FİKSASYONUN ETKİLERİ
Otoliz, hücrelerin ölümünden sonra intraselüler enzimlerin hareketinin değişmesi ile protein yıkımına ve sonuçta hücrelerin sıvı hale gelmesine yol açar. Otolitik değişiklikler herhangibir bakteriyel hareketten bağımsızdırlar, soğukla geciktirilir, 37 C de muhafaza etmek önemli ölçüde hızlandırır. Doku 57 C'ye ısıtılırsa hemen hemen tamamen inhibe edilir. Otoliz, beyin, böbrek gibi çok iyi özelleşmiş organları , elastik fibriller, kollajen gibi yapılardan daha hızlı ve ciddi olarak etkilemektedir. Mikroskobik incelemede otoliz olmuş dokunun hücre çekirdekleri kondensasyon (piknoz), fragmentasyon (karyoreksis), lizis veya görülmeme (karyolizis) gösterebilir. Sitoplazma şişmiş ve granüler hale gelebilir ve tüm doku sonradan boyama reaksiyonunda kayıp veya büyük değişimle granüler ve homojenöz kütle haline dönüşür. Otoliz, epitelin dökülmesine, hücrelerin bazal membrandan ayrılmasına yol açar. Ek olarak teşhis önemi olan maddeler (örn.glikojen) miktarca azalır ve uygun fiksasyonun olmayışından dokuda yayılırlar.
Bakterilerin dokularda yol açtıkları değişiklikler otolizdekine çok büyük benzerlik gösterir ve ölüm sırasında (septisemi gibi) hasta dokudaki veya yaşamda vücutta normalde bulunan ( Örneğin barsak flora bakterileri gibi) non-patojenik organizmaların çoğalmasıyla meydana gelmektedir. Fiksatifler dokuda mevcut olan veya ölümden sonra meydana gelen ve dokunun daha ileri değişimlerine yol açan bütün bakterileri öldürür.
Fiksasyonun en önemli etkilerinden biri doku proteinlerinin ve yapı taşlarının koagülasyonudur. Böylece takip sırasında kayıpları ve diffüzyonları minimuma inmektedir. Ancak ek olarak fiksatif, takip sırasındaki haraplayıcı etkilere karşı koruyucu olmalıdır. Eğer, taze tespit edilmemiş doku çeşme suyunda yıkanacak olursa ciddi ve tamir edilemez harabiyet ve hücre lizisi oluşur. Fakat doku önce, Zenker de tespit edilirse ve daha sonra suya daldırılırsa zararsızdır. Akılda tutulmalıdırki doku elemanlarının koagulasyonu gerekli olmasına rağmen büyük bir artifakt oluşacaktır. Çünkü canlı hücre sıvı veya yarı-sıvıdır.
Fiksasyon hücre ve doku elemanlarına değişen oranlarda kırma indislerini değiştirerek optik differansiasyon sağlamaktadır. Bazı hücre elemanlarının kırma indisleri çevreleyen ortama çok yakındır. Bu nedenle klasik mikroskopla canlı olarak incelendiklerinde görülemezler. Fiksasyon dokuların boyama basamağında da önemli bir etkiye sahiptir ve genellikle boya hareketlerini kolaylaştırır. Tespit ajanları bazı boyaların uygulanması üzerine özellikle faydalı bir etkidir. Örneğin çekirdek boyası olan carmalum, formalinden sonra merkurik klorid fiksasyonuna göre daha az boyar. Bazen tespit ajanı özel doku kompenenti ve doku arasında direkt bir link olarak hareket edebilir ve bu durumda fiksatifin bir mordant olarak hareket ettiği söylenebilir. Örnek olarak da hematoksilenle miyelinin gösterimi için dokunun potasyum dikromatla muamele edilmesi verilebilir.
Fiksatiflerin diğer önemli bir fonksiyonu ise, dokuyu sertleştirmeleri sebebiyle doku parçalarından kolaylıkla ince kesitlerin alınmasına sebep olmalarıdır. Fiksasyon olayında fiksatifte kullanılan bazı kimyasal maddeler sebebiyle enzimler inaktif hale getirilir veya muhafaza edilir. Fiksatiflerin pratik uygulanması düşünülürken, araştırmanın gerçek amacı, dokunun boyutu, tipi ve tazeliği kesit alma prosesi ve uygulanmak istenen boyama tekniğinin bilinmesi gereklidir. Hiçbir fiksatif bütün dokular ve teknikler için ideal değildir. Proteinler, tuzlar, CH'lar veya lipidler çökertilir ve dolayısıyle dokunun yapısı elemanları sertleşir ve katılaşır.
Fiksasyon işlemi fiziksel (ısı, kurutma ve dondurma ile ) ve kimyasal yolla yapılabilir. Isı ile fiksasyon dezavantajları nedeni ile artık uygulanmamaktadır. Kurutma ile fiksasyon, kan ve kemik iliği yaymalarında kullanılır. Dondurma ile fiksasyon, lipidler, enzimler ve ameliyat parçalarının hızlı teşhisinde kullanılır. Dondurulan örneklerden dondurma mikrotomu ( Cryostat ) ile kesit alınır. Kimyasal fiksasyon en çok kullanılan yöntemdir. Bu yöntemde alınan örnekler ya fiksatife atılır (immersiyon yöntemi ) ya da hayvan anestezi altında iken organı besleyen arter yolu önce serum fizyolojik ardından fiksatif verilerek yapılır (Perfüzyon Yöntemi). Perfüzyondan sonra örnekler alınarak tekrar fiksasyonun tamamlanması için fiksatife atılırlar. Böylelikle organ vücuttan çıkarılmadan bir miktar tespit edilir. Morfoloji daha iyi korunduğundan genellikle titiz çalışma gerektiren araştırmalarda kullanılır.
Fiksatifler daima maksada ve boyama metodlarına uygun olarak seçilmelidir. Tespit olayının basarılı olması aşağıdaki unsurlara bağlıdır
1- Ölümden ve operasyondan sonra elde edilen doku ve organ parçaları derhal fiksatife atılmalıdır. Kalp durmasından en geç ışık mikroskobunda 30 dk., elektron mikroskobunda 4 dk. sonra örnekler fiksatife alınmalıdır.
2- Fiksatifte kullanılan kimyasal maddelerin tazeliğinde emin olmalı ve bu maddeleri titizlikle tartmalı ve karıştırmalıdır. Aksi taktirde fiksatifin etki ve nüfuz kabiliyeti ortadan kalkar.
3- Doku parçaları mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır.
4- Fiksatif yeterli miktarda yani doku parçasının en az 10 misli olmalıdır (Formalin için 20 misli).
5- + 4C'de fiksasyon yapılması önerilmektedir. Her ne kadar düşük ısılar fiksatifin, dokuya penetrasyonunu azaltırsa da otolizi önlendiğinden iyi tespit için gereklidir.
6- İçi boş organlar tespit solusyonu ile doldurulmalıdır. Böylece tespit solusyonu dokuya her iki yüzden işler. Hem de boşluğun iç yüzündeki düzgün yüzey şeklini korumuş olur.
7- Kırışma ve katlanma olasılığı olan dokular mantar plakalar üzerine gerilmelidir.
8- Kaba önce fiksatif konmalı sonra parçalar aktarılmalı. Aksi taktirde doku kaba yapışır ve yapışma yerinden tespit solusyonu dokuya işlemez.
9- Yağdan ve havadan zengin dokular tespit solusyonunda yüzdükleri için bir kaset içine alınarak tespit edilmelidir.
10- Tespit solusyonunun dokuya işleyişini hızlandıran işlemlerden kaçınmalıdır. Yüksek ısı bir yönden tespit solusyonunun. dokuya işlerliğini artırır. Diğer yönden de dokuda otolizi hızlandırır.
11- Kullanılan tespit solusyonunun dokulara işleme hızları bilinmelidir. Bu hız her tespit solusyonu için değişiktir. Örneğin aIkol 5 mm kalınlığında bir dokuyu 2-4 saatte tespit eder. Aseton 5 mm kalınlığında bir dokuyu 2 saatte tespit ederken, sublime 5 mm kalınlığında bir dokuyu 5 saatte tespit eder .% 4'1ük formalin 4 mm kalınlığında bir dokuyu + 4 Cde 5 saatte tespit eder.
12- Kural olarak özel amaçlar dışında doku 24 saatten fazla tespit edilmemelidir.
13- Tespit solusyonu ne hipotonik,ne de hipertonik olmalıdır. Kullanılacak tespit solusyonunun osmomolaritesi canlı dokunun osmolaritesi (300 mosl) ve ölü dokudakine (450 mosl) uygun olmalıdır. Bu özellik gözönünde bulundurularak tespit edilmeyen doku su ile kesinlikle yıkanmamalıdır.
14- Tespit solusyonunun pH'sı canlı dokunun pH'sına yakın olmalıdır (6-8). Bu nedenle tamponlanmış formalinle dokuların tespit edilmesi daha uygun olur.
Dokunun aşırı derecede sertleşmesine müsade edilmemelidir. Doku aşırı derecede katılaşacak olursa daha sonraki işlemleri zorlaşır.
Kaplar yeterli büyüklükte ve düz hatlı olmalı, boğazı ise dar olmamalıdır. Böylelikle spesimenlerin sonradan çok küçük kavanoza aktarılırken minumum hasar görmesi sağlanır.
Uzun zaman tespit solusyonunda kalan ve tespit solusyonunun buharlaşması sonucu sertleşen dokulardan tekrar çalışmak istendiğinde bu doku antiformine konarak yumuşatılabilir.
ANTi FORMİN SOLUSYONU: 1 gr antiformin 5 ml suya konarak yahutta konsantre solusyonun 20 ml'si 80 ml suya konarak hazırlanır. Tamamen kuruyan dokuysa Dimetilsülfoksid (DMSO) içinde yumuşatılarak tekrar çalışır hale getirilebilir.
TESPİT ESNASINDA MEYDANA GELEN HATALAR
Fiksasyon artefaktları birçok nedeni vardır. Bunlar :
a) Doku parçaları iyi tesbit edilmemişse, tespit olmamış doku elemanları otolize uğrarlar. Böylece ileride yapılacak işlemlerde beklenen netice alınamaz.
b) Eğer bir fiksatif hazırlanırken formule iyi dikkat edilmez ve karışımı temin edecek maddeler uygun bir denge sağlıyamazlarsa hücrelerde şişme, büzülme ve ayrılmalar meydana gelerek, histolojik detaylar kaybolur.
Histoloji
-
Endosülfan ve okratoksin-A’nın birlikte sıçanlarda toksisitesi: histopatolojik değişiklikleri
-
Histoloji Pdf Ders Notları
-
DEKALSİFİYE EDİLMEMİŞ KESİTLERİN HAZIRLANIŞI
-
DEKALSİFİKASYONU TEST ETMEK
-
KELATLAMA AJANLARI
-
ELEKTROLİTİK DEKALSİFİKASYON
-
ASİT DEKALSİFİKASYON SIVILARI
-
Histopatoloji nedir ?
-
KEMİK DOKUSU VE DEKALSİFİKASYON
-
MSS’DE DEJENERE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
MARKSCHE’DEN BOYASI (Spielmayer, Benda)
-
MSS‘DE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
KARIŞIK OLAN TEKNİK
-
BİELSCHOWSKY TEKNİĞİ
-
GÜMÜŞ ÇÖKTÜRME YÖNTEMLERİ