PCR Polimeraz zincir reaksiyonu nasıl yapılır
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir in vitro ve in vivo DNA amplifikasyon metodudur, reaksiyonlar farklı sıcaklıklardaki üç olayın sikluslar halinde tekrarına dayanmaktadır.
PCR ile DNA fragmentleri çoğaltılabilir ve çok küçük örneklerden analizler için yeterli miktarlar elde edilebilir.
Gerekli olan reaktifler:
1) kalıp olarak kullanılacak DNA (genomik DNA);
2) iki tane tek iplikli sentetik DNA oligonükleotidi (forward ve reverse primer), PCR yapılmak istenen gen dizisini belirler;
3) dört tip deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs);
4) yüksek ısıda çalışabilecek bir DNA polimeraz (Taq DNA pol.).
PCR üç ana siklusun tekrarlarından meydana gelir:
- denatürasyon 94ºC’de çift iplikçikli DNA’nın iki tek iplikçiğe ayrılması;
- annealing (eşleşme) 50-60ºC’de primerlerin tek iplikçik halindeki kalıp DNA’ya spesifik olarak bağlanmaları;
- extension (sentez) 72ºC’de, primerlerle sınırlandırılmış olan bölgenin Taq pol. tarafından amplifikasyonu.
Deneturasyon ve extension fazlarındaki ısılar değizmezken annealing (eşleşme) ısısı istenen DNA dizisinin AT/GC içeriğine göre değişir. Sikluslar yaklaşık 30 defa tekrar edilir. Yeni sentezlenen fragmentler bir sonraki siklusta kalıp görevi görürler böylelikle her siklusta çoğaltılmak istenen dizinin logaritmik (2n, n=30-35 döngü) bir artışı söz konusudur. PCR ile 150–3000 nükleotidlik diziler çoğaltılabilir.
primerler 1 mM
dNTP’s 2 mM
10 X Buffer (MBI) 1x
MgCl 1.50 mM
Taq(MBI) 1U
DNA 100 ng