Gen Klonlanmasında Rekombinant DNA Teknolojisi
Daha önceki bölümlerde aşamalarını anlattığım ve oluşturulan rDNA 'ların hücrelere aktarılması sırasında çeşitli yöntemler kullanılır.
Rekombinant DNA moleküllerin hücreye aktarılması sırasında(bu hücreler konak hücrelerdir) rekombinant molekülün aktarılacağı organizmaya bağlı olarak çeşitli aktarım (transfer) yöntemleri mevcut olup, aktarım işlemi, "transformasyon" adını alır.
Bu yöntemler;
1)Kimyasal teknikler(kalsiyum-fosfat transfeksiyonu)
2)Fiziksel teknikler(mikroenjeksiyon, elektroporasyon ve kimyasal porasyon,biyolistik)
3)Füzyon teknikleri
4)Viral teknikler
olarak dört gruba ayrılır.
AMAÇ??
istenilen genin, yeni hücreye girip, anlatım yapması!!!
Kimyasal Tekniklerden, kalsiyum-fosfat transfeksiyonu; bu yöntem, istenilern geni ve ekspresyon için gerekli elementleri, konak hücre üstüne çöktürme yöntemidir.Plazmit DNA, kalsiyum-fosfat ile çöktürülüp, hedef hücrrnin bu yapıyı endositoz/fagositoz ile içine alması sağlanır.Böylece bu çözeltiyi sindirerek hücre içine alan hücreler, istenilen genin anlatımını gerçekleştirmiş olurlar.Genellikle bu gücrelerdeki plazmit vektörler çoğalmazlar, kalıcı olarak hücre içinde yar alırlar.Genelde seçilen genler, antibiyotiğe karşı direnç genleridir.Bu işlemde plazmit vektör çoğalması söz konusu olmadığından transformasyon değil, transfeksiyon denir.Çünkü transformasyon, hücrenin kontrolsüz büyümesi anlamına gelir.
Fiziksel tekniklerden, mikroenjeksiyon; zahmetli fakat verimli bir tekniktir.DNA molekülü, mikroskop altında, çok ince uçlu pipet yardımıyla hücrenin sitoplazmasına veya çekirdeğine doğrudan aktarılır.Memeli hücre ve embriyolarında, bitki protoplast ve dokularında başarıyla uygulanmaktadır.Memeli hayvanların döllenmiş yumurtalarına, bu yolla gen aktarımı yapılarak, transgenik haycan elde edilmiş olunur.Bu işlem sonucunda çok sayıda hücre elde etmek mimkün değildir.Çünkü az sayıda DNA injekte edilebilinir.
Fiziksel tekniklerden, elektroporasyon; membrana elektrik akımı verilerek, membranda küçük delikler açılması sağlanır.Bu delikler, nükleik asitlerin geçişine olanak sağlarlar.Bu delikler, her hücrede, farklı elektrik akım gücü ve farklı sürelerde elektrik akımı verilmesiyle gerçekleşir.Bu teknik, insan, bakteri, maya hücrelerinde gen aktarımı için kullanılmakadır.
Fiziksel tekniklerden, biyolistik; bu yöntemde, küçük çaptaki metal partiküllerine sarılmış DNA molekülleri bulunur.Bu metal partikğlleri, altın ya da tungsten elementleri olabilir.Bir mikroprojektil denen bir nevi silaha benzeyen alet ile, bu metal partikülleine sarılı DNA 'lar hücreye bombardıman edilir.Böylelikle hücrenin içine giren bu yapılardan bazıları bu metal partüküllerinden ayrılır ve hücre genomu ile birleşir.Mitokontri ve kloroplast organellerinde kullanılan yegane yöntemdir.Ayrıca bitki hücrelerine gen transferi için de kullanılır.
Füzyon teknikleri; iki hücrenin, genetik içeriğinin birleştirirlmesi işlermi olup, amaç iki ebeveyinin farklı özellliklerini taşıyan bir hibrit oluşturmaktır.İstenilen iki ebeveyn genlerini, hedef hücreye aktarılmak için iki farklı füzyon tekniği mevcuttur.
a)istenilen genleri bazı taşıyıcılar ile( lipozom, eritrosit) hücreye aktarma yöntemi; bu yöntemde örneğin lipozomlar, duvarsız hücre ile etkileşirler ve lipozom içeriği, hücrenin içine aktarılır.Bu gen aktarımında, memeli hücresinin metafaz evresindeki kromozomlar, lipozomlara bağlanır ve kromozomların hücre içine girmesi sağlanır.Böylece oluşan hibrit hücreler, seçici ortamda üretilerek aktarılan gen yönünden incelenirler.Bu transfekte hücre genleri, DNA' da geçici olarak anlatılabilirler.
b)İki farklı hücrenin birleştirilmesi tekniğidir.Monoklonal antikor eldesi için( hibridoma tekniği) kullanılan bir yöntemdir.
Viral teknilkler; genetik materyali hücrelere aktarmak için virüslerden yararlanılır.Bu virüsler DNA/RNA genetik materyali taşıyan virüslerdir.Bu yöntemde bakterinin enfekte edilip öldürülmesi söz konusu değildir.Bakterinin genomuna giren, onunla birlikte anlatım yapan ve stabilitesinin korunmasını sağlayan vektör olarak kullanılan virüslerden üretilmiş vektörler "baculovirus" ya da "vaccine" viral vektörleri olabilir.Lambda vektörleri ve çeşitleri en sık kullanılan vektörlerdir.
Hayvan hücrelerinde transformasyon(hayvan hücrelerine gen aktarımı);
*Mikroenjeksiyon
*embriyonik kök hücre
*gen terapisi(temelinde, hasta kişinin genlerini, iyileştirici proteinler üretecek şekilde değiştirmek yatıyor)-retroviral transformasyon
mikroenjeksiyon; verimli yumurtalar ayrılır ve DNA 'lar(somatik hücredeki DNA'lar)yumurta hücresinin pronüklousunun içine enjekte edilir.(yumurta hücresindeki çekirdek içeriği daha önce çıkarılmıştır)Hücre bölünmesi süresince, DNA, kromozomlara yerleşmiş olur.Enjekte edilmiş genler, sonucu elde edilen emriyo, taşıyıca anneye yani dişi konak canlıya enjekte edilir.Hamilelik dönemi oluşur ve devam eder.Sonunda, soyların, aktarılmış DNA 'ları barındırıp barındırmadığı tespit edilir.En iyi şartlarda, %1-5 arasında bir başarı elde edilir.
Embriyonik kök hücre; embriyonik kök hücreler, blostosist dönemindeki hücrenin iç membranından alınan yapılardır.ESC(embriyonik kök hücre), DNA ile mikroenjeksiyona tabi tutulur.ESC, erken embriyo safhasındaki embriyoya injekte edilmiştir.Bu olay "kimera" yani hibrit embriyo olarak adlandırırlır.Transforme edilmiş hücrelerin, germ hücresine gelişmesi beklenir.Bir sonraki kuşaklar "kimera" söz konusu olduğu için (hibrit embriyo) tamamen transgenik soyları oluşturacaktır.
Retroviral transformasyon; virüslerden yararlanılır ve virüslerin doğal olarak barındırdığı avantajlardan yararlanılır örneğin, her virüs kendine özgü, infekte edebileceği bir konak hücreye sahiptir.Modifiye edilmiş viral vektörler ile ilgili DNA'lara karşı görevlendirilirler.
Bitki hücrelerinde transformasyon ( bitkilere gen aktarımı);
*Agrobacterium aracılığı ile; bir toprak bakterisidir.DNA'yı bitkilere yapışarak, doğal olarak aktarır.
*Biyolistik
*Elektroporasyon
*Mikroenjeksiyon
Agrobacterium tumefaciens bakterisinin, bitki hücrelerini enfekte edip gebnetik materyalini bitkiye aktaran ve tümor oluşumunu sağlayan yani bitki hücreini enfekte etmesini sağlayan, dairesel plazmit yapısı "Ti plazmit".Ti plazmit, RNA bulundurmaz, GC içeriği %56 oranında olup, içeriğindeki genetik materyalin %81'i gen kodlar.Bu plazmit, transgenik bitki eldesi için önemli olmakla birlikte, dikodiledon bitkilere uygulanan bir işlemdir.Ti plazmit genel olarak bitki genomuna entegre olan bir ya da daha fazla TDNA bölgesi, bir vir bölgesi, bir replikasyon merkezi, konjugatif transferin gerçekleşmesini sağlayan bir bölge ve opin katabolizması için gerekli olan genleri içerirler .
İkili vektörler;Vir bölgesi ve gen AYRI vektörler üzerindenir.TDNA kısmı çıkarılmıştır.
ko-entegratif vektörler;Vir bölgesi ve gen aynı vektör üzerindedir.TDNA kısmı vektörün üzerindedir.
Ti plazmit vektöründe;
SOL sınır'a yakın ;selektif genler sol sınıra yakın klonlanır.
SAĞ sınır'a yakın;istenilen gen, sağ sınıra yakın klonlanır.
Enfekte işlemi;
*Enfektif Ti plazmidi hazırdır.
*T-DNA bölgesi VirD2' ye bağlı olarak(hareketi sağlar) ayrılır.
*TDNA, proteinlerle kaplanır.(VirE2 mevcudiyetinde)
*Bakteri T-DNA'sı, kanaldan bitki hücresine geçer.
*T-DNA-protein kompleksi bitki sitoplazmasında ilerler
*Bitki nükleusuna girerek genoma entegre olur.
*Oksin, sitokinin ve opin hormonları sentezi ile hücre sayısında artış görülür.(tümör oluşması kontrolsüz hücre bölünmesidir)
*Taç tümörü oluşumu ile süreç sonlanır.
kaynak; vikipedi, Gene Cloning and DNA Analysis T.Brown
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar