırlanır. Eğer her iki plasmid, aynı RNAI ve RNAII moleküllerini spesfiye ediyorsa, RNA I'in hücre içindeki konsantrasyonu, her iki plasmidin kopya sayısını dengede tutar. İnkompatibilite özelliği, plasmidleri sınıflamada yardımcı olmaktadır. Enterobakterilerde 30, stafilokoklarda 15 ve pseudomonaslarda en az 11 inkompatibilite grubu belirlenmiştir

http://www.biyologlar.com/inkompatibilite

Oksijen ve Canlılar

En bol bulunan bir element olan oksijen, atmosferimizde fotosentetik canlıların faaliyeti sonucu oluşmaya başlamıştır.Oksijen bütün canlılar için vazgeçilmez bir element olup; hidrojen, karbon, nitrojen ve kükürt ile birlikte organik moleküllerin temel yapısal Atom larını oluşturur. Bunun yanında, aerobik canlıların enerji metabolizmasındaki rolü nedeniyle, oksijen hayati bir öneme sahiptir. Bilinen bütün canlı türleri, organik moleküllerin içindeki şekli ile oksijene gereksinim duysalar da, serbest formdaki moleküler oksijen her canlı türü için aynı anlamı ifade etmez. Aerobik canlılar yaşamları için mutlaka moleküler oksijene gereksinim duyarken, anaerobik canlılar büyüme ve çoğalmaları için oksijene bağımlı değildirler. Anaerobik canlılardaki oksijenin toksik etkisinin nedeni, oksijenden kaynaklanan bazı reaktif türlerin biyolojik molekülleri oksitlemeleri ve bu reaktif türlere karşı anaerobik canlılarda savunma sisteminin bulunmamasıdır. Oksijen sadece anaerobik türlerde değil, yaşamları için mutlaka moleküler oksijene bağımlı olan canlılarda da toksik etkilidir. Oksijenin canlılardaki toksik etkileri başlıca iki tür mekanizma ile gerçekleşir 1. Aerobik canlılarda gözlenen oksijen toksisitesinin ilk açıklaması, moleküler oksijenin bazı enzimleri inhibe ettiği şeklindedir. Örneğin, nitrojen fiksasyonunu katalizleyen nitrojenaz enzimleri ve CO2 fiksasyonunu katalizleyen ribüloz bifosfat karboksilaz oksijen tarafından kompetetif olarak inhibe edilirler. Oksijen, glutamat dekarboksilaz enzimini inhibe ederek beyinde GABA düzeyini düşürmektedir. 2. Oksijenin enzim inhibisyonu etkisi sınırlı ve çok zayıftır. İlk kez 1954 yılında, oksijenin biyolojik sistemlerde görülen toksik etkilerinin, oksijenin bazı reaktif türlerinden kaynaklanabileceği ileri sürülmüştür. Bugün, oksijenin canlılardaki toksik etkisinin “oksijen radikalleri” olarak adlandırılan ve oksijenin vücuttaki metabolizması sırasında oluşan reaktif türlerden kaynaklandığı bilinmektedir. REAKTİF TÜRLER OLARAK RADİKALLER Atomlar, proton ve nötronlardan oluşan pozitif yüklü bir çekirdek ve çekirdeğin etrafında bulunan negatif yüklü elektronlardan oluşur. Elektronlar hem partikül, hem de dalga özelliğine sahip olup, çekirdek etrafında ışık hızı ile hareket ederler. Bu nedenle elektronların çekirdek etrafındaki yeri tam olarak tarif edilemez, yalnızca bulunma olasılığının en yüksek olduğu yerden bahsedilebilir. Belirli elektronların bulunma olasılığının en yüksek olduğu yer “ orbital ” olarak adlandırılır. Radikaller, dış orbitallerinde paylaşılmamış elektron içeren kimyasal türlerdir. Her türden kimyasal ve biyokimyasal tepkime daima atomların dış orbitallerindeki elektronlar seviyesinde gerçekleşir. Dış orbitallerde paylaşılmamış elektron bulunması söz konusu kimyasal türün reaktivitesini olağanüstü arttırdığı için, radikaller reaktivitesi çok yüksek olan kimyasal türlerdir. RADİKALLER NASIL OLUŞUR İçinde bulunduğumuz çevrede çeşitli fiziksel etkenler ve kimyasal olaylar nedeniyle devamlı bir radikal yapımı vardır. hücresel koşullarda da ciddi bir miktar ve çeşitlilikte radikal üretilmektedir. Radikaller başlıca 3 temel mekanizma ile oluşur: 1. Kovalent bağların homolitik kırılması ile. Yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar ve yüksek sıcaklık kimyasal bağların kırılmasına neden olur. Kırılma sırasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalıyorsa, bu tür kırılmaya homolitik kırılma denir ve her iki atom üzerinde de paylaşılmamış elektron kalır. 2. Normal bir molekülün elektron kaybetmesi ile. Radikal özelliği bulunmayan bir molekülden elektron kaybı sırasında dış orbitalinde paylaşılmamış elektron kalıyorsa radikal formu oluşur. Örneğin askorbik asit, glutatyon ve tokoferoller gibi hücresel antioksidanlar, radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formu oluşur. 3. Normal bir moleküle elektron transferi ile. Radikal özelliği taşımayan bir moleküle tek elektron transferi ile dış orbitalinde paylaşılmamış elektron oluşuyorsa bu tür indirgenme radikal oluşumuna neden olabilir. Örneğin moleküler oksijenin tek elektron ile indirgenmesi, radikal formu olan superoksidin oluşumuna neden olur. Superoksit radikalinin yapımındaki artış da, oksijenin diğer radikal türlerinin ve diğer atom merkezli radikallerin oluşumu için tetik fonksiyonu görür. OKSİJEN VE OKSİJEN RADİKALLERİ Moleküler oksijen dış orbitallerinde paylaşılmamış iki elektron içerir. Bu elektronlar, spinleri aynı yönde ve farklı orbitallerde iken minimum enerji seviyesindedirler. Radikal tanımına göre oksijen “diradikal” yapıya sahip bir moleküldür. Oysa oksijenin reaktivitesi beklenenin aksine çok düşüktür. Diradikal bir yapıya sahip olan oksijenin herhangi bir molekül ile tepkimeye girebilmesi için, tepkimeye gireceği molekülün de benzer yapıya (farklı orbitallerde spinlerin aynı yönde elektron içermesi) sahip olması gerekir. Oysa başta organik moleküller olmak üzere atom ve moleküller orbitallerinde elektronları antiparalel ve eşleşmiş olarak içerirler. Veya paylaşılmamış elektronlar kovalent bağlara katılmışlardır. Bunun sonucu olarak oksijenin diğer moleküllere olan reaktivitesi son derece kısıtlanmıştır. Bu kısıtlama “spin kısıtlaması” olarak adlandırılır. Canlıların oksijeni kullanabilmesi için, oksijene elektron transferi yaparak spin kısıtlamasını aşmaları gerekir. Bu işlem için canlılar bazı metal iyonlarından (Fe, Cu, Mn, Zn) yararlanırlar. Spin kısıtlaması nasıl aşılır 1. Oksijene elektron transferi ile. Proteinlere bağlı metal iyonları aracılığıyla oksijene bir veya iki elektron aktarımı katalizlenebilir. Oksijene tek elektron transferi ile süperoksit radikali oluşur. Spin kısıtlaması kalktığı için süperoksit oksijene göre çok daha reaktiftir. İki elektron transferi ile de peroksi anyonu oluşur. 2. Enerji absorbsiyonu ile. Bu mekanizma ile oksijenin iki uyarılmış formu oluşur. Singled oksijen diye adlandırılan oksijenin bu formlarında dış orbital paylaşılmamış elektronlarından birisinin spini değişmiştir. Zıt spinli elektronlar aynı orbitalde (delta formu) veya ayrı ayrı orbitallerde (sigma formu) bulunabilirler. Canlılarda Oksijen Radikallerinin Yapımı Oksijen bulunan bir ortamda çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlerle oksijen radikalleri yapılabilir. Vücudumuzda oluşabilen radikallerin sayısı “yüzlerce farklı tür” şeklinde ifade edilebilirse de, bu radikaller arasında süperoksit, H2O2, nitrik oksit ve hidroksil radikalinin özel yerleri vardır. Hatta bu radikaller içinde süperoksit ve nitrik oksit temel radikaller sayılabilir. Çünkü süperoksit ve nitrik oksit enzimatik mekanizmalarla, devamlı olarak ve önemli derişimde üretilen radikallerdir. Ayrıca bu iki radikal, biyolojik sistemlerde tanıdığımız diğer bütün önemli radikaller ile radikal yapıda olmayan reaktif türlerin oluşumunu başlatabilecek özelliktedirler. Normal biyokimyasal tepkimeler sırasında oluşan oksijen radikalleri ile çeşitli biyolojik fonksiyonları yerine getirmek üzere üretilen nitrik oksidin derişimleri genellikle çok düşüktür. Düşük derişimdeki reaktif türler, hücrelerin antioksidan sistemleri tarafından inaktive edildiklerinden önemli toksik etkilere neden olmazlar. Ancak bu radikallerin yapımları çeşitli patolojik durumlarda artabilir, çoğunlukla da her iki radikal bileşik grubunun oluşumu birbiri ile paralel seyreder. Örneğin inflamasyon durumlarında aktive olan lökositler aynı anda hem oksijen radikallerini hem de nitrik oksidi yüksek derişimlerde sentezlerler. Nitrik oksit, oksijen radikalleri ile tepkimeye girerek veya oksijenli ortamlarda oksitlenerek, kendisinden çok daha reaktif türlerin oluşumuna neden olur. oksijen radikallerinin fazla yapımının neden olduğu etkilerin toplamı “oksidan stres“ diye adlandırılır. Oksidan stresi, nitrik oksidin reaktif türlerinden kaynaklanan toksik etkilerden ayırmak mümkün olmadığından, “nitrozatif stres” den ayırmak imkansızdır. Bu bakımdan, oksidatif hasar, superoksitten kaynaklanan radikaller ile nitrik oksidin reaktif türlerinin neden olduğu hasarların bir toplamıdır. Süperoksit Canlılarda oluştuğu ilk gösterilen radikal olan süperoksit, başlıca şu mekanizmalarla üretilmektedir: 1.) İndirgeyici özellikteki biyomoleküler oksijene tek elektron verip kendileri oksitlenirken süperoksit radikali oluşur. Hidrokinonlar, flavinler, tiyoller, katekolaminler, ferrodoksinler, indirgenmiş nükleotidler gibi yüzlerce biyolojik molekül aerobik ortamda oksitlenirken süperoksit yapımına neden olurlar. 2.) Başta çeşitli dehidrogenazlar ve oksidazlar olmak üzere, yüzlerce enzimin katalitik etkisi sırasında süperoksit radikali bir ürün olarak oluşabilir. 3.) Mitokondrideki enerji metabolizması sırasında oksijen kullanılırken, tüketilen oksijenin % 1-5 kadarı süperoksit yapımı ile sonlanır. Buradaki radikal yapımının nedeni NADH-dehidrogenaz ve koenzim-Q gibi elektron taşıyıcılardan oksijene elektron kaçağının olmasıdır. 4.) Aktive edilen fagositik lökositler bol miktarda süperoksit üreterek fagozom içine ve bulundukları ortama verirler. Antibakteriyel etki için gerekli olan bu radikal yapımı, daha reaktif türlerin oluşumunu da başlatır. Yani radikal yapımı bazı hücresel fonksiyonlar için gerekli de olabilir. Hücresel koşullarda üretilen süperoksit, oksitleyici veya indirgeyici olarak davranabilir. Aldığı elektronu metal iyonuna, sitokrom c’ye veya bir radikale verirse tekrar oksijene oksitlenir. Oksijenden daha oksitleyici olan süperoksit bir elektron daha alırsa peroksi anyonuna indirgenir. 2H+ O2-. + e- à O2= à H2O2 Bu tepkime biyolojik moleküllerin oksidasyonuna neden olduğundan tercih edilmez. Aerobik canlılarda süperoksitlerin H2O2’e çevrilmesi katalitik aktivitesi çok yüksek bir enzim olan süperoksit dismutaz (SOD) tarafından katalizlenir. SOD O2-. + O2-. + 2H+ à H2O2 SOD tarafından katalizlenen bu tepkime “dismutasyon tepkimesi” diye adlandırılır. Süperoksit, özellikle hafif asidik koşullarda SOD olmadan kendiliğinden dismutasyonla da H2O2’e çevrilebilir. SOD enziminin yüksek katalitik etkisi nedeniyle hücrelerde süperoksit birikimine izin verilmez. Ancak çeşitli patolojik durumlarda süperoksit yapımının artmasıyla süperokside özgü tepkimeler görülmeye başlar: Süperoksit metal iyonlarını indirgeyerek bağlı olduğu proteinlerden salınımına neden olur. kofaktörlerin oksidasyon düzeylerini bozar ve metal iyonlarının katıldığı hidroksil radikali yapım tepkimelerini hızlandırır. Diğer radikallere göre daha az reaktif olsa da indirgenmiş nükleotidlerin, bazı amino asitleri ve antioksidan bileşikleri oksitler. Süperoksit, hücre zarlarının hidrofobik ortamlarında daha uzun ömürlü ve çözünürlüğü daha fazladır. Zar fosfolipidleri nedeniyle hücre zarı yüzeyleri daha asidiktir ve süperoksit burada daha kolayca bir proton alarak hidroperoksit radikalini (HO2.) oluşturur. Bu radikal de çok reaktif olup, hücre zarlarında lipid peroksidasyonunu başlatabilir ve antioksidanları oksitleyebilir. Hidrojen Peroksit Hidrojen peroksit, oksijenin enzimatik olarak iki elektronla indirgenmesi ya da süperoksitlerin enzimatik ve non-enzimatik dismutasyonu tepkimeleri sonucu oluşur. Yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden radikal özelliği taşımaz, reaktif bir tür değildir. Hidrojen peroksidin oksitleyici bir tür olarak bilinmesinin nedeni, demir, bakır gibi metal iyonlarının varlığında hidroksil radikalinin öncülü olarak davranmasıdır. Hidrojen peroksit özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan demir ile tepkimeye girerek yüksek oksidasyon düzeyindeki reaktif demir formlarını oluşturur. Bu formdaki demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip olup, hücre zarlarında lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri başlatabilir. Oksitleyici özelliği nedeniyle, biyolojik sistemlerde oluşan H2O2’nin derhal ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Bu görevi hücrelerdeki önemli antioksidan enzimler olan katalaz ve peroksidaz enzimleri yerine getirir. Hidroksil Radikali Biyolojik ve kimyasal sistemlerde üretilen hidroksil radikali (.OH) canlılarda iki mekanizma ile oluşabilir. 1.) İyonlaştırıcı radyasyonun etkisi ile sulu ortamda su moleküllerinin iyonlaşması gerçekleşir.2H2O à H2O+ + e- + H2O* Uyarılmış su molekülü (H2O*) homolitik yıkım ile; H2O+ ise bir su molekülü ile tepkimeye girerek hidroksil radikali oluştururlar. Bu tepkimeler çok kısa sürede gerçekleşir ve üretilen .OH, radyasyonun canlılardaki toksik etkisinden sorumlu başlıca kimyasal türdür. 2.) Hidrojen peroksitin eksik indirgenmesi ile .OH yapımı, vücutta bu radikalin en önemli kaynağıdır. H2O2’nin iki elektron ile indirgenmesi ile su oluşurken, tek elektron ile indirgenmesi .OH yapımına neden olur. bu tür indirgenme Fe, Cu gibi metal iyonları tarafından katalizlenir. Askorbik asit, süperoksit gibi indirgeyici bileşiklerin de bulunduğu ortamda oksitlenen metal iyonu tekrar indirgendiğinden H2O2’den .OH yapımı sürekli bir duruma gelir. Fe, Cu H2O2 + Askorbat (veya O2-.) à .OH + semidehidroaskorbat Haber-Weiss tepkimesi ya da fenton tepkimesi olarak adlandırılan bu tepkime ile .OH oluşacağı vücutta üretilen H2O2 derişimi ve serbest metal iyonunun varlığına bağlıdır. Süperoksit hem H2O2’nin öncülü hem de metalleri indirgeyici bir tür olduğundan; süperoksit proteinlere bağlı metallerin indirgenip serbest kalmasına da neden olabildiğinden, biyolojik koşullarda süperoksit oluşumunun arttığı ortamda .OH üretimi kaçınılmazdır. Fenton tepkimesini katalizleyen en aktif metal iyonları demir ve bakırdır. Biyolojik sistemlerin tanıdığı en reaktif tür olan .OH, su dahil ortamda rastladığı her biyomolekülle tepkimeye girer. Hidroksil radikalinin tepkimeleri başlıca: a) Elektron transfer tepkimeleri b) Hidrojen çıkarma tepkimeleri c) Katılma tepkimeleri Bütün bu tepkimeler, .OH’ın paylaşılmamış elektron içeren dış orbitaline elektron alma ilgisinden kaynaklanır. Katılma tepkimeleri, özellikle elektronca zengin moleküllerle (pürin ve primidin bazları, aromatik amino asitler gibi) gerçekleşir. Hidroksil radikalinin organik moleküllerden hidrojen atomu alarak suya indirgendiği tepkime, hidrojen çıkarma tepkimesi olarak bilinir. Hidroksil radikali ile oluşan en iyi tanımlanmış biyolojik hasar, lipid peroksidasyonu olarak bilinen serbest radikal zincir reaksiyonudur. Her tür biyolojik molekül .OH’ın bir hedefi ise de özellikle elektronca zengin bileşikler tercihli hedeflerdir. Nükleik asitler, proteinler ve lipidlerde başlatılan radikalik tepkimelerde binlerce farklı ara ürünler oluşabilir. DNA ile tepkimesi sonucu baz modifikasyonları, baz delesyonları, zincir kırılmaları gerçekleşebilir. İleri derecedeki DNA hasarları tamir edilemediğinden hücre ölümüne neden olur. Proteinler üzerinde oluşan oksidasyonlar yapı değişimine neden olacağından proteinleri proteolitik yıkıma götürür. Hücre zarı su içermediğinden .OH’ın başlıca hedefi yağ asididir. Zar lipidlerinin peroksidasyonu zarın yapısını bozar ve geçirgenliğini artırıp yine hücre ölümüne neden olabilir. Özellikle .OH yapımını katalizlemelerindeki etkileri nedeniyle, canlılarda metal iyonların radikal hasarlarından birinci derecede sorumludurlar ve bu etkiye sahip olamadıkları formda (proteine bağlı) tutulmalıdır. SİNGLET OKSİJEN Oksijenin enerjetik olarak uyarılan bu formunda reaktivite çok yüksektir. Aldığı enerjiyi çevreye dalga enerjisi şeklinde verip yeniden oksijene dönebilir. Başlıca şu mekanizmalarla vücutta oluşabilir: a) Pigmentlerin (örneğin flavin içeren nükleotidler, retinal, bilirubin) oksijenli ortamda ışığı absorblamasıyla b) Hidroperoksitlerin metaller varlığındaki yıkım tepkimelerinde c) Kendiliğinden dismutasyon tepkimeleri sırasında d) Prostaglandin endoperoksit sentaz, sitokrom p450 tepkimeleri, myelo/kloro/laktoperoksidaz enzimlerinin etkileri sırasında Oksijenin bu enerjetik reaksiyonu sonucunda iki tip singlet oksijen üretilir. Sigma singlet oksijen : Enerjisi daha fazladır ve çok kısa ömürlüdür. Delta singlet oksijen : Daha uzun ömürlüdür ve gözlenen kimyasal reaksiyonlardan esas sorumlu form olduğu kabul edilmektedir. Singlet oksijen diğer moleküllerle etkileştiğinde ya içerdiği enerjiyi transfer eder, ya da kovalent tepkimelere girer. Özellikle karbon-karbon çift bağları singlet oksijenin tepkimeye girdiği bağlardır. Doymamış yağ asitleri ile de doğrudan tepkimeye girerek peroksi radikalin, oluşturur ve .OH kadar etkin bir şekilde lipid peroksidasyonunu başlatabilir. NİTRİK OKSİT Nitrik oksit, çok önemli biyolojik fonksiyonları yerine getirmek üzere üretilen nitrojen merkezli bir radikaldir. Paylaşılmamış elektron aslında nitrojen atomuna ait ise de, bu elektronun hem nitrojen hem de oksijen atomu üzerinde delokalize olması nedeniyle tam radikal özelliği taşımaz. Bunun sonucu, bilinen diğer radikallere göre reaktivitesi baskılandığından oldukça uzun ömürlüdür. Oksijen radikalleri çok sayıdaki enzimatik ve enzimatik olmayan yollar ile fiziksel/kimyasal mekanizmalarla oluşturulurlar. Oysa vücudumuzda NO sentezini sağlayan mekanizmalar son derece kısıtlıdır. Vücuda giren nitro bileşiklerinin metabolize edilmesi sırasında oluşan NO bir tarafa bırakılacak olursa, endojen NO oluşturan tek kaynak nitrik oksit sentaz (NOS) enzimidir. Bu enzimin nöronal, endOtelyal ve indüklenebilir olmak üzere 3 formu vardır. Radikal olarak reaktivitesi düşük olan NO, metal içeren merkezler ve radikaller ile büyük bir hızla tepkimeye girer. Özellikle lipid radikaller ile tepkimeye girmesi NO’e antioksidan bir etki de kazandırır. Fizyolojik değişimde üretilen NO esas olarak oksihemoglobin tarafından nitrata (NO3-) oksitlenerek aktivitesi sonlandırılır. Oksijen radikallerindeki durumun aksine, nitrik oksidi ortamdan temizleyen herhangi bir özel enzim yoktur. Aerobik ortamda NO stabil değildir. Derişiminin artması ile oksidasyonu hızlanır. Bu nedenle ortamdaki derişimi ile kendi ömrü arasında ters bir orantı vardır. v Radikalik tepkimeler şu durumlarda sona erer. a) Oluşan radikallerin antioksidanlar ile indirgenmesi b) Radikallerin birbirleri ile tepkimeleri c) Ortamda tepkimeye girebilecek bileşik kalmaması Buna göre hücresel koşullarda, oluşan radikalin çok erken safhalarda indirgenmesi biyomoleküllerin korunması bakımından hayati öneme sahiptir. ENZİMATİK ANTİOKSİDANLAR NON-ENZİMATİK ANTİOKSDANLAR Süperoksit dismutaz Redükte glutatyon Katalaz Tioller Glutatyon peroksidaz Vitamin C Glutatyon redüktaz Vitamin E b-karoten Diğer non-enzimatik antioksidanlar Serbest radikaller çeşitli hastalıkların patogenezinde önemli rol oynarlar. Diabet ve diabet komplikasyonlarının gelişimi, kanser, yaşlılık, Behçet Hastalığı gibi çok sayıda hastalıkta serbest radikal üretiminin arttığı ve antioksidan savunmaların yetersiz olduğu gösterilmiştir. Ancak bu hastalıkların çoğunda, serbest radikallerin hastalığın bir sebebi mi, yoksa bir sonucu olarak mı meydana geldikleri bilinmemektir. NE KADAR RADİKAL YAPIMI Yaşam için mutlaka gerekli olan oksijen, canlıların yaşamının sona erdirilmesinde de etkili olan faktörlerin başında gelir. Canlıların yaşlanması, radikallerin neden olduğu kalıcı hasarların bir birikimi olarak değerlendirilmektedir. Vücutta üretilen radikaller her zaman tehlikeli kimyasal türler olarak değerlendirilmemelidir. Oksijenin biyokimyasal tepkimelerde kullanılması için reaktif formlarına çevrilmesi zorunludur. Örneğin: Steroid yapıdaki çok sayıdaki bileşiklerin, eikozanoidler gibi biyolojik aktif moleküllerin sentezi Ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu Çok sayıdaki oksidaz ve hidroksilaz enzimlerinin etkileri için Sitotoksik etkilere sahip hücrelerin fonksiyonları için radikal yapımı olmazsa olmaz bir koşuldur Biyolojik ihtiyacın üzerinde üretilen radikaller gözlenen toksik etkilerden sorumludurlar. Çevresel faktörler (Örneğin: iyonlaştırıcı radyasyon), vücuda alınan çeşitli kimyasal bileşikler, çeşitli enfeksiyonlar, doku travmaları gibi patolojik durumlar vücutta radikal yapımında artışa neden olurlar. Düşük derişimdeki radikal yapımının etkileri çok uzun bir süreç sonunda örneğin yaşlanma sonunda görülürken; yüksek derişimde ve yaygın radikal yapımının etkileri kısa sürede ve ciddi bir patolojik durum olarak karşımıza çıkabilir

http://www.biyologlar.com/oksijen-ve-canlilar

Apoptozis ve Polimorfizm

Programlı hücre ölümü olan “apoptozis”, hem hücresel homeostazisin devamlılığı hem de hücre çoğalması ve farklılaşmasında çok önemli olan hücre eliminasyonu için gerekli fizyolojik bir işlemdir. Apoptozis, nekrozis, otofaji, anoikis ve mitotik katastrof gibi programlı veya indüklenen hücre ölümleri tanımlanmış olmasına rağmen, içlerinde sistematik olarak en çok ve en iyi çalışılanı, apoptozisin moleküler işlergesi olmuştur. Apoptozis, genetik işlergelerle düzenlenmekte ve malign hücrelerde bu işlergelerin denetimi bozulabilmektedir. Bu da kontrolsüz hücre büyümesine ve tümör gelişimine neden olmaktadır. Apoptotik işlergelerde rolü olan pro-apoptotik ve antiapoptotik genlerin klonlanmış olmasına ve apoptotik yolaktaki olası fonksiyonlarının araştırılmasına rağmen80 bu genlerin önemi ve kanser gelişimindeki ürünleri halen tam olarak ortaya konamamıştır81. Apoptozis; iyonlar (Ca+2), moleküller (seramid), genler (c-myc), proteinler (p53) hatta organeller (mitokondri) gibi çok sayıda aracıyla düzenlenir82. Normal hücre ve tümör hücresi arasındaki gen ve protein ifade edilmesindeki artış veya azalışların (ifade farklılıklarının), tümörün başlangıç aşamasında mı yoksa ilerleyen evrelerinde mi gerekliliği halen bilinmemektedir81. Apoptozisin azalması tümörigenezis ile ilişkilendirildiği için, apoptozisin negatif düzenleyici genlerinin onkogenik potansiyeli olabileceği, pozitif düzenleyici genlerinin de tümör baskılayıcı genler gibi davranabileceği öngörülmektedir. Birçok tümörde anti-apoptotik proteinler, yüksek düzeyde pro-apoptotik moleküllerle beraber bulunur (aktif kaspaz-3 ve kaspaz-7 gibi)81. İlk bakışta çelişkili görünen bu durum 30’dan fazla proteini içeren ve bir kısmı apoptozisi indükleyen bir kısmı da baskılayan Bcl-2 ailesi ile açıklanabilir. Bu ailenin üyeleri kendi aralarında homo veya hetero-dimerler oluştururlar. Hücrenin sağkalım durumu bu ailenin pro-apoptotik ve anti-apoptotik üyelerinin göreceli oranına bağlıdır. Bu heterodimerlerden biri olan Bcl- 2/Bax’ın birbirine oranının bazı hematolojik malignensilerde prognostik değer taşıdığı rapor edilmiştir83,84. Bu oranın azalması apoptozisin aktivasyonu, artması ise apoptozisin inhibisyonu ile sonuçlanmaktadır. p53 geninin Pro72 polimorfizmi, apoptozisilişkili SNP’dir. Ancak, karsinogenezisde apoptozis ile ilgili olabileceği düşünülen genler/proteinler de vardır (Şekil 2). Tümör nekroz faktörü- α (TNF-α), en çok çalışılan ve bazı önemli kanser tipleri ile ilişkili olduğu belirlenen sitokinlerden biridir85. FAS, TNFRSF6/CD95/APO-1 olarak bilinen apoptotik sinyal yolağında yer alan hücre yüzey reseptörü, promotör bölgesinde yer alan SNP’lerin kanser duyarlılığında rolü olabileceği belirtilmiştir86,87. FAS -1377 G/A, -670A/G ve FAS ligand (FASL) -844T/C polimorfizmleri bu genlerdeki transkripsiyonel aktiviteyi değiştirebilmektedir. Ölüm yolağındaki FAS ve FASL genlerindeki polimorfizmlerin özefagus skuamöz kanseri geliştirme riskini arttırdığı gösterilmiştir87. p73 geni, p53 geninin hücre döngüsü kontrolü, apoptozis ve hücre büyümesi gibi sahip olduğu fonksiyonları düzenleyebilir. Ekzonların bilinen kodlayıcı bölgelerinin dışında, 5′ ucunda ribozoma bağlanma işlevinden sorumlu ve 3′ ucunda da poliA kuyruğunun eklenmesinde rolü olan kodlayıcı olmayan (untranslated bölgeleri (UTR)) bulunabilmektedir88, 89. p73 genindeki bağlantı gösteren ve kodlayıcı olmayan 2. ekzonda bulunan G4C14-A4T14 polimorfizmleri baş-boyun skuamöz kanserlerinde genetik belirteç olabileceği belirtilmiştir90.Tümör nekrozis faktör, apoptozis ile ilişkili- ölüm reseptörü 4 (DR4) ve 5’e bağlanarak dışarıdan apoptotik yolağı uyaran ligandı uyarır. APO2L/TRAIL, dışarıdan apoptotik yolağı uyaran, TNF reseptör gen süper ailesinin alt grubu olan bir ailedir. APO2L/TRAIL, ikisi proapoptotik reseptörler [(DR4 veya APO2L/TRAIL R1), TRAIL-reseptör 2 (APO2L/TRAIL-R2, DR5, KILLER/DR5)], diğer ikisi de (TRID ve DcR2) tuzak reseptörler- hücre ölümünü indükleyemeyen- olmak üzere dört farklı hücre yüzey reseptörlerine eşit eğilimli olarak bağlanır. APO2L/TRAIL ile indüklenen hücre ölümü, reseptör ifadelenmesi ve bağlanması ile sınırlıdır91 Bir çalışmada, DR4 ekzon 4 G/G genotipinin mesane kanseri riskini azalabileceği öne sürülmektedir91. Hematolojik ve sindirim yolundaki kanserlerde kaspaz- 8, kaspaz-10 ve DR4 genlerinde mutasyonlar rapor edilmesine rağmen, kanser ile ilişkilendirilen bu apoptotik genlerdeki SNP’ler ile ilgili çalışma daha azdır92-96. Bu çalışmalardan birinde kaspaz-8 polimorfizminin meme kanseri yatkınlığına karşı koruyucu etkisi olduğu rapor edilmiştir96. DNA onarım ve polimorfizmi kısmında bahsettiğimiz, XPD’deki polimorfik değişim ilk başlarda DNA onarım çalışmalarına dahil edilip araştırılmıştır. Ancak, kodon 3122deki Asp/Asn (GAT/AAT) polimorfizmi, AAT homozigotları ultraviyole ile uyarılan apoptozisdeki artış ile karakterize edildiğinden, bu DNA onarım enzimindeki polimorfizm, apoptotik yolakla da ilişkilendirilmiştir97. Hücre ölüm genlerinin kodlanan bölgelerinde belirlenmiş SNP’lerin sayısının, kodlanmayan bölge ve henüz onaylanmamış gen polimorfizmleri ile artış göstereceği öngörülmektedir70. Çünkü, hastalıklardaki fonksiyonel anlamlılıkla ilişkilendirilmiş SNP’lerle ilgili bilgimiz, gelecekteki çok sayıda olgu-kontrol gruplarını içeren çalışmalarda uygun polimorfik aday genlerin seçiminde yol gösterici olabilecektir.

http://www.biyologlar.com/apoptozis-ve-polimorfizm

Doku Mühendisliği

Doku mühendisliği son yıllarda Estetik Plastik ve rekonstrüktif Cerrahi alanında önemli bir uğraş konusu haline gelmiştir. Çeşitli nedenlerle oluşan doku kayıplarının rekonstrüksiyonu için primer kapatmadan, greftlere, yakın ve uzak fleplerden son aşama olarak mikrocerrahi yöntemler ile serbest doku aktarımına uzanan cerrahi işlemler, matür dokuların fiziksel olarak değiştirilmesi ve nakli gerçekleştirilmiştir. Plastik cerrahide yeni bir aşama olarak kabul edilebilecek doku mühendisliği, dokuların hücresel ve moleküler düzeyde değiştirilmesini sağlar. Doku mühendisliği, geleneksel biyomedikal araştırmalardan elde edilen bilgileri klinikte doku replasmanına uyarlayan özel bir araştırma alanıdır. Mühendislik ve yaşam bilimlerinin prensiplerini; doku fonksiyonlarını iyileştiren , koruyan veya onların yerini alan biolojik yer tutucuların geliştirilmesine uygulayan disiplinler arası yaklaşım olarak tanımlanabilir. Doku mühendisliğinin başlıca amacı, plastik cerrahinin gelişimi boyunca kullanılan cerrahi işlemler sonucunda görülen morbidite ve skar gibi sorunlar olmadan laboratuar koşullarında kayıp dokuyu rekonstrükte edecek dokuların oluşturulmasıdır. DOKU MÜHENDİSLİĞİNİN KLİNİK UYGULAMALARI Klinik uygulamada temel prensipler 1) Doku defektinin dikkatle belirlenmesi 2) Kayıp dokunun yerine konması için uygun bir tasarım yapılması 3) Yeni dokunun kontrollü bir şekilde fabrikasyonu 4) Doku mühendisliği ile elde edilen dokunun defekte başarıyla aktarımı 5) Elde edilen yeni dokunun kalıcı olması olarak sayılabilir. Klinik uygulanmada amaç , uygun süre içinde iyileşme, maksimum fonksiyonel ve estetik restorasyon,ve minimal morbiditedir. Genel Olarak Doku Mühendisliğinin Aşamaları • Kullanılacak hücrelerin elde edilmesi, • Bu hücrelerin kültür ortamında çoğaltılması • Taşıyıcı iskelet üzerine ekilmesi • Taşıyıcı iskelet üzerine tekrar kültüre edilip istenen üç boyutlu yapıyı kazanması • Hastaya aktarımı Biyomateryaller İnsanda ilk implantasyon materyallerinin geliştirilmesi,1960’larda gerçekleşmiştir. Bu materyaller, biyolojik olarak “inert” kabul edilirler, yani belirgin doku yanıtı uyarmamaktadırlar. Cronin ve Gerow ‘un ilk kez tanıttıkları silikon jel meme implantları bunlara örnek olarak verilebilir. İkinci kuşak biyomateryaller, ekstrasellüler matrix ile kimyasal olarak etkileşebilecek şekilde tasarlanmaktadır. Bu materyaller ilk kez 1970’li yıllarda tasarlanmıştır, bunlar içinde cam ve kalsiyum seramiklerinin olduğu kemik replasman materyalleri sayılabilir. Yine biyolojik olarak yıkılan sentetik polimerler, emilebilen sütür materyalleri ve kemik fiksasyon plakları bu grup içindedir. Biyolojik olarak yok edilebilen sentetik materyallerin hücrelerin tutunması ve doku oluşumuna yön vermesi için bir “taşıyıcı iskelet” (SCAFFOLD) rolü oynayabileceği fikri doku mühendisliği alanını başlattı. Günümüzde biyolojik sistemlerde özel moleküler yanıt oluşturabilecek üçüncü kuşak biyomateryallerin geliştirilmesi için yoğun çalışmalar mevcuttur. Doku mühendisliğinde biyomateryallerin, çok önemli rolü vardır. Doku kalıbını sağlayan çemberler , doku iskeleti, biyoaktif madde dağıtan araçlar gibi implante edilen cihazlar için gereklidirler. İmplante edilen kalıplar, istenen fonksiyonun özel üç boyutlu şekle bağlı olduğu yapıdaki dokular için kullanışlı olmaktadır. Kalıp, önceden belirlenmiş şekillerde doku oluşumuna rehberlik edebilir, ve kan akımının bulunduğu kaynaktan yeni oluşacak dokuya yönlendirilmesini sağlar ve böylece yeni oluşan dokunun cerrahi aktarımını mümkün kılar. Doku fabrikasyonu için kullanılan alanda katı duvarlı çemberler, biyoaktif materyalleri bünyesinde yoğunlaştırıp lokalize eder. Biyomateryallerin doku mühendisliğinde diğer önemi ise “taşıyıcı iskelet” olarak kullanılmalarıdır. Yapı iskelesi olarak kullanılacak materyal için istenen temel özellikler arasında biyouyumlu, yok edilebilir, mekanik bütünlüğü ve doku iletimini sağlayabilir olması sayılabilir. Vücutta normalde bulunan ve “framework” görevindeki materyaller, örneğin hyalurinik asit, glikozaminoglikanlar, kollagen, polisakkarit (çitosan), fibrin bu amaçla kullanılabilir ve bunların ince bağırsak mukozası ya da dermisten hazırlanan asellüler karışımları doku mühendisliğinde kullanılabilir. Doku iskeleti olarak kullanılabilecek semi sentetik maddeler içinde (biyolojik yapıda var olan maddelerin sentetik maddelerle karışımları) veya sentetik maddeler (tamamen doğal olmayan maddeler) olabilir. Sentetik polimerlerin daha esnek tasarımlara olanak sağlayabilmeleri, içerik ve yapıları isteğe göre özel olarak üretilebilmeleri gibi avantajları vardır. Bazı polimerler, biyolojik koşullarda örneğin vücut sıvılarına maruz kalınca veya hücresel yıkım veya enzimatik yıkıma uğrayabilmektedirler. Bunu gidermek için küçük delikler (por’lar) aracılığıyla geçirgenik ve hidrofobik niteliklerin, ko-polimer oranı ve kristallik gibi özellikler eklenerek biyolojik yıkımdan bir miktar korunmaları sağlanmaktadır. Biyoyıkılabilir polimerler, kalsiyum seramikleri ve her ikisinin kombinasyonları delikli materyal özelliğinde üretilip yapı iskelesi olarak kullanılabilir. Materyaller, yüzey özelliklerini ve kompozisyonu değiştirecek şekilde biyoaktif moleküller ile modifiye edilebilir. Biyolojik ortamda parçalanırken biyoaktif materyaller halinde ortama salınan biçimde de üretilebilirler. Bu amaçla 100 mikrometre çaplı mikropartiküller içerecek şekilde oluşturulabilirler. Biyomateryaller yüzeyde hücreler ve ekstrasellüler matris ile temas halindedirler. Sentetik ve doğal maddelerin yüzey özellikleri, elektrik, topolojik ve kimyasal olarak değiştirilebilir. Materyalin yüzeyine çeşitli moleküllerin eklenmesi ile adherans ve hareketlerini etkilenebilir. Kalsiyum mineralleri ile kaplama, parçalanabilen polimerlerin kemik dokusu ile daha uyumlu olmasını sağlayabilir. Kollajen lifler gibi doğal olarak var olan bazı maddeler spesifik hücre adhezyonunu sağlayan kenarları taklit etmek amacıyla kullanılabilir. Hücre fonksiyonları, yüzey mühendisliği ile özel büyüme faktörleri salgılayacak şekilde kontrol edilebilir. Yapı teknolojisi içinde mikrotemas printing, laser fotolitografi, mikro sıvı kanalları gibi işlemler , sentetik materyaller üzerine hücre ekimi işleminin topografisini kontrol etmek için uygulanmaktadır. Biyoteknoloji Biyoteknoloji alanı, bitki hayvan ve insan hücreleri dahil tüm organik hücrelerin fonksiyonlarını anlamak, onları değiştirmek ya da yönlendirmek için çok sayıda teknolojiyi bünyesinde barındırmaktadır. Hücre nakli, büyüme faktörü salınımı, gen terapileri gibi biyoaktif komponentleri destekleyen metodlar, biyoteknolojinin odağını teşkil eder. Hücre bazlı teknolojiler içinde hücre nakli ve in vivo hücre iyileşmesine yönelik işlemler bulunmaktadır. Hücre naklinin temel planı hücrelerin toplanması, bunların kültür ortamında büyümeleri ve doku fonksiyonunun düzeltilmesi amacıyla alındıkları dokuya (vericiye) geri aktarımı olarak ifade edilebilir. Bazı yaklaşımlarda hücreleri, in vitro koşullarda doku oluşturduktan sonra geri vermek varken, bazılarında bu hücreleri in vivo olarak doku oluşumuna rehberlik edecek sentetik bir yapıya ekip eş zamanlı olarak alındıkları ortama geri verme söz konusudur. Kök hücreler, pluripotent özellikleri ve kültür ortamında çoğalabilmeleri nedeniyle bu amaç için elverişlidirler ve kültür ortamındaki değişikliklerle farklı hücrelere dönüşebilirler. Doku mühendisliği kavramının ortaya atılmasından önce hücre transplantasyonu genelde hücrelerin doğrudan enjeksiyonu ya da bunların ekstrasellüler matriks proteinleri ( örneğin kollajen) üzerine yerleştirilmesi üzerine yoğunlaşmıştır. Doku mühendisliği ile bu yaklaşımın bir adım ötesine geçilmiş ve implantasyon öncesinde bir iskele üzerinde üç boyutlu kültürler elde edilebilmektedir. Hücre yaşaması için difüzyon sınırlılığı nedeniyle bu yöntemde tek başına yüksek vaskülarize dokuların elde edilmesi zordur. Hücre nakli, hücre yaşamını destekleyecek kapiller yatakların prefabrikasyonu gibi yöntemlerle zenginleştirilmelidir. Vaskülarize doku elde edilmesi için özelleşmiş doku oluşumu ve anjiogenez gereklidir. Büyüme faktörleri bu nedenle doku mühendisliği için oldukça önemlidir. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan büyüme faktörlerine örnek olarak fibroblast growth factor –2 (FGF-2 veya FGFb) verilebilir. Bu büyüme faktörü, hem osteoblast öncü hücrelerinin proliferasyon ve diferansiyasyonunu uyararak kemik oluşumunu hem de anjiogenezi uyarır. Bu ikili etkisinden dolayı üzerine hücre ekilmiş hidroksiapatit seramiklerinde, sentetik polimer iskelelerde ve izole damarlar üzerinde kaplanmış kemik oluşumunda kullanılmaktadırlar. Benzer şekilde Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) de anjiogenez ve osteogenezde etkindir. Genetik mühendisliği ile hücre teknolojisinin birleştirilmesi fonksiyonel olarak daha iyileştirilmiş doku replasmanlarının elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Doğal dokuların davranışlarını değiştirerek önemli büyüme faktörlerinin daha etkin rol oynamasını sağlanabilir ve “yaşayan” protein salgılayan implante edilebilir materyaller elde edilebilir. Genetik olarak modifiye edilmiş allojenik hücreler mikroenkapsülasyon tekniği kullanılarak nakil edilebilir. Fibroblastlar gibi daha kolay büyüyen hücreler, modifiye edilerek daha zor sentezleyen bazı hücrelerin yaptıkları elemanları sentezler hale gelebilmektedir. ERİŞKİN KÖK HÜCRELERİNİN REJENERATİF TIPTA KULLANIMI Kök hücreler, pluripotent yani birçok klona farklılaşabilmeleri ve kendi kendine rejenere olabilme özellikleri yanı sıra uzun ömürlü olmaları nedeniyle doku mühendisliğinde giderek daha fazla ilgi çekmektedir. Buna rağmen kök hücrelerin biyolojik davranışları halen net olarak anlaşılamamıştır. Kök hücre kullanımı basit olarak iki aşamada incelenebilir: İlk aşamada organ ya da dokunun oluştuğu klona farklılaşır. Daha sonra dokunun fonksiyonel gereksinimine göre üç boyutlu mimari yapıya “monte edilir”.Bu karmaşık aşamalara ek olarak her basamakta dokuya ve işlem sırasına özel düzenleyici faktörlerin etkisi vardır. Kök hücreler, temel olarak embriyonik veya erişkin kökenlidir. Embriyonik kök hücreler (EKH) preimplantasyon aşamasındaki blastokistin iç hücre tabakasından elde edilirler, erişkindekiler ise esas olarak kemik iliğinden elde edilebilir. Multipotent olduklarından çok çeşitli alanlarda kullanılabilmektedirler. Örneğin, kültür ortamının manipulasyonu sırasında yapılan gözlemlerde kök hücrelerin hematopoetik hücrelere, adipositlere, kas hücrelerine, kondrositlere ve diğer birçok hücreye dönüştükleri gözlenmiştir. Bu olumlu özelliklerin yanı sıra hücre stabilitesi, onkojenik potansiyel ve etik nedenlerle bu EKH çalışmalarına olan ilgi sınırlanmıştır. EKH’lerin aksine kemik iliği kökenli kök hücreler uzun yıllardan beri çalışılmakta ve kemoterapi ve radyason sonrasında kemik iliği rekonstrüksiyonu için kullanılmaktadırlar. Kemik iliğinde iki ayrı kök hücre populasyonu vardır: hematopoetik kök hücreler, kan hücrelerinin gelişimi ile ilgiliyken mezenşimal kök hücreler (MKH) çeşitli bağ doku elemanlarını kemik, kartilaj, adipo ve kas dokularına in vivo ve in vitro dönüşebilmektedir. EKH’lere benzer olarak MKH’ler kültür şartlarını ve biyokimyasal çevreyi değiştirerek farklı hücrelere dönüşebilirler. Ne var ki klinikte pratik uygulamalarda bazı engeller söz konusudur. Örneğin alınması sırasında ağrı, morbidite, az sayıda hücre elde edilmesi sayılabilir. Kemik iliğinin yanı sıra erişkin kök hücreleri için ek kaynaklar için progenitor hücre populasyonu da dokunun devamlılığının korunması ve onarımı için kullanılabilir. Ohgushi ve Caplan (3) mezenşimal progenitor hücrelerin kemik iliğinden veya periosttan implante edilen materyallere göç edebildiklerini ve osteojenik farklılaşmaya uğradıklarını göstermiştir. Ringe ve ark , (4) 2002 yılında yayınladıkları bir çalışmalarında MKH’nin yenidoğanda 100000 kemik iliği hücresinde 1 iken 50 yaşındaki bireyde 0,25’e, 80 yaşında ise 0,05’e düştüğünü gösterdiler. Bu bulgular nedeniyle araştırmacılar kemik iliğinden izole edilen progenitör hücreleri kültür ortamında çoğaltıp defektli organa yerleştirmeyi denemektedirler. Javiswal (5), MKH kullanarak askorbik asit, deksametazon, beta-gliserofosfat ile zenginleştirilmiş kültür ortamın in vitro osteojenik farklılaşmayı gerçekleştirdi. Bunun yanı sıra diğer bir çalışmasında bu multipotent hücrelerin adiposit klona veya osteojenik klona farklılaşmalarının mitojen ile aktive olan bir proteinkinaz’a bağlı olduğunu gösterdi. Yoshikawa (6) osteojenik olarak zenginleştirilmiş kültür ortamında rat MKH’ni por içeren hidroksiapatit içine yerleştirmiş ve bunu subkutan olarak implante etmiştir. İmplantasyondan 1 hafta sonra kemik oluşumu ve maturasyonu gözlendi. Ohgushi, rat uzun kemiğinde 8 mm lik bir defektin kalsiyum bazlı seramik üzerine yerleştirilen MKH ile onarıldığını gösterdi Kıkırdak dokusu için yapılan araştırmalarda total kalça protezi uygulanan hastaların femur başından izole edilen yüksek yoğunlukta (1,5x10*6) insan MKH’ni içeren hücre pellt’lerini basınç altında polilaktik asit polimerleri üzerine yerleştirmişler ve proteoglikandan zengin ekstrasellüler matriste kondrosit benzeri hücrelere farklılaştığı. ortaya konmuştur. Bunun yanı sıra Sekiya ve ark. (7) insan erişkin kemik iliği stromal hücrelerinden in vitro kıkırdak gelişimini göstermişlerdir. Wakitani, (8) 2002 yılında yaptıkları bir çalışmada kemik iliği kökenli kök hücrelerini önce kültürde çoğaltmış ve kollagen gel iskelete yerleştirmiş, daha sonra hastalarındaki kıkırdak defektlerine aktarmıştır, sonuçta MKH’nin aktarımı ile daha iyi iyileşme sağlanmıştır; ancak klinik fayda açısından ele alındığında belirgin düzelme saptamadıklarını belirtmektedirler. Tendon onarımları için 1998’de Young ve ark . nın yaptıkları bir çalışmada tavşan kemik iliği kökenli MKH ni tip 1 kollagen içeren jel içine implante etmiş ve bunun tendon onarımına olan etkisini incelemişlerdir. Sonuçta biyomekanik, yapı ve fonksiyon açısından iyileştirici etkinin bulunduğunu göstermişlerdir. Awad ve ark . da benzer deneysel çalışmayı yapmış; ancak biyomekanik özelliklerde iyileşme saptarken yaranın mikroyapısında belirgin değişiklik olmadığı sonucuna varmışlardır. Kemik iliği kökenli MKH’lerin iskelet kası, düz kas ve kalp kasına farklılaşabileceği bilinmektedir. Bu, travma, vasküler yetmezlik, tümör rezeksiyonu sonrasındaki kas kayıplarında ve dejeneratif kas hastalıklarında kasların rejenerasyonu için üzerinde yoğun olarak çalışılan konulardandır. Esas ilgi kalp kası rejenerasyonu üzerinde odaklanmıştır, akut MI ve ekstremite iskemisi sonrasında kök hücre kullanımı ile ilgili Faz 1 çalışmalar yapılmaktadır. İskelet Olarak Kullanılan Doğal Materyaller a) Kollagen İlk olarak örgülü Dacron ile desteklenmiş Tip1 kollagen üzerine kültüre edilmiş sığır endoteli, düz kas ve fibroblastlar yerleştirilmiş ve tekrar oluşum için kültüre edilmişlerdir. Sonuçta üzerindeki endotel hücrelerinin yaşadıkları da Von Villebrant faktör ve prostasiklin salgılamaları ile doğrulanmıştır. Yine de bu modelin dayanıklılığı doğal damar greftlerine göre daha zayıftır. (Max. Burst strength 325 mm Hg olarak ölçülürken Bu değer, doğal koroner arterde 5000 mmHg dır.) Diğer çalışmalarda domuz dokusundan elde edilen desellülarize kollajen iskeleler de denemiştir. Domuz ince bağırsak mukozası izole edilerek hücreden uzaklaştırılır ve esas olarak kollgenden oluşan matriks haline getirilir. Bu yapının daha dayanıklı olduğu, daha iyi kompliyansa sahip olduğu gösterilmiştir. Bu materyallerde esas problem, bunların da bir miktar trombojenik özelliklerinin olması ve xenogenik materyale olan immun yanıttır. b) Desellülarize arteriyel matris: Xenogenik arteriyel matris konduitler de geliştirilmektedir. Bu yaklaşımda damarlar, tripsin ve etilendiamintetraasetik asit ile muamele edilip hücrelerinden uzaklaştırılmaktadır. Bunun için domuz karotis arteri kullanılır ve desellülerize edildikten sonra safen venden izole edilen insan endotel hücreleri ve kasları bunun üzerine ekilir. Fizyolojik koşullarda pulsatil akıma maruz bırakılınca başarıyla tek katlı endotel tabakası oluşturmuştur. Bu xenogreftlerin de benzer şekilde immun yanıt oluşturma riski ve hastalık taşıma potansiyelleri de önümüzdeki engellerdendir. c) Hücre “tabakası” (cell sheets) L’Heureux ve ark nın yaptığı bir çalışmada (8) İnsan umbilikal veninden elde edilen düz kaslar ve insan deri fibroblastları süper akışkan nitelikte ve hücre tarafında sentezlenen ekstrasellüler matriks içeren tabakalar oluşturacak şekilde 5 hafta süreyle inkübe edilmiştir ve Bu, tabakalar yuvarlanarak düz kas tabakası ve dışta adventisya tabakası oluşturulmaya bırakılmıştır. 8 hafta süreyle bu iskele, kültüre edilmiş ve lümene endotel hücreleri ekilmiştir ve doğal bir arterin her üç tabası da elde edilmiştir. İn vivo ortamda hastaya aktarıldıklarında, implantasyonun 1. haftası sonunda %50 patens oranı saptanmıştır. Bu yapı tamamen insan hücreleri ve insan ekstrasellüler matriks proteinleri içermektedir. Bu örnekte de trombüs oluşumu gözlenmiştir, ve bu yapının gücü adventisya tabakasındadır oysa normal dokuda media tabakası esas olarak bu yükü taşımaktadır. Bunun yanı sıra 12 haftalık bekleme süresi de bir dezavantajdır. Sentetik polimer İskeletler Doğal materyallerin mekanik özelliklerinin zayıf olması nedeniyle sentetik materyallerin geliştirilmesi yönünde çalışmalar artmıştır. Biyolojik olarak emilebilen sentetik polimerler, gelişen üç boyutlu doku için geçici bir çevre oluşturacak şekilde tasarlanabilir. Bu amaçla poliglikolik asit , polietilen glikol gibi maddelerden iskele oluşturulup mekanik ve biyo uyumları incelenmektedir. Bu materyallerin en önemli özellikleri emilebilir yapıda olmaları ve mekanik kuvvetlerinin doğal materyallere göre daha iyi olmalarıdır. Vasküler doku mühendisliğindeki potansiyel problemler Greft patensinin önündeki en büyük sorun “tromboz” dur. Bu nedenle son dönemde yapılan çalışmalar daha çok trombozun önlenmesi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Örneğin genetik mühendisliği ile antitrombotik faktörler salgılayabilen düz kas hücrelerinin endotel hücreleri ile ekimi gerçekleştirilerek greft patens oranlarını artırmaya yönelik çalışmalar vardır. Bir başka çalışmada güçlü bir trombosit agregasyon inhibitörü olan nitrik oksit kullanılmıştır. Nitrik oksit sentetaz 3 taşıyan virusle tranfekte edilen sığır düz kas hücreleri ile başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Alternatif gen terpisi olarak Vasküler Endoteliyal Büyüme Faktörü (VEBF) ile transfekte edilmiş vasküler hücrelerin kullanımı gündeme gelmiştir. Bu büyüme faktörü, endotel hücreleri için mitojen niteliktedir ve in vivo olarak anjiogenezi uyarmaktadır. VEBF ile transfekte edilmiş düz kas hücreleri, endotel hücre proliferasyon ve migrasyonunu in vitro olarak arttırdığı gösterilmiştir. Özet olarak Küçük çaplı vasküler greftllerin doku mühendisliği önünde maliyet , süre, dayanıklılık, immunite gibi birçok problem dursa da sağlayacağı faydalar nedeniyle üzerinde yoğun olarak çalışılan konulardandır. Yakın gelecekte non trombotik özellikte ve yeterli mekanik güce sahip vasküler yapılar klinik çalışmalarda yerine alacaktır. DERİ VE DOKU MÜHENDİSLİĞİ Deri mühendisliğinin amacı, doğal derinin normal anatomi ve fizyolojisinin rejenerasyonudur. Otolog keratinosit kültürleri 20 yıldan uzun süreden beri klinik kullanımdadır. Günümüze kadar geçen zamanda kültüre suni deriler sadece kısmi olarak anatomik veya fonksiyonel yapıyı restore etmekte kullanılmıştır. Oysa, deri mühendisliğinin potansiyeli ve sınırları bunun çok ötesindedir. Kültür Edilmiş Epidermal Otogreftler İlk kez 1975’de ağır yanıklı hastada Rheinwald ve Green , insan keratinosit kültürü tekniklerini kullanmıştır. Bu otörlerin adıyla anılan keratinosit kültür metodu ile 1-5 cm2lik biopsinin 3 hafta sonunda %70 yanık alanı olan erişkinde ki deri defektini örtecek kadar otolog epitel sheet’i elde etmek mümkündür. 20 yıldan uzun süreden beri yanık hastaları, çok tabakalı ince sheet’te lokalize otolog keratinosit kültürleri ( Kültüre Epiteliyal Otogreftler –KEO-) ile tedavi edilmektedir. Bu deri greftleri kalıcı yara örtüsü sağlamaktadır. KEO kulanımındaki en büyük problem, yeterli kalitede greftleme için uygun hale gelmesi için 3-4 hafta gibi uzun zaman gerektirmesidir. Cerrahi olarak bu kırılgan KEO’nun manipulasyonu zordur, enfeksiyon riski vardır ve çok pahalıdır. Erken dönemde bu yapıların vücutta tutması, literatürde %49-80 oranında değişmektedir. Bunun yanı sıra yeni epidermis çok kırılgandır ve yıllar sonra bile üzerinde küçük travma sonrasında büller oluşabilmektedir. Yaranın kendisinin uygun hale getirilmesi KEO’nun az olan iyileştirme potansiyelini arttırabilir. Bu amaçla yaradaki tanjansiyel debridmanlar, nekrotik dokuların uzaklaştırılması, ve defektin allojenik kadavra derisi gibi geçici dermal maddelerle örtülmesi uygulanabilir. Kültüre epiteliyal sheet’lerin bir çok olumsuz yönlerine rağmen yeterli donör alanın olmadığı yaygın deri defektlerinde rutin olarak kullanılmaktadır. Alternatif Keratinosit Uygulamaları KEO yerine kültüre edilmiş yarı akışkan hücrelerin kullanımı son dönemde daha ilgi çekmektedir. Bu kavram, kontakt inhibisyonu olmayan hücrelerin daha fazla büyüme potansiyelleri ve yara iyileşme potansiyelleri olması temelinden yola çıkılarak oluşturulmuştur. Bu hipotez, yarı akışkan kültürlerde yüksek proliferasyon potansiyeli ve diferansiyasyon marker’larının az oranda ekspresyonunun görülmesi ile desteklenmektedir. KEO’lardan enzimatik yolla geçici süre için alfa6 beta4 integrinlerden uzaklaştırılmaları (Hücre adhezyonundan sorumlu moleküllerdir) mümkün olabilmektedir. Kültür sürecinde enzimatik basamağa müdahale için bazı doğal ya da sentetik materyaller kullanılarak keratinositler yarıakışkan olarak kültüre edilebilir, böylece enzimatik işlemlerden kaçınılarak istenen sonuca ulaşılabilir. Bu biyomateryaller içinde poliüretan membranlar, silikon kollagen membranlar, hyaluronik asitli membranlar, kollagen süngerle ve fibrin glue sayılabilir. Keratinosit migrasyonu, iyileşme sırasında reepitelizasyon işlemi için büyük önem taşımaktadır. Diğer bir uygulama metodu da taşıyıcı araç olarak kültür vasatı veya fibrinin kullanıldığı tripsin ile ayrıştırılmış yarı akışkan hücrelerin kullanılmasıdır. Fibrin, yara iyileşmesi sürecinde doğal matriks elemanıdır ve hücrelerin yeniden düzenlenişinde çok iyi bir rehber olarak davranır. Keratinosit hücre greftlemesi ile hücrelerin manipulasyonu daha kolaylaşmıştır. Allojenik kadavra derisi ile kombine edilince stabil yapıda neoepitel elde edilebilir. Allojenik epitel hücreleri atılırken dermal kısmı kısmi olarak integre olur ve dermal rekonstrüksiyon için taşıyısı iskelet gibi davranır, Kadavra deri kullanımındaki bir engel de hastalık taşıma olasılığıdır. Bu da klinik kullanımı sınırlandırmaktadır. Deri replasmanına diğer bir yaklaşım da hem epiteliyel hem de dermal komponent içeren kompozit greft kullanımıdır. Bunlarla yapılan çalışmalarda bazal membran rejenerasyonunun dermis ve epidermisin interaktif süreç olduğunu göstermektedir. Keratinosit veya fibroblast ekilmiş farklı biyomateryaller, deneysel olarak dermis ve bazal membran komplekslerinin rejenerasyonuna yol açan olumlu özellikleri olduğu saptanmıştır. Tüm bu bulgular ışığında kültüre keratinositler, ekstrasellüler matriks ve kültüre fibroblastları içeren kombine suni deri geliştirilmiştir. Dermal Taşıyıcılarla Kombinasyon: Tam Kat Deri Mühendisliği KEO uygulamaların sonuçları incelendiğinde araştırmacılar epitel greftlerinin kalitesini arttırmak için dermal komponent eklenmesi üzerinde yoğunlaşmıştır. Fonksiyonel bir deri replasmanı, pür epidermal replasmandan daha faydalıdır. Çalışmalar, derimsi materyaller (skin substitudes) ile kültüre keratinositlerin greftleme öncesinde in vitro kombine edilmesi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Dermal taşıyıcı iskelet olarak birçok materyal kullanılmıştır. Örnek olarak dermisten veya, kollajenden derive dilen kafesler verilebilir. İn vitro çalışmalarda intakt bazal membranın , dermal yapının, ve canlı keratinositlerin önemi görülmüştür. Bunlara ek olarak kollajen ve glikozaminoglikanlardan oluşan dermal kafes geliştirilmesi ile her üç koşulun da sağlanması mümkün olmuştur. Matrikse fibroblast inokulasyonu ile keratinositler için daha uygun ortam oluşturulmuş ve deneyimli merkezlerde başarılı klinik sonuçlar alınmıştır. Bu tür kompozit greftler üzerinde yapılan çalışmalar ümit vericidir; ancak, bu yapıların difüzyon ile beslenmeleri için gerekli koşulların henüz çok iyi olmaması ve maliyet gibi aşılması gereken sorunlar vardır. Yaranın onarımı yerine “rejenrasyonu” başlatmak için kültüre keratinositlerin dermal matriks ile doğrudan yara üzerinde kombine edilerek kullanımı üzerinde çalışmalar mevcuttur. AlloDerm’in dermal matrix olarak kullanıldığı deneysel çalışmalarda bu asllüler dermal greft, epidermisten ve dermis hücrelerinden yoksun bırakılmış dermal matrikse karşılık gelmektedir , bazal membran olarak kullanılmıştır ve hem domuz modelinde, hem yanık hastalarında bu yapı üzerine konulan kısmi kalınlıkta deri grefti başarıyla tutmuştur. Gelecekte , mühendislik ile elde edilen derimsi materyallerin (skin substitudes) anatomi ve fizyolojisi daha iyi anlaşılacak ve bunlar otolog deri greftlerinin yerini alacaktır. Bunun yanı sıra derimsi materyallere eklenecek melanosit gibi diğer dermal hücreler ile daha iyi sonuçlar alınacaktır. En önemli hedef ise onarım yerine rejenerasyonu uyaracak derimsi materyallerin geliştirilmesidir. KIKIRDAK VE DOKU MÜHENDİSLİĞİ Kıkırdak, göreceli olarak basit kabul edilebilecek; ancak esas olarak proteoglikan , kollagen ve sudan oluşan ekstrasellüler matriks içinde yer alan kondrositlerce oluşmuş oldukça özel bir bağ dokusudur. Rejenerasyon potansiyeli yüksek olan kemik dokunun aksine kartilaj, onarım ve rejenerasyondan yoksundur. Beslenmesi, vasküler ağlar yerine difüzyon yoluyla gerçekleşmektedir. Buna rağmen kıkırdak, onarılacak alana kolaylıkla nakledilebilir ve bir çok rekonstrüksiyonda başarıyla kullanılabilir. Kıkırdak, hücre nakli ve doku mühendisliği için çok uygun olan birkaç özelliğe sahiptir. Tek tip hücre yani kondrosit içermektedir. Kondrositler, içinde bulundukları ekstrasellüler matris de kollagen ve sülfatlı glikozaminoglikan gibi birçok makromolekülü sentezler. Kıkırdak bifazik bir materyaldir; yoğun kollagen ağdan oluşan solid matriks fazı proteoglikan jel içinde bulunmaktadır. İnterstisyel sıvı fazı, eklem kıkırdağına , proteoglikan matriks içinde su ve elektrolitlerin serbest akımı- nın sağladığı eşsiz viskoelastik yapıyı verir. Kıkırdağın biyokimyasal içeriği özel kıkırdak yapılarının karşılaştığı mekanik faktörlerle yakından ilişkilidir. Eklem kıkırdağının basıncı emip eski haline gelecek şekilde düzenlenişi varken kulak yapısındaki elastik kıkırdak, şekil ve destek verecek şekilde sabittir. Defekte uygun yeni kıkırdak dokusunun mühendislikle elde edilmesi sırasında dokunun özellikleri ve mekanik gereksinimleri göz önünde tutulması ayrı bir önem taşımaktadır. Kıkırdak mühendisliğinde hedefler arasında, nonimmunojenik, istenen şeklin verilebileceği, resorbe olmayan otolog kondrositlerin oluşturduğu defekte uygun kıkırdak dokusu oluşturmak sayılabilir. Geçen yüzyıldan günümüze kıkırdak defektlerinin onarıma ait en yaygın işlem vücudun diğer bölümlerinden alınan kıkırdak greftlerinin şekillendirilerek kullanımı olmuştur. Ne var ki tüm kıkırdak greftleri, alındıkları bölgenin özelliklerine bağlı olarak zaman içinde bir miktar resorbe olmakta ve istenen şekli yitirebilmektedirler. Bunun yanı sıra donör alan morbiditesi ve oluşacak skarlar da hastalar için ek problem getirmektedir. Bu olumsuz özellikleri nedeniyle araştırmacılar alloplastik materyallere yönelmiş ancak bu materyallerin kullanımı ile elde edilen doğal olmayan sonuçlar ve ortaya çıkan komplikasyonlar nedeniyle kıkırdak mühendisliği ilgili çalışmalar yoğunlaşmıştır. Hücre Kaynakları Kıkırdak mühendisliği için esas engel, hücrelerin sağlanmasıdır. Başarılı bir mühendislik için kondrogenezisi sağlayacak yoğunlukta hücrenin polimer yapıda taşıyıcı üzerine ekilebilmesi kıkırdak mühendisliği için çok önemlidir ve başarılı sonuç alınabilmesi için hücre tipi, hücre sayısı ve ortam kritik faktörlerdir. Birçok canlı türünde yapılan deneysel çalışmalarda ekstrasellüler matrislerinden ayrılan kondrositlerin fenotipik olarak stabilitelerinin yitirdikleri gözlenmiştir.Tek tabaka halinde inkübe edildiklerinde plak üzerinde düzleşip, yayılıp fibroblast haline geldikleri bilinmektedir. Benya ve ark nın da yapıtıkları çalışmada (10) kulak kartilajından elde edilen kondrositlerin tek tabaka halinde inkübe edildiklerinde Tip 1 kollagen sentezinin giderek azaldığını ve Tip 1 kollagen sentezinin arttığını (fibroblastlarda ve bazı andiferansiye mezenşimal hücrelerdeki gibi) gözlemişlerdir. Kondrositleri, doğal ortamlarındaki gibi üç boyutlu yapıda tutmak, hücrelerin doğal özelliklerini korumalarına ve kendi uygun ekstrasellüler matris içeriklerini sentezlemelerini sağlayabilir. Bonaventure ve ark. (11) Tek tabakalı kültürde “dediferansiye” olmuş insan kıkırdak hücrelerinin, tekrar kondrosit fenotipine dönüp tip 2 kollagen ve geniş agregasyonlu proteoglikan sentezleyebildiğini gösterdi. Tek tabakalı kültürde birkaç hücre bölünmesinden sonra bile kondrositlerin, in vivo ortamda tekrar eski fenotiplerine dönebileceği bilinmektedir. Fonksiyonlarının geri dönüşümü yanı sıra biyolojik olarak yıkılabilen hidrojen polimerleri içinde sferik şekillerini geri kazanabilirler karakteristik matriks moleküllerini üretebilirler. Kondrojenik potansiyeli olan hücreler de doğru polimer ve uygun koşullar içinde kıkırdak gelişimini sağlayabilir. Örneğin, Mizuno ve ark.(12) demineralize kemik matriksi içeren tip 1 kollagen süngerler üzerine insan dermal fibroblastlarını ekmişler ve tip 2 kollagen içeren kartilaj benzeri doku elde etmişlerdir. İnsan, tavuk, tavşan ve köpek mezenşimal kök hücrelerinde (MKH) yapılan birçok çalışmada kontrol altındaki in vitro koşullarda kemik, yağ tendon, kas ve kıkırdak benzeri dokulara farklılaştıkları gözlenmiştir. MKH’ni , transforming Growth Factor Beta (TGF beta), deksametazon, insulin like growth factor (IGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) gibi kondrojenik bir ortamda kültüre ederek kondrogenezis gerçekleştirilmiştir. Kondrogenezisin delili de ortamda kıkırdak ekstrasellüler matriks elemanlarının ve kondrositlere özel gen ekspresyonlarının saptanmasıdır. Tüm bu bulgular, faklı kaynaklardan gelen hücrelerin kıkırdak mühendisliği için kullanılabileceği fikrinin doğmasına yol açmış ve birçok denysel çalışmaya yön vermiştir. Allojenik veya xenojenik kaynaklı kondrositler de kıkırdak mühendisliği için kullanılabilir. Allojenik veya xenojenik kıkırdakların bütün olarak kullanımı klinik olarak başarılı olmasa da bu kaynaklardan izole edilen kondrositlerden doku mühendisliğinde faydalanılabilir. Ancak bu hücrelerin ekstrasellüler matriksi uzaklaştırıldığında major histokompatibilite antijenlerinin ekspoze olması ve bunların oluşturacağı immun yanıt araştırıcıların karşısındaki problemlerden biridir. Bunun için taşıyıcı iskeletin; hem kondrositlerin kendi estrasellüler matrikslerini oluşturmasını sağlayan hem de immun yanıttan koruyan yapıda olması beklenir. Taşıyıcı İskeletler Erozyon ya da rezorpsiyonu kontrol edilebilen doğal veya sentetik polimerler in vivo ve in vitro kıkırdak mühendisliği için kullanılabilir. Örneğin intersellüler alanda biriken ekstrasellüler matriks proteinlerinin miktarı ile orantılı olarak yok edilen polimerler kıkırdak oluşturmak için kullanılabilir. a)Sentetik Polimerler Polyesterin poli alfa hidro esterleri kıkırdak mühendisliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunlara örnek olarak poli L laktik asit (PLLA), poliglikolik asit (PGA) ko-polimer poli L laktik ko-glikolik asit verilebilir. Bu polimerler kafes şeklinde yüksek geçirgenliğe sahip olarak oluşturulabilir ve böylece besleyici maddelerin ve hücresel atıkların rahatça değişimine izin verir. PLLA ve PGA toksik olmayan metabolitlerine hidroliz yoluyla parçalanırken yıkım hızları da ayarlanabilir. PLLA daha hidrofobiktir, daha yavaş parçalanır. Özellikle PGA polimerleri ile in vitro çok sayıda çalışma mevcuttur. Örneğin tavşan diz eklemi defektlerinde artiküler kondrositlerin PGA üzerine ekimleri sonrasında yeni matriks oluşumu gözlenmiştir ve in vivo olarak biyouyumlu polimerler üzerinde yeni kartilaj oluşturulabileceğini de göstermektedir. Bu sentetik fibröz polimerlerin birkaç dezavantajı arasında istenen şeklin verilmesindeki güçlük, ve hücre adhezyonunu güçleştiren hidrofobik yapıda olmaları sayılabilir. Hücreleri yapışmasında güçlük demek daha fazla sayıda hücreye ihtiyaç duymak demektir. Bu, klinik olarak büyük güçlük getirmektedir, çünkü otolog hücre temini için küçük miktarda kıkırdak biyopsisi alınabilmektedir ve az miktarda hücre, kültürde çoğaltılmak zorundadır. Bunun yanı sıra, bu tip polimerler, immun kompetan hayvanlarda subkutan lokalizasyon gibi vasküler kompartmanlara implante edildiklerinde güçlü bir yabancı cisim reaksiyonu oluşturmaktadırlar. Bu immun yanıtın histolojik incelemesinde gözlenenler tıpkı polyester sütür materyaline olan reaksiyon gibidir. b)Geçirgen Biyolojik İskeletler Kıkırdak için biyolojik iskelet olarak ekstrasellüler matrikste de yoğun olarak bulunan kollajen kullanılmaktadır. Kollajen süngerler geçirgen, biyouyumlu ve biyoyıkılabilir özelliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Kollajen ve kollagen glikozaminoglikan iskeletlerin hazırlanışı hakkında çok sayıda bilgi literatürde mevcuttur. Genelde hayvan dokularından elde edilmektedir. En sık sığır tendonundan elde edilen tip 1 kollajen kullanılmaktadır. Sentetik kafes iskeletler ile kıyaslandıklarında kollagen iskeletin kollajen üretimini, sentetik PGA’in de proteoglikan sentezini uyardığı gözlenmiştir. Buna ek olarak süngerin delikli yapısı ve yüzey özelikleri de hücre gelişimin ve kıkırdak oluşumunun önemli birer uyaranıdır. Kondrosit gelişimi ve ekstrasellüler matriks oluşumunun uyarılması için kollajen süngerler üzerine büyüme faktörlerinin örneğin basic FGFnin eklendiği çalışmalarda kondrosit dışı hücrelerin kondrositlere farklılaşmasını uyardığı saptanmıştır. Hyaluronan, gelişen embriyonun andiferansiye mezenşiminde ve kıkırdak ekstrasellüler matriksinde geniş yer tutan bir maddedir ve en önemli özelliği, gelişmekte olan mezenşimal hücrelerin kondrositlere farklılaşmasını uyarmasıdır. Bunun yanı sıra kondrosit fonksiyonlarını etkileyen fiziksel mikro çevrede önemli rolü olduğu düşünülmektedir. Solchoga’nın yaptığı bir çalışmada (13) tavşan kondilinde osteokondran bir defektin onarımı için hyaluronan fragmanları kullanılmış ve polimer süngerlerin kullanıldığı kontrol grubuna göre daha yüksek çoğalma hızı kaydetmiştir. c)Hidrojel iskeletler Hidrojeller, üç boyutlu yapılarını uygun koşullarda koruya jelatinöz kolloidler olup çözünebilen bir polimerin su ile karıştırılması ve ortama çapraz bağlara sahip ajanın eklenmesi ile elde edilirler. Polimer jeller gibi şekillendirilebilirler, daha büyük avantajları ise enjekte edilebilmeleridir. Hidrojellerin hücrelerin immobilizasyonu için uygun üç boyutlu destek matriks sağlayabildikleri kanıtlanmıştır. Hidrojellere örnek olarak iyonlarla çapraz bağlı aljinatlar ve çitosan , pluronikler gibi hidrojen bağlı blok ko-polimerler, (PEO –polietilen oksit- ve PPO’nun (polipilen oksit) ko-polimerleridir) ve çok sık kullanılan fibrin glue sayılabilir. Hidrojellerin kullanımını kısıtlayan sorunların başında özellikle enjekte edilen formlar için mekanik ve şekil özelliklerini uzun süre koruyamamalarıdır. Örneğin pluroniklerle oluşturulan jellerin yük altında bütünlüklerini kaybedebildikleri bilinmektedir. Doku mühendisliği ile geliştirilen kıkırdak dokusunun biyolojik ve biyomekanik özelliklerini daha uygun hale getirmek için 1- Ekstrasellüler kıkırdak matriksinin biyolojik özelliklerinin iyileştirilmesi 2- Geliştirilen kıkırdağa iç destek sağlamak 3- Pseudo perikondriyum gibi bir dış destek sağlamak gibi girişimler denenmektedir. Bunların yanı sıra kondrosit gelişimini arttıracak, ekstrasellüler matriks sentezini hızlandıracak büyüme faktörlerinin ortama eklenmesine yönelik çok sayıda çalışma mevcuttur.

http://www.biyologlar.com/doku-muhendisligi

HÜCRE YAŞLANMASI (Cellular Aging)

Yaşlanma genel anlamda bir eskime bir bozulma olayıdır. Bu çok kısa tanımdan başka tanımlar da yapılabilir: Bunların tümü de yaşlanmayı zamanın fonksiyonuna yani kinetiğe bağlarlar: Yapılan tanımlar bir organizma kadar bir hücre için de geçerlidirler. Hatta yıldızlar, galaksiler gibi cansız maddelerle, kültür gibi nicel olarak ölçülemeyen kavramlar için de yaşlanmadan söz edilmekte-dir.(1) Yaşlanmayla ilgili çalışmalar önceleri çok hücreli organizmalarla yapılmıştır. Hücre yaşlan-ması çalışmaları ise hücre kültürü tekniklerinin gelişmelerinden sonra başlayabilmiştir. Çok hücreli organizmalar hücrelerden yapıldığına göre,vücudun yaşlanmasından sorumlu olan birimlerin hücre-ler olup olmadıkları sorgulanabilirdi. Gerçekten de organizmalar hücreleri yaşlandıkları için mi yaşlanıp ölmektedirler? Bu sorunun karşılığı bazı durumlar için evet, ancak çoğu durumlar da olumsuzdur. Yaşlanma ile organizma hayatının son bulması (ölüm) olaylarını da ayrı ayrı değerlendirmelidir. Çünkü birbirinden çok farklı kavramlardır: Kanser hücreleri gibi tamamen gençleşmiş görünen, ancak anarşik şekilde çoğalan hücreler de organizmanın ölümüne neden olmaktadır. Çoğu organizmalar, hücreleri ölümü gerektirecek kadar yaşlanmadıkları halde, değişik nedenlerle ölmektedirler. Çoğu da organ yetmezliğine bağlı-dır. Organizmanın ölmesi için bir hücre grubunun yaşlanıp ölmesi gerekmemektedir. Kendileri tamamen yaşlanmadıkları halde organizma için gereken görevini yapmaz durumuna geçen,ya da asıl görevlerinden başka görevler yapmaya başlayan hücre grupları da organizmanın ölümünden sorumlu olmaktadırlar. Organizma öldüğünde hücre ve dokularının önemli bir bölümü, çoğu kez de tamamı, daha yaşayacak durumda bulunmaktadır. Yabanıl atlarda ve kangurularda dişler eskidikleri için beslenememekten (açlıktan), kemirgenler çoğunlukla kanserden, modern insan ise çoğunlukla kanser ve kalp yetmezliğinden ölmektedirler. O halde hücre yaşlanmasını, organizmanın yaş-lanmasından ayrı olarak incelemelidir. Akla gelen başka bir soru da bir hücreli organizmalardaki yaşlanma durumudur. Bir hücreli-lerde yaşlanma var mıdır? Burada da prokaryotlarla ökaryotları ayırt etmek gerekecektir. Yaşlan-mış hücreyi, zamanla bazı görevlerini yapamaz ve bölünemez duruma gelmiş bir hücre olarak kabul ettiğimizde, bakterilerde yaşlanma olayı görülmemektedir. Kendilerine uygun bir ortam buldukları sürece, var olma ve çoğalma yetenekleri sınırsızdır. Amib ve Paramecium gibi bir hücreli ökaryotlar da ölümsüz gibi görünseler bile, gamet oluşturup eşeysel çoğalabilmeleri , aç bırakmalardan sonra çoğalma (bölünme) yeteneklerinin sınrlı kalması , bunlarda da yaşlanma olayının varlığını işaret et-mektedir. İnsan fibroblastlarının ise, yaklaşık 60 katlama döneminden sonra öldükleri görülmüştür. Her hücre grubunun kendine özgü bir maksimun katlanma sayısı vardır. Hücre gruplarına göre değişen bu maksimun katlanma sayısına, bu konudaki gözlemlerini ilk olarak ileri süren araştırmacının adına atfen “Hayflick Limit” denilmiştir. Bu limit sayısı , genç bireylerden alınan fibroblastlarda daha yüksek (≥60) , yaşlı bireylerden alınanlarda ise daha düşük(30-40) bulunmuştur. Aynı durum progeria ve Werner sendromu gibi erken yaşlanma sendromları için de geçerlidir. Örneğin Werner sendromlu birinin fibroblastlarının maksimum katlanma sayısı, 100 yaşındaki bireyinkinden daha küçüktür.Ayrıca maksimun katlanma sayısı önceden bilinen hücreler, belli bir katlanma sayısından sonra sıvı azota konulup,katlanmaları belli bir süre durdurulacak olursa ,yeniden çoğalmaya başlatıldıklarında, hiç ara vermeden hangi bölünme sayısında duracaklarsa, yine aynı katlanma sayısında durmaktadırlar(2).Diğer taraftan ,aynı grup hücrelerin (örneğin fibroblastların) in vitro maksimun katlanma sayıları, alındıkları canlı türünün ortalama ömür uzunluğuna da bağlıdır. Daha uzun ömürlü türlerden alınan fibroblastların maksimun katlanma sayıları da daha fazladır. Bölünmesini durdurmuş insan fibroblastlarının çoğu (% 85 i) G1 azı da G 2 döneminde bulunmaktadırlar. Yaşlı hücrelerin mikroskobik görünümleri nasıldır? Çekirdekler yuvarlak görünümlerini yitirip loblar oluşturmuşlardır. Sitoplazmadaki lizozomal aktivite ve otofajı artmıştır. Bunun sonu-cu olarak vaküoler yapı da artış göstermiştir. Endoplazmik retikulum daha az ribozomlu duruma geçmiş, aralıkları da daralmıştır. İnsan fibroblastlarında hücre hacmi ve çekirdek çapı artmıştır(3). Yaşlı hücrelerde sentez, özellikle de enzim sentezleri değişmekte midir?Değişiyorsa bu de-ğişiklik hangi yönde olmaktadır? Yaşlı hücrelerdeki bazı enzimlerin sentez hızı azalıp, bazıları-nınki de artabilmektedir. Ancak her yaşlanmakta olan hücre grupları için değişmez veriler bulun-muş değildir. DNA onarım yeteneğinin azaldığını gösterir veriler, kesin ve yeterli görülmemektedir. Hangi tür maddeler hücrelerin maksimun katlanma sayısını (ömrünü) artırmaktadırlar? Testi yapılmış birkaç maddeden E vitamini (antioksidant),hidrokortizon, maksimun katlanma sayısını %100 ‘e varan ölçülerde artırmışlardır.(50 yerine100 katlanma sayısı). Hiç yaşlanmaz görünen , ölümsüz (katlanma sayısı sonsuz büyük) ökaryot hücre grupları da vardır. Ancak bunlar, kontak inhibisyonunu ve hücre içi sentez konrollerini yitirmiş kanser hücre-leridir. Bilinen şu ki,”normal ökaryotik hücreler” hem in vivo,hem de in vitro olarak ,yaşlanmak-tadırlar. O halde bir türün ölümsüzlüğünün sırrı nedir?Bir türün bireyleri yaşlanıp ölseler bile tür kuşaktan kuşağa geçerek varlığını sürdürebilmektedir. Mayoz bölünme (gamet oluşumu) ve döllenme birbirlerini takip etmeden hücre gençleşmesi ve türlerin devamlılığı mümkün görülmemektedir. Bu da bize mayoz /zigot evrelerinde bir DNA onarımının (gençleşmesinin) olabileceğini düşündürür. Yaşlıdan genç, bu mekanizmadan sonra doğabilmektedir. Yaşlanma olgusunu açıklamak amacıyla çeşitli teoriler oluşturulmuştur. Ancak bunlardan hic biri tek başına yaşlanmayı açıklamaya yeterli görülmemiştir. Bu teorilerden birkaçı şunlardır: 1-Somatik mütasyon teorisi (Curtis,Danielli, 1956): Somatik hücre DNA’larında zamanla çeşitli mütasyonlar birikerek bu hücrelerin normal metabolizmalarının sürmesini engellerler. So-nuçta hüçreler yaşlanarak ölürler. 2- Yanlışlık felaketi (Error catostrophe) teorisi (Orgel,1963,1974):Protein sentezindeki kendiliğinden oluşabilen hatalar (polpeptid içine belli bir aminoasidin yerine hatalı olarak başka bir aa’in girmesi)RNA ve DNA sentezleyen enzim ve proteinlerin hatalı çalışmalarına neden ola-bilirler .Bunun sonucu olarak da hatalı RNA ve DNA ‘lar sentezleneceğinden , sonu gelmez bir hatalar zinciri başlayacak ve hücre metabolizması bir felakete doğru sürüklenecektir. Bu nedenle hücreler yaşlanıp öleceklerdir. 3-Virus işgali teorisi (Hotchin, 1972 ):Genomda viral kaynaklı yabancı DNA ‘ların yığıl-ması sonucunda istenmeyen bazı genler çalışarak ürün vermeye başlayacaklar, yine bu yabancı DNA ‘lar yüzünden gerekli bazı genler de ifade edilemez olacaklardır. Bu da hücre metabolizma-sını anarşiye götürecek ve yaşlanmasına neden olacaktır. 4 –Hücresel bilgi kaybı (Comfor , 1968): Hücre DNA’sında zamanla ve rastgele gen kaybı ve sonradan devreye giren zararlı genler vardır. Hücre yaşlanması ve ölümüne neden olanlar bun-lardır. 5-Otoimmün teori (Bürnet ,1972):Organizmadaki savunma hücrelerinin yabancı hücre ve moleküllerle uğraşacağı yerde, kendi öz hücre ve molekülleri ile uğraşması sonucu yaşlanma olayı başlar ve tüm organizma yıkıma gider. 6-İntoksikasyon (zehirlenme) hipotezi ( Sheldrake,1974):Hücreler ,kendi metabolizma ar-tıkları ve çevreden gelebilen başka toksik maddelerin içlerinde birikmesi sonucu yaşlanıp ölürler. 7- Genomda önceden proğramlanma teorisi (Hayflick, 1961-65):Hücrenin zaman içindeki yaşlanma ve ölümü , kendi genomu tarafından önceden proglanmıştır. Yaşlanma ve ölüm bu program çerçevesinde meydana gelir. Her tür canlının kendine göre az çok belirlenmiş bir ortalama ömrünün bulunması, bu teoriyi destekler. Hayflick ve Wright (1975) ‘ın hücre melezleme çalışmaları da bu düşünceyi desteklemiştir. Çekirdeği yok edilmiş yaşlı bir hücre ile, çekirdeği bulunan genç bir hücre hibritlendiğinde (kaynaştırıldığında),bu melez hücrenin yaşlanma ve ölüm seyri, çekirdeğin kontrolü altında olmakta, yaşlı stoplazmanın önemli bir etkisi görülmemektedir. Ayrıca somatik hücre kromozomlarındaki telomer (uç bölge) kısalması (insanda10-15 kilobaz olan telomerik bölgeler, her bölünmede 50-200 baz çifti kadar DNAlarını yitirirler[8-9]), bu bölgelerin belli bir kısalmadan sonra hücre bölünmesinin ya durması, ya da hücrenin kanserleşmesi, somatik hücrelerde bu bölgelerin sabit tutulmasını sağlayan telomeraz denilen enzimin bulunmayışı ( telomeraz, bazı kök hücrelerinde ve kanserlerin % 85 inde bulunmaktadır), genomda önceden programlanmış yaşlanma hipotezini desteklemektedir. Bu hipotezler içinde en rahat denenebileni (deneye uygun olanı), Orgel’in “ hata felaketi “ ya da “yanlışlık fekaketi” hipotezidir. Bu hipotez protein sentezi ile ilgili olduğundan , canlılara her hangi bir aminoasidin yerine onun analoğunu (benzerini) verecek olursak , bu aa polipeptid zinciri içinde gerçeğinin yerini alacak, ancak onun görevini yapamayacaktır. Böylece kazalar zinciri baş-latılmış olacaktır. Bu tür deneyler çeşitli canlı türleri ile yapıldıklarında bir birinden farklı sonuçlar alınmıştır. Bazı canlılarda ömür uzunluğu değişmemiş, bazı canlılarda ya da hücre gruplarında de-ğişmiştir. Drosophila ile yapılan deneylerde uzunluğunun değişmeyip, sadece protein turnover hı-zını artırdığı gözlenmiştir (7) . Bir mantar olan Neurospora ve fibroblastlarla yapılan deneyler ise Orgel hipotenizi destekleyici yöndedir. 1986’da Fleming ve arkadaşlarının Drosophila proteinleri ile yaptıkları deneyler , yaşlı si-neklerle genç sinekler arasındaki protein farklarının nitel (kalitatif) olmayıp ,nicel (kantitatif ) ol-duğunu göstermiştir (4). Bu da yaşlı hücrelerdeki bazı gen aktivitelerinin tamamen yok olmayıp azalıp çoğalabildiklerini işaret eder. Eğer ki bu azalıp çoğalmalar, anahtar görevi yapan bazı pro-teinlerde olursa, hücre metabolizması tamamen değişebilecek, bu hücreye ve çevre dokulara zarar- lı olabilecektir. Sonuç olarak, kanserleşmemiş her somatik hücre grubunun maksimum bir katlanma sayısı (ömür uzunluğu ) vardır. Canlıların, kendilerini oluşturan hücrelerin maksimum katlanma sayı-larına ulaşmadan önce öldükleri de bir gerçektir. Ancak, bu sınıra kadar gelmiş de olsalar, ömürle- ri bu limitle sınırlıdır. Bu sınırı yukarı doğru çekebilmek için besin olarak kullanılması mümkün görülen vitamin E,A,C ve diğer anti oksidant maddelerle çalışmalar yapılmış, Drosophila ile % 65 varan artış elde edilmiştir (5). KAYNAKLAR 1.Rosen R:Cells and Senecence, Internat Rev Cytol 54,161-91,1978. 2.hayflick L: The Cell Biology of Aging, in ”Clinics in Geriatric Medicine”, Vol 1, No 1, 15- 27,1989. 3.Chu Chang Chua, Deborah E, Geiman and Roger L Ladda: Mechanisms of Aging and Development 34, 35-55 ,1986. 4.Fleming JE Quattrocki E, Latter G,Miquel J,Marcuson R, Zuckerkandl E, Bensch KG: Age-Dependent Changes in Proteins of Drosophila melanogaster, Science 231,1157-59 ,1986. 5.Nalçacı OB: Antioksidan Maddelerin D.melanogaster Ömür Uzunluğu Üzerine Etkileri İnönü Üniv.Fen Bilimleri Dergisi 1(1): 20-37,1987 6.Dell’orco RT.Whittle WL and Maciera-Coelho A:Changes in the Higher Order Organization of DNA Durin Aging of(HDF).Mech Aging and Development 35,199-208 ,1986 7.Bozcuk AN:Aging in Drosophila and Orgels hypothesis Gerontology 23(6),414-419,1977 8.Harley C.B. and Sherwood S.W. Telomerase, checkpoints and cancer, Cancer Surveys 29, 263-284, 1997 9.Bestilny L.V., Brown C.B., Miura Y. ve digerleri, Selective inhibition of telomerase activity during terminal differentiation of immortal cell lines, Cancer Res. 56, 3796-3802, 1996.

http://www.biyologlar.com/hucre-yaslanmasi-cellular-aging

Proteinler

Genler taşıdıkları bilgileri kullanarak proteinleri oluşturur.Yine genler oluşturdukları bu proteinler sayesinde hücre veya organizma düzeyinde tüm biyokimyasal olayları takip eder.Bu biyokimyasal tepkimeler sonucunda organizmaların sahip oldukları fenotipler belirlenir.Protein sentezi prokaryotik hücrelerin sitoplazmasında sentezlenir.Proteinlerin translasyonu için genetik bilgiyi taşıyan bir DNA molekülü veya RNA’ya ihtiyaç vardır.Ayrıca DNA’daki genetik bilgiyi protein sentezi birimi olan ribozomlara taşıyan nükleik asitlere ihtiyaç vardır(mRNA).Yine sitoplazmada bulunan aminoasitlerin protein sentez birimi olan ribozomlara taşıyan nükleik asitlere(tRNA) ihtiyaç vardır.Son olarak protein sentezi için yapı olarak protein olarak protein ve ribozomal RNA’dan oluşan nükleoprotein olan ribozomlara ihtiyaç vardır.Proteinleri hücrelerin fonksiyonel birimleri olup hücrelerdeki makromoleküllerin büyük bir kısmını oluştururlar(%50’den fazlasını).Proteinler hücrede enzim,antikor,hormon,taşıyıcılık ve yapısal görevler üstlenebilirler.Proteinleri bu görevleri yerine getirebilmeleri ancak genler tarafından belirlenen kendilerine özgü yapılarında olmalarıyla mümkündür.Ancak bu yapıdaysa üstlendiği görevi yerine getirebilir.             H                I H3+N – C – C = O               àAminoasit                I                R         O- Hücre içerisinde aminoasitlerin karboksi gruplarıyla amino grupları yüklü olurlar. Dolayısıyla biyokimyasal olarak aminoasitlar dipolar iyonlardır. Aminoasitler dipolar iyon oldukları için hem asidik hem de bazik özellik gösterirler.Proteinlerin özellikleri yapılarındaki aminoasitlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinden gelir.Aminoasitlerin genel yapısı α-aminoasit şeklindedir.Bunu tek istisnası Prolin’dir.Aminoasitler kendi aralarında peptid bağları oluştururlar.Bu bağ α-amino grubu ile diğer aminoasidin α-karboksi grubu arasında 1 mol su çıkışıyla sağlanır.Oluşan yapısal dipeptid,tetrapeptid ve hexapeptid şeklinde isimlendirilir.Çok sayıda peptid varsa polypeptid olarak adlandırılır.Bütün polypeptid zincirlerinde 1 C-terminus(C-ucu) uç vardır.Bir de N-terminus(N-ucu) olarak isimlendirdiğimiz uç cardır.Bir başka deyişle polypeptidlerin bir ucunda amino grubu vardır(N-ucu).Diğer ucunda ise karboksi grubu vardır(C-ucu).Polypeptid oluşumunda yer alan peptid bağı bir kovalent bağdır.Protein yapısında görev alan diğer bir önemli kovalent bağ ise disülfit bağıdır.Bu bağ Sistin aminoasitleri arasında meydana gelir.polypeptidler kapsadıkları aminoasitlerden dolayı net bir pozitif veya negatif yük kazanabilirler.Proteinlerin bu özellikleri kullanılarak birbirinden elektroforez denilen bir yöntemle ayrılırlar.             Proteinler aminoasitlerin birbirine peptit bağlarıyla bağlanması sonucu oluşan polipeptit zinciridir.             Sekonder yapının oluşması polipeptit zinciri içindeki atomların karşılıklı etkileşimleri sonucu oluşur.Örneğin H bağlarını oluşması verilebilir.Sekonder yapının en iyi bilinen örneği α-sarmal yapı ve β-pleli tabaka yapısıdır.Örneğin α-sarmal yapı α-keratin proteinin yapısında bulunmaktadır.             Tersiyer yapı,polipeptitlerin mevcut olan bütün bağları ile etkileşerek oluşturduğu yapıya denir.Bu bağların içinde R gruplarından gelen etkileşimlerde vardır.Örneğin disülfit bağları ve kovalent bağlar verilebilir.             Kuarterner yapı,bu yapı özellikle polimerik(oligomerik) olan proteinlerin oluşumunda önemlidir.Yapıya 2 veya daha fazla polipeptit zinciri girer.Kuarterner yağı polipeptit zincirleri oluşumuyla oluşur ve enzimleri çoğu bu yapıdadır.Ayrıca bu yapıda önceki yapılarda saydığımız etkileşimler mevcuttur(hemoglobinà4polipeptit).Proteinlerin kazanmış oldukları üç boyutlu yapılara proteinlerin konformasyonu denir ve bu göz önüne alınırsa proteinler: Globüler: Sıkıca sarılı küresel proteinlerdir.Suda çözünürler.Proteinlerin bir çoğu örneğin enzim olanlar,antikor,hormonlar,taşıyıcı proteinler bu yapıdadır. Fibroz:Genellikle uzun flament yapıdadır.Bunlar genellikle suda çözünmez.Yapısal ve kontraktil görevleri vardır.α-keratin,aktin ve miyozin fibroz proteinlerdir. Proteinler aminoasitlerden oluşmakla beraber işlevsel hale geçmek için bazen aminoasit olmayan diğer yapılarla birlerşir.Bu proteinlere birleşik veya konjuge proteinler diyoruz.Proteinlerdeki aminoasit olayan kısımlarına prostetik grup diyoruz.Birleşik proteinler prostetik gruplarına göre adlandırılır.Örneğin glikoprotein,lipoprotein,nükleoprotein…vs. Proteinlerin özellikle enzim olarak görev yapanlarının işlevlerini yerine getirmesi konformasyonları ile direkt bağlıdır.Enzimler hücrede katalizör görevi yapan proteinlerdir. Katalizörler bir kimyasal reaksiyonun meydana gelişini kolaylaştıran maddelerdir.   Enzimler sentezlenirken enzimlerde belirli hassas bölgeler vardır.Bu bölgelerden biri aktif bölge diğeri ise allosterik bölgelerdir.Bu enzim aktivitesini düzenleyen bölgedir.Allosterik bölgeler molekül ağırlıkları düşük olan ve efektör adı verilen moleküllerin bağlandığı bölgelerdir.Efektörler enzimin substrata olan ilgisini düzenler.Bu ilgiyi 2 şekilde oluşturabilir. Ya aktivatör olarak(Enzimin substurata olan ilgisini artırma) ya da inhibitör olarak (aktivatörün tam tersi) görev yapar.Hücre içerisinde enzimlerin işlevini düzenleyen diğer bir mekanizma ise feed-back inhibisyonudur.Bu genellikle bir metabolik yolun ilk basamağında yer alan enzimin metabolik yol sonucu oluşan product tarafından inhibe edilmesidir. Örneğin histidin aminoasidi 9 basamaktan oluşan bir metabolik yol sonucu oluşur.ortamda yeterince histidin aminoasidi biriktiği zaman histidin allosterik bir efektör gibi davranarak metabolik yolun ilk enzimini inhibe eder.Genellikle değişiklik konformasyonal biçimler alarak değişik görevler yapan proteinlere allosterik proteinler denir.Proteinler biyolojik olarak aktif durumlarını ancak belirli ortamlarda koruyabilirler.Örneğin ortamın ısısı,pH’sı değişirse proteinler görevlerini yapamayabilirler.Bir proteinin üç boyutlu yapısını kaybetmesine ve işlevini yitirmesine denaturasyon denir.Bu olay yüksek ısı,pH,organik çözücüler,deterjanlar ve radyasyon sonucu meydana gelebilir.Bu maddeler proteinlerin yapısındaki H ve kovalent bağları,hidrofobik ve hidrofilik etkileşimleri değiştirerek üç boyutlu yapılarını değiştirirler. Denaturasyonda primer yapı genellikle korunur.Proteinlerin denature olmasına neden olan maddeler ortamdan çekildiğinde proteinler yeniden üç boyutlu yapılarını kazanabilirler.Buna renaturasyon denir.Örneğin Ribonükleaz enzimi verilebilir.  

http://www.biyologlar.com/proteinler

Atık Suların Arıtılması

Atık su arıtılması sırasında oluşan biyokimyasal reaksiyonlar daha çok bakteriler tarafından gerçekleştirilir.Atık suyun bileşimi çok kompleks olup binlerce organik maddeyi çok deşişik konsantrasyonlarda içerir.Atık suda çok sayıda substrat ve mikroorganizma bulunması bazı reaksiyonların inhibisyonuna sebep olabilmektedir.Ayrıca substrat konsantrasyonunun çok düşük olması reaksiyon hızlarının da fermantasyona kıyasla çok yavaş olması sonucunu doğurur. Atık işlemlerin biyokimyası atışın içerdiği bileşiklerin tabiatı ile yakından ilgilidir. Kentsel atık sularda bulunan organik C’nin %75 i karbonhidrat,,protein,amino asitler ve yaş asitlerinden kaynaklanır.Geriye kalan kısımda anyonik deterjanlar ve non iyonik deterjanlar önemli yer tutar.Organik maddenin 2/3 i süspanse haldedir. Atık işlemleri “açık” sistemler olduğundan mikrobiyal populasyon özellikle düşük büyüme hızlarında çok çeşitlidir.Aerobik işlemlerde ana katabolik reaksiyonlar moleküler O2’li oksidasyon ile tamamlanırken ,anaerobik solunum bazı durumlarda meydana gelir ve nitrat elektron akseptörü olur.Anaerobik işlemlerde ana reaksiyon hidrolitik ve fermentatif reaksiyonlardan sonra inorganik karbonun elektron akseptörü olarak kullanıldığı solunumdur.Bu reaksiyonların son ürünü metan olup CO2 in H2 ile direkt indirgenmesi ile de elde edilebilir. Solunum-O2 Tüketimi Bir atışın arıtılması sırasında O2 tüketiminin bilinmesi çok önemlidir.Çünkü havalandırma aktif çamur prosesinde toplam maliyetin önemli bir kısmını oluşturur. Oksijen tüketimi manometrik ve elektrodlarla veya beş günlük BOD(Biyolojik Oksijen ihtiyacı) testi ile belirlenebilir.Arıtılmış olsun veya olmasın atık suların büyük kısmı genellikle nehirlere verilir.Nehir canlı hayatı için çözünmüş O2 miktarı esansiyel olduğunda daha 1912 yılında ingiltere’de nehir suyundaki çözünmüş O2 ni kritik düzeye düşürmeden kanalizasyon sularının nehre verilebilmesi için BOD testleri yaptırılmaya başlanmıştır. Saf bakteri kültürleri için spesifik endojen solunum oranı çok düşükken aktif çamur durumda oldukça yüksektir.(~%10-50).Bunun iki önemli sebebi vardır. 1)Aktif çamur kendine bağlı olarak suda çözünmeyen formattaki yağ asitleri,karbonhidratlar ve proteinleri içerir. 2)Arıtma proseslerinde metabolize olabilecek depo ürünlerini içerebilecek mikroorganizmalar yavaş büyürler buna karışlık endojen solunumu çok hızlıdır. Bu durumlarda hücre canlılığını yitirir ama solunum devam eder ve mikrobiyal büyüme olmadığı halde O2 tüketilir.Normal olarak aktif çamurda canlı hücre oranı %1-10 arasında değişir.Sonuçta total lizizin gerçekleşir ve hücre içeriği dışarı çıktığından bulanıklığa sebep olur.Supernatantın çözünmüş organik karbon(DOC) ve BOD değeri yükselir. Atık işlemlerinde endojen metabolizma ve lizizin bilinmesi havalandırma tankının O2 gereksinimini hesaplayabilmek açısından önemlidir. Çözünmüş Oksijen(DO) Moleküler O2,H2 veya e akseptörü olarak hizmet görür ve sonuçta H2O oluşur.O2 ender olarak doğrudan organik moleküllere transfer edilir.DO arttırılırsa solunum hızlanır ve hiperbolik bir görüntü verir. Hızın DO konsantrasyonuna bağımlılığı Monod ve MichaelisMenten denklemlerine uyar ve bakterinin oksijene ilgisi Km sabiti ile ifade edilir.

http://www.biyologlar.com/atik-sularin-aritilmasi

ANTİSENS TEKNOLOJİSİ

ANTİSENS NEDİR Sense, m-RNA veya DNA molekülünün 5’- 3’ ipliğidir. Sense’in komplementeri olan iplik de antisens olarak isimlenir. ANTİSENS TEKNOLOJİSİ Antisens teknoloji insan, hayvan ve bitkilerdeki hastalıkların daha spesifik tedavisi ve yeni keşifleri için ayrıca, fonksiyonel genomik çalışmalar için çok güçlü silahlardan oluşan uygun tekniklerdir Doğal olarak oluşan bu mekanizma sekansa spesifik olup ilk kez Caenorhabtidis elegans nematodunda keşfedilmiştir. Prensip : Antisens teknoloji olarak bilinen yöntemde, antisens RNA moleküllerinin hedef genin RNA(sense) ipligine spesifik olarak bağlandıgında system bu çift helix’I yabancı olarak algılar ve hatalı m-RNA molekülü daha translasyona girmeden parçalanaıp yok edilecektir ve gen ifadesinin moleküler düzenlenişine engel olunacaktır. Yani Antisens teknolojisi ile oluşmuş olan proteinin inhibisyonu degil proteinin oluşmadan önceki transkripsyon veya translasyon aşamasının inhibisyonu amaçlanır. Antisense teknolojisi proteinle ilgili hastalıkların ilerlemesini durdurmak için oligonükleotidler olarak adlandırılan sentetik DNA ve RNA segmentlerinin kullanımını içerir. Artık günümüzde bir proteinin aminoasit zinciri bilindiginde DNA’nın anmalı geri çevrilebilir vem-RNA sını hedef alacak bir antisense oligonukleotid dizayn edilebilir. Bu teknoloji ile ADIS, Kanser, Hepatid gibi tedavisi mumkun olmayan hastalıklara belki careler bulunacaktır. Anitsens ipliğinin bugun gelişritlen en son hipotezleri RNA splicing’in bloke edilmesi RNA molekülünün azalmasının hızlandırılması HnRNA intronlarının kesilmesi m-RNA nın sitoplasmaya taşınmasının engellenmesi Translasyonun engellenmesi Triplex DNA oluşumunun saglanması (Şekil Tez syf 5) Atisense RNA E.coli’deki ColE1 ve R1 plasmidleri ile yapılan çalışmalar esnasında bu plasmidlerin kopya sayılarını control eden plasmidlerin kodlandıgı küçük RNA regulatörleri bulunmuştur. ColE1 ile yapılan çalışmalar sırasında Antisense RNA lar hakkında önemli bulgular elde edilmiştir. Bu plasmidde DNA replikasyonu Replikasyon orjininden başlar ve RNA primerleri açılan RNA çift iplikleri ile hibrit oluşturur. DNA polimeraz, RNA primerlerine bazları ilave ederek orjini içeren iplige komplementer olan yeni bir DNA ipligi sentezlemektedir. Sense ve antisense iplikleri komplementer olduklarına gore sense RNA primeri ve antisense RNA molekülleri de birbirlerine komplementer olup hibrit oluşturabilirler. Böylece dublex RNA primerleri plasmidin orjini ile eşleşemeyecekleri için DNA replikasyonu başlayamayacaktır. Antisense RNAların yapısı Doğal olarak bulunan antisense RNAlar 35-150 nukleotid arası uzunlua sahiptir ve 1-4 arasında steem-loop yapısı içerirler. Etkili antisense RNAlar 8 nukleotidli G-C bakımından zengin ilmekler içerirler. Hem gövde hem de ilmek yapısı stabilize olma durumu açısından önemlidir çunku komplementer RNA ile hızlı etkileşim için yapı iskeleti oluşturur. Ve sense ve antisense etkileşiminin bozulmasına karşı yapıyı korur. Antisense RNAların etki mekanizmalrı antisens oligonükleotidlerinkine çok benzer. Antisens RNA ların etki mekanimaları şöyldedir. antisens, RNA transkripsiyonun inhibe eder. RNA splicing ve mRNAnın nükleustan dışarı taşınımını bloke eder. Translasyonu inhibe eder. Hedef mRNA ya bağlandıktan sonar RNAaz 3’ü indkleyip çift iplikli RNAnın bozulmasını sağlar. Kalıp DNA dan oluşan antisens RNA lar plasmid ve viral vektörler ile taşınırlar. Bu hususta anrisens RNA lar antisens oligonükleotidlere gore daha avantajlıdırlar. Çünkü kendi kalıpları etkili bir şekilde hedef hücreye viral vektörler ve diğer yollarla alınırlar. Aktif formları hücre içinde farklı promotorlar tarafından kontrollü bir şekilde oluşturulur. PROKAROTLARDA ANTİSENS RNA ARACILI REGÜLASYON SİSTEMLERİ Plasmid sistemleri Primer oluşum inhibisyonu Rep translasyonu için gerekli olan lider dizinin sentezinin inhibisyonu Plazmidin konjugasyon ve post segregasyon killing proseslerinin kontrolü transpozon sistemleri faj sistemleri Antisens Oligonükleotidler: Anitsense oligonukleotidler genellikle 15-20 nukleotid içeren ve hedef m-RNA ya kopmlamenter olan sentetik dizilerdir. 1970 yıllarında Zamecnik ve Stephenson tarafından gösterilmiştir. Bu araştırmacılar Rous Sarcoma virusün (RSV) 35SRNA’ sının 5’ ve 3’ uçlu nükleotid sekansını kullanarak viral integrasyonda önemli olarak görünen 21 nükleotidlik tekrarlayıcı sekansları identifiye etmişler ve viral sekansın bir kısmına komplementer olan d( AATGCTAAAATGG ) 13 mer’ lik oligonükleotidi sentezlemişlerdir. Bu sentetik oligonükleotid sekansı RSV ile enfekte olmuş fibroblast hücre kültürlerine verildiğinde, viral üretim büyük ölçüde inhibe olmuştur. Böylece araştırmacılar önemli sekanslara hibridize olarak onları bloke eden oligonükleotidlerin viral integrasyonu inhibe ettiği sonucuna varmışlardır. Hücreye verilen bu oligonükleotide “hibridon” adı verilir Antisens oligonükleotid aktivitesine katkıda bulunan başlıca 2 mekanizma vardır : Bir çok antisens oligonukleotid RnaseH enzimini active ederek active edecek şekilde dizayn edilmiştir. RNaseH; DNA-RNA heterodublexinin RNA kısmını keserek hedef m-RNA nın bozulmasını sağlar. Rnase H kesimini teşvik edemeyen oligonukleotidler şse translasyonun ribozonlar tarafından bloke edilmesinde kullanılırlar. Anitsense oligonukleotidlerin etkililigi : Oligonukleotidler de antisens RNAlar ile aynı etki mekanizlarına sahiptir. Fakat bazıe eksik yanları vardır. Bunlar ; Dagıtım özgüllüğü eksiktir In vivo da stabil kalamazlar Karaciğer ve böbreklerde birikime yol açarlar Düşük hücresel alınım vardır. Hücreler içindeki etkili konsanstarasyonlar kısa süreli muhafaza olurlar. Antisense Oligonukleotid Tipleri : Birinci Tip oligonukleotidler : m-RNA ya bağlanarak RnazeH aktivitesi ile translasyonu engeller. İkinci Tip oligonukleotidler : Ribozim aktivitesi ile Trasnlasyonu engellerler. Üçüncü Tip oligonukleotidler: DNA ç,ft sarmalına bağlanarak üçlü sarmal oluşturur ve Transkripsyon engellenir. Antisense oligonukleotidler restrüksiyon endonucleazlardan nasıl korunur ? Birinci sınıf modifikasyon, DNA ve RNA nükleotidlerindeki baz veya fosfat bağlarının değişimidir. DNA nükleotidlerinde olmayan, RNA nükleotidlerindeki 2’(OH) hidroksil grubu olan ( Riboz ) modifiye edilebilir. Bu modifikasyon, nukleaz degredasyonuna karşı bir tür kamuflajdır. Oksijen atomundan birini sülfür ile yer değiştirmişlerdir. Bu modifikasyon insan serumunda 10 saatin üzerinde nükleazlara karşı dayanıklı bir şekilde kalmış, aynı sekansa sahip modifiye olmamış oligonükleotid ancak 1 saat kalabilmiştir. İkinci sınıf modifikasyon, Riboz şekerinin 2’ pozisyonundaki alkil modifikasyonlar içeren RNA nükleotidleridir. Bu modifikasyonların en önemli ikisi, 2’-O-metil ( OMe ) ve 2’-Ometoksi- etil ( MOE ) RNA’ larıdır. Modifikasyona uğramış antisens oligonükleotidlerin hibridizasyon afinitesi arttırılmış 3.sınıf modifikasyonlar ile hibridizasyonda termal stabilite artmış ve hedefin tanınması zenginleşmiştir. Bu tipler arasında ençok bilinen PNA’dır (1991). Şeker fosfat bağları poliamid bağları ile tümüyle değişmiştir. Bu oluşumlar stabiliteyi arttırıcı ve yüksek hibridizasyon kinetiği sağlarkan, hücreye verilimi ve RNAaz H kesim mekanizması için elverişli değildir. RNA İNTERFERANS (RNAi) RNAi, bitkilerde, solucanlarda, mayalarda ve insanlar arasında yüksek oranda korunmuş, doğal olarak oluşan biyolojik bir prosestir. Hücre içinde iki bölümden oluşan bir yol izine sahiptir. Hücrede oluşan öncül dubleks RNA molekülü ilk olarak, Dicer endonukleaz ile 21- 23 nükleotidlik kısa fragmentlere ayrılır. siRNA (short interfering RNA) olarak bilinen bu effektör RNA’ lar, RNA uyarıcı protein kompleksi ile etkileşir ( RNA inducing silencing protein compleks; RISC ). Bu protein kompleksi, siRNA’nın bir ipliğini lider sekans olarak kullanarak, hedef homolog RNA’ları kesmektedir. Bitkilerde, RNAi hücre savunmasında rol oynar; virus infeksiyonundan, transpozonlardan (sıçrayıcı gen) ve tekrarlayıcı sekansların uygun olmayan ifadelenmesinden, hücreyi korumaktadır. Memeli hücreleri de benzer savunma sistemine sahiptir. Hazırlayanlar Orçun GÜNGÖR Zübeyde HANOL KAYNAK: reptile.fisek.com.tr/5.pdf

http://www.biyologlar.com/antisens-teknolojisi

PİNEAL BEZ (Epifiz. Gl.pinealis)

Pineal bez, beyin yarımkürelerinin arasında, diencephalonun tavanında yerleşmiş, konik-çam kozalağı şeklinde küçük bir organdır. 7x5x4 mm boyutla­rında.100-180 mg ağırlığındadır. Pineal bez, karmaşık bir polinöronal yol izleyerek-retina üzerine düşen çevresel ışığa ait bilgileri alıp buna cevap vermektedir .Tartışmalı olmakla beraber, ışıkla ilgili sinyalleri endokrin sinyallere dönüştüren nöroendokrin transduser olarak kabul edilir. Epifiz bezindeki pinealositler tarafından salgılanan melatonin ve seratonin adenohipofiz, nörohipofiz, endokrin pankreas, adrenal korteks, adrenal medulla, paratiroid ve gonadlar üzennde genellikle inhibitor etki yapar. Karanlık pineal bezde aktivite artırıcı rol oynarken, .aydınlık azaltıcı rol oynamaktadır. Pineal bezdeki aktivite artışı, etkilediği iç salgılı bezlerde aktivite azalmasına neden olur. Pineal bezin ayrıca uyku periodu, vücut ısısının ayarlanması, metabolizma, immün sistem, tümör büyümesi (inhibisyon), lokomotor aktivite, beyin transmitter metabolizması vb. daha birçok fonksiyonda rol oynadığı ileri sürülmektedir.

http://www.biyologlar.com/pineal-bez-epifiz-gl-pinealis

HÜCRE SİKLUSU VE KANSER

Hülya CABADAK Marmara Ün. Tıp Fakültesi, Biyofizik AD, İSTANBUL, TÜRKİYE Anahtar Kelimeler: Hücre siklusu, siklinler, siklin bağımlı kinazlar, tümör baskılayıcı gen, kanser Organizma/organ/doku gelişimi, hücrelerin büyüme ve çoğalmalarını içerdiği gibi hücre ölümlerini de sağlar. Hasarlı dokuların onarımı somatik hücrelerin ve destek dokunun çoğalması ile gerçekleşmektedir1. Hücre büyümesi, farklılaşması ve çoğalmasında rolü olan proto-onkogenlerde meydana gelen mutasyonlar tümör gelişimine, tümör baskılayıcı genlerde meydana gelen mutasyonlar ise hücre siklusunun inhibisyonunu engelleyerek anormal hücre büyümesine neden olur2. Homeostasis; hücre çoğalması, büyümenin durdurulması ve apoptozis (programlı hücre ölümü) ile sürdürülmektedir2. Hücre büyümesi ve ölüm arasındaki dengenin bozulması hiperplazi veya neoplaziye neden olur1. Pozitif veya negatif uyaranlar genetik lezyona yatkın hücrelerde, malign çoğalmaya neden olabilir. Malign gelişimi en aza indirmeye yardımcı mekanizmalardan birisi nekrozdur. Nekroz (kontrolsüz hücre ölümü) hücre şişmesi ve hızlı dejenerasyon olarak tanımlanır. Apoptozis, nekrozdan farklı olarak fizyolojik koşullarda meydana gelen ve doku homeostazisini sağlayan ölüm şeklidir. Programlı hücre ölümü apoptozisin normal hücre döngüsünde ve fizyolojik süreçlerde rolü vardır. Apoptotik hücrelerde hücre büzülmesi, kromatinin kondanse olması, sitoplazmik tomurcuklar ve apoptotik cisimciklerin oluşumu gibi morfolojik değişimler meydana gelir3. Makrofajlar apoptotik hücre ve cisimciklerini fagosite eder. Doku zedelenmesinde ilk etmen reaktif oksijen türevleridir. Reaktif oksijen türevlerinin hedefleri plazma zarında ve diğer hücre kompartmanlarında bulunan proteinler, lipidler, karbohidratlar ve nükleik asitlerdir3. Son yıllarda nekrozun da programlanmış olabileceği ve organizma homeostasis mekanizmalarının bir parçası olduğu yönünde görüş oluşmakla birlikte daha yaygın olarak nekroz indüklenmesi olası tedavi mekanizması olarak değerlendirilmektedir. Nekrozda ölen hücrelerden HMGB1 (High mobility group protein B1) ve HDGF (hepatoma derived growth factör) gibi moleküllerin salınımının immün cevabı uyardığı veya yara onarımını aktive ettiği düşünülmektedir4. Apoptozis, normal hücre ölümünün yanısıra mutant hücre çoğalmasını önleyen önemli bir yoldur. Hücre siklusu ve apoptozisde çok sayıda protein ikili rol oynar. Çevresel faktörlerle meydana gelen DNA hasarı hücre siklus kontrol mekanizmalarının bozulmasına neden olur. Pek çok kanser tipinde hücre siklus kontrol noktalarında mutasyonlar belirlenmiştir2. Büyümenin durdurulması (growth arrest), DNA onarımı ve apoptozis’in engellenmesi kanser gelişiminde kritik yolaklardır.5 Tümör baskılayıcı genlerde mutasyonlar hasarlı hücrelerin hücre sikluslarının ilerlemesine ve tümör gelişimine neden olur2,6. Genomun gardiyanı olarak da tanımlanan p53 proteini karmaşık etkinliklere sahip ve hücre siklusunu baskılayan bir proteindir2. p53, hücre döngüsünü düzenleyen bir transkripsiyon faktörüdür. Birçok organizmada kanserin baskılanmasında rolü olan çok önemli bir proteindir. p53 proteini hücre büyümesinin durdurulması, programlanmış hücre ölümü, hücre farklılaşması ve DNA tamir mekanizmasının başlatılmasında da rol alır. p53, mutant hücre çoğalmasına karşı genomun korunmasında önemli rol oynar2,6. 1.NORMAL HÜCRELERDE HÜCRE SİKLUSU Sürekli bölünen hücrelerde mitozdan sonra siklus G1-S-G2 (interfaz) ve M (mitoz) şeklinde tekrarlanır. Bu süreçte hücre uyarımı ve büyüme meydana gelmekte veya bölünme sinyali almadıkları sürece istirahat fazı G0 da durmaktadırlar2,7 . G1, S, G2 fazları (Interfaz) hücre siklusunun %90’nını kapsar ve 16-24 saat sürer. Mitoz bölünme ise 1-2 saat sürmektedir. Hücre büyümesi G1 fazında kısıtlayıcı nokta (R point) tarafından koordine edilir. Kısıtlayıcı noktada hücre duracak veya hücre siklusunu tamamlayacaktır7,8. G1 fazında hücreler kendi çevrelerini kontrol eder, sinyalleri alır ve büyümeyi indükler. Bu fazda DNA sentezi (replikasyonu) için hazırlık yapılır. RNA ve protein sentezi olur. S fazında ise DNA sentezlendikten sonra, G2 fazında hücre büyümeye devam eder aynı zamanda RNA sentezi, protein sentezi gerçekleşir ve hücre mitoza hazırlanır. Mitoz; profaz, metafaz, anafaz ve telofazdan oluşmaktadır. Telofazda sitoplazmik bölünme tamamlanır ve aynı genetik materyalli iki yeni hücre meydana gelir. Hücre siklusunda bir faz tamamlanmadan sonraki faza geçilirse genetik materyal tam ve doğru kopyalanmadığı için hücrede hasar meydana gelebilir. Hücre siklusunda G1-S geçişinde, G2-M geçişinde ve metafaz-anafaz geçişinde kontrol noktaları vardır. Bu kontrol noktalarında hücrenin siklusa devam edip etmeyeceği kararı verilir7. Radyasyon veya toksinle muamele edilen hücrelerde DNA’da meydana gelen hasara göre hücre siklusu kontrol noktaları G1 den S fazına veya G2’den mitoza geçişi engeller. DNA’da meydana gelen hasar DNA sentezini de inhibe edebilir. DNA’sı replike olmamış hücrelerde mitoza giriş kinaz komplekslerinin inaktivasyonu ile engellenir7. Hücre siklusunda iki tip gen grubunun rolü vardır: Onkogenler (Her 2, lneu, ras,c myc vb) ve tümör baskılayıcı genler p53 ve Rb (Retinoblastoma geni)9. Onkogenler, kanser gelişimini doğrudan ve dolaylı olarak etkileyen gen grubudur. Tümör baskılayıcı genler ise kanser gelişimini baskılar1. p53 geni işlevini kaybederse hücre büyümesinin kontrolü ortadan kalkar ve DNA tamiri olmadan hücre siklusu kontrolsüz devam eder. Normal hücrelerde DNA hasarı olduğunda, p53 genomik kararlılığı sağlar ve hücre siklusunu G1’de inhibe eder ve hücreye tamir için zaman kazandırır. Hasar tamir edilemiyorsa hücre apoptozise gider7,9 . Hu W ve ark. farelerde p53 ve onun düzenleyicileri Mdm2’nin embriyo implantasyonunda da rolü olduğunu ileri sürmüşlerdir10. Normal hücrelerde Rb hücre siklusunu G1 fazında inhibe eder. Retinoblastoma ve osteosarkom tümör hücrelerinde Rb gen inaktivasyonu gösterilmiştir. Büyüme uyarısı, hücreden büyüme faktörlerinin salınımı ile başlar. Büyüme faktörleri hücre zarında özgün reseptörlere bağlanır ve sinyaller sitoplazma proteinlerine iletilir. Bu sinyaller çekirdekte transkripsiyon faktörlerinin salınımına ve hücrenin hücre siklusuna girmesini sağlar4,11. Hücre siklus saati hücre siklusunun ilerleyip ilerlemeyeceğini belirler veya hücreyi ölüme yönlendirir8,9. 1-1. Hücre siklus kinazları Hücre siklusu siklinler (cyc=cln), siklin bağımlı kinazlar (cdk) ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri (CDI) tarafından kontrol edilir. Bu proteinlerin düzeyleri hücre siklusunun farklı fazlarında farklılıklar gösterir. Siklin bağımlı kinazlar G1-S-G2 ve mitoza geçişi kontrol eder.2,7,9 Memeli hücrelerinde hücre siklusunun düzenlenmesinde işlevleri en iyi bilinen onbir tane siklin bağımlı kinaz (cdk 1-11) ve 16 siklin (siklin D (D1, D2 ve D3); siklin E (E1, E2), siklin A (A1, A2) ve B (B1, B2) rol oynamaktadır (Tablo 1)2,7,9,11,12. Siklin D, E, G1/S fazlarının sınırında geçici olarak sentez edilir ve hücre S fazına girdiğinde hızla yıkılır, Siklin A ve B, S/G2/M faz geçişlerinde sentezlenir, siklin A1 mayoz ve embryogenesis de, siklin A2 çoğalan vücut hücrelerinde bulunur. Siklin B1’in siklin B2’nin fonksiyonlarını kontrol ettiği düşünülmektedir12. Cdk’lar protein fosforilasyonu yapan enzimlerdir. Cdk aktivitesi DNA sarmalının açılması içinde gereklidir. Replikasyon öncesi kompleks’in (PRC: Prereplicative compleks) birkaç bileşeni fosforile olur. Yeni replikasyon orijinleri mitozun sonunda cdk aktivitesi düşene kadar yeni PRC kompleksleri oluşturamaz. Bundan dolayı her hücre siklusunda DNA bir kez replike olur13,14. Cdk’lar siklin’e bağlandığında aktifleşerek aktif siklin-cdk komplekslerini oluştururlar. Siklinler bu komplekslerin düzenleyici alt birimleri, cdk’lar ise katalitik alt birimleridir15. Cdk, siklin (yapısal proteini) ve kinaz (enzim)inden oluşmaktadır9. Herbir cdk katalitik altbirimi farklı düzenleyici altbirimle biraraya gelebilir. Hücre siklusu boyunca kinaz komplekslerinin aktivite düzeyi değişir. Bu nedenle hücreler DNA’larını bir kez replike eder ve kromozomların yavru hücrelere uygun dağılımı sağlanır. Siklin-siklin bağımlı kinaz komplekslerinin (cyc-cdk) düzenlenmesi, cyc altbiriminin hücredeki konsantrasyo-nuna, fosforillenme durumuna ve inhibitör moleküllere bağlıdır. Siklinler hücre siklusunun farklı fazlarında bir taraftan sentezlenirken diğer taraftanda yıkılırlar. Memelilerde Cdk 2, Cdk 4 ve Cdk1(cdc 2)’in, siklin D, E, A ve B ile birlikte ekspresyonu olmaktadır2,9 . Siklin E ekspresyonu E2F transkripsiyon faktörlerine bağlıdır16,17. Herbir siklin özgün olarak belirli bir fazda en yüksek değere ulaşır, sonraki faza girerken hızla yıkılır. Siklinlerin düzeyleri transkripsiyon düzeyinde düzenlenir. Yıkımları ise ’ubiquitin’’ yolağı ile sağlanır Aktif cyc-cdk komplekslerinde cdk altbirimi Thr 161 amino asidinden fosforillenmişdir. Bu fosforilasyon cdk’yı aktive eden kompleks (cak)’ın aktivitesi ile meydana gelir18. Bir kez aktive olan cyc-cdk kompleksi, DNA replikasyonu ve mitozdaki birçok işlemin kontrolünde rolü olan proteinleri fosforiller. Protein kinazlarla cyc-cdk altbirimlerinin fosforilasyonu ile kinaz kompleksi inaktive olur7,9,11. Cdk’ların aktiviteleri sadece siklinlerle düzenlenmez ayrıca fosforilasyon ve defosforilasyona yol açan başka yollarla da düzenlenir. Siklin bağımlı kinaz inhibitörleri (CKI): Hücre siklus inhibitör proteinleri (CKI) cdk aktivitesini kontrol eder. Bu proteinler cyc-cdk kompleksi oluşumunu ve DNA replikasyonunu inhibe eder. CKI’lar hücre siklusunu frenlediklerinden tümör baskılayıcı genlere de adaydır. Etkiledikleri cdk ve inhibisyon mekanizmalarına göre iki farklı CKI ailesi vardır. Bunlardan ink 4 ailesinde p15, p16, p18, p19’ G1 fazındaki cdk4 ve cdk6’yı bağlayarak cyc-cdk kompleks oluşumunu inhibe eder (Şekil 2a). Cip/Kip ailesinde ise p21, p27, p57 bulunmaktadır. Cip/Kip ailesi cyc-cdk kompleksini inhibe etmektedir (Şekil 2b )2,7,9,11,12. G2 fazında siklin B cdk1(cdc-2)’in tam aktivasyonunu sağlayarak mitoza girişi tetiklemektedir (Şekil 2c)9,11,12. Genellikle, farklı kanser hücrelerinde hücre siklusunun G1-S fazını kontrol eden proteinlerin inaktif olduğu, G2-M fazlarını kontrol eden proteinlerde ise değişimin daha az olduğu belirtilmektedir1,2,19. 1-2. Normal hücrelerde G1-S geçişi Büyümeyi uyaran sinyaller G1 fazı başlangıcında siklin D düzeyini sonraki evrede ise siklin E artışına neden olur (Şekil 3)2,9,11,12,20. Kısıtlayıcı noktada (R point) büyüme inhibitör faktör (Rb, Retinoblastoma) hücrenin S fazına girip girmeyeceğini belirleyen anahtar gibi rol oynar7,4,8,9,11,21. Kısıtlayıcı nokta geçilirse hücre DNA sentezinin olduğu S fazına girer. DNA sentezi sırasında iplikçiklerin birbirinden ayrılması ile DNA hasara çok duyarlı hale gelir ve bu nedenle S fazı hızlı geçilir4. Hücre siklusunun ilerlemesi Rb proteininin fosforillenmesi ile belirlenmektedir22. Az fosforillenmiş (Hipofosforile) Rb E2F transkripsiyon faktörünü bağlıyarak inaktifleştirir11,23,24. E2F’nin inaktifleşmesi sonucu hücre S fazına ilerleyemediğinden siklus durur. İstirahat halindeki (Go fazında) hücre bölünme sinyali aldığında hipofosforile Rb G1 fazının sonuna doğru cyc’nin cdk ile birleşmesi ile cyc-cdk kompleksini oluşturur ve bu kompleks Rb proteinini fosforiller7,11,24. Fosforillenen Rb proteininden E2F salınır, E2F ‘nin siklus ilerletici etkisi ile S fazına giriş için gerekli genlerin transkripsiyonu aktive olur ve hücre S fazına girer6,9,11,12,18,19,24-26. Hücre siklusunun S fazına geçişini G1 fazında aktive olan siklinler sağlar. Go fazında bu siklinlerin çoğunun ekspresyonu olmaz. G1 cyc-cdk kompleksleri transkripsiyon faktörlerini aktive etmektedir. Büyüme faktörleri, otokrin uyarım, lektinlerle mitojenik uyarım veya Ras yolağı gibi hücre içi sinyal yollarında mutasyon, hücrelerin tekrar G1 fazından siklusa girmelerini uyarabilir9,27. İstirahat halindeki hücrelerde, başlangıçta mRNA’sı stabil olmayan siklin D az miktarda bulunur. Go’da büyüme faktörleri ile uyarım, siklin D sentezini ardından siklin E’nin birikimini uyarır.20 Büyüme faktörleri olmadığında siklin D düzeyi hemen düşer1,7,11,20. Embriyonik hücrelerde siklin E düzeyleri devamlı yüksektir28. Hücre siklusunda Rb aktivitesi ICBP90 transkripsiyon faktörü ile protein düzeyinde düzenlenebilir29. G1-S geçişinde, büyüme faktörlerine cevap olarak siklin D düzeyi artar. Siklin D artışı ile siklin D-cdk 4(cdk 6) kompleksi oluşur. Siklin D ve cdk 4‘ün ve de onların aktif komplekslerinin birikimi p16’nın inhibitör rolünü ortadan kaldırır ve Rb (retinoblastoma gen) fosforillenir24,30. Az fosforillenen Rb, E2F transkripsiyon faktörün inaktivasyonuna neden olan histon deasetilaz (HDAC) enzimine bağlanır31. Rb’nin fosforillenmesi S fazının başlaması ve ilerlemesi için gereken genlerin geçici olarak aktivasyonunda rolü olan E2F transkripsiyon faktörün baskılanmasını kaldırır. G1 de siklin E -cdk2 kompleksi (MTOC) mikrotübülleri organize eden merkezin iki sentromere dublikasyonunu aktive eder32. Siklinlerin uyarıcı etkileri CDK inhibitörleri CKI tarafından önlenmektedir. G1/S fazı geçişi için önkoşul CKI ların baskılanmasıdır. Örneğin hücre siklusuna giriş için siklin D1 düzeyinin yükselmesi yeterli değildir. ERK (extracelllular signal regulated kinase) aktivasyonu da geç G1’de cdk’ların aktivitesini artırmak için birkaç aşamada rol oynar. ERK aynı zamanda CKI’ların inhibisyonunda da rol oynamaktadır33. G1 fazı boyunca hücre çoğalmasını engelleyen birçok genin baskılanması için ERK’in sürekli aktivitesi gereklidir. Tek başına ERK aktivasyonu hücre siklusuna girişi sağlama- ya yetmez. Vücut hücrelerinde ERK, hücre siklusunun G2/M fazında aktive olur. Metafazda tutulan hücrelerde ERK fosforillenmemiş durumdadır33. Eş zamanlı çoğalan (senkronize) HeLA ve NIH 3T3 hücrelerinde ERK’in aktivasyonunun S fazının sonuna doğru meydana geldiği ve mitoz sonuna kadar aktif halde kaldığı belirlenmiştir. MEK (MAPK kinaz) inhibitörleri ile ERK aktivasyonu bloke edildiğinde mitoza girişin geciktiği ardından metafazdan anafaza gecikmeli geçişin mitoz süresinin uzamasına neden olduğu belirtilmektedir34. G2/M geçişinde ERK inhibe edildiğinde M faz süresi iki kat artar. ERK aktivasyon yolakları henüz tam olarak anlaşılamamıştır33. Genellikle normal hücrelerde p53, MDM2 proteinine bağlı olarak inaktiftir. p53 ubiquitin ligazla yıkıma uğradıktan sonra aktive olur. Aktive olan p53, p21 ekspresyonunu aktive eder. p21 G1-S (cdk) ve S (cdk) komplekslerine bağlanarak onları inhibe eder ve hücre siklusu durur. Siklusun durması hücreye tamir için zaman kazandırır. Radyasyon ve ilaç gibi hücrenin strese maruz kaldığı durumlarda DNA hasarı olursa, hücre bu uyarıya p53 düzeyini artırarak yanıt verir. p21’in aktivasyonu sağlanarak G1 kontrol noktasında Rb proteinin daha fazla fosforlanması önlenerek hücre siklusu durdurulur. p21 siklin-cdk kompleksini inhibe etmesi yanında “proliferating cell nuclear antijen (PCNA)i de inhibe eder35. Timidin ve metotoraksat (methotraxate) gibi ilaçlar hücre siklusunun ilerlemesini engeller36. 1-3. Normal hücrelerde G2-M geçişi Hücreler DNA sentezinden sonra G2 fazına girer. Siklin B-cdk1 kompleksinin aktivitesi artar, mitoza giriş uyarılır9,19,37. Siklin B-cdk1 kompleksi mitozu ilerleten faktör (MPF) olarak da isimlendirilmektedir. Geç S fazında siklin B sentezlenmeye başlar ve sentez mitoz boyunca devam eder, mitoz tamamlandığında siklin B düzeyi hızla düşer. Bu düşüş aktif MPF kompleksinin oluşmasını ve ikinci hücre bölünmesini engeller. Siklin B düzeyi sitoplazma ve çekirdek arasında aktif taşınımla düzenlenir. İnterfaz (G1,S,G2) aşamasında siklin B sitoplazmadadır. Mitoz başlangıcında siklin B cdk 1’e bağlanarak aktif MPF kompleksini oluşturur. İnhibe edici fosforillenme aynı zamanda MPF aktivitesi-ni düzenleyebilir. cdk1 altbiriminin ikinci kez fosfofosforilenmesi siklin B-cdk1 kompleksi-ni inaktive eder. Wee 1, nükleer protein kinaz, çekirdekte MPF kompleksini inaktive ederek erken mitozu engeller11,20,38. Wee1’ın cdk1 altbiriminin ATP bağlama bölgesini fosforillemesi ile MPF kompleksi inaktive olur. Myt 1, Golgi aygıtında lokalize olan protein kinazdır. Myt 1, cdk1’i fosforiller ve interfazda onun siklin B ile bağlanmasını düzenler11,20. Cdc25, cdk’lardan inhibe edici fosfat gruplarını kaldıran fosfatazdır. Cdc 25 hücre siklusunun çeşitli fazlarına ilerlemeyi kontrol eder39. Bu aşama mitoza girişte hız sınırlayıcı basamaktır. cdc25b proteininin G2 fazında birikimi ilk MPF aktivasyonunda kritik rol oynar. cdc25c protein düzeyi hücre siklusunun bütün fazları boyunca sabit kalır. G2-M geçişinde, cdc25c çekirdekte birikir ve mitoz başlangıcında MPF komleksini aktive eder. DNA’sı replike olmamış hücrelerin mitoza girişi MPF kompleksinin inaktive olması ile önlenir11,20,40. G1 fazını geçen hasarlı hücreleri ortadan kaldırmak için G2 fazı kontrol noktalarında siklin-cdk-CKI sistemi gereklidir11,20. Bu kontrol noktası sağlam olmayan kromozomların ayrılmasını önler5. G2 fazında, S fazında replike olmuş DNA ve kromatin proteinleri kondanse olur ve kardeş kromatidler olarak paketlenirler. Mitozun metafaz aşamasında kromozomlar ekvator plağına dizilir, ardından kutuplara çekildikten sonra iki yavru hücreye bölünür. Sentro-merler mikrotübüllere bağlanamazsa mitoz gecikir. Bu olaylarda siklin B-cdk1 gereklidir. Siklin B-cdk1 kompleksi aynı zamanda (MPF) M fazının ilerlemesinde de anahtar rol oynar. Marumato ve ark. siklin B-cdk1(cdc-2) aracılı fosforilasyonla indirek olarak aurora-A’nın aktive olduğunu bildirmişlerdir41. Siklin B-cdk1 (cdc-2) çekirdeğe girişte gereklidir. Aurora A’nın aktivasyonu nükleer translokasyonu sağlar ve siklin B cdk1(cdc-2)’nin tam aktivasyonu mitoza girişi tetikler. Çeşitli kanser tiplerinde Aurora A’nın fazla eksprese olduğu belirlenmiştir5,11,20,41,42. 1-3-1. DNA’sı hasarlı hücrelerin G2-M geçişi DNA hasarından sonra, G2 bloğunun olması için cdk 1 defosforillenmesinin inhibisyonu gereklidir9,43. DNA hasarı, cdc-25c’yi fosforilleyen chks1 ve 2 protein kinazların aktivasyonunu sağlar. Fosforillenen cdc-25c, 14-3-3 proteinlerine bağlanarak çekirdekten sitoplazmaya taşınır. cdc25c çekirdek içinde bulunursa, siklin B-cdk1 kompleksini aktive eder. Bunun yanısıra siklinB-cdk1 kompleksin aktivitesine gereken çekirdek içindeki cdc25c miktarının yetersiz olmasından dolayı G2 blok aktive olur. Aynı zamanda p53 de G2-M geçişinde rol oynayabilir9. DNA hasarında p53 stabil kalmakta ve 14-3-3 trans-kripsiyonel olarak aktive olmaktadır. Aktive olan 14-3-3 fosforillenmiş cdc 25c’e bağlanır ve kompleksi sitoplazma içinde tutar, böylece mitoza geçişe uygun aktif siklin B-cdk1 kompleksi azalır11. p21 ve p53 ikinci tur DNA sentezi yapmış fazla DNA’lı hücreleri G2 ve M fazında engeller5,39. p53, G2’ye girişi inhibe eden 14-3-3 gen transkripsiyonunu artırarak bu geçişi önlemektedir. 14-3-3 cdc25c fosfatazla birleşir ve bu kompleks cdc25c’nin çekirdeğe girişini inhibe ederek DNA ‘yı bloke eder9,11. 1-4. Normal hücrelerde mitoz iplikçik kontrol noktası Mitoz iplikçik kontrol noktası metafazdan anafaza geçişi düzenler.2,7,11,20,44-46 Bu kontrol noktası bütün kinetokorlara uygun mikrotübül bağlanmasını kontrol eder ve kinetokor gözetiminde uygun kromozom ayrılmasını sağlar. Mitotik siklinlerin yıkımından sonra anafaz başlar. Mitotik siklinler ubikuitinlendikten sonra proteozomal yıkım olur. Mitotik siklinlerin yıkımı siklinB-cdk1 kompleksini inaktive eder ve bu inaktivasyon mitozun normal bitmesini sağlar7,11. Mitoz iplikçik kontrol noktası olgunlaşmamış kardeş kromatidlerin ayrılmasını engeller. Bu kontrol noktasında rolü olan genler, MAD1L1, MAD2, MAD2L1, MAD2B, BUB1, BUBR1, BUB3, TTK, MPS ve CDC20’ dir. Bu genler hücre siklusunun kontroluna katılır. Mayadan insana kadar MAD ve BUB proteinleri korunmuştur. BUB ve MAD gen ürünleri kinetokor gözetimi ve anafaz düzenlenmesi için gereklidir. MAD proteinleri doğru kromozom ayrılmasını, BUB gen ürünleri ise mitozun ilerlemesini düzenler47. Drosophila Melonogaster, C.elegans ve farede mitoz iplikçik kontrol noktasının tamamen kaybolmasının embriyon ölümüne neden olduğu gösterilmiştir7,9,11,48-50. DNA sentezinden sonra kohesin protein kompleksleri kardeş kromatidleri birarada tutar ve kromozomlar oluşur11,20,51,52. Mitoz iplikçik kontrol noktası anafaz promoting kompleksi (APC) düzenler. CDC20p APC’yi aktive eder ve pds1p ubiquitinlenme ile yıkılır. Pds1p’nin yıkılması ile separin Esp 1 aktive olur ve kohesin salınır, böylece anafazda kardeş kromatidler ayrılır. CDC20p’nin APC’yi aktive etmediği durumlarda kohesin salınmaz, kardeş kromatidler ayrılamaz ve anafazda inhibisyon meydana gelir10,53. CDC20’nin MAD2, BUBR1, BUB3 ile kompleks oluşturması anafaza girişi beklemeye alır. 2- Kanser ve kontrol noktası inaktivasyonu Gen mutasyonlarından dolayı G1-S geçişindeki değişimler kansere neden olabilir. Kanser hücrelerinin karakteristik özelliklerinden biri büyüme uyarımından bağımsız olarak G1 fazına tekrar girebilmeleridir. Rb fosforillenme/defosforillenme dengesizliği olduğunda, G1-S fazları arası geçişlerde olan değişiklikler hücrelerin çoğalmasını değiş-tirebilir. Rb gen mutasyonları insan kanserlerinden bazılarında (glioblastoma ve Retino-blastoma vb) tanımlanmıştır. Tümör virüsleri HDAC ile Rb’nin bağlanmasını inhibe edebilir. Siklin D’nin fazla eksprese olduğu bazı durumlarda ise E2F aktifleşmesinden sonra Rb inhibisyonunu sağlayan defosforillenme olmadığında S fazına hatalı ilerleme olabilir11. Kusurlu G1 siklin E-cdk2 kompleksi sentriollerin hatalı replikasyonunu uyarmaktadır11. Hücrede iki veya daha fazla sentriolün varlığı anafazda hatalı kromozom ayrılmasına neden olur. Bazı insan kanserlerinde sentriollerin fazla dublikasyonu da belirlenmiştir7,11. 2-1. DNA’sı hasarlı kanser hücrelerinde G1-S geçişi: Radyasyon v.b. etkenlere maruz kalan hücrelerde hücre siklusunda hatalar olmaktadır11,54. Örneğin Gama radyasyonuna maruz kalan hücrelerde fonksiyonel p53 geninin yetersiz olmasından dolayı bu hücreler G1’de tutulamaz ve S fazında hasarlı DNA’yı dublike ederek gen mutasyonuna ve/veya hatalı kromozom dizilimine neden olur11,54-56. Hücre çoğalmasını gen delesyonu, fazla gen ekspresyonu ve nokta mutasyonlar etkilemektedir. İnsan kanserlerinde farklı genlerde nokta mutasyonlar ve delesyonlar vardır19. İnsan kanserlerinde en sık görülen mutant gen p53’tür. Normal bir hücrede DNA hasarı olduğunda, p53 düzeyi artar ve hücre siklusunu G1 fazında inhibe ederek DNA onarımı için hücreye zaman kazandırır6,43,54. Hasar tamir edilemiyorsa hücre apoptozise gider43. Hasarlı hücrenin ölümü veya hücre siklusunda kalmasının nasıl sağlandığı tam olarak bilinmemektedir. p53 mutasyonlarında hücreler bölünmeye devam eder. Bu mutasyonlar sonucunda tümör baskılayıcı fonksiyonlarında kayıp olurken diğer yandan onkojenik fonksiyon ortaya çıkabilir11,15,20. Muskarinik reseptör agonist ve antagonistler varlığında çoğaltılan K562 hücrelerinde siklin D1 transkripsiyon seviyelerinin değiştiği belirlenmiştir57. Bellamy ve ark. 5 gray gama radyasyonunun fibroblastlarda büyümenin durmasına, aynı doz radyasyonun ince bağırsak kripto hücrelerinde ise apoptozise neden olduğunu göstermişlerdir5,22. p53 aynı zamanda cdk’ların inhibitörü p21 transkripsiyonunu artıra-rak da DNA hasarına yanıt verir7,11,20. S fazında eksprese edilen siklin A erken fazda cdk2 ile sonraki fazda cdc ile birleşir. Siklin-cdk kompleksi DNA sentezinin başlamasında rol oynar, cdk ekspresyonunun inhibisyonu ise hücre siklusunun durmasına neden olur6,9. ATM ( Ataxia Telengiectasia Mutant kinaz ) tarafından p53’ün aktivasyonu DNA onarımı ve apoptozisi koordine eden DNA hasar sinyal yollarına aracılık eder59. ATM çift iplik kırıklarına cevapta ve ATR (ATM ve Rad3 related) olarak adlandırılan kinaz diğer tip DNA hasarlarına cevapta önerilmektedir60. Hücre siklusunda ATM ve CHK2 ekspresyonu nispeten devamlı olmasına rağmen ATR ve CHK1 G1 fazının başında ve ortasında düşüktür. ATR ve CHK1 G1/S geçişine yaklaştıkça önem kazanır. ATM/ATR p53 transkripsiyon faktörünü fosforiller. ubiquitin kinaz,MDM2 p53’ün hızlı sirkülasyonunu sağlamaktadır61,62. Ayırıcı hedef mekaniz-malar hala açıklanamamıştır. p53‘le uyarılan G1 fazında duraklamada p21Cip1/Waf 1’in rolü vardır65. Aynı zamanda PCNA (proliferating cell nuclear antigen) inaktive olmaktadır. PCNA, DNA sentezini katalize eden, DNA tamirinde yer alan DNA polimeraz delta’nın kofaktörüdür. Sentezi hücre siklusunun geç G1 fazında baslayarak orta-geç S fazinda en yüksek değere ulasmaktadir43,59,60. p21, cyc-cdk kompleksini inhibe etmesi yanında PCNA’i de inhibe eder. Hücre siklusunun G1/S fazında durdurulmasında yeni belirlenen nükleer protein ICBP90’un p53/p21Cip1/WAF 1 aracılı yolaklarda hedeflerden biri olarak önerilmektedir22,43. İnsan Rad 9 ve Rad 17 proteinlerinin S fazı başlangıcındaki kontrol noktasında ve kromozom kararlılığının sürdürülmesinde önemli olduğu belirlenmiştir37. Rad 9’un ATR kinazla büyük protein kompleksinin fosforillenmesine aracılık ettiği de önerilmektedir69. p53 ve Rb protein fonksiyon kaybının nedenleri mutasyon, delesyon veya diğer proteinlerle bağlanma olabilir25. Rb kontrolu kanser hücrelerinin bir çok tipinde bozulmaktadır. Rb kontrolunun bozulma nedeni Rb fosforillenmesinde rolü olan siklin ve cdk’larda onkojenik mutasyonlardır63. p53 fonksiyonu cdk 4 ve cdk 6 supressorlerinin fazla ekspresyonu ile baskılanır9,64. Genomda onkogenik lezyonlara p53 fonksiyonunun bozulması neden olur. Bunun nedeni p53’ün apoptozis öncesi düzenlenmesinin gerçekleşmemesidir25,41. Hücre siklusunda kontrolün kalkması p21, p27, p57 gibi p53’ün downstream genlerinde kusurlara neden olabilir. Cdk’ların ve siklin-cdk komplekslerinin aktivitelerini Cdk (p21, p27, p57)’nin inhibitörleri inhibe eder ve hücrenin S fazına girişini engeller4,5,6,7,11,22,25,26,65. Bazı tümörlerde cdk4 ve cdk 6’nın negatif düzenleyicileri olan p15 ve p16’nın mutant olduğu da rapor edilmiştir5,22,41,53. Tümör hücrelerinin bir kısmında cdc4 de kusurlar veya cdc4’ün ekspresyonunun fazla olmasından dolayı siklin E düzeyi normal değildir. Bazı tümör hücrelerinde siklin E-cdk2’nin negatif düzenleyicisi olan cdk inhibitörü, p27’nin kaybolduğu da belirlenmiştir56,60. 2-1-1. p53 aracılı apoptosis p53 ve Bcl 2, programlı hücre ölümünde anahtar rol oynayan genlerdir66. Normalde p53 hücre akibetini belirleyen moleküler ağı düzenler. cMyc (nükleer fosfoprotein) p53’ü seçici olarak aktive eder ve p53 apoptozisi başlatır2,5,22,43. Nükleer fosfo protein cMyc, Fas ligand ve Fas reseptörle birleşir. Bu proteinin p53 bağımlı ve bağımsız yolaklar ile sitokrom c salınımını indükleyen bax’ın transkripsiyonunu düzenlediği de düşünülmektedir6,65. Hasarlı hücrelerde fonksiyonel p53 yoksa, hücre siklusu kontrol noktaları tarafından kontrol edilmeden siklus ilerler5,9. p53’ün düzenleyici aktivitesini geçtiğini gösteren alternatif yol ise p53’un negatif düzenleyicisi Mdm 2 (murine double minute 2) dir. Mdm2 proteini, p53’ü kontrol altında tutar ve p53’ün G1/S geçişinde siklusu durdurmasını ve apoptozisi engeller. Radyasyon ve benzeri etkenlerle hücre etkilendiğinde Mdm2 proteininin p53’ bağlanma bölgesinde yapısal değişiklikler meyda-na gelir. Bu nedenle Mdm2 p53’ü bağlayamaz ve serbest p53 transkripsiyonel aktivitesi ile G1 ve G2 kontrol noktalarında siklusu durdurur ve bax genini aktive ederek apoptozise neden olur58. Mdm2, p53’ün transkripsiyonunu azaltır ya da p53’e bağlanarak aktivitesini inhibe edebilir. Lösemi, lenfoma, sarkoma glioma ve meme kanserinde Mdm2 gen amplifikasyonu gösterilmiştir2. Çok organize bir işlem olan apoptozis zararlı ve anormal hücrelerin yıkımını sağlamaktadır3,11,65. Apoptozis yolunda iki düzeyde mekanizma bozuklukları görülür: 1. Apoptozisi düzenleyen genlerde mutasyon ve bu nedenle apoptozise gitmeyen hücrelerin yaşamasıdır, 2. Apoptozise direnç geliştiren hücrelerin Darwinizm (doğal seçilim) ile seçilip yaşamaya devam etmesidir66. 2-1-2. Apoptozise karşı mekanizmalar: Bcl 2 hücre ölümünü inhibe ederek hücreyi apoptozise karşı korumaktadır21,66,67,68. Bu ailenin diğer üyelerinden Bcl-xL, mcl ve bag 1 hücre ölümünün inhibitörleri iken bad, bax ve bik apoptozisi ilerletirler3,67. GADD45 (a growth arrest and DNA damage (gadd)-induced gene) hücre siklusunun G2-M kontrol noktasında önemli rolü olan nükleer proteindir. Bu protein cdc2 proteini ile etkileşerek cdc2 kinaz aktivitesini inhibe etmektedir. cMyc, GADD45 ve cki genleri p15, p21, p27’yi baskılayarak hücre büyümesini sağlar2,7,9. Yaşam faktörleri olmadığında c-Myc onkogeni hücreleri apoptozise götürür68,69,70. Apoptozis öncesi ve sonrası olaylar tamamen açık değildir. Bcl-2 mitokondrinin dış zarında bulunur ve mitokondriden sitokrom c salınımını bloke eder56,70. Sitokrom c kaspazları aktive ederek apoptozisi indüklemektedir3,5,36,67. Bcl-2’nin ekspresyon düzeyi apoptozisi belirleyen faktörlerden birisidir. Bcl-2 ekspresyonu fazla olan hücreler hücre ölümünden kaçabilir30,65. Antiapoptotik Bcl-2 üyeleri kaspaz aktivasyonunu önleyerek antiapoptotik etki gösterirler. Bazı çalışmalarda Bcl-2 çok yüksek bulunmasına rağmen hücre ölümünün arttığı da gösterilmiştir7. NF-kB transkripsiyon faktörünün Bcl-2 ailesini up-regule ettiği bilinmektedir. Bcl-2 aynı zamanda Ras2’nin antiapoptotik aktivitesini de düzenler.2 Bcl-2’nin diğer düzenleyici mekanizması, bax gibi büyüme düzenleyicilerinin aktivitesini inhibe ederek apoptozisi engellemektedir2,7,25,43,67. 2-1-3. Apoptozis kontrol noktaları Apoptozisin olup olmayacağını Bax ve Bcl-2 dengesinin doğruluğu belirler7,62. Hücrelerin apoptozise gitmesi için Bax düzeyinin Bcl-2’den fazla olması gerekir4,5,9,25. Bu mekanizma apoptozisde kontrol noktası 1 olarak önerilmiştir 25,64 (Şekil 4). Yaban tip p53 varlığında Bcl-2 ekspresyonu az olan hücreler apoptozise gider5,71. Tersi olursa yaban tip p53 az, Bcl-2 fazla ise çok mutasyon olabilir. Bunun nedeni hücre proliferasyonunun aktive olmasıdır3,9,25. Bcl 2 ailesinin en büyük proteini Bcl-XL, Bcl-2’ ye benzer yolda hareket eder ve Bcl-2 aktivitesini baskılayan Bak apoptozise neden olur5,9,19,43,68,72,77. Apoptozis yolağında ikinci kontrol noktası çok iyi belirlenememiştir. Interlökin converting enzim (ICE) prokaspaz 1 olarak bilinmektedir. ICE DNA onarım enzimleri ile etkileşmektedir.9,25 Polyadenosin difosfat-riboz polimeraz DNA kırıklarını tanır ve DNA onarımına katılır. Nükleer membran proteini lamin A, PARP’ı parçalar ve apoptotik hücre morfolojisi meydana gelir. ICE ile PARP inaktive olursa, apoptozis başlar9,68. 2-2. Kanser hücrelerinde G2-M geçişi: Kanser gelişiminde ve/veya hastalığın ilerlemesinde G2-M geçişinde değişimlerin rol oynadığı belirlenmiştir. İyonize edici radyasyon Ku homoloğu olan protein kinazları, ataxia telegiectasia mutant (ATM) ve ATM ilişkili (ATR) genleri aktive eder74. Mayada yapılan çalışmalarda telomer idamesi ve DNA onarımı arasındaki bağlantı gösterilmiştir75. Ku, DNA kırıklarının onarımında homolog olmayan uçlar için gereklidir. Ku telomerik DNA’ya bağlanır ve G zengin dizilerin işlenmesine katılır. Telomer idamesinde rolü olan Ku, DNA’larında çift iplik kırığı olan hücrelerin G2-M geçişinde aktive olmaktadır76. Chk1 ve Chk2 protein kinazlar ilk olarak mayada gösterilmiştir. Bu kinazlar, DNA hasarı sonucu aktive olan hücre siklus kontrol noktalarında önemli rol oynamaktadır. Mutant Chk2 Li-Fraumeni sendromlu hastalarda bulunmuştur11,20,77. Chk2 tümör baskılayıcı gen olmaya adaydir. DNA hasarının ardından, Chk1 ve Chk2 yalnız G2 bloğunu uyaran cdc25c’yi fosforillemez; aynı zamanda stabilizasyon için p53 fosforilasyonunu da uyarır. Mikrotübül inhibitörlerinin yaban (wild) tip p53’lü fare embriyo fibroblastlarına verilmesi ile G2-M geçiş bloğu aktive olmaktadır bunun yanısıra mutant p53‘lü hücrelerde hücre siklusu durdurulamamıştır. Bu blok kromozomların ayrılması ve mitoz tamamlanmadan önce diğer S fazına geçişi önleyerek aneuploidiyi engellemektedir. Böylece mutant p53 uygun kromozom ayrılması olmaksızın tekrar tekrar döngüye neden olarak genomik dengesizliğe neden olmaktadır (örneğin aneuploidi). Bu cdk’ların aktivitelerinin inhibisyonu ile gerçekleşir11,20,35. Bu geçişin inhibisyonu p53’ün G2’ye girişi inhibe eden 14-3-3 geninin transkripsiyonunu artırmasıyla sağlanmaktadır. 14-3-3 cdc25c kompleksi, cdc 25c’nin çekirdeğe girişini engeller9,36. Memelilerde DNA hasarı sonucunda tetiklenen sinyal ileti kaskadında ATM ve ATR protein kinazların önemli rolleri vardır. chk1 ve chk2 bu kinazların kontrol noktası fonksiyonlarına aracılık etmektedir78. ATM ve ATR stress olmadığında aktive olmazlar, strese maruz kalınca aktive olmaktadırlar. ATM kinaz normal hücre siklusu ilerlemesinde veya hücre farklılaşmasında gerekli değildir79. 2-3. Kanser hücrelerinde mitoz iplikçik kontrol noktası Bazı araştırmacılara göre kanser gelişimini ve genomik dengesizliği mutasyon oranları ile açıklamak mümkün değildir11,12,80-82. Genomik dengesizlik somatik hücre gen mutasyonu veya aneuploidi gibi kromozom anomalileri içerebilir. Aneuploidi tümör baskılanmasında, hücre siklusunun düzenlenmesinde, sentrozom oluşumu ve fonksiyonunda, hücre büyümesi, metastaz ve metabolizmada bulunan çok sayıda genin dengesizliği olarak tanımlanabilir.11 Kanser gelişimi ve ilerlemesinde aneuploidilerde mitotik kontrol noktası içindeki MAD veya BUB genlerindeki mutasyonların rol oynayabileceği önerilmektedir7,44. Bu mutasyonlar mitotik kontrol noktası değişimine, metafazdan anafaza geçiş sırasında kromozomların yanlış ayrılmasına ve aneuploidiye neden olur. Bu tip mutasyonlar ilk olarak aneuploidi fenotipli olarak sınıflandırılan 19 kolorektum kanser hücre soyunda çalışılmıştır7,44. Ondokuz hücre soyundan ikisinde BUB1 geninde farklı mutasyonlar belirlenmiştir. Aneuplodili bireylerde hBUB1 geninde kalıtsal mutasyonlar bulunmuştur83. BUB1 üç fonksiyonel domain içerir: bunlar CD1, nükleer lokalize edici domain (NLS) ve kinaz domain (CD2)’lerdir. CD1 içinde çerçeve kayması ve anlamsız mutasyonlar bulunmuş, NLS veya CD2 domainlerinde ise mutasyon bulunamamıştır. Farklı araştırıcılar aneuploidi belirlenen kanserlerde BUB ve MAD genlerinde mutasyonlar bulmuştur7,83. Fakat bu mutasyonlar ile ilgili çalışmalar hala yetersizdir. İnsan kanserlerinde mitoz iplikçik kontrol noktaları hakkında bilinenler çok azdır. İnsan kanserlerinin çoğunda mutant MAD1’in kromozom instabilitesine neden olduğu belirlenmiştir11. Aurora kinaz ailesi hücre siklusunu G2/M kontrol noktasından sonra mitoz kontrol noktasında veya mitozun sonuna doğru rol oynar84-87. Aurora kinazlar hatasız hücre bölünmesi için gereklidir84. Aurora kinazların kromozom dizilimi, kromozom ayırımında ve sitokinesisde önemli rolleri vardır. Aneuploidi olan tümörlerde Aurora kinaz’ın fazla ekspresyonu ve sentrozom amplifikasyonu belirlenmiştir88. Aurora A kinaz p53 gibi tümör baskılayıcı proteinleri fosforilleyerek onların aktivitelerini de düzenlemektedir85. Aurora A ve B’nin ras yolağı aracılığı ile hücre transformasyonuna neden olduğu gösterilmiştir86-88. Bu nedenle Aurora kinaz inhibitörleri ile hücre siklusu bloke edilerek kanser tedavisine yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Aurora B kinaz inhibitörü AZD1152 lösemi tedavisine yeni etken madde olarak önerilmektedir89. 2-4.Kanser hücrelerinde sentriol anomalileri Kanser hücrelerinde sentriollerin fazla duplike olduğu belirlenmiştir. Normal hücreler, hücre siklusunun G1 fazında siklinE-cdk2 kompleksleri ile sentriol kopya sayısını düzenler11,32. Anormal spindle (asp) gen ürünü mikrotübül assosiye eden proteindir. Asp proteini kutuplarda herbir mitotik iplikçiğin herbir sentrozoma bağlanmasında rol oynar. Mitozun metafazdan anafaza geçişte tutulmasının nedeni asp mutasyonu sonucu anormal iplikçik morfolojisidir. p53, sentrozom replikasyonunda rol oynayabilir11. Fonksiyonel p53 proteini olmayan fare embriyo hücrelerinde bir hücre siklusu sırasında çok sayıda sentrozom kopyası gösterilmiştir. Mitoz sırasında sentrozom sayısının çok olmasının kromozomların yanlış dağılımına ve bu nedenle aneuploidiye yol açtığı bildirilmiştir7,11. 2-5. Tedavi potansiyeli İnsan kanserlerinin %50’sinden daha fazlasında p53 mutasyonunun olduğu rapor edilmiştir84,90. Düzenleyici sinyal yollarında anahtar oyuncuların rolünün anlaşılması, bilgi artışının yanısıra tedavi hedef ve stratejilerinin belirlenmesine katkı sağlayacaktır. (7hidroksistaurosporin) UCNO1 olarak tanımlanan antikanser etkeninin cdc25c‘yi inhibe ederek G2/M kontrol noktasını bozduğu rapor edilmiştir. Kemoterapi ve radyoterapi gibi anti-kanser tedavilerine direnç, DNA hasar kontrol noktalarının değişmesi ile mümkün olabilir91. Kansere karşı ilaç tedavisinin gelişimi hücre transformasyonu içinde moleküler hedeflere daha fazla odaklanmak gereklidir. Araştırmalar hücre siklus kontrolünün düzenlenleyen kimyasal cdk inhibitörlerinin araştırılmasına dönmüştür2,84. Kanser gelişmeden önce p53 ve pRb mutasyonlarının taranması da tümör gelişiminin erken teşhisine olanak sağlayacaktır72,90. Bir grup araştırıcı siklin A veya E’nin fazla ekspresyonunu ve p53 mutasyonunu ‘’border line’' ve invasif yumurtalık kanserlerinde göstermişlerdir9,92. Check point kinase 1 (Chk 1) kanser tedavisinde yeni hedef olarak gösterilmektedir93. Kemoterapik etkenlere direnç gösteren yumuşak doku sarkomalarında G2/M kontrol noktasının korunduğunu göstermek için immunhistokimyasal analizler kullanılmıştır. Sonuç Hücre siklusunda olaylar kaskadını düzenleyen ve kontrol eden etkileşimler çok sayıda ve komplekstir. Tümör baskılayıcı fonksiyonun ve programlı hücre ölüm yolaklarının anlaşılması yönünde ilerlemeler olmasının yanısıra çözümlenmemiş çok sayıda soru vardır. Kemoterapi ve biyoterapi için hücre siklus kontrol noktaları büyük potansiyele sahip hedeflerdir. Kemoterapi ve radyoterapi sonrası kanser hücrelerinin yaşaması onarım yollarındaki hasarlara bağlı olabilir. Hücre siklus kontrol noktalarında ve DNA onarım yollarındaki moleküler bileşenlerin daha iyi anlaşılması için in vivo ve in vitro çalışmalar klinik çalışmalarla da desteklenmelidir7,9,11,33,80,93,94. 1) Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell JE. Molecular Cell Biology. 4th edition: WH Freeman and Co, New York, 2000. 2) Vermeulen K, VanBockstaele DR, Berneman Z N. The cell cycle : a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif 2003; 36: 131-49. 3) Guimaras CA, Linden R. Apoptosis and alternative deastyles. Eur J Biochem 2004; 271: 1638-50. 4) Zong WX, Thompson CB. Necrotic death as a cell fate? Genes Dev 2006; 20 : 1-15. 5) Bellamy COC. p53 and apoptosis. Br Med Bull 1996; 53(3): 522-38. 6) DeVita Jr VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer: principles and practice of oncolgy. 5th edition: Lippincott-Raven, Philadelphia, 1997. 7) Vermeulen K, Berneman ZN, vanBockstaele DR. Cell cycle and apoptosis. Cell Prolif 2003; 36: 165-75. 8) Öndağ Cabadak H. İnsan periferal kan ve fibroblast hücre kültürlerinin sinkronizasyonu ve sinkronize hücre kültürlerinden kromozom analizi ve karyotip hazırlanması. Yüksek Lisans Tezi, Ankara: Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, 1987. 9) Foster I. Cancer: A cell cycle defect. Radiography 2008; 14: 144-9. 10) Hu W, Feng Z, Teresky AK, Levine AJ. p53 regulates maternal reproduction through LIF. Nature 2007; 450(7170): 721-4. 11) Kearns WG, Liu JM. Cell cycle checkpoint genes and aneuploidy: A short review. Current Genomics 2001; 2: 171-80. 12) Giacinti C, Giordano A. RB and cell cycle progression. Oncogene 2006; 25: 5220-7. 13) Kelly TJ, Brown GW. Regulation of chromosome replication. Annu Rev Biochem 2000; 69: 829-80. | 14) Prasanth SG, Mendez J, Prasanth KV, Stillman B. Dynamics of pre-replication complex proteins during the cell division cycle. Phil Trans R Soc Lond B 2004; 359: 7-16. 15) Flatt PM, Pietenpol JA. Mechanisms of cell-cycle checkpoints: at the cross roads of carcinogenesis and drug discovery. Drug Metab Rev 2000; 32: 283-305. 16) Sears RC,Nevins JR. Signalling networks that link cell proliferation and cell fate. J Biol Chem 2002; 277: 11617-20. 17) Stevaux O, Dyson NJ. A revised picture of the E2F transcriptional network and RB function. Curr Opin Cell Biol 2002; 14: 684-91. 18) Fearson E. Human cancer syndromes: clues to the origin and nature of cancer. Science 1997; 278: 1043-50. 19) Molinari M. Cell cycle check points and their activation in human cancer. Cell Prolif 2000; 33: 261-74. 20) Cheng M, Sexl V, Sherr C, Raussel M. Assembly of cyclin D-dependent kinase and titration of p27Kip1 regulated by mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) Proc Natal Acad Sci 1998; 95: 1091-4. 21) Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle and cancer. Science 1994; 266:1821-8. 22) Kirsch DG, Kastan MB. Tumor-suppressor p53: implications for tumor development and prognosis. J Clin Oncol 1998; 16(9): 3158-68. 23) Dyson NJ. A revised picture of the E2F transcriptional network and RB function. Curr Opin Cell Biol 2002; 14(6): 684-91. 24) Weinberg R. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell 1995; 81: 323-30. 25) King RJB. Cancer biology, Longman, 1996. 26) Fearson E. Human cancer syndromes: clues to the origin and nature of cancer. Science 1997; 278: 1043-50. 27) Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100: 57-70. 28) Murray AW. Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell 2004; 116: 221-34. 29) Hopfner R, Mousli M, Jeltsch JM, Voulgaris A, Lutz Y, Marin C, Bellocq JP, Oudet P, Bronner C. ICBP90, a novel human CCAAT binding protein, involved in the regulation of topoisomerase II expression. Cancer Res 2000; 60: 121-8. 30) Harbour JW, Dean DC. The Rb/E2F pathway: expanding roles and emerging paradigsm. Genes Dev 2000; 14: 2393-409. 31) Zhang HS, Postigo AA, Dean DC. Active transcriptional repression by the Rb-E2F complex mediates G1 arrest triggered by p16INK4a, TGFbeta, and contact inhibition. Cell 1999; 97: 53-61. 32) Hinchcliffe EH, Thompson EA, Maller JL, Sluder G. Requirement of Cdk2-cyclin E activity for repeated centrosome reproduction in Xenopus egg extracts. Science 1999; 283 (5403): 851-4. 33) Champard JC, Lefloch R, Pouyssegur J, Lenormand P. Erk implication in cell cycle regulation. Biochem Biophys Acta 2007: 1773(8): 1299-310. 34) Roberts EC, Shapiro PS, Nahreini TS, et al. Distinct cell cycle timing requirements for extracellular signal regulated kinase and phosphoinositide-3-kinase signalling pathways in somatic cell mitosis. Mol Cell Biol 2002; 22: 7226-41. 35) Harper J, Adami G, Wei N, et al. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 1993; 75: 805-16. 36) Öndağ H. Effects of excess thymidine and methotraxate on human peripheral blood and fibroblast culture, NATO-ASI The Enzyme Catalysis Process Book, 1998. 37) Pines J, Hunter T. Human cell division: the involvement of cyclins A and B1 and multiple cdc2s. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1991; 56: 449-63. 38) Heald R, McLoughlin M, McKeon F. Human wee1 maintains mitotic timing by protecting the nucleus from cytoplasmically activated cdc2 kinase. Cell 1993: 74; 463-74. 39) Strausfeld U, Labbé JC, Fesquet D, et al. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature 1991; 351 (6323): 242-56. 40) Draetta G, Eckstein J. Cdc25 protein phosphatases in cell proliferation. Biochim Biophys Acta 1997: 1332: M53-M63. 41) Marumato T, Hirota T, Morisaki T, et al. Roles of aurora -A kinase in mitotic entry and G2 check point in mammalian cells. Genes Cells 2002; 7: 1173-82. 42) Giono LE, Manfredi JJ. The p53 tumor suppressor participates in multiple cell cycle check points. J Cell Physiol 2006; 209: 13-20. 43) Maddika S, Ande SR, Panigrahi S, Paranjothy T, Weglarczyk K, Zuse A, Eshraghi M, Manda KD, Wiechec E, Los M . Cell survival, cell death and cell cycle pathways are inter connected: Implications for cancer therapy. Drug Resist Updat 2007; 10: 13-29. 44) Cahill DP, Lengauer C, Yu J, Riggins GJ, Willson JK, Markowitz SD, Kinzler KW, Vogelstein B. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature 1998; 19: 392: 300-3. 45) Cahill DP, da Costa LT, Carson-Walter EB, Kinzler KW, Vogelstein B, Lengauer C. Characterization of MAD2B and Other Mitotic Spindle Checkpoint Genes. Genomicsm 1999; 58: 181-7. 46) Ouyang B, Meadows J, Fukasawa K. Human Bub1: a putative spindle checkpoint kinase closely linked to cell proliferation. Cell Growth Differ 1998; 9(10): 877-85 . 47) Sazer S. The Schizosaccharomyces pombe spindle checkpoint protein mad2p blocks anaphase and genetically interacts with the anaphase-promoting complex. Proc Natl Acad Sci 1997; 94(15): 7965-70. 48) Basu J, Bousbaa H, Logarinho E, Williams BC, Sunkel CE, Goldberg ML. Mutations in the essential spindle checkpoint gene bub1 cause chromosome missegregation and fail to block apoptosis in Drosophila. J Cell Biol 1999; 146(1): 13-28. 49) Kitagawa R, Rose AM. Components of the spindle-assembly checkpoint are essential in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol 1999; 1(8): 514-21. 50) Dobles M, Liberal V, Scott ML. Benezra R, Sorger PK. Chromosome missegregation and apoptosis in mice lacking the mitotic checkpoint protein Mad2. Cell 2000; 101(6): 635-45. 51) Waizenegger IC, Hauf S, Meinke A, Peters JM. Two distinct pathways remove mammalian cohesin from chromosome arms in prophase and from centromeres in anaphase. Cell 2000; 103(3): 399-410. 52) Roberts BT, Farr KA, Hoyt MA. The Saccharomyces cerevisiae checkpoint gene BUB1 encodes a novel protein kinase. Mol Cell Biol 1994; 14(12): 8282-91. 53) Taylor SS, McKeon F. The human homologue of Bub3 is required for kinetochore localization of Bub1 and a Mad3/Bub1-related protein kinase. J Cell Biol 1998; 142(1): 1-11 54) Chipuk JE, Green DR. Dissecting p53-dependent apoptosis. Cell Death Differ 2006; 13: 994-1002. 55) Katsan MB, Bartkova JK. The retinoblastoma protein pathway in cell cycle control and cancer. Exp Cell Res 1997; 237: 1-4. 56) Sherr C, Mccormick F. The Rb and p53 pathways in cancer. Cancer Cell 2002; 2: 103-12. 57) Cabadak H, Aydın B, Kan B. Muscarinic agonist and antagonists changes muscarinic receptor and cyclin D1 expression in K562 cells. EMBO ’’ Molecular mechanisms of cell cycle control in normal and malignant cCells. Spetses Island-Greece,5-8 October 2007: 53. 58) Reifenberger G, Reifenberger J, Ichimura K, et al. Amplification of multiple genes from chromosomal region 12q13-14 in human malignant gliomas: preliminary mapping of the amplicons shows preferential involvement of CDK4, SAS and MDM2. Cancer Res 1994; 54: 4299-303. 59) Arima Y, Hirota T, Bronner C, et al. Down regulation of nuclear protein ICBP 90 by 53/p21Cip1/WAF1 dependent DNA damage checkpoint signals contributes to cell cycle arrest at G1/S transition. Genes Cells 2004; 9: 131-42. 60) Dang T, Bao S, Wang X. Human Rad 9 is required forthe activation of S-phase check point and the maintenance of chromosomal stability. Genes Cells 2005; 10: 287-95. 61) Wahl GM, Carr AM. The evolution of diverse biological responses to DNA damage: insights from yeast and p53. Nature Cell Biol 2001; 3: E277-86. 62) Craig A, Scott M, Burch L, Smith G, Ball K, Hupp T. Allosteric effects mediate CHK2 phosphorylation of the p53 transactivation domain. Embo Rep 2003; 4: 787-92. 63) Massagué J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature 2004; 432: 298-306 64) Latham K, Baker GL, Musunuru K, et al. Cell cycle control and differentiation: mechanisms of proliferative dysfunction in cancer cells. Cancer Detect Prev 1996; 20: 5. 65) Kaldis P. The cdk-activating kinase (CAK): from yeast to mammals. Cell Mol Life Sci 1999; 55: 284-96. 66) Decuadin D, Geley S, Hirsch T, et al. Bcl-2 and Bcl-Xl antagonize the mitochondria dysfunction preceding nuclear apoptosis induced by chemotherapeutic agents. Cancer Res 1997; 52: 62-7. 67) Story M, Kodym R. Signal transduction during apoptosis; implications for cancer therapy. Front Biosci 1998; 3: d365-75. 68) Dixon S,Soriano BJ, Lush RM, Bomer MM, Figg WD. Apoptosis: its role in the development of malignancies and its potential as a novel therapeutic target. Ann Pharmacother 1997; 31: 76-82. 69) Evan G, Littlewood T. A matter of life and cell death. Science 1998; 281: 1317-21. 70) Jin S, Antinore MJ, Lung FD, Dong X, Zhao H, Fan F, Colchagie AB, Blanck P, Roller PP, Fornace AJ, Jr Zhan Q. The GADD45 inhibition of Cdc2 kinase correlates with GADD45-mediated growth suppression. J Biol Chem 2000; 275 (22): 16602-8. 71) Harms-Ringdahl M, Nicotera P, Radford JR. Radiation induced apoptosis. Mutat Res 1996; 366: 171-9. 72) Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, et al. Structure of Bcl-xL- Bak peptide complex recognition between regulators of apoptosis. Science 1997; 275: 983-6. 73) Taya Y. Rb kinases and Rb-binding proteins: new points of view. TIBS 1997; 22: 14-7. 74) Smith GC, Divecha N, Lakin ND, Jackson SP. DNA-dependent protein kinase and related proteins. Biochem Soc Symp 1999; 64: 91-104. 75) Peterson SE, Stellwagen AE, Diede SJ, Singer MS, Haimberger ZW, Johnson CO, Tzoneva M, Gottschling DE. The function of a stem-loop in telomerase RNA is linked to the DNA repair protein Ku. Nature Genet 2001; 27(1): 64-7. 76) Stellwagen AE, Haimberger ZW, Veatch JR, Gottschling DE. Ku interacts with telomerase RNA to promote telomere addition at native and broken chromosome ends. Genes Dev 2003; 17: 2384-95. 77) Bell DW, Varley JM, Szydlo TE, Kang DH, Wahrer DC, Shannon KE, Lubratovich M, Verselis SJ, Isselbacher KJ, Fraumeni JF, Birch JM, Li FP, Garber JE, Haber DA. Heterozygous germ line hCHK2 mutations in Li-Fraumeni syndrome. Science 1999; 286(5449): 2528-31. 78) Takagaki K, Katsuma S, Kaminishi Y, et al. Role of Chk1 and Chk2 in Ara-C-induced differentiation of human leukemia K562 cells. Genes to Cells 2005; 10: 97-106. 79) Shiloh Y, Kastan M B. ATM: genome stability, neuronal development, and cancer cross paths. Adv Cancer Res 2001; 83: 209-54. 80) Marusyk A, DeGregori J. Building a better model of cancer. Cell Division 2006; 1: 24. 81) Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature 1997; 386: 623-7. 82) Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers. Nature 1998; 396: 643-9. 83) Hanks S, Coleman K, Reid S, Plaja A, Firth H, Fitzpatrick D, Kidd A, Mehes K, Nash R, Robin N, Shannon N, Tolmie J, Swansbury J, Irrthum A, Douglas J, Rahman N. Constitutional aneuploidy and cancer predisposition caused by biallelic mutations in BUB1B. Nat Genet 2004; 36: 1159-61. 84) Carmena M, Earnshaw WC. The cellular geography of aurora kinases. Nat Rev Mol Cell Biol 2003: 4; 842-54. 85) Keen N, Taylor S. Aurora-kinase inhibitors as anticancer agents. Nat Rev Cancer 2004; 4: 927-36. 86) Kanda AH, Kawai H, Suto S, Kitajima S, Sato S, Takata T, Tatsuka M. Aurora-B/AIM-1 kinase activity is involved in Ras-mediated cell transformation. Oncogene 2005: 24; 7266-72. 87) Tatsuka M, Sato S, Kitajima S, et al. Overexpression of Aurora-A potentiates HRAS-mediated oncogenic transformation and is implicated in oral carcinogenesis. Oncogene 2005; 24: 1122-27. 88) Pihan GA, Purohit A, Wallace J, Knecht H, Woda B, Quesenberry P, Doxsey SJ. Centrosome defects and genetic instability in malignant tumors. Cancer Res 1998: 58; 3974-85. 89) Yang J, Ikezoe T, Nishioka C, Tasaka T, Taniguchi A, Kuwayama Y, Komatsu N, Bandobashi K, Togitani K, Koeffler HP, Taguchi H, Yokoyama A. AZD1152, a novel and selective aurora B kinase inhibitor, induces growth arrest. Blood 2007; 110: 2034-40. 90) Golias C, Charalabopoulos A, Charalabopoulos K. Cell proliferation and cell cycle control: a mini review. Int J Clin Pract 2004; 58: 1134-41. 91) Hattori H, Kuroda M, Ishida T, Shinmura K, Nagal S, Mukal K, et al. Human DNA damage check points and their relevance to soft tissue sarcoma. Pathol Int 2004; 54: 26-31. 92) Blegen H, Einhorn N, Sjovall K, Roschke A, Ghadimi B, McShane L, et al. Prognostic significance of cell cycle proteins and genomic instability in borderline, early and advanced stage ovarian carcinomas. Int J Gynecol Cancer 2000; 10: 477-87. 93) Tse AN,Carvajal R,Schwartz GK. Targeting checkpoint kinase 1 in cancer thera-peutics. Clin Cancer Res 2007; 13(7): 1955-9. 94) Kastan MB, Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature 2004; 432: 316-23.

http://www.biyologlar.com/hucre-siklusu-ve-kanser

Hücre Yüzeyinde Etki Gösteren Hormonlar

1 - Hipotalamik Hormonlar Hipotalamustan salgılanan düzenleyici faktörler büyüklük ve kimyasal yapı bakımından birbirlerinden farklıdır. Bu hormonların hepsinde de karboksil ucu bloke edilmiştir. Hepsi hipotalamusta sentezlendikten sonra hipotalamo-hipofizer portal dolaşımla hipofize gelirler. Bu hormonların yarı ömürleri birkaç saniye kadardır. Bu gruptaki hormonlar kontrol ettikleri hipofizer hormonlarla birlikte aşağıda incelenmiştir. 2 - Hipofiz Hormonları - Arka Hipofiz Hormonları Vazopressin ve oksitosin hipotalamusun supraoptik ve paraventriküler çekirdeklerinin nöronlarında sentezlendikten sonra, bu nöronların aksonları boyunca arka hipofize taşınırlar. 1 Vazopressin Vazopressin halkasal bir nonapepdittir ve molekül ağırlığı 1084’dür (İnsan). Pepditte bir disülfit köprüsü ve karboksil ucunda amid grubu ile bloke edilmiş bir glisin bulunur. Biyolojik aktivite için disülfit köprüsü ve amid grubu mutlaka gereklidir. Vazopressinin başlıca görevi böbreklerden süzülen suyun tutulmasıdır. Bu antidiüretik etki sonucu idrar konsantre hale gelir. Bu nedenle hormona antidiüretik hormon da denilmektedir. Vazopressin ayrıca damarlardaki düz kaslara etki ederek damarların büzülmesine neden olur. Vazopressin böbreğin distal tubüllerine etki ederek tubüllerin suya geçirgenliğini artırır. Distal tubuller böbreğin hiperozmolar bölgesinde bulunduklarından su buradan geri emilir. Vazopressin halkasal tubül hücrelerinin plazma zarında bulunan ve birbirine benzeyen en az iki resptöre bağlanarak adenilat siklazı aktive etmektedir. Böylece hücrede cAMP düzeyi artar ve protein kinaz A aktive olur. Bunun aktivasyonu hücrede bir seri fosforilasyonlara neden olur. Buna bağlı olarak mikrotubül ve mikroflament yapılarında değişiklik oluşur. Sonuçta da henüz tam olarak bilinmeyen mekanizmalarla tubulün luminal zarına suyu iten moleküller yerleştirilmiş olur. Vazopressin salgısını kontrol eden en önemli faktör kanın ozmolalitesidir. Ozmolalitedeki artış salgıyı artırırken, ozmolalitedeki azalma salgıyı inhibe eder. Hipotalamusun vazopressin üretememesi sonucu diabetes insipidus oluşur. Nadiren kalıtsaldır. Çoğunlukla hipotalamustaki bir tümör veya kitleden, cerrahi girişimlerden, kafa travmasından veya enfeksiyonlardan sonra ortaya çıkar. Her durumda da hipotalamusun arka hipofize vazopressin salgılama yeteneği ortadan kalkmıştır. Diabetes insipidus’ta idrar konsantre edilemediği için idrar miktarı çok artar. Su kaybı plazma ozmolalitesinin artmasına neden olur. Dehitratasyon kontrol altına alınmazsa ölümcül olabilir. 2 Oksitosin Oksitosin’de halkasal bir nonapepdittir ve bir disülfit bağı taşır. Başılca görevi doğum ve laktasyon sırasında düz kasların kasılmasını uyarmaktır. Hamilelikte uterustaki oksitosin reseptörlerinin sayısı 100-200 kat artar. Bu nedenle hormon düzeylerindeki çok hafif artışlar dahi önemli fizyolojik etki ile sonuçlanır. Doğum sırasında oksitosin salınması uterusun kasılmasını artırarak fötusun çıkmasını sağlar. Oksitosin sıklıkla doğumu hızlandırmak amacıyla verilir. Doğumdan sonra oksitosin sütün gelmesi için de önemlidir. Bebeğin-yavrunun emmesi oksitosin salınımını uyarır. - Orta Lop Hipofiz Hormonları 1 Melanosit Stimüle Edici Hormon Melanosit uyarıcı hormon (Melanocyte-stimulating hormone, MSH) hayvanlarda melanin yapımını uyararak pigmentasyonu artırır. Öncül madde pro-opiomelanokortin’dir. Bu oncülden a ve b olmak üzere iki türlü MSH üretilmektedir. a-MSH bütün türlerde aynı olup 13 amino asitten oluşmuştur. b-MSH ise farklı sayıda amino asit talır. Bu hormon hayvanlarda hipofiz ara lobda üretilir. İnsanlarda hipofizin bu kısmı eksiktir. İnsanlarda pigmentasyonu ACTH’nin kontrol ettiği düşünülmektedir. - Ön Hipofiz Hormonları Ön hipfizden 6 hormon salgılanmaktadır. Bunların hepsi de pepdit ve protein yapılıdır. Bunlar hipotalamik hormonların kontrolü altında olup hipotalamik faktörler ön hipofiz hormonlarından dördünün salınımını uyarır, ikisinin salınımını da inhibe eder. Ayrıca ön hipofiz hormonları periferik dokulardaki hedef hücrelerden salınan faktörlerle inhibe edilirler. 1 Büyüme Hormonu (Growth Hormon, GH) Somatotropin adı da verilen büyüme hormonu (growth hormone) (GH) küçük bir protein molekülüdür. Taşıdığı amino asit sayısı bakımından türlere göre farklılıklar gösterir. Insan büyüme hormonu 188, sığır büyüme hormonu 369, koyun büyüme hormonu ise 191 amino asitten kurulmuştur. İnsan ve maymunlarda tek bir polipepdit zincirinden ibaret olduğu halde sığır ve koyunlarda iki zincirli bir yapı gösterir. İki disülfit bağı bulundurur. Bu hormon büyüme yeteneğine sahip olan bütün vücut dokularının büyümesini temin eder. Bunu dolaylı yoldan yapar. GH, somatomedin C (İnsülin benezri büyüme faktörü, insülin-like growth factor, IGF-I) salınımını uyarır. Somatomedin C ise uzun kemiklerin ve yumşak dokuların büyümesini sağlar. Büyüme hormonu en azından birkaç amino asidin, belki de bütün amino asitlerin hücre zarından stoplazmaya geçişlerini direkt etkiyle artırır. Bu etki hücre içerisindeki amino asit konsantrasyonlarını yükseltir. Büyüme hormonu ribozomlar üzerinde direkt bir etki ile de protein sentezini artırmaktadır. Aynı zamanda çekirdekteki trankripsiyon işleminin stimilasyonuna ve böylece oluşan RNA miktarında artışa neden olmaktadır. Sonuçta protein metabolizması üzerine anabolik etkileri vardır. Hücre zarında amino asit geçişinin bu şekilde kontrolü insülin tarafından glikoz geçişinin düzenlenmesi mekanizmasına çok benzemektedir. GH’nun karbohidratlar üzerine etkisi insulin etkisinin zıddıdır. GH uygulanmasından sonra görülen hiperglisemi glikozun çevre dokularda kullanılmasının azalması ve glukoneogenezis ile hepatik üretimin artmasının birlikte sonucudur. Büyüme hormonu büyümenin hızlandırılabilmesi için karbonhidratlara ve insüline ihtiyacı vardır. Büyüme hormonu pankreası çıkartılmış hayvanlarda büyümeye sebep olmaz. Büyüme hormonu hücre glukoz metabolizması üzerinde üç büyük etkiye sahiptir. 1 - Enerji elde etmek amacı ile glukozun daha az kullanılması. 2 - Hücredeki glikojen depolanmasının artması ve 3 - Hücreler tarafından gerçekleştirilen glukoz alımının azalmasıdır. Büyüme hormonu langerhans adacıklarının beta hücrelerinin sürekli uyarılarak fazla miktarda insülin salgılanmasına sebep olur. Büyüme hormonuna bağlı olarak insülin salgılanmasının çok aşırı derecede stimüle edilmesi beta hücrelerinin iflas etmelerine sebep olabilir ve diabetes mellitus tablosu ortaya çıkabilir. Büyüme hormonu yağ dokularında bulunan serbest yağ asitlerinin harekete geçirir ve vücut hücreler için gerekli olan enerjinin büyük kısmının bu yağlardan karşılanmasını sağlar. Karbonhidratlar az miktarda sarf olunca da, proteinler kullanılarak karbonhidrat elde edilmesi olayı yani glikoneogenezis sınırlanmaktadır. Bu olay protein kullanımını azaltan diğer bir faktördür. In vitiro olarak GH adipoz doku ile inkube edildiği zaman serbest yağ asitleri ve gliserolün bırakılmasını artırır. İnvivo GH’un uygulanmasından sonra çok hızlı olarak (30-60 dakika içinde) dolaşımda serbest yağ asitleri ve karaciğerde yağ asitlerinin oksidasyonun artmasına neden olmaktadır. İnsulin noksanlığında (Örneğin diabetes mellitus), ketogenezisde bir artış olur. Bu etkiler ve karbohidratlar üzerine olan etkiler muhtemelen IGF-I ile ayarlanamaz. Triacilgliserol depolarından yağ asitlerinin mobilizasyonu, kaslarda glikolizisin inhibisyonuna yardımcı olmaktadır. Uzun süre GH uygulanması diabetes mellitus ile sonuçlanabilmektedir. Fazla miktarda büyüme hormonunun tesiri ile yağların mobilizasyonu büyük miktarlar şeklinde gerçekleşmekte ve buna bağlı olarak da karaciğerde aşırı miktarda asetoasetik asit teşekkül ederek ketozise yol açabilmektedir. GH veya benzer etkili IGF-I, pozitif Ca, Mg ve PO4 dengesini artırır ve Na, K, Cl retensiyonuna sebep olur. GH laktojenik reseptörlere bağlanır, böylece prolaktinin birçok özelliğine sahiptir, örneğin, meme bezlerinin uyarılması, laktogenezis gibi. GH sentez ve salgısı önemli olarak, hipotalamustan salgılanan GH-releasing hormon (GH-RH) tarafından kontrol edilir. Bu hormon karboksil ucundan amitlenmiş 44 amino asitlik bir proteindir. GH-RH, hipofizin somatotrof hücrelerdeki reseptörlerine bağlanıp adenilat siklazı aktive ederek cAMP düzeylerini yükseltir ve GH salınmını uyarır. GH sentezi için tiroid hormonu ve kortizol de gerekir. GH serbest bırakılışının negatif kontrolü somatostatin tarafından sağlanır. Somatostatinin halkasal bir pepdit olup biyolojik aktivitesi için yapıda yer alan disülfit köprüsü gerekli değildir. Somatostatin aynı zamanda glukagon, insülin, TSH, FSH, ACTH ve gut hormonların salınmasını inhibe eder. Fakat prolaktine etki etmez. Somatostatin Ca mobilizasyonunu inhibe ederek GH’ü inhibe ediyor görülmektedir. Somatostatin ayrıca, barsaktan gastrin ve organizmanın değişik yerlerinden yaklaşık 13 değişik hormonun salgılanmasın inibe eder. Puberteden önce GH eksikliği orantılı boy kısalığına neden olan panhipoptiütarizm bütün ön lob hormonlarının normalden az salgılanmaları durumudur. Bu duruma hipofizer cücelik denir. Kongenital olabildiği gibi sonradan da olabilir. Büyüme hormonundaki yetersizliklere bağlı olarak cücelik gelişebilir. Aşırı miktarda büyüme hormonu salgılanmasına bağlı olarak da devlik gelişir. Nadiren bazı hastalarda yüksek GH seviyesine karşın hipofizer cüceliğe benzer bir durum ortaya çıkar. Bu duruma Laron cüceliği denir. Akromegali de büyüme hormonuna bağlı olarak gelişen klinik bir durumdur. GH fazlalığı hemen her zaman hipofiz bezinin iyi huylu ve büyük tümörlerine bağlı olarak ortaya çıkar. 2 Prolaktin Luteotrop hormon, laktotrop hormon olarak da adlandırılmış olan prolaktinin esas fonksiyonu dişilerde süt yapımını uyarmaktır. Bunun olabilmesi için olgun meme dokusunun gelişmiş olması gerekir. Süt yapımında prolaktin, östrojenler, insülün ve kortizol ile birlikte etki eder. Prolaktin süt proteinleri olan kazein ve laktoalbumin mRNA’larının yapımın artırır. Prolaktin progesteron oluşumu için Corpus luteumu stimüle eder. Prolaktin düzeyleri erişkin yaşam boyunca korunur. Ancak süt vermeyen insanlardaki rolü bilinmemektedir. Erkeklerde herhangi bir fonksiyonu yoktur. Prolaktin ön hipofiz hormonları içerisinde salgılanması inhibüsyonla kontrol edilen tek hormondur. Hipotalamusla hipofiz arasındaki suprasellülar bölgedeki bir tümör gelişimi hipotalamo-hipofizer portal dolaşımın kesilmesi, prolaktin dışındaki tüm ön hipofiz hormonlarının salgılarının kesilmesine neden olur. Prolaktin salgısı ise artar. Bunun sebebi ön hipofiz hormonlarının salgılanmasını uyaran ve aynı şekilde prolaktin salgılanmasını baskılayan hipotalamik faktörlerin hipofize ulaşamamasıdır. Prolaktin salgısı prolaktin inhibe edici faktör veya dopamin tarafından kontrol edilir. Dopamin beynin pek çok yerinde nörotransmiter olarak etki eden bir katekolamindir. Dopamin, hücre yüzeyindeki spesifik reseptörüne bağlanıp adenilat siklazı aktive ederek hipofizin laktotrof hücrelerini inhibe eder. Ek olarak dopamin, fosfatidilinozitol döngüsünü de inhibe etmektedir. Ayrıca kısa bir negatif feed-back mekanizması da vardır. Prolaktin median eminensteki hücrelere doğrudan bağlanarak dopamin salgısını artırır ve sonuçta prolaktin salgısı inhibe edilir. T-RH (Thyrotropin-Releasing Factor) başta olmak üzere çeşitli faktörler prolaktin salgısını artırır. Hamilelik sırasında prolaktin salgılayan hücrelerin sayısı ve hücrelerin uyarıcılarla-inhibütörlere duyarlılıkları artar. Östrojenler prolaktin reseptörlerini artırır. Böylece prolaktin salgısı ve duyarlılık artar. Hiperprolaktinemi genel olarak antipsikotik bir ilaç olan fenotiazin gibi dopamin antagonisti ilaçların kullanılmasından sonra ortaya çıkar. Diğer bir neden de hipofizin prolaktin üreten iyi huylu tümörü olan prolaktinoma’dır. 3 Tirotropin Troidi uyarıcı hormon (thyroid-stimulating hormone) (TSH) adı da verilen tirotropin hipofiz bezi tarafından üretilen üç glikoproteinden birisidir. Tiroid bezinden tiroid hormonlarının salgılanmasını uyarır. TSH ayrıca tiroid bezinin büyümesini de uyarmaktadır. Bu hormon hedef hücre yüzeyindeki reseptörüne bağlanarak adenilat siklazı uyarır ve hücre içi cAMP artışı üzerinden etkisini gösterir. TSH’ın yaklaşık % 15’i karbohidrattır. Iki altbirimden oluşur. a ve b olarak adlandırılan altbirimler birbirlerine nonkovalent etkileşimlerle bağlıdır. Bu alt birimlerin tek başlarına biyolojik aktiviteleri yoktur. a-altbirimi glikoprotein yapısındaki tüm hipofiz hormonlarında ve koryonik gonadotropinde ortaktır. Dolayısı ile TSH’nın spesifik etkisi b-altbiriminden gelmektedir. TSH salgısı tirotropin salgılatıcı faktör (Thyrotropin-Releasing Factor) T-RH tarafından uyarılırken, somatostatin ve tiroid hormonları tarafından inhibe edilir. T-RH bir tripepdittir. Amino ucunda glutamik asidin piro halkası ile karboksil ucunda amid grubu ile bloke edilmiştir. T-RH hem TSH hem de prolaktin salgısını uyarır. Somatostatin TSH salgısını engellemektedir. Ancak TSH salınımının en kuvvetli inhibütörü tiroid hormonlarıdır. Eğer plazma tiroksin veya triiyodotironin düzeyleri yüksekse , T-RH düzeyi yüksek olsa bile hipofiz TSH salgılamayacaktır. Bu durum, tiroid fonksiyonundaki küçük değişiklikleri saptamak için uygulanan T-RH stimülasyon testinin temelini oluşturur. Tiroid ile ilgili sorunların çoğu hipofiz bezinin değil de tiroidin kendi hastalıklarından kaynaklanır. Yüksek TSH düzeyleri genellikle tiroid bezinin hormon üretememesi sonucu feed-back inhibüsyonun kalkması sonucu olur ve bu duruma primer hipotroidizm adı verilir. TSH düzeyinin yükselmesi tiroid hastalığının en hassas ve kesin göstergelerinden birisidir. Nadiren hipofiz tümörleri TSH üretir ve hipertiroidizme neden olur. Hipertiroidizme neden olan tiroid bezinin hiperfonksiyonu, TSH salgısının azalmasına yol açar. Tiroid hormonlarının fazlası hipofiz bezinde feed-back ile TSH üretimini durdurur. 2.3.4 Gonadotropinler Üç gonadotropinden ikisi hipofiz, biri plasenta tarafından üretilir. Hipofiz hormonları Luteotropin yada diğer adı ile luteinleştirici hormon (Luteinizing hormone, LH) ve follikül uyarıcı hormon (Follicle-stimulating hormone, FSH) dur. Plasental hormon ise insan koryonik gonadotropini (human chorionic gonadotropin, hCG) dir. Bu hormonların temel görevi dişilerde yumurtalıklarda normal yumurta gelişimini uyarmak ile implantasyonu ve fötüsün büyümesini sağlamaktır. Gonadotropinlerin yapısı TSH’ya benzer ve bunlar da glikoproteinlerdir. İki altbirimleri vardır. a-Altbirimi üç hormonda ve TSH’da aynıdır. Farklı b-altbirimi hormonlara spesifik etkilerini sağlar. Bu hormonları ölçen testlerde esas ölçülen b altbirimleridir. Örneğin gebelik testi hCG’nin b altbirimine özgü bir testtir. Gonadotropinler yumurtalık ve testikül hücrelerindeki spesifik reseptörlere bağlanırlar. LH ve FSH için farklı reseptörler vardır. Bunlar cAMP’yi artırarak etki gösterir. Biyolojik olarak FSH testislerde spermatozoitlerin ve yumurtalıklarda folliküllerin büyümesini uyarır. LH ise steroid hormonların yapımı üzerine etkili bir hormondur. Testislerdeki leydig hücrelerinde testosteron yapımını ve yumurtalıklardaki corpus luteum’da progesteron yapımını uyarır. Plasental hCG de LH gibi corpus luteum’u uyarır. LH ve FSH salgısının düzenlemesinde en etkili hormon, amino ve karboksil uçları bloke edilmiş bir dekapepdit olan Gn-RH dır. GnRH hipofizin gonadotrof hücrelerindeki spesifik reseptörlerine bağlanır ve fosfatidilinozitol döngüsünü uyarır. Sonuçta hücre içi kalsiyum artar ve protein kinaz C aktive olur. Bu olay gonadotropinlerin, özellikle de LH’nın salgılanmasına yol açar. Steroidler feed-back etki ile gonadotropin salgısını baskılar. Erkeklerde testosteron, kadınlarda ise östradiol ve progesteron LH salgısını durdurur. Östradiol ve progesteron birlikte verildiğinde, tek başlarına olduklarından daha etkilidirler. Bu sinerjetik etki, bu hormonların oral kontraseptiflerin yapısında beraber bulunmalarının biyokimyasal temelini oluşturur. Hipofizer gonadotropinler puberteden önce az üretilirse normal büyüme ve cinsel gelişim eksikliği ortaya çıkar. Erkeklerde erişkin erkek karekterleri ve kas yapısı ile fallik veya testiküler büyüme ve spermatogenez oluşmaz. Dişilerde meme gelişmesi ve mensturasyon olmaz. Adrenal androjenlerin kontrol ettiği normal kıllanma ortaya çıkar. Puberte sonrasında gonadotropin yetmezliği libido eksikliğine, erkeklerde impotense ve kadınlarda amenoreye neden olur. HCG kadınlarda gebelik sonrasında kanda ve idrarda süratle artar. Bu olaya dayanılarak gvenli gebelik testi yapılır.

http://www.biyologlar.com/hucre-yuzeyinde-etki-gosteren-hormonlar

Steroid Hormonların Metabolizmaları

Kandaki normal fizyolojik düzeyleri 10-10 ile 10-8 M arasında bulunan bu hormonlar iyi karakterize edilmiş plazmadaki proteinlerle taşınmaktadırlar. Plazma albuminleri spesifik olmayan bir şekilde ve sınırsız oranda steroid hormonları bağlar ve taşır. Ancak bunun sadece mineralokortikoidler (aldosteron) için önemi vardır. Diğer hormonlar affinitesi ve seçiciliği yüksek proteinlere (globulinlere) bağlanarak taşınırlar. Bu proteinler hormonları vaktinden önce inaktivasyona karşı korudukları gibi hormonların aşırı ve dengesiz bir şekilde salınmalarını da önlerler. 1. Hücreye Alınış: Steroidler lipofilik olduklarından kolaylıkla plazma zarlarının lipid tabakasından geçebilirler ve böylece bütün hücrelere girebilirler. Bazı insan tümörlerinde (hiperplastik prostat papillomları ve hipofiz adenomları gibi) steroidler için kolaylaştırılmış veya aktif transport mekanizmalarının bulunduğu gösterilmiştir. Fakat bu mekanizmaların normal hücreler için olan önemleri bilinmemektedir. Steroidler hücre içerisinde stoplazmik hidrofob proteinlere bağlanırlar. Bu nedenle steroid hormon etkinliğinin spesifikliği hedef doku hücrelerinin stoplazmalarındaki özgül reseptör protein aracılığı ile sağlanır. Eğer bir hücrede özgül reseptör protein yoksa hormon dengesi hücre dışı yöndedir. Plazmada onu bağlayıp taşıyan alfa ve beta globulinlere bağlı olarak kalır. Halbuki hedef hücrelerde spesifik reseptörler olduğundan denge içe dönük olur ve hormonlar kolayca hücreye girerler. 2.Metabolizma: İki önemli madde hariç steroid ve türevleri hedef hücrelerde biyolojik cevaplarını oluşturmak üzere metaboliz edilmezler. Ancak androgenlerin etkili olabilmeleri için çeşitli hedef hücrelerde seçici şekilde testosteronunu belirli metabolitlerine çevrilmeleri gerekir. Bu metabolitler arasında 5 dihidroksitestosteron oluşumu erkek yardımcı sex organlarının muhafazası için çok önemlidir. Diğer istisnayı da kolekalsiferol göstermektedir. Bunun kemik ve mineral metabolizması üzerindeki maksimum etkilerini gösterebilmesi için en az iki kez hidroksillenmesi gerekmektedir. Sonuçta 1,25 dihidroksikolekalsiferol oluşur. 3. Reseptör komplekslerinin aktivasyonu ve çekirdeğe girmeleri Çoğu araştırıcılarca kabul edildiğine göre stoplazmik reseptörler çekirdeğe girmeden önce bir aktivasyona uğramaktadırlar. Böylece steroid-reseptör kompleksinin çekirdeğin akseptör yerlerine bağlanmaları kolaylaşır. Ancak yapılan çalışmalar reseptör aktivasyonunu ortaya çıkaramadığı gibi östrogen reseptörleri dışında fizikokimyasal şekilleri de bir değişikliği ortaya koyamamıştır. Bütün hedef hücrelerde hormonlar 0 santigrat derecede bile stoplazmada spesifik bir halde bağlı olarak bulunurlar ve çekirdeğe ancak 20 santigrat derecenin üzerindeki sıcaklıklarda taşınabilirler. Bütün bunlara rağmen kabul edildiğine göre steroid reseptör kompleksi nükleusa diffüze olur veya taşınır. Bu taşınma sırasında reseptör protein daha düşük ağırlıklı bir proteine dönüşür veya steroid hormon ikinci ve daha küçük molekül yapısında bir proteine iletilir. Sedimentasyon katsayısı azalmış bulunan kompleks çekirdeğe girer ve kromatine oldukça sıkı bir şekilde bağlanırlar. Bu bağlanma büyük bir olasılıkla kromatinin asit özellikteki proteinleri ile olmaktadır. Reseptör protein stoplazmaya geri dönebilmektedir. Bu nedenle östradiol gibi işaretlenmiş steroid bir hormon damardan verildiğinde bunun hedef hücre çekirdeklerinde toplandığı görülmektedir. 4. Akseptör Yerleri: Akseptör yerlerinin şekli ve tabiatı halen tartışılmaktadır. Hem DNA’nın hemde Histon olmayan proteinlerin akseptör olabileceklerine dair deliller vardır. Steroidlerin çekirdekçikte yoğunlaştıkları gösterilememiştir. Böylece akseptör yerleri ya nükleoplazma veya çekirdek zarı yada her ikisidir. Kromatinin boncuklu şekli ile hormon etkileri arasında bir ilişki de bulunamamıştır. Çekirdekte hormon buradaki özgül genleri, anlatımlarını özgül haberci RNA’lar oluşturmak yoluyla kayıtlanması (transkripsiyonu) için uyarırlar. Bu protein biyosenteinin kayıtlama aşamasını uyarıyorlar demektir. Haberci RNA’lar stoplazmaya geçerek ribozomlarda yeni proteinlerin sentezi demek olan çevirim işlemini başlatırlar. Steroid hormonların etkilerini DNA’nın özgül mRNA türleri şeklinde yazılmasını uyararak etki gösterdikleri kavramı üç türlü kanıt ile desteklenmektedir: 1. Bu tür hormonlar kromatindeki histon olmayan proteinlere daha çok bağlanmaktadılar. Bu proteinlerin özgül genlerin yazılmasını ayarladığı sanılmaktadır. 2. mRNA sentezinde, saflaştırılmış kromatin etkinliğinin steroid hormonlar tarafından uyarılmasıdır. Sentezlenen mRNA’nın özgül bir protein sentezine neden olduğu birkaç durumda gösterilmiştir. 3. Hedef organların yanıt verme yeteneklerinin aktinomisin D tarafından engellenmesidir. Bu yanıt verebilmek için mRNA sentezine gerek olduğunu göstermektedir. Biyokimyasal deneylerde engelleyicilerin kullanılması tamamen doyurucu bir yaklaşım olarak kabul edilmese de bu tür deneyler destekleyici katkılar sağlamaktadır. Steroid Sekresyonunun Düzenlenişi Böbrek üstü bezi ve diğer seks steroidlerinin sentezi ve salgılanışı hipofizden çıkan adrenokortikotropik hormon (ACTH) tarafından kontrol olunur. ACTH’nun sekresyonu da hipotalamustan salıverilen kortikotropin salıverici faktör (kortikotropin releasing factor-CRF) tarafından düzenlenir. Bu bezin uyarılmasından sonra adrenler içerisinde bulunan kolesterol konsantrasyonunda hızlı bir düşüş görülür. Bu durum ACTH etkisiyle kolesterolün pregnenolona dönüştüğünün delilidir. ACTH’nin etki mekanizmasının reaksiyon hızını etkileyen substrat veya kofaktörlerin hücre içerisine girmelerini hızlandırmaları ile olduğu sanılmaktadır. ACTH aynı zamanda adrenokortikal fosforilaz enzimini de aktive etmektedir. Hayvanlara ACTH verildiği zaman adrenal kolesterol miktarındaki azalışa paralel olarak askorbik asit düzeyi de alçalmaktadır. Ancak aynı zamanda adrenal damarlarda askorbik asit düzeylerinde artış görülmektedir. Vitamin C’nin adrenal steroidler üzerindeki etkisi tartışılmaktadır. Bazıları askorbik asidin steroid hidroksilasyonlarını inhibe ettiğini ve askorbik asidin azalmasının bu inhibisyonu ortadan kaldırdığını öne sürmektedirler. Bir diğer düşünceye göre ise askorbik asit steroidlerin hidroksilasyonunu stimüle etmektedir. Bunu NADPH’lı bir oksidazı aktive ederek yaptığı ileri sürülmektedir. ACTH’nin etki mekanizmasının büyük olasılıkla kolesterol yan zincirinin degradasyonu sırasında olduğu bilinmektedir. ACTH tarafından steroid sentezinin uyarılması ve serbest bırakılması cAMP ile ilgili olarak düşünülmektedir.cAMP’nin kendisi direkt olarak ACTH’nin etkisini stimüle edebilmektedir. Steroid sentezi ekseriyetle Ca++ bağlı olarak adrenal mitekondrial membranda meydana gelen yapısal değişikliğe de bağlanmaktadır. ACTH’nin salgılanışı, kandaki steroidler tarafından feed-back mekanizma ile kontrol edilmektedir. Bu steroidlerden en önemlisi kortizoldür. Glikokortikoidler spesifik olarak hipofiz bezinde ACTH ve mRNA sentezini artırırlar. Yine pregnenolon steroidogenezisin bir feed-back inhibitörüdür. Diğer kortikosteroidlerden farklı olarak adrenaller tarafından aldosteronun üretimi ACTH tarafından etkilenmez. Aldosteron üretimi beta adrenerjik uyarı ile de artmaktadır. Beta adrenerjik uyarı ile ilgili olarak böbrekler ve dolayısı ile rennin-anjiyotensin sistem aldosteronun sekresyonunda önemli bir kontrolördür. Aldosteron üretiminin beta adrenerjik stimülüsler tarafından artırılması aldosteron salıverilişinin cAMP tarafından artırıldığına dair fikri desteklemektedir. 2.1 Adrenal Korteks Hormonları Adrenal bezin dış kısmı adrenal korteksdir. Hayat için gereklidir. Embriyolojik orjini, adrenal medulludan oldukça farklıdır. Adrenal korteks zona reticularis, zona fasciculata ve zona glomerulosa olmak üzere üç bölümden oluşur. Adrenal korteksin steroid hormonları 3 sınıfa ayrılır. 1. Glukokokortikoidler: Öncelikle protein, karbonhidrat, lipid metabolizmasını etkilerler ve zona fasciculata’dan sentezlenirler. 2. Mineralokortikoidler: Elektrolitlerin transportunu ve dokularda suyun dağılımını etkilerler. Zona glomerulosada sentez edilirler. 3. Adrojen ve östrojenler: Spesifik hedef organlarında sekunder seks karakterlerini etkilerler, zona fasciculatada sentez edilirler. 2.1.1 Glukokortikoidler En önemlisi kortizoldür. Kortizol sentezi için pregnenolonda önce 17a-hidroksilasyon (D5 yolu) ve daha sonra çift bağın D4’e izomerizasyonu gerekir. Kortizol endoplazmik retikulumda 21 hidroksilaz ve mitekondride 11b-hidroksilazın etkileri ile 17a-hidroksiprogesterondan sentezlenir. Kortisol plazmada protein bağlı olarak ve serbest halde bulunur. Plazma bağlı protein alfa globilindir, buna transkortin veya kortikosteroid bağlı globulin (CBG) denir. CBG karaciğerde üretilir ve sentezi troid bağlı globilin (TBG) gibi östrojenler tarafından artırılır. Gebelik döneminde veya diğer yüksek östrojen şartlarında, CBG düzeyi artar ve dolayısıyla plazma total cortizol düzeyi artar. CBG ve total plazma kortizol düzeyi bazı karaciğer hastalıklarında azlır, yine, idrarla fazla protein kayıplarında (nefrotik sendrom) da azalır. Glukokortikoidler insuline antagonisttir. Glukokortikoidler dolaşımdaki glukozu artırırlar. Kan damarlarında ve gastrointestinal sistemde düz kas tonusunun korunması için de gereklidir. Kortizol geneel olarak katabolik bir hormondur. Yani hücrelerde protein yıkımını hızlandırır. Travma ve enfeksiyon gibi stres durumları ile başaçıkabilmek için yakıt moleküllerini harekete geçirir. Hiperkortizolizm genel olarak bağışıklık sisteminin baskılanmasını gerektiren otoimmun veya inflamatuar hastalıklar nedeniyle glukokortikoidlerin farmakolojik dozlarına bağlı olarak ortaya çıkar. ACTH salgılayan bir hipfiz tümörüne bağlı olarak ortaya çıkan Cushing sendromu da hiperkortizolizme neden olur. Kortizol fazlalığı olan hastalarda şişmanlık, karın, göğüs ve yüzde yağ birikimi gözlenir. Glukokortikoid fazlası diabetes mellitusa, ekimozlara, yara iyileşmesinin gecikmesine, immun yetmezliğe neden olur. Glukokortikoid yetmezliğine Adisson hastalığı denir. Genellikle adrenal bezlerin otoimmun harabiyeti sonucu oluşur. Bu hastalarda yetersiz glukoneogenezis sonucu hipoglisemi, damar tonusunun azalması sonucu hipotansiyon, hafif ateş ve yüksek ACTH konsantrasyonlarına bağlı olarak hiperpigmentasyon görülür. Glukokortikoidler veteriner hekimlikte ketozis, gebelik toksemisi gibi metabolik hastalıklar ile artritisler, üreme, göz ve deri hastalıklarında ve bazı sinirsel hastalıkların sağıtımında kullanılırlar. 2.1.2 Mineralokortikoidler Mineral dengesinin korunabilmesi için adrenal mineralokortikoidlere ihtiyaç vardır. En güçlü mineralokortikoid olan aldosteron böbreklerden sodyum tutulmasına ve potasyumun atılmasına neden olur. Kortizolün tersine aldosteron, adrenal korteksin zona glomerulosa tabakasında D4 yolu ile progesterondan sentezlenir. Aldosteronün plazmada bağladığı spesifik bir taşıyıcı protein yoktur. Fakat çok zayıf bir formda albumine bağlanır. Aldosteron salgılanmasında etkili olan faktörler, ekstrasellüler sıvının potasyum iyonu yoğunluğu, renin-angiotensin sistemi, vücudun sodyum miktarı ve ACTH’dur. Aldosteron oluşumunda özellikle dolaşımdaki sodyum eksikliği ve potasyum fazlalığı ile hücre dışı sıvı hacmindeki azalış etkilidir. Dışarıdan verilen ACTH aldosteron yapımını geçici olarak uyarsa da bu hormonu esas kontrol eden mekanizma bu değildir. Esas uyarılar, damar içindeki hacim ve tuz durumuna cevap olarak böbreğin jukstaglomerüler (JG) hücrelerinden gelir. JG hücreleri glomerül yakınında, afferent böbrek arteriolünün özel kısımlarına yerleşmişlerdir. Bu hücreler kendilerine bitişik bir böbrek tubulünde yerleşmiş olan ve tubuldeki tuz ve sıvı bileşimine duyarlı olan makula densa hücreleri ile beraber çalışırlar. Tuz eksikliği, kan hacmi veya basıncında düşme sonucu JG hücrelerinden bir glikoprotein enzim olan renin salglanır. Renin, anjiotensinojeni anjiotensin I e çevirir. Anjotensin I daha sonra anjiotensin converting enzyme (anjiotensin dönüştürücü enzim) ile anjiotensin II’ye çevrilir. Anjiotensin II de bir aminopepdidaz ile anjiotensin III’e dönüştürülür. Her ikisi de adreanl korteksin zona glomerulosa hücrelerindeki spesifik reseptörlere bağlanırlar ve aldosteron salgısını artırırlar. Yüksek potasyum düzeyleri de aldosteron salgısını artırır. Aldosteron distal renal tubililerde potasyum-hidrojen iyonu ile değiştirelerek sodyumun glomeruler filtrattan geri emilimini artırır. Sodyumun barsaklardan emilimini de büyük ölçüde artırmaktadır. Na+ ve Cl-‘nin ter, tükürük, mide barsak kanalı salgıları ile kaybını azaltır. Yukarıdaki etkilerine paralel olarak ekstrasellüler sıvı hacmini artırarak kan basıncını yükseltir. İdrar miktarı artar. Hiperaldosteronizm, adrenal bezin hiperplazisi veya tümörü nedeniyle oluşur. Bu durumda hipertansiyon, hipokalemi ve düşük plazma renin düzeyleri gözlenir. Aldosteron sentezindeki artış, sodyum tutulması ve damar hacmindeki artış renin salgılanmasının baskılanmasına neden olmaktadır. Bu durumda ciddi bir ödem ve hipernatremi oluşmaz. Çünkü diğer hormonal sinyaller böbreğin aldosteron etkisinden kaçabilmesine olanak verir. Bu grup hormonların veteriner sağıtımdaki uygulama alanı hemen hemen köpeklerin kronik interstitiel nefritislerinin sağıtımı ile sınırlıdır. Glukokortikoidlerin aksine tek başına mineralokortikoid yetmezliği tedavi edilmese bile ölümcül değildir. Bunun sebebi vazopressin, katekolaminler ve atrial natriüretik pepdit gibi hormonların kan basıncını ve elektrolit metabolzimasını düzenleyici etkileridir. 2.1.3 Adrenal Androjenler Adrenal androjenler primer olarak zona fasciculata’da pregnenolon veya progesteronun 17. Karbonundaki yan zincirinin koparılmasıyla sentezlenirler. ... 2.2 Gonadal Steroidler 2.2.1 Östrojenler ve Progestinler Yumurtalık folliküllerinde üç major hücre tipi vardır. Follikül çevresindeki interstisyel hücrelerden köken alan theca interna hücreleri, yumurta hücresini saran granulosa hücreleri ve yumurta hücresinin kendisi. Yumurtalıklardaki theca interna hücrelerinde pregnenolon önce D4 yolu ile progesterona, daha sonra da androstenedion’a çevrilir. Oluşan androstenedion yumurtalıklardaki granulosa hücrelerinde önce testosterona (17a-hidroksisteroid dehidrogenaz ile) ve daha sonra major östrojen olan östradiole (Östradiol 17b) dönüştürülür. Östrojen sentezindeki anahtar enzim bir 19-hidroksilaz-aromataz kompleksidir. 19. Karbonun uzaklaştırılması ve A halkasının aromatizasyonu ile 18 karbonlu steroidin yapımı katalizlenir. Etkili diğer östrojenler ise östron ve östriol’dür. Yumurtalıklar tarafından gonadal steroidlerin üretilmesi, hormon yapımı ile yumurta hücrelerinin olgunlaşması ve ovulasyon ile döngüsel bir şekilde senkronize olmaları son derece ilginç olaylardır. Östrojenin en önemli görevi menstrual siklusun normal şeklilde devamını sağlamak ve dişi üreme organlarını gebeliğe hazırlamaktır. Ovaryum folliküllerinden östrogenlerin salgılanması ovaryum ve ön hipofiz arasındaki feed-back mekanizma ile düzenlenmektedir. Buna göre ön hipofizden salgılanan FSH ve LH’ın ovaryumları uyarmasıyla östrogenler salgılanır. Söz konusu uyarıda FSH’nın etkinliği birinci derecede ve LH’inkine ikinci derecede kalır. Östrogenlerin kan yoğunluğu arttığında dolaylı olarak ön hipofizden FSH salgılanması inhibe edilir. Östrogenlerce FSH salgısının inhibüsyonu mekanizması erkek hayvanlarda androgenlerin FSH salgısını inhibe ettiği şekilde ve ondan daha güçlü olarak hipotalamustan GnRF salgısının ve ona bağlı olarak FSH ve LH salgılarının azalması ovaryumlardan östrogenlerin salgılanmasının azalmasına yol açar. Östrogenlerin kan yoğunluğu azaldığında yukarıda özetlenen mekanizma tersine çalışmak suretiyle salgılanmaları artar. Böylece kan östrogen yoğunluğu gizyolojik düzeylerde tutabilmesi için feed-back kontrol mekanizması sayesinde FSH ve östrogen yoğunlukları arasında bir denge sağlanır. Kana geçen östrogenlerin büyük kısmı plazmada sex hormonu bağlayan globulin (SHBG) adı verilen bir özel proteine bağlanırlar. Bu proteinin karaciğerdeki sentezi östrogenlerin etkisi ile ihtiyaca göre ayarlanmaktadır. Östrogenler dişilerde cinsiyet organlarının ve ikincil cinsiyet karakterlerinin gelişmesi, gelişmenin ve fizyolojik etkinliklerinin sürdürülmesi için gereklidirler. Östrogenler dişi karakterlerinin meydana gelmesinde birinci derecede sorumludurlar. Özellikle progesteron olmak üzere diğer steroidlerle birlikte etkileyerek östrus (kızgınlık) olarak nitelenen davranış ve fiziksel değişiklikleri oluştururlar. Östrogenlerin dişi memelilerde oluşturduğu ikincil sex karakterleri vücut şeklinin kılların ve sesin değişmesi, memelerin gelişmesi, tüylenme vb işlevleri kapsar. Meme bezlerinin büyümesi duktusların, stromanın gelişmesindeki artış ve yağ depolanması sonucunda meydana gelir. Meme bezleri üzerindeki etkide progesteron, glukokortikoidler ve insülinle birlikte hareket eder. Östrogenler tüm çiftlik hayvanlarında vücudun erken gelişen kısımlarının gelişmesini uzatmak suretiyle büyümeyi uyarıcı bir etki gösterirler ve dokuların besinlerden daha iyi yararlanmalarını sağlayarak kemiklerin ve kasların gelişmesini artırırlar. Bu grup hormonların etkisiyle azot alıkonulmasında artış olmaz. Hormon kullanılmasına bağlı olarak özellikle kasaplık hayvanların karkas ağırlıklarında meydana gelen artış, yağdan çok vücut proteinlerinin ve kemiklerin ağırlık artışından ileri gelir. Gerçekten de östrogenler hücrelerde protein sentezini artırırlar. Üreme organlarının bu hormonlar tarafından büyütülmesinde hücrelerde sayısal artışın yanında protein sentezindeki artışa bağlı olarak hücre büyüklüğündeki artmanın da katkısı vardır. Genç horozlara uygulanan östrogenler vücutta daha çok yağın depolanmasına olanak sağlar. Östrogenlerin proteinler üzerindeki anabolik etkileri sığırlar başta olmak üzere kanatlılar ve tüm kasaplık hayvanların semirtilmesi yönünden önem taşımakta olup bunun için özellikle dietilstilbestrol (DES) gibi nonsteroid sentetik östrogenler sığır, koyun ve domuzlarda, yemlerle birlikte verilerek veya deri altına implante edilerek kullanılabilmektedir. DES’in neden olduğu besin kirlenmesi birçok ülkede özel bir sorun yaratmaktadır. Kanserojenik etkili bulunması, sorunun önemini daha da artırmıştır. Öte yandan cinsiyet farkı gözetmeksizin insanlarda östrogenik etki gösterildiği ve dolayısı ile besinleri ile birlikte östrogenik hormon kalıntısı alan insanların östrogenik etki riski ile karşı karşıya olmalarıda konunun önemli diğer bir yönüdür. Ovülasyondan sonra granulosa hücreleri corpus luteum yapısı içerisinde başta progesteron olmak üzere progestinleri sentezlerler. Androgenler ve östrogenler dışında kalan ve çoğunluğu korpus luteumdan salgılanan veya bu organdan izole edilen gonadal steroidler genellikle progestinler adı altında toplanırlar. Memeli vücudunda sentezlenen başlıca projestin hormonu progesterondur. Bunun büyük bir çoğunluğu ovaryumlardan, korpus luteumun lüteal hücreleri tarafından salınmaktadır. Çeşitli dokularda hazırlanan progesteronun bir kısmı salgılanır, diğer kısmı ise hücrelerde diğer steroid bileşiklere çevrilmektedir. Progesteron uterus mukozasının kalınlığını ve bezlerinin kompleksitesini artırır. Böylece endometruyum implantasyona hazırlanır. Uterus kasılmalarının frekansı azalır. Böylece implante olmuş durumdaki fötüsun dışarı atılması önlenmiş olur. Myometruyum hücrelerini oksitosine karşı duyarsızlaştırır. Fallop borularını kaplayan mukozada da progesteron etkisi ile sekretuar değişiklikler meydana gelir. Bu değişiklikler döllenen ve bölünmekte olan ovum için çok önemlidir. Zira ovumun buradan geçerek uterusa ulaşması sırasında beslenmesi bu şekilde sağlanmaktadır. Progesteron memelerde lobulus ve alveolusların gelişmesini sağlar. Alveol hücreleri progesteron etkisi ile çoğalır, büyür ve sekretuar nitelik kazanır. Dana sonra da prolaktin etkisi ile süt salgılamaya başlar. Büyük miktarda progesteron distal tubuluslardan su sodyum ve klorür rezorpsiyonunu artırır. Bu etkisini aldosteron reseptörleri ile birleşme yetenekleri sayesinde gösterir. Progesteron katabolik etkilidir. Yani annenin yedek protein depolarını harekete geçirerek bunları gebelikte gerekli olan yapım işleri için uterusun büyümesi, süt bezlerinin büyümesi, gelişmesi ve özellikle uterus içerisindeki plasentanın gelişmesi ile yavrunun beslenip büyümesi için kullanır. Gebelikte progesteron etkisi ile iştah artar ve fiziksel etkinlik azalır. Progesteron psisik etkileri çerçevesinde olmak üzere dişi hayvanlarda yavru yapma örneğinde olduğu gibi annelik davranışlarının gelişmesini kolaylaştırır. Yüksek dozda verilen progesteron ve tüm progestirler hipotalamustan gonadotropin salıverici faktör salgılanmasını inhibe etmek suretiyle ön hipofizden LH salgılanmasını azaltırlar. İnekler gibi östrus siklusu gösteren hayvanlarda bu durum diöstrusun uzunluğunun bir düzenleyicisi olabilir. Çünkü korpus luteumun progesteron sekresyonu kesilir kesilmez derhal FSH salgılanması bunu izler ki bu da proöstrus ve folliküllerin gelişmesine neden olur. Yüksek dozlarda verilen progesteron birçok hayvan türünde ve kadında folliküllerin gelişmesini önlemek suretiyle ovulasyonu bloke edebilmektedir. Gebelik sırasında ovulasyon olmaması LH salgılanmasındaki azalmayla açıklanır. Progesteron yüksek dozlarda verildiğinde vücut ısısını yükseltir. Vücut ısısının yükselmeye başlaması ovülasyon zamanını belirleme bakımından bir gösterge oluşturabilir. Termojenik etkinin hormonun hipotalamusta termoregülasyon merkezine etki etmesinden ileri geldiği sanılmaktadır.

http://www.biyologlar.com/steroid-hormonlarin-metabolizmalari

Genleri Durdur Yaşamı Uzat

Genleri Durdur Yaşamı Uzat

Yaşlanma çok aşamalı bir sürecin son aşamasıdır ve bu aşamadan sonra herkes yaşama veda eder. Birçoğumuz bu vedayı istemeyiz. En azından bu vedayı olabildiğince ertelemek isteriz. Bu doğrultuda, uzun yaşamın hatta ölümsüzlüğün başrol oyuncusunun genlerimiz olduğunu daha önceki makalelerimizde sıklıkla dile getirdik.Yaşlılık ve genlerin ilişkisi üzerine yapılan çalışmalar sonucu belirli gen gruplarının yaşlılıkla doğrudan ilgisi olduğu tespit edilmektedir. Zaten vücudumuzdaki genlerin birçoğunun yaşlılık üzerine dolaylı etkisi olduğu da su götürmez bir gerçektir. Peki yaşlanmaya doğrudan hizmet ettiği tespit edilen genleri işlevsiz duruma getirerek yaşlanmayı durdurabilir miyiz?Yaşlılığı ne yazık ki durdurmamız şu anda çok mümkün gözükmesede yavaşlatmak mümkün. Yaşlılığı yavaşlatmanın genetik düzeydeki yöntemlerinden biri gen inhibisyon yöntemidir. Model organizmalar kullanılarak yapılan çalışmalarda uzun ömürlülük ve yaşlanma üzerinde rol oynayan 238 geni inhibe ederek yaşam süresini yaklaşık %60 oranında uzatabilmekteyiz. Bu sayının yaşlanmada rol oynayan yeni genlerin keşfiyle zamanla artabileceğini de belirtmemiz gerekiyor.  4698 maya türü üzerinde yürütülen çalışmalar sonucunda tespit edilen 238 gen aynı zamanda insanlarla benzer gen faaliyetleri gösteren bir model organizma olan yuvarlak solucanlarda da vardır. Bununla birlikte 238 genin yaklaşık yarısı memelilerin genomlarında da bulunmaktadır. Bu genler delesyonla (kromozomdan ilgili gen bölgesinin koparılıp atılmasına dayalı bir gen inhibisyon yöntemi) inhibe edilerek yaşlanma büyük ölçüde yavaşlatılabilir. Tabi burada bu genlerin inhibe edilmesinden kaynaklanan birçok sorunda beraberinde gelmektedir. Bu genler yaptıklarıyla ne kadar yaşlanmaya hizmet etseler de, bulundukları canlıların vücutlarında kilit roller üstlenebilmektedir.Bu genleri “yaşlanma genleri” diye lanse etmek çok yanlış olacaktır. Örneğin, LOS1 adı verilen bir genin delesyonu organizmanın ömrünü bir hayli artırmaktadır. Fakat bu gen, hücrelerin büyümesini regüle eden farklı bir gen olan mTOR ile DNA hasarlarını kontol eden GCN4 genleri arasındaki bağlantıyı sağlar ve protein üretiminden de sorumludur. Yani asıl işi yaşlanmayı sağlamak değildir. DNA hasarlarına gösterilen müdahalelerde yaşlanma ile ilişkilendirilmektedir ve LOS1 geni de bu noktada önemli bir role sahip olabilir.Zamanla işlevi bozulan ve yıpranan genlerimiz bir süre sonra artık organizma için yararlı olmaktan çıkıyor ve bünyesinde bulunduğu organizmaya zarar veriyor. Bu tip genlerin de yaşlanmada önemli bir rolü vardır. Bu etkiyi bir nebze olsun azaltmak için; işlevi bozulan ve bulunduğu organizmaya yararı olmayacak olan genlerin inhibe edilmesi, potansiyeli olan bir yöntemdir.Referans ve İleri Okuma    A Comprehensive Analysis of Replicative Lifespan in 4,698 Single-Gene Deletion Strains Uncovers Conserved Mechanisms of Aging, McCormick, Mark A. et al., Cell Metabolism , Volume 22 , Issue 5 , 895 – 906Saylam, G. http://www.biyogaraj.com/saglik/genleri-durdur-yasami-uzat.html

http://www.biyologlar.com/genleri-durdur-yasami-uzat

Telomer,Telomeraz ve Yaşlanma

Telomerler, ökaryot hücre kromozomlarının her iki ucunda bulunan, heterokromatin (yoğun katlanma gösteren ve daha koyu boyanan bölge) yapıda özel deoksiribonükleik asit dizisi olup,kromozom stabilitesinde, gen ekspresyonunda, kromozomal replikasyonda, tümör oluşumunda, yaşlanmada ve hücre bölünmesinde rol aldığı bilinen yapılardır. Telomeraz enzimi ise nükleoprotein (nükleotid (RNA) ve proteinden oluşan) yapıda revers transkriptaz özelliği gösteren ve telomer boyundan sorumlu enzimdir. Son yıllarda, yaşlanmada telomer boyunun kısaldığının keşfedilmesiyle birlikte telomer ve telomeraz konuları bilim adamlarının bir hayli ilgisini çekmektedir.Farklı kanser tiplerinde yapılan çalışmalar, telomeraz aktivitesinin tanısal bir belirteç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Küçük miktardaki örneklerin ve vücut sıvılarının (idrar örnekleri, plevra/bronko alveoler lavaj sıvıları, asit sıvısı, pelvik/periton yıkama sıvıları) bu yöntemle incelenebilmesi,telomerazın belirteç olarak kullanım değerini arttırmaktadır.Telomeraz inhibisyonu ile özellikle kısa telomerli tümör hücrelerinde yaşam süresinin kısalması,ölümsüzleşmede ve kanser gelişiminde telomeraz reaktivasyonunun rol aldığını desteklemektedir. Ancak bazı insan tümörleri ve ölümsüz hücre serilerinin, telomeraz aktivitesi göstermemelerine rağmen uzun telomerlere sahip olmaları, telomer uzamasını sağlayan alternatif mekanizmaların bulunduğunu düşündürmektedir. İnsan telomerazının alt birimlerinin klonlanması, telomeraz aktivitesini düzenleyen genlerin keşfedilmesi ve telomerazın dışında ölümsüzleşmeye yol açan diğer mekanizmaların aydınlatılmasıyla, gerontolojide ve kanser tedavisinde sürpriz gelişmelerin olması beklenmektedir...

http://www.biyologlar.com/telomertelomeraz-ve-yaslanma

RNA ve protein sentezi posttranslasyonel posttranskripsiyonel modifikasyonu

Transkripsiyon aynen protein sentezinde oldugu gibi baslangic, uzama ve sonlanma asamalari var. DNAda replikasyon orjini denen yer vardi. Ayni sekilde DNA uzerinde promoter bolgeleri var. RNA polimerazlar bunu taniyorlar ve transkripsiyon buradan basliyor. Promoterlar; pribnow box TATAAT (-10 dize) baslangictan on dize once baslar. -35 dize var. ökaryotlarda -25 dize tata kutusu hognex box filan var. (dikkat edersen A ve Tden zengin, ezberleme bunlari, boyle promoterlar oldugunu bil) Uzama safhasinda RNA polimeraz ile uzar, burada proof reading yok. Yani kalip hatali ise yanlis RNA uretiliyor. Sonlanma; RNA DNAdan kücük oldugu icin bir yerde bitecek. Rho faktoru denen protein yapida yerler vardir. Promoterin baslatmasi gibi rho faktoru ile de sonlanma olur. Bazen de bu bolgeler yok, palindrom denen bolgeler var. 5’3’ ve 3’5’ olarak tersten okundugunda ayni olan bolgeler var. bunlara gelince sac tokasi gibi kivrilir ve sonlanir. Postranskripsiyonel modifikasyonlar; mRNAda sentez sonrasi yapilan degisiklikler. Ribozomal RNAlar ilk basta 30 50S seklinde degil prerbozomal45SrRNA diye basliyor 5.8 5 28S gibi parcalaniyor. Bu arada 45S RNA cekirdekçiktedir. tRNAlar üzerinde; her tRNA da saat 12 üzerinde a.a. baglama bolgesi 5’CCA3’ var. tum tRNAlarda ayni ve sonradan ekleniyor. Nukleotidil transferaz enzimi ile. En cok oynama mRNA seklinde yapilir. mRNAlar sentezlenirken hnRNA seklinde oluyordu. 1- 5’ ucuna metil guanozin sapkasi eklenir. (metili SAMdan gelir). 2- 3’ucuna poliA kuyrugu eklenir. Bu iki posttranskripsiyonel modifikasyon m-RNAyi 20-30 sn korumak icindir. 3- intronlarin cikartilmasi ve ekzonlarin birlestirilmesi(splicing). snRNA(proteinlerle birlesik bir RNAdir) ekson birlesmesine yardim eder. 4- Alternatif splicing yardimci (snRNA vs) kullanmadan yapilan ekson birlestirme islemidir. SLEde snRNAlara karsi otoantikorlar vardir. ß thalassemi eksonlarin yanlis birlestirilmesine en onemli ornektir. ß geni 11. kromozom uzerinde bir noktada idi iki tane kromozom oldugu icin iki tane vardi. Biri bozuksa minor ikisi bozuksa ß thalasemi major idi. Ekzonlarin birlesmis ve protein kodlayabilecek anlamli haline (modifiye ve son haldeki mRNAya) siston(?) denir. Prokaryotlarda ayni siston birden fazla proteini kodluyor olabilir ama okaryotlar monosistoniktir. Protein sentezi; translasyon, santral dogma da denir. (aynen aktarildigi icin, hatali bile olsa duzeltilmez. Aynen RNAda oldugu gibi). Her uc nukleotid bir a.a.e karsilik gelir. Buna genetik kod denir. U,C,A,G ile 4X4X4=64 varyasyon olabilir. Ama 20a.a. var. AUG metiyoninin tek sifresidir ve baslatici kodondur. Bir sürü a.a. eklenir. En son uclusu UAA, UAG, UGA stop kodonlaridir. Hatalara bi ornek verelim. UCA serin sifresi UCU olursa bu da serin olur. Bu sessiz mutasyondur. CCA olursa proline donusur, bu yanlis mutasyondur. UAA olursa da stop kodonu oldu, protein tak diye bitti bu da sacma mutasyondur. bu iki mutasyon nokta mutasyonlardir. ß zincirinde 6.a.ade glutamat yerine valin gecmesi yanlis mutasyondur ve HbS(OHA) olusur. en sik rastlanan mjutasyonlar baz degisimleridir. İki tipi var; transisyon: purin cikip purin, pirimidin cikip pirimidin gelmesi. A ile G, U ile C yer degistiriyor. Transversiyon; purin yerine pirimidin gelirse, ya da tersi. Misal, GAA glutamatin sifresidir GUA valin sifresidir. GAG yine glutamat GUG olursa valin olur. Bu ikisi de HbStir. En tehlikeli mutasyon cerceve kaymasi mutasyondur. 1,2,3,4,5,6,7,8,9 diye giden protein aslinda 123/456/789/dur. Eger aradaki ucuncu (veya daha cok) a.a. yok olsa (124/567/8910), ya da araya bir veya daha fazla a.a. gelirse cerceve kayiyor. Mutasyondan sonraki tum a.a. sifreleri degisiyor. DNAda mutasyon yapan nedenler; radyasyon, UV isinlari timinleri kaynastirir timin dimerleri olusturur demistik, bunu UV ozgun endonukleaz acar eksikliginde xeroderma pigmentosum olur demistik. Bazen X isinlari DNA uzerinde bozukluk yapiyor. X isinlarinin onarilamadigi durumlarda da Ataksi telenjiektazi olusuyor. (UV=xeroderma, X=ataksi telenjiektazi) kimyasal mutajenler; alkilleyici olan/olmayan ajanlar. Formaldehit, hidroksilamin, nitroz asit vs. interkalating ajanlar (akridinler) cerceve kaymasi mutasyonu yaparlar. Bazi maddeler ilk alindiginda, bazilari metabolize edilirken kanserojen olur. Bir maddenin kanserojenik potansiyelini gosteren testi Ames testidir. Tumor supressor genler p53, G1 ve G2 (ilk ve ikinci ayrilik) fazinda denetler. Hasarinda Kontrolsuz cogalma olur. Protein sentezi icin 1-a.a.ler 2- tRNAlar 3- aminoaçil tRNA sentetaz (a.a. ve tRNA baglanmasini saglayan enzimler) burada da ATP> AMP donusumu olur. (protein sentezinde baska yerde ATP kullanimi olmaz, yani prt sentezinde ATP dolayli yoldan kullanilir.) 4-mRNA (kalip) 5- rRNA 6-baslangic uzama ve sonlanmaya eslik eden yardimci faktorler. Baslangic uzama ve sonlanma burada da vardir. Postranslasyonel modifikasyon da var. Baslayabilmesi icin 1- 30S kucuk rRNA gereklidir. Uzamada rolu yok sadece baslangicta. 2- mRNA kaliptir o mutlaka gerekiyor, 3-metiyonin baslangic icin mutlaka gerekli, 4-GTP gerekli (ATP degil) 5-baslangic faktoru olmali. Translasyonun balslanacagi nokta, 1- E. Coliye ozel shine dalgarno dizesi AUGden ≈10 baz once olur. 30S rRNA bu diziye komplementerdir. 2- AUG kodonunu taniyan ozel tRNA ile belirlenir. Streptomisin gibi 30s inhibitoru ilaclar prt sentezini baslangic asamasinda durdururlar. Uzama icin 50S rRNA gerekli. Metiyoninden sonra gelen a.a. ile arasindaki baglari kuran enzim peptidil transferazdir. Kloramfenikol 50S inhibitorudur ama total etkisi peptit baglarinin olusumunu engelleme (peptidil transferazi engelleme) seklinde gosterir. A.a. eklendi, peptid bagi kuruldu, simdi 3 nukleotid yana kaymali rRNA. Bu yer degistirme islemine translokasyon denir. Translokasyona yardimci olan faktorlere elongating factor EF-2 denir. Difteri toksini EF-2yi inhibe eder. Klindamisin ve eritromisin de 50S inhibisyonu yaparak ve uzamayi engelleyerek etki gosterir. Fusidik asit de translokasyonu engeller. Puromisin; tirozinin aminoaçil tRNA sina yapisal analogudur (a.a. ile birlesmis tRNA). Uzama safhasinda durdurur. Peptid baginin olusumunda 50S rRNA nin icindeki 23S rRNAnın peptidil transferaz aktivitesi yer alir. (enzim aktivitesi olan RNA, ligandin de enzim aktivitesi olan proteindi.) Kloramfenikol peptidil transferazi inhibe eder. Sikloheksimid ökaryotlarda peptidiltransferazi inhibe eder. Sonlanma, son kodon olur. (Transkripsiyonu bitiren rho faktoru ya da palindromdu.) buralarda hep GTP kullanilir. Kisaltma posttranslasyonel modifikasyona ornektir (zimojenler). Sinyal peptidin kaybi; preprohormonlarin amino ucunda 15 30 a.a.lik sinyal peptid olur. İnsulinden sinyal peptit ayrilir misal. (bu da bi cesit kisalma). Glikozillenme, kandaki albumin haric butun prtler glikoprt idi. Golgide olur. Glikozit olusturan a.a.ler serin treonin asparajin idi. İlk ikisi o ikincisi n glikoziddi. Tunikamisin deoksijiromisin (?) n glikoziti bozarlar. Hidroksillenme; kollagende hidroksiprolin hidroksilizin vardi. İdrarda artisi kemik harabiyeti. Metillenme; 3metil histidin aktin ve miyozinde vardi, idrarda artisi kas yikimini gosterir. Epsilon N Metillizin de karnitin(metiyonin+lizin) sentezinde yer alir. (metil SAMdan gelir.) Karboksillenme, K vitaminine bagli pihtilasma faktorlerin aktivasyonunda gorevli a.a. gama karboksiglutamattir. (burada glutamata karboksil ekleyen her zamanki gibi biyotin degil vitamin Kdir.) osteokalsin kemikte kollajen disi en cok bulunan prtdir. Bunda da gama karboksiglutamat var. (osteokalsin aktivasyonunda gorevli a.a. diye soracaktir gama karboksiglutamati). Fosforilasyon; serin treonin ve tirozin fosforlanan a.a.lar. en onemlisi diye sorarsa da serin. Desmozin, elastine esneklik veren yapiydi ve dort tane capraz bagli lizinden olusuyordu. İzopren turevlerinin eklenmesi; kolesterol sentezi sirasinda olun izoprenlerin proteinlere eklenmesidir. Sisteinlere eklenir Ras protein ve onkogenleri, proto onkogenler ve G proteinleri izoprenlenir. Diger kovalan modifikasyonlar. Karboksilaz enzimleri mutlaka biyotin isterler ve biyotin kovalan sekilde irreversible baglanir. ß alanin KoA ve pantotenik asit yapisinda yer alan posttranslasyonel a.a.dir. Selenosistein, kendi tRNAsi olan ve bazi proteinlerin yapisina direk giren bir a.a.dir. tiyoredoksin reduktaz ve glutatyon peroksidaz yapisindadir. Sonradan katilmadigi icin posttranslasyonel değildir. Bastan girmistir.

http://www.biyologlar.com/rna-ve-protein-sentezi-posttranslasyonel-posttranskripsiyonel-modifikasyonu

Potasyum Siyanid Testi

Bu test, mikroorganizmaların potasyum siyanid (KNC) içeren besi yerlerinde canlı kalma ve üreyebilme durumlarını belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda testten, mikroorganizma cins (Citrobacter freundii (+), Salmonella (-), Arizona (-) Klebsiella (-), Enterobacter (+) ve E. coli (-) ve türleri (P. aeruginosa (+) ve Alcaligenes faecalis (-) ayırmada da işe yarar. Siyanid (CN) , bir sitokromoksidase inhibitörüdür. Demir içeren enzimler siyanid tarafından bloke edilirler. Siyanid demirle birleşerek enzimi inaktive eder. Sitokrom oksidase de ağır metalli bir pigment olup (ferro sitokrom oksidase) siyanidle birleşerek elektron transport mekanizmasını sekteye uğratır ve respirasyon durur. Oluşan inhibisyonun derecesi siyanid’in miktarı ile ilgilidir. Bazı mikroplar, ortamda 0.001 M siyanid bulununca üremezler. Materyal 1) İçinde potasyum siyanid (1/13000 KCN) bulunan sıvı ortam ( pH 7.6 ve 1 ml). 2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri 3) Kontrol pozitif (P. aeruginosa veya K. aerogenes) ve negatif (E. coli) suşlarının kültürleri 4) Ekilmemiş tüpler Metot Kültürlerden siyanidli brotha ekim yapılır ve 37 °C de 1-3 inkube edilir. Değerlendirme Pozitif olgularda tüpte üreme yoktur. Negatif durumlarda üreme meydana gelir. Sonuçlar kontrollerle karşılaştırılarak değerlendirilir. Dikkat edilecek noktalar 1) KCN çok zehirli olduğu için, bu teste çok gerekli olduğu zaman başvurulmalıdır. KCN solusyonu, pipetle ağız yardımıyla çekilmemelidir. KNC dumanları da teneffüs edilmemelidir. Şırıngadan yararlanılır. 2) Bazal ortamdaki pepton yoğunluğu %0.3 kadar olmalıdır. Yüksek konsantrasyon (%1) şüpheli sonuç verebilir (Salmonella 'larda). 3) KCN 'li besi yeri buzdolabı sıcaklığında 3-4 hafta muhafaza edilebilir. 4) Kültürlerden yapılan inokulasyonlar, bir bulanıklık oluşturmayacak durumda olmalıdır. 5) Siyanidli besi yerleri, içerlerine ferro sulfate ve alkali ilave edildikten sonra otoklava konmalıdırlar.

http://www.biyologlar.com/potasyum-siyanid-testi

Telomerlerin görevi nedir?

Telomerlerin varlığı, kromozomların uçlarının rastgele çift zincir DNA kırılmalarından koruyarak istenmeyen kromozom uçlarının birleşmesinden ya da kromozomu nükleolitik parçalanmadan korur. Kromozomların bu fiziksel korunmasının dışında, ökaryotik telomerleri, kromatin organizasyonu, kromozomların replikasyonu ve hücre çoğalmasını gibi önemli hücresel görevleri vardır. Memeli telomerleri, canlı türüne, hücre türüne ve genetik geçmişe bağlı olarak 1–50 kb telomerik DNA'ya sahip olabilir. İnsan telomerleri, üreme hücrelerinde 10–15 kb’dır, fakat bazı somatik hücrelerde ve genellikle kanser hücrelerinde daha kısadır. Bu uç diziler çok iyi korunmuşlardır. İnsan telomerleri, kromozomun uç bölgesinde bulunan ve çift iplikli arka arkaya tekrarlanan 3’ TTAGGG hekzanükleotid dizisinden oluşurlar . Bu hekzanükleotid dizileri, kement şeklinde ilmik oluşturan (T-loop) 100–200 nükleotitlik G-zengini (G-kuyruğu) sarkan 3’ tek iplikli TTAGGG dizisiyle sonlanırlar. Telomerlerin kendine özgü olan T-loop düzeni, telomerin kendi üzerine kıvrılmasıyla oluşur. Tek iplikli sarkan (overhanging) Guanin zengini tek iplik (G-kuruğu) çift iplikli telomerin “içine” girer. Bu yapı da telomer ipliklerinden birinin yerine geçerek ikinci bir ilmek olan d-loop’u oluşturur. Bu t-loop ve d-loop yapıları, telomeri diğer kromozomlarla uç uca birleşmelerden ve telomerleri kromozom kırıkları olarak algılayıp telomer tamirini başlatan hücre döngüsü kontrol noktalarından korur. Özellikle Telomerik DNA’da bulunan proteinler, ikili telomer bağlanma proteinleri olan TRF1 ve TRF2’dir. TRF1, TRF2 ve ilişkili oldukları proteinler, kompleksin oluşmasından ve T-loop oluşumundan başlıca sorumlu proteinlerdir. TRF1, intratelomerik kıvrımlarda önemlidir ve telomer uzunluğunu düzenler. TRF1’in fazla üretilmesi telomerlerin kısalmasına, inhibisyonu ise telomerin uzamasına sebep olur. TRF2 telomer uzunluğu boyunca bağlanır fakat T-loop yakınında fazla bulunur ve bu da T-loop oluşumu ve stabilizasyonu için önemlidir. Bu iki proteinin işbirliği, iki elin bir düğüm atmasına benzer, ilk el (TRF1) ilmeği (loop) oluşturur ve ikinci el (TRF2) ipliği sıkar ve korur. Telomerler her hücre döngüsünde ortalama 50–150 baz çifti azalır. Bu telomer kısalması sonuçta, hücre bölünme sayısını kısıtlar. Son zamanlarda yapılan gözlemler, telomerlerin düzenlenmesinin birçok ökaryotik hücrenin hücre döngüsünde önemli bir etken olduğunu ortaya koymuştur. Telomerik birleşmeler, mitoz sırasında kırılan disentrik kromozomların oluşmasına sebep olarak kromozom köprülerinin, kırıklarının ve birleşmelerin oluşmasını sağlarlar. Sonuçta hayatta kalan hücrelerin genomlarında değişiklikler olur. Fonksiyonel olmayan kromozom uçları ve genomdaki dengesizlik ayrıca telomer uzunluğunda değişiklik olmasına sebep olur. Bu da, hücre yaşlanması kontrolünde hızlanmaya ya da gecikmeye sebep olur. Bu yüzden fonksiyonel olmayan telomerler, genetik bilginin kaybolmasına, yeniden düzenlenmesine ya da dengesinin kaybolmasına sebep olur. Bu genomik değişiklikler de sonuçta hem kansere hem de fenotipin yaşlanmasına sebep olur. Hücre bölünmesinin devamlılığını sağlamak için üreme hücrelerinde, klonal gelişme gösteren lenfositlerde ve ölümsüz kanser hücrelerinde telomerlerin korunması gerekmektedir. Telomer uzunluğunun korunmasını sağlayan en bilinen yöntem, telomerlerin de novo olarak üretilmesi ve telomeri kapaması için telomerazın verilmesidir.

http://www.biyologlar.com/telomerlerin-gorevi-nedir

Doğal öldürücü hücre nedir ?

Doğal öldürücü hücre veya doğal kātil hücre diye adlandırılan bir çeşit lenfosit hücresi. Doğal öldürücü hücreler kemik iliğinde yapılırlar, kan, kemik iliği ve dalakta bulunurlar. Doğal bağışıklığın bir parçasını oluşturan doğal öldürücü hücrelerin uyarılmaya ihtiyaçları yoktur. Mikropları direkt saldırarak imhā etmezler, bunun yerine virüsler tarafından enfekte edilmiş vücut hücrelerine ve kanser hücrelerine saldırırlar. Doğal kātil hücreler bağışıklık sisteminin özelleşmemiş savunma hücreleridir. Doğal kātil hücreler (NK - Natural Killers) kandaki lenfositlerin %10’unu oluşturur. Bunlar, T ve B lenfositlerde bulunan, antijen reseptörleri için gen kodlanmasının yeniden düzenlenmesinden yoksundur. NK hücreler, MHC sınıf 1 moleküllerinin normal seviyelerini gösteren hücrelere saldırmaz, ancak yabancı MHC’leri öldürürler, öyle ki MHC I ifadesi azalmış olan veya namevcut olan olanları da öldürürler. Bu durum, sıklıkla viral enfeksiyonlarda ve kanserde görülür. NK hücreleri periferik kanda, azurofilik (kırmızı) granüller içeren büyük lenfositler olarak saptanabilir. (büyük lenfositler = large granular lymphocytes – LGLs) Doğal öldürücü hücreler büyük görünümlü lenfositlerdendir, fagositik değillerdir (fagositoz yapamazlar). Saldırdıkları hücrenin zarını zayıflatıp su ve iyonların hücrenin içine difüze olmasını (girmesini) sağlarlar. Artan basınç nedeniyle saldırılan hücre parçalanır. NK Hücrelerinin Gelişimi CD7,CD2 ve bazen de CD5 taşıyan NK-hücre/T-hücre progenitörleri kemik ilinde, fetal karaciğerde ve timusta bulunur. Kemik iliği stromal hücrelerinde çok sayıda üretilen IL-15, NK hücrelerinin ayırt edilmesinde çok önemlidir;IL-2 ve IL-18 ise NK hücrelerinin daha ileri olgunlaşmalarına yardımcı olmaktadır. IgG’nin Fc bölümü için olan düşük afiniteli (eğilimli, yakın ilgili) reseptör (CD16) ve CD56 adhezyon (yapışma/yapıştırma) molekülü tipik NK hücresi işaretleyicileridir. NK Hücreleri Tarafından Hedefin Tanınması En çok sayıda aktive edici ve inhibe edici NK-hücre reseptörleri kromozom 19 geni üzerinde kodlanmıştır. NKp46,NKp30 ve NKp44 (doğal sitotoksik reseptörler , NCRs) gibi aktive edici reseptörler, NK-hücrelerin hedef hücrelere “kilitlenmesini” sağlamaktadır. Bunlar imminoglobülin (Ig) süperfamilyasına (/ailesine) aittir ve küçük intrasitoplazmik kuyrukları vardır. Bu nedenle doğal kātil hücrelerin aktivitelerini tetikleyebilmek için  zinciri, FcRl ve DAP12 gibi uyum sağlayıcı polipeptidlerle birleşme gereksinimi duyarlar. Bunların ligandları hala bilinmemektedir. Dördüncü tetikleyici reseptör NKG2D’dir. Bu uyum sağlayıcı molekül DAP10 ile birleşen bir C-tipi lektin homodimerdir. NKG2D reseptörleri MICA ve MICB denilen MHC sınıf I bağlantılı proteinlerle birbirlerini etkilemektedirler, ki bu proteinler normal hücrelerde zayıf olarak ifade edilir lakin üst düzenlenmeleri stres hücrelerinde ve tümör hücrelerinde yapılır. Bu proteinler klasik MHC 1 moleküllerine benzerler fakat peptidlerle bağ yapmazlar ve 2 mikroglobülinlerle birleşmezler. Pek çok reseptör, klasik MHC molekülü tanımlamalarıyla karıştırılır. Antijene özel T hücrelerinden farklı olarak, bu reseptörler genellikle farklı HLA sınıf I alellerinden oluşan bütün takımı tanır fakat peptid/MHC komplekslerini tanımaz. Bunlar iki büyük familya (aile) olarak gruplandırılabilirler: kātil hüce immünoglobülin benzeri reseptörler (killer cells immunoglobulin-like receptors –KIRs) ve immünoglobülin benzeri kopyalar (immunoglobulin-like transcripts – ILTs, ayrıca leukocyte immunoglobulin-like receptors yani lökosit immunoglobulin benzeri reseptörler – LIRs- olarak da bilinirler). KIR’lar sadece NK hücrelerde ve T-hüclerinin bir alt grubunda bulunurken, ILT/LIR’lar aynı zamanda monositler, dentritik hücreler ve B hücrelerinde de bulunur. Bu reseptörler, çoğunlukla intrasitoplazmik kuyruklarının yapısına bağlı olarak, aktivasyon veya inhibisyona aracılık ederler. Çoğu durumda, uzun sitoplazmik kuyruk, immünoreseptör tirozince zengin inhibisyon motifi (immunoreceptor Tyrosine-rich inhibition motif –ITIM)’ın varlığını belirtir. ITIM, aktive edicireseptörlerden gelen hücre içi uyum sağlama sinyallerini bloke etmekten sorumlu özgül bir fosfatazı tetikler. Kısa sitoplazmik kuyruklu reseptörler ITIM’dan yoksundur ve aktive edici sinyale uyum sağlamak için ITAM (immünoreseptör tirozin içerikli aktive edici motif – immunoreceptor tyrosine-based activating motif) içeren adaptör moleküller DAP12 veya FcR gibi uyum sağlayıcı polipeptidlerle birleşirler. KIR ve LIR familyalarının (ailelerinin) her ikisi için de bir düzineden fazla farklı reseptör tanımlanmıştır. NK hücre reseptörlerinin 3. sınıfı, C-tipi lektin-benzeri reseptör ailesine aittir (daha önce aktive edici NKG2D reseptörleri olarak bahsedildiği gibi). Buna rağmen çoğu NK reseptörleri hem aktive edici hem de inhibe edici izoformlarda bulunmaktadır, bu gösterir ki ITIM ilişkili reseptörlerden gelen inhibe edici sinyaller çoğunlukla aktive edici sinyallerden baskın olmaktadır. NK Hücrelerin Sitolitik Mekanizmaları Hedef hücrelerin, programlanmış hücre ölümü veya apoptozis tanımlarını da kapsayan “hücre intiharı”nı tetikleyici CD95 antijeni (Fas veya APO-1 de denir) gibi apoptozis reseptörleri olması nonsecretory (salgısız) liziz gerektirir. NK hücrelerinin en yaygın liziz mekanizması litik granül salmalarıdır. Granüller, konukçu hücrenin membranında porlar yaratan bir protein olan perforin ve farklı proteinazların oluşturduğu bir grup olan granzimleri içerir. Perforin varlığında, granzim B hücre ölümüne neden olan kaspazları (caspase) aktive ettiğin hücre çekirdeğine (nukleusuna) ulaşır. NK hücreleri antibadi kaplı hücreleri yok edebilirler. Antibadinin, NK hücresi üzerindeki Fc reseptörüne (CD16) bağlanması, proteolitik enzim salınmasına neden olarak antibadiye bağlı hücre aracılı sitotoksiklik (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity – ADCC) sitolitik programını aktive eder.

http://www.biyologlar.com/dogal-oldurucu-hucre-nedir-

 
3WTURK CMS v6.03WTURK CMS v6.0