MOLEKÜLER MARKERLAR
Bitkiler; virüs, bakteri, fungus, nematod ve böcekler tarafından saldırıya uğramaktadırlar. Bitkiler bunlara karşı kendilerini koruyacak bağışıklık sistemlerine sahip değillerdir. Bununla birlikte kendilerini korumak için ya devamlı yada teşviklenme durumunda faaliyete geçen antimikrobial savunma mekanizmaları ve dayanıklılık genleri (R) taşımaktadırlar. Dayanıklılık ıslahının amacı, dayanıklı genlerinin belirlenmesi, kültür bitkilerine aktarılması ve klonlanmasıdır. Dayanıklılık genlerinin belirlenmesi, geleneksel yöntemlere göre uzun zaman almakta ve gözlemlemek zordur. Moleküler markörler kullanılarak bu zorluklar ortadan kaldırılmaktadır.
MOLEKÜLER MARKÖRLER
Moleküler markörler, genomda herhangi bir gen bölgesi yada gen bölgesi ile ilişkili DNA parçasıdır. Bu markörler, polimeraz zincir reaksiyonuna bağlı olmayanlar (RFLP) ve bağlı olanlar (RAPD, AFLP, SSR) olarak adlandırılmaktadır.
1. Kesilen Fragmentlerin Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms, RFLP)
İlk keşfedilen moleküler markör sistemidir. Üzerinde çalışılan bitkinin DNA’sı çeşitli restriksiyon enzimleri ile kesilir ve agorozda bir güç kaynağı yardımı ile yürütülür. DNA’lar southern çalışılan bitkinin DNA’sı çeşitli restriksiyon enzimleri ile kesilir ve agorozda bir güç kaynağı yardımı ile yürütülür. DNA’lar southern blot tekniği kullanılarak naylon menbrana aktarılır. Markör olarak kullanılan DNA parçacıkları P32 veya biotin ile işaretlenir ve membran da bulunan kesilmiş DNA’lar ile eşleşmeye (hibridizasyona) tabi tutulur. Film geliştirilerek elde edilen sonuçlar değerlendirilerek dayanıklı ve duyarlı bitkiler arasında farklılık (polimorfizm) bulmaya çalışılır. Çok fazla DNA’ya ihtiyaç duyulması, pahalı ve fazla zaman alması tekniğin dezavantajını; sonuçların güvenirliği ve kodominat marker sistemine sahip olması ise avantajını oluşturmaktadır.
2. Değişken DNA Dizilerinin Tesadüfen Çoğaltılması (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)
RFLP metodundaki zorlukları aşmak ve PCR tekniğinin getirdiği avantajlardan yararlanmak amacıyla RAPD tekniği geliştirilmiştir. Sistemin temeli, dayanıklı ve duyarlı bitkiler rasgele üretilmiş 6-10 baz uzunluğundaki RAPD primerleriyle PCR yapılması ve bireyler arasında farklılığın belirlenmesidir. PCR esnasında primerler tesadüfi olarak genoma bağlanmakta ve bağlanılan bölgeler çoğaltılmaktadır. PCR ürünleri, elektroforesis edildikten sonra ethidium bromide ile boyanarak oluşan polimorfik bantlar dikkate alınarak dayanıklı ve duyarlı bireyler birbirlerinden ayrılmaktadır. Kullanılan her RAPD primeri için oluşan PCR ürünleri iki grup içerisinde incelenmektedir. Birincisi değişken olarak adlandırılırlar ve bunlar nükleotitlerdeki inversiyon, delesyon (silinme) ve primer bağlanma bölgelerindeki nükleotit değişikliğinden kaynaklanmaktadır. İkincisi değişken olmayanlar (monomorfik) olarak adlandırılmaktadırlar (Williams ve ark., 1990)
RAPD analizi temelde basittir ve tekniği kullanmak için dizilim (sekans) analizine gerek yoktur. Uygulanması hızlı ve kolaydır. Çoğaltma işlemi normal PCR koşullarından farklı olmakta, primer bağlanma sıcaklığı çok düşük (35-37 oC) tutulmakta ve tek bir primer kullanılmaktadır. Markörün uygulamasının hızlı ve kolay olması avantajını; yalnızca dominant markerler oluşturulması, PCR esnasında yanlış eşleşmelerin oluşu, PCR şartlarındaki küçük bir değişmenin bile sonuçları etkilemesi ve laboratuarlar arasında tekrarlanma problemine neden olması tekniğin dezavantajını oluşturmaktadır.(Williams ve ark., 1990; Santos ve ark., 1994; Thormann ve ark., 1994).
3. Çoğaltılan Fragmentlerin Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Length Polymorphisms, AFLP)
Yeni bir markör sistemi olarak geliştirilmiştir (Vos ve ark., 1995). Ebeveynler ve ıslah sonucu elde edilen bireylerin DNA’ları iki restriksiyon enzimiyle (4 baz ve 6 baz) kesilmekte ve DNA’nın kesilmesi sonucu oluşan bu DNA parçacıkları adaptörlerle birleştirme (ligasyon) yapılmaktadır. Ligasyon ürünleri birer baz ilave edilmiş primerlerle PCR yapılmakta ve elde edilen PCR ürünleri 3 baz ilave edilmiş primerlerle (primerlerin birisi radyoaktif veya fluoresent ile işaretlenmekte) secici PCR tabi tutulmaktadır. PCR ürünleri poliakrilamid jelde yürütülerek oluşan polimorfizme göre sonuçlar değerlendirilmektedir. Tek bir reaksiyonda 30-150 bölge tanımlanabilmesi, sonuçların tekrarlanabilir olması en önemli avantajını oluşturmaktadır. Dezavantajı ise pahalı olması, laboratuar ekipmanına gereksinim duyulması ve dominat markör olmasıdır (Vos ve ark., 1995; Ridout ve Donini, 1999).
4. Basit Tekrarlı Diziler (Simple Sequence Repeats SSR)
Canlı genomunda çok sıklıkla tekrarlanan DNA dizileri bulunmaktadır. Bu diziler belirli sayılarda tekrarlanmaktadır. Dizilerin genomun neresinde bulunduğu ve kaç defa tekrarlandığı türden türe değişiklik göstermektedir. Aynı tür içindeki fertler arasında da bu dizilerin bulunup bulunmamasına dayalı olarak SSR tekniği geliştirilmiştir. Tekrarlanan bölgelere özgü spesifik primerler geliştirilmekte ve bu primerler ile PCR yapılmaktadır. PCR ürünleri, elektroforesis yapıldıktan sonra ethidium bromide veya gümüş nitrat kullanılarak boyandıktan sonra polimorfizim aranmaktadır. Tekniğin, kodominant yapı göstermesi ve tekrarlanabilir olması en önemli avantajını; genom bilgisine ve dizilim analizine ihtiyac duyulması dezavantajını oluşturmaktadır (Rangwen ve ark., 1995; Ridout ve Donini, 1999).
MOLEKÜLER MARKÖRLERİN GÖRÜNÜŞLERİNE GÖRE SINIFLANDIRILMASI
1. Dominant markörler : Alleller arası ilişkide dominantlık söz konusu olduğundan heterozigot bireyleri (Aa) belirlemek mümkün değildir.
2. Kodominant markörler: Alleller arası ilişkide dominantlık söz konusu olmadığı için heterozigot bireyleri (Aa) homozigot dominant (AA) bireylerden ayırt etmek mümkündür. Bu yüzden herhangi bir noktadaki marker için üç ayrı şekil (AA, Aa ve aa) elde edilebilir ve bunlar birbirlerinden ayrılabilmektedir.
MOLEKÜLER MARKÖRLERİN ÖZELLİKLERİ
Moleküler markörler morfolojik ve biyokimyasal markörlere göre bir çok avantajlara sahiptirler (Botstein ve ark., 1980; Helentjaris ve ark., 1985; Williams ve ark., 1990). Bunlar;
a. Genoma bağlı olduklarından güvenirlidirler,
b. Tekrarlanabilir ve laboratuarlar arasında standardize edilebilirler,
c. Genomda birden fazla bölgeyi belirleme imkanına sahiptirler,
d.Çevre koşullarından etkilenmemektedirler,
e. Dominat ve kodominat özellik göstermektedirler,
f.Bütün dokularda tanımlanabilmektedirler,
g. Markörler öldürücü etkiye sahip değillerdir.
MOLEKÜLER MARKÖRLERİN DAYANIKLILIK ISLAHINDA KULLANILMASI
Dayanıklılık, hastalık ve zararlı etmeninin çoğalma ve gelişmesinin bitki tarafından engellenmesidir (Roberts 2002). Bitkinin hastalık ve zararlı etmenine karşı dayanıklılığı; düşük, orta ve yüksek düzeyde gerçekleşmektedir. Bitki yüksek düzeyde dayanıklı ise patojen hiç çoğalamamakta veya çok az düzeyde çoğalabilmekte, orta ve düşük dayanıklılıkta ise hastalık ve zararlı etmeni belli düzeyde çoğalabilmektedir (Roberts 2002). Buna karşın duyarlı bitkide dayanıklılığın tam tersi olaylar görülmektedir. Bu durumda hastalık ve zararlı etmeni tamamen çoğalmakta ve yoğun enfeksiyonlarda bitkinin ölümüne neden olmaktadırlar.
Dayanıklılık kalıtsal olarak; tek gen (monogenic), birkaç gen (oligogenic) ve çok gen (polygenic) tarafından idare edilmektedir. Dayanıklılığın tek gen, birkaç gen ve çok gen tarafından idare edilmesinin bilinmesi ıslah çalışmaları için büyük önem taşımaktadır. Tek gen tarafından idare edilen dayanıklılık ıslahı çalışmaları, diğerlerine göre oldukça basit ve sonuç elde edilmesi daha kolaydır. Çok gen tarafından yönetilen dayanıklılıkta genomda bir çok bölge etkili olduğundan genel olarak Mendel’in genetik açılım oranlarına uygun olmayabilmektedir (Geiger, 1989). Bu durum kantitatif olarak ölçülebilmekte ve bunlar QTL (Quantitative Trait Loci) olarak adlandırılmaktadırlar (Young, 1996) QTL üzerine çevre ve genler arası interaksiyonlar büyük rol oynamaktadır. Bu bölgelerin her birinin etki dereceleri birbirlerinden farklı olmakta ve çevre şartlarından fazla etkilenmektedirler. Çevrenin etkisinin fazla olması bu gibi dayanıklılık durumlarını belirlemeyi güçleştirmektedir (Tanksley 1993).
Başta çok gen olmak üzere, birkaç gen ve tek gen tarafından idare edilen dayanıklılık özelliklerini (karakterleri) normal olarak geleneksel ıslah yöntemleri ile belirlemek zaman almakta, fazla iş gücü gerektirmekte ve çok güç olmaktadır. Bununla birlikte bir bitkiyi aynı anda birden fazla hastalık veya zararlı etmenle testlemek geleneksel yöntemlere göre hemen hemen imkansızdır. Bütün bu zorluklar moleküler markörlerin devreye girmesiyle aşılabilmektedir (Ballvora ve ark., 1995; Bradshaw ve ark., 1998; Lu ve ark., 1999).
Moleküler markörlerin uygulamaya aktarılabilmesi için ilk önce üzerinde çalışılan hastalık ve zararlı etmenine karşı dayanıklılıktan sorumlu gen kaynağının klasik yöntemlerle belirlenmesi gerekmektedir. Hastalık ve zararlılara karşı dayanıklılık genleri çoğunlukla bitkilerin yabani formlarında bulunmakta ve bu genler melezleme çalışmaları ile yabani bitkilerin kültür formlarına aktarılmaktadır (Boerma ve Hussey, 1992). Kimi durumlarda dayanıklılık geni veya genlerini taşıyan yabani türler ile bunların kültür formları arasındaki melezlemeler başarılı olmamakta ve istenilen dayanıklılık geni aktarılamamaktadır. Bu durum dayanıklılık ıslahı çalışmalarına sınırlama getirmektedir. Bu sınırlamalar, doku kültürü ve gen aktarım yöntemleri (Agrobacterium tümefaciens, biyolistik, elektroporasyon, mikroenjeksiyon vb.) kullanılarak aşılmaya çalışılmaktadır (Boerma ve Hussey, 1992; Vrain, 1999).
Dayanıklılık ıslahı çalışmalarında moleküler markörler: a) Dayanıklılık geni ile ilgili markör oluşturulmuş veya gen klonlanmış b) Dayanıklılık geni ile ilgili markör oluşturulmamış veya gen klonlanmamış ise uygulamada farklılıklar göstermektedir. Dayanıklılık geni ile ilgili moleküler markör veya markörlerin daha önceden oluşturulması veya genin klonlanması dayanıklılık ıslahı çalışmalarına büyük kolaylıklar getirmektedir. Üzerinde çalışılan dayanıklılık geniyle ilgili markör veya gene özgü primerler kullanılarak ebeveynler ve ıslah sonucu elde edilen bireyler (F1, F2 vb) fide döneminde PCR ile hızlı ve güvenli şekilde belirlenmektedir. Moleküler markörlerin bu gibi uygulamaları ıslah çalışmalarında, Markör Yardımcı Seleksiyon (MAS) olarak adlandırılmaktadır (Staub, 1996; Baird ve ark., 1996). MAS kullanılarak dayanıklı bireyler hızlı şekilde belirlendiği için ıslah çalışmalarına büyük bir ivme kazandırmakta ve yalnızca istenilen bireylerle yola devam etmeyi sağlamaktadır.
Moleküler markörlerin bir diğer uygulama alanı olmadığı veya genin klonlanmadığı durumlarda başvurulmaktadır. Bu durumda, ilk önce dayanıklılık geniyle ilgili moleküler markör oluşturulmakta ve gen haritalanmaktadır. Bunun için ıslah yöntemleri kullanılarak F2, BC ve rekombinat inbred hatlar oluşturulmaktadır. Daha sonra moleküler markörler kullanılarak gen ile ilgili moleküler markör veya markörler oluşturularak gen haritalanmaktadır. Gen klonlama yöntemleri kullanılarak da (cDNA
kütüphanelerin oluşturulması, kromozom üzerinde yürüme ve transposon mimleme) gen izole edilmektedir.Bu tür uygulamalar belli zaman ve işgücü gerektirmektedir. Bununla birlikte oluşturulan markör veya genin izolasyonu daha sonra yapılan ıslah çalışmalara büyük kolaylıklar sağlamaktadır. Çünkü elde edilen sonuçlar birebir ıslah uygulamalarına aktarılarak, ıslahı kısaltmakta ve kolaylaştırmaktadır.
Sonuç olarak; moleküler markörler, dayanıklılık ıslahı çalışmalarının hedefine daha hızlı ve güvenli şekilde ulaşmasını ve dayanıklılıktan sorumlu genlerin klonlanmasını sağlayan en önemli tekniklerdir.
Alıntıdır...
Genetik
-
İnsanlarda Kaç Kromozom Vardır?
-
Sık görülen mikrodelesyon sendromları nelerdir?
-
Bilim insanları kromozomları nasıl inceler?
-
Arkea'da Kromozomlar ve DNA Replikasyonu
-
DNA Onarım Mekanizmaları Nelerdir?
-
DNA hasarına neden olan etkenler nelerdir?
-
XYY Süper Erkek Sendromu - JACOB’S, Sendromu
-
Bitki doku kültürü çalışmaları ile haploid bitkiler elde edilebilir
-
Gram pozitif bakterilerden genomik DNA izolasyon protokolü
-
E. coli bakterisinden genomik DNA izolasyon protokolü
-
DNA’nın Keşfi
-
İnsan Genom Projesi Nedir ? Amaçları Nelerdir ?
-
Genomik mikrodizilimlerle ikilenme teşhisi yöntemi
-
Gen duplikasyonu ve amplifikasyonu nedir?
-
DNA ile RNA Arasndaki Farklar ve Benzerlikler Nelerdir